Summary
Den tredimensjonale kulturmetode er beskrevet i denne protokollen sammenfatter pancreas utviklingen fra dispergert embryonale muse bukspyttkjertel progenitorer, inkludert et vesentlig ekspansjon, differensiering og morfogenese i en forgrenet organ. Denne metoden er mottagelig for avbildning, funksjonelle forstyrrelser og manipulering av nisjen.
Introduction
Organ kultur gir en nyttig modell som bygger bro over gapet mellom det komplekse, men svært relevant in vivo undersøkelser og praktisk, men omtrentlig simulering av cellelinje modeller. I tilfelle av bukspyttkjertelen, er det ingen cellelinje helt ekvivalent med bukspyttkjertel progenitorer, selv om det er transformert cellelinjer som simulerer endokrine og eksokrine celler. Den voksne hele bukspyttkjertelen kan ikke dyrkes; isolerte endokrine holmer kan opprettholdes for noen uker uten celleproliferasjon og vev skiver kan holdes in vitro for noen timer fem. Embryonisk pancreas kultur har vært mye brukt, ikke bare for å studere dens utvikling, men også å undersøke epitel-mesenchymale interaksjoner 4,6,7, til bilde prosesserer 8 eller for kjemisk å påvirke dem 9. To orgel kultur metoder er i hovedsak brukt: den første består i dyrking bukspyttkjertelen knopper på fibronectin belagte plater 2, som er betjenesnient for bildebehandling formål; det andre alternativet er å kultur organene på filtre på luft-væske-grensesnittet 3,4 som beste bevarer morphogenesis. Selv om svært nyttig, er disse fremgangsmåter fører til en viss grad av utflating; ekspansjon av progenitorer er svært begrenset i forhold til den normale utviklingen og det anvendte utgangs populasjonen er kompleks som omfatter alle typer av pankreatiske celler og mesenkymale celler.
Evnen til kultur og utvide spredte primære celler er verdifullt å studere avstamning relasjoner og avdekke de iboende egenskapene til isolerte celletyper 10. Sugiyama et al 11. Kunne opprettholde bukspyttkjertelen stamfedre og endokrine stamfedre som beholdt noen funksjonelle tegn for 3-5 dager i kultur på næringslag. Pancreatospheres, beslektet med neurospheres 12 og mammospheres 13, har blitt utvidet fra voksne holmer og duktale celler selv om arten av forfedrene / stamcellersom genererer disse sfærene er ikke klart. I tillegg, i motsetning til fysiologisk utvikling, de pancreatospheres inneholdt noen nevroner 14,15. Spheres ble også nylig produsert fra embryonale bukspyttkjertel progenitors 16,17 og regenererende pankreata 18 med god stamfar ekspansjon og påfølgende differensiering, men ikke klarte å rekapitulere morphogenesis.
3D modeller fra spredte og ofte definerte celler som selv-organiserer i miniatyriserte organer nylig har blomstret og simulere utvikling eller voksen omsetning av flere organer som tarmen 19,20, magen 21, leveren 22, prostata 23 og trakea 24. I noen tilfeller er utviklingsmessig morfogenese og differensiering blitt rekapitulert i 3D fra ES-celler, som er tilfellet med optiske kopper 25, tarm 26 eller hjerne 27..
Her, vi desCribe en metode for å utvide dissosiert multipotent bukspyttkjertelen stamfedre i en 3D Matrigel stillas der de kan differensiere og selv organisere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen tar sikte på å vokse bukspyttkjertelen organoids avledet fra murine E10.5 dissociated epiteliale bukspyttkjertelen celler.
Protokollen krever etisk godkjenning for dyreforsøk.
En. Disseksjon av Dorsal Bukspyttkjertel Bud fra E10.5 mus embryoer
- Ofre for tidsbasert gravide mus på embryonale dag (E) 10,5, åpne magen med en saks, fjern de to livmor horn og legg dem i en 10 cm petriskål fylt med kaldt fosfatbuffer saltvann (PBS) eller Dulbeccos endret viktig medium (DMEM) holdt på is. Den totale eksperimentet fra offeret til celle såing utføres i 60-90 min for å forhindre celleskader.
- Separer livmoren i individuelle embryo segmenter ved hjelp av små saks. Overfør et embryo til en 35 mm petriskål med kald PBS og visualisere den under et dissekere mikroskop med belysning ovenfra. Med disseksjon tang fjerne omliggende muskler, decidua og eggeplomme sac og utsetter fosteret. Plasser embryo tilbake i kalde DMEM medium. Embryoet kan lett overføres ved hjelp av en 3 ml plast overføringspipetten / dropper. Isoler hver enkelt embryo på lignende måte før fortsetter.
- Plasser et embryo i en ren 35 mm petriskål i PBS.
- Bruk tynne pinsett (0,05 mm bredde) for å fjerne forbena. Forsiktig inn pinsett i åpningen for å løsne fordøyelseskanalen fra ryggmargen region (Figur 1). EKSTRA: For mer bekvemt se magen, fjerne overkroppen av embryoet, ned til hjertet og halen regionen under plomme stilken.
- Lokaliser mage, lever og tarm. Ved hjelp av tenger, å isolere mage-tarmkanalen fra magen til tarmen og plassere den i kaldt DMEM på is (fig. 1). Den dorsale pankreatisk knopp er festet dorsalt, posterior til magen (figur 1).
- Isolere hver enkelt mage-tarmkanalen i en liknendeLar måte før du fortsetter. Hvis embryoene må genotypede, samle halen ved disseksjon og holde hver enkelt mage-tarmkanalen i en annen brønn i en 24-brønns plate med kaldt DMEM på is.
- Plasser en mage-tarmkanalen i en ren 35 mm petriskål i kaldt PBS. Nå bruker belysning nedenfra i lyse feltet for å visualisere og dissekere dorsal bukspyttkjertelen knopp under disseksjon mikroskop. Disse forholdene vil optimalisere visualisering av volumene. Ved hjelp av elektrolytisk-skjerpet wolfram nåler eller 20 G sprøyte nåler, isolere bukspyttkjertelen knopp med så lite mesenchyme som mulig rundt epitel (Figur 1).
- Overfør den isolerte knopp i en petriskål inneholdende en kald dispase-løsning (1,25 mg / ml) i 2-3 min. Fra dette punkt, kan overføringen mest bekvemt gjøres med flamme-trukket 50 mL glasskapillærer som er koblet til en munn-styrt fleksible rør. Alternativt, men med flere risk for å miste knoppen, bruker en 10 mL automatisk pipette (Pipetman) med passende plast tips.
- Utfør bukspyttkjertelen knopp aspirasjon og utstøting i henhold mikroskopisk kontroll. Sett bukspyttkjertelen knopp tilbake i PBS. Videre rengjøres det isolerte pankreatisk bud fra mesenchyme med nålene og forsiktig aspirasjon ved hjelp av glasskapillære (figur 1).
- Når hele mesenchyme er fjernet, skyll bukspyttkjertelen knopp i kaldt PBS; overføre hver knopp til kaldt DMEM i individuelle brønner (60-brønners mini skuffer fylt med 10 mL av kaldt DMEM). Det er viktig ikke å fjerne mesenchyme i dispase, som gjør vevet meget klebrig.
2. Plating og kultur av dispergert Cells
- Overfør dissekert epithelia fra alle embryoer med en flamme trukket glass kapillær inn koniske brønner på 60-brønners mini skuffer fylt med 10 mL PBS for skylling.
- Overfør knoppen inn 10 mL Trypsin 0,05% ennd la det inkuberes ved 37 ° C i 4 min. Inaktivere trypsin ved å overføre knopp i en brønn med 10 mL DMEM + 10% kalvefosterserum (FCS).
- Dissosiere cellesuspensjonen ved aspirasjon gjennom en tynn kapillær trukket med en pipette puller. Det er viktig å unngå bobler på dette stadium, mens pipettering opp og ned for å dissosiere i cellene. Pancreas organoids optimalt starte fra små grupper på 5-15 celler og derfor delvis dissosiasjon er anbefalt (Figur 1).
- Pool cellene fra flere embryoer i et Eppendorf-rør for å minimalisere forskjeller på grunn av individuell behandling. Fortynn cellesuspensjonen i kald Matrigel i et 01:03-forhold. Delmengde denne blandingen til en 96-brønns plate, 8 ul / brønn, eller i en plate som er optimalisert for imaging (se nedenfor).
- Inkuber platen ved 37 ° C i 5 min, slik at Matrigel å tykne. Fyll brønnene med 70 mL av medium av valget (organoid eller sfære, se Tables 1 og 2), og la i en fuktet miljø inneholdende 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C.
- Sett på middels hver 4. dag. Overvåke den voksende bukspyttkjertelen kolonier daglig og dokumentere prosessen med bildebehandling.
- Små molekyler eller proteiner av interesse kan tilsettes til mediet på dette stadiet for eksperimenter forstyrrelser, som rapportert tidligere 28.
Tabell 1: Organoid medium.
| Navn på Material | Stock Konsentrasjon | Konsentrasjon i finalen medium | Volum på lager |
| Penicillin-Streptomycin | 100% | 1% | 50 mL |
| KnockOut Serum erstatning (supplement) | 100% | 10% | 500 mL |
| 2-merkaptoetanol | 14,3 M 0,1 mM | 1 mL | |
| Forbolmyristatacetat (PMA) | 16 mikrometer | 16 nM | 5 mL |
| Y-27632 (ROCK hemmer) | 50 mM | 10 mikrometer | 1 mL |
| EGF | 50 pg / ml | 25 ng / ml | 2,5 mL |
| Rekombinant humant R-spondin en | 250 mikrogram / ml | 500 ng / ml | 10 ul |
| - Eller - | |||
| Rekombinant Mouse R-spondin en | 250 mikrogram / ml | 500 ng / ml | 10 ul |
| Rekombinant humant FGF1 (aFGF) | 100 pg / ml | 25 mikrogram / ml | 1,25 mL |
| Heparin (Liquemin) | 2500 U / ml | 2,5 U / ml | 2 mL |
| Recombinant Menneskelig FGF10 | 100 pg / ml | 100 ng / ml | 5 mL |
| DMEM/F-12 | 4,412.25 mL | ||
| Total | 5000 mL |
Tabell 2: Sphere medium.
| Navn på Material | Stock Konsentrasjon | Konsentrasjon i finalen medium | Volum på lager |
| Penicillin-Streptomycin | 100% | 1% | 50 mL |
| B27 x50 (supplement) | 100% | 10% | 100 mL |
| Rekombinant humant FGF2 (bFGF) | 100 pg / ml | 64 ng / ml | 3,2 mL |
| Y-27632 (ROCK hemmer) | 50 mM | 10 mikrometer | 1 mL |
| DMEM/F-12 | 4845,8 mL | ||
| Total | 5000 mL |
Tre. Imaging av progresjon av Organoid Development
- Bilde organoids enten daglig eller etter tid lapse mikroskopi ved hjelp av et fluorescerende time-lapse mikroskop. For tiden lapse bildebehandling, bruke en XY (Z) automatisert invertert fluorescerende mikroskop.
- Innskudds små dråper av 3 mL i 4-brønners plater eller glass-bunn plater fylt med 2-5 ml medium. Bilde med en 10x lang avstand objektiv. Merk: Transgene mus som uttrykker fluorescerende tracere kan brukes. Movie 1 viser for eksempel den første utvidelsen av organoids fra Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + mus fire. Atom GFP gjør det mulig for brukeren å spore celler som enkeltobjekter, men lignende prinsipper kan brukes til å spore celler med membran fluorescens sliksom mT / mG mus 29.
- Starttid-lapse bildebehandling tre timer etter seeding cellene for å unngå fokus fonner og sette programvaren kontrollerende automatisering å ta en bilde / t for tre eller flere dager på manuelt definerte posisjoner. For hver posisjon, erverve en differensial interferens kontrast (DIC) image samt GFP signal, rapportering fluoriserende fargestoff uttrykk.
4. Gjenoppretting av Organoids for histologi
- Plasser 96-brønn plate på is og fjernes mediet, og erstatte det med iskald PBS. Dette depolymerizes delvis Matrigel.
- Forsiktig aspirer enkelte organoid, fjerne rundt Matrigel ved hjelp av en 1000 mL tips for å ikke forstyrre den generelle arkitekturen. Overfør hver organoid til et godt med iskald PBS. Hold platen på is. Direkte festing i Matrigel er også mulig.
- Fest organoid for 15 min i 4% paraformaldehyde (PFA), fryse ned det i sukrose, og legge det i gelatin. Behandle hverorganoid for frysesnitt og histologi som tidligere beskrevet (Johansson et al. 2007) 4..
5. Gjenoppretting av Organoids for PCR og biokjemi
- Plasser 96-brønn plate på is og fjerne mediumet. Legg 60 mL av RNAlater per brønn for å stabilisere og beskytte cellulær RNA.
- Bryt gelen i hver brønn mekanisk ved delvis depolymerisering av den på is. Enten gjenopprette enkelt organoids ved hjelp av en 1000 mL tips for å ikke forstyrre den generelle arkitekturen eller gjenopprette hele godt (med Matrigel) ved å forstyrre gel mekanisk med en 200 mL tips. Bruk en 1000 mL spissen for å overføre brønninnholdet til en RNase-fri ikke-klebrig Eppendorf rør holdt på is.
- Vask brønnene med 60 mL RNAlater og tilsett resten av innholdet til den samme Eppendorf tube.
- Spinn rør for 5 min ved 500-1000 xg ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten, kun etterlot 20-30 mLav RNAlater i røret sammen med pelleten. For biokjemi, lagres prøvene så tørre som mulig.
- Må ikke fryses prøver i RNAlater umiddelbart; oppbevar ved 4 ° CO / N (for å tillate RNAlater å grundig penetrere vev). Vevet kan bli lagret ved -20 ° C i lengre tid, og kan senere bearbeides for vev avbrudd og ekstraksjon av små mengder RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E10.5 rygg bukspyttkjertelen stamfedre dissosiert og seeded i 3D Matrigel rekapitulere bukspyttkjertelen utvikling. Stamfedre kan lettest fulgt med fluorescerende reportere. I vårt tilfelle brukte vi en transgen mus som uttrykker en kjernefysisk GFP protein kontrollert av Pdx1 promoter (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Movie 1) i fravær av tamoxifen og dermed uten å aktivere Neurog3 4 (Figur 2).
Med organoid medium, forekommer en innledende komprimering av små klaser av celler i de første timer. Ekspansjon kan deretter bli detektert ved utvidelsen av klyngene i de første 4 dager (figur 2A). Fra dag 5, greiner danner i de 20% største organoids. Enkeltceller ikke utvide og mister Pdx1 uttrykk mens de store klynger beholde Pdx1 uttrykk 28.
I disse forholdene, stamfedre gjennomgå en spectacular morfogenese med fremveksten av forgrenede epiteliale strukturer. Denne prosessen foregår kun når forfedrene er seedet i ≥ 4-celler klynger, som indikerer en sterk forutsetning for samfunnet signaler. Histologisk analyse viser at etter dag 7 av kulturen, er de resulterende mini-organer bestående av pankreatiske progenitorer (Sox9 + / HNF1B + / Pdx1 +-celler: Figur 3B) og differensierte celler som uttrykker enten eksokrin (Amylase +) eller endokrine (Insulin + eller Glukagon +) markører (figur 3A, C). Differensieringen inn endokrine celler er lavere enn i den endogene bukspyttkjertelen (ca. 0,1%), men ble øket til 1% når FGF1 ikke blir tilsatt til kulturmediet 28.. Bemerkelsesverdig, ikke bare de seeded progenitors differensieres til de forventede bukspyttkjertelen linjene, men de også spontant vedta den normale bukspyttkjertelen arkitektur. Selv om E10,5 multipotent bukspyttkjertelen stamfedre er ikke polarisert, cellene i kultur polariserer som demonstrert av segregering av Mucin1 og aPKC i membranen overfor de sentrale lumen og de organiserer inn en forgrenet rørformet nettverk. Regionalisert "tips og trunk" domener dukke opp: HNF1B + stamfedre og endokrine celler er lokalisert i den sentrale regionen, mens akinærceller er plassert i periferien som en delvis eller fullstendig krone av celler. De organoids kan opprettholdes i kulturen for 10 dager; etter denne perioden, de som regel mister sin arkitektoniske organisering og bli cystisk (ikke vist). Aging kan skje etter delvis dissosiasjon, men raskt fører til cyste formasjonen, et fenomen som er redusert ved tilsetning av BMP-inhibitor Noggin 28..
Med kulen medium, er ekspansjons hyppigere og er sett fra 2% av enkeltceller; imidlertid effektiviteten av sfæren dannelse korrelerer med størrelsen av seeded klynger 28. På dag 2/3, er et hulrom detekteres i små klaser og utvider seg deretter, som fører til i hovedsak monolags hule kuler med tilfeldige lokale flerlags områder (figur 2B). Disse kulene kollapser når det hentes fra Matrigel (figur 3D-H). Under disse betingelser er de resulterende strukturer i hovedsak består av pankreas progenitorer, med en liten prosentandel av differensierte eksokrine og endokrine celler på dag 7 (figur 3D-H). Progenitorer i kulene også blitt apikalt polarisert, som demonstrert ved segregering av aPKC på membranen som vender mot det sentrale lumen i alle celler (figur 3F). Pancreatospheres kan passaged minst to ganger (ikke vist).
Figur 1. Skjematisk fremstilling av procedure. mage-tarmkanalen er i utgangspunktet dissekert fra embryo og senere dorsal bukspyttkjertelen knopp er isolert. Den mesenchyme fjernes og bukspyttkjertelen stamfedre er skilt ved hjelp av trypsin. De resulterende delvis dispergert cellene blir deretter utsådd ved lav tetthet i vekstfaktor-fratatte Matrigel. Scale barer:. 1,00 mm med unntak for den resulterende organoid bildet hvor målestokken er 200 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Progress av kultur over tid. (A) En liten klynge av pankreas progenitorer dyrket med organoid medium og etterfulgt med time-lapse mikros fra 3 hr etter plating, i 60 timer. I bottom paneler, en organoid etter syv dager med kultur. Målestokk: 200 mikrometer; gjelder for alle paneler i A. (B) Eksempel på en sfære fulgt i en 60 timers time-lapse og tatt på dag 7 av kultur. Målestokk: 200 mikrometer; gjelder for alle paneler i B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3.. Histologi. (AC) Serial seksjoner av en 7-dagers organoid farget på stamcelle (B - HNF1B) og differensiering (A - amylase, C - insulin) markører. Den organoid er sammensatt av epitelisk (A - E-cadherin), og apikalt polarisert (B - mucin1) celler. Den stiplede linjen tilsvarer den ikke-acinar midtre område (A), hvorHNF1B (B) og endokrine (C-celler) blir detektert (DH) Deler av 7-dagers sfærer farget for progenitor. (G - HNF1B, H - Sox9) og endokrine (D - insulin og glukagon) markører. Kulene er sammensatt av apikalt polarisert (D, F - aPKC) epitel (E - E-cadherin) celler. Målestokk:. 50 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Storskalaproduksjon av funksjonelle beta-celler in vitro er fortsatt ineffektiv 1.. I denne utfordrende sammenheng, kan utviklingsbiologi studier hjelpe å tyde den eksakte signaler som kreves for differensiering av funksjonelle betaceller. Denne protokollen tillater opprettholdelse, vekst og differensiering av embryoniske stamceller pankreas in vitro. Dette inkluderer dannelsen av insulin-produserende beta celler som ikke co-express andre endokrine hormoner, har høye nivåer av Pdx1, uttrykker de pro-convertases som modnes insulin og har behandlet insulin 28. Viktige viktige faktorer i systemet er aktiviteten av FGF (eksogent stimulert av tilsatt FGF potensieres av heparin) og hakk (endogen) signalveier, så vel som ROCK-inhibering av Y-27632: i fravær av disse faktorene, ingen eller meget begrenset antall organoids og kuler ble generert 28. Kravet for FGF og ikkech aktivitet er lett å forstå basert på deres betydning for bukspyttkjertelen utvikling i vivo 28. ROCK hemmer kan bli erstattet av Blebbistatin, og dermed avsløre at hyperaktive av fila dynamikk ved dissosiasjon fører til både økt celledød, en sterk hemming av stamfar transkripsjonsfaktor Pdx1 og en mangel på ekspansjon. Interessant, ble mange flere komponenter av organoid medium vist seg å være individuelt unødvendig, men deres samlede fravær resulterte i tap av epiteliale forgrening 28. I tillegg til visse essensielle komponenter i mediet, er det viktig å kontrollere graden av dissosiasjon av stamceller. Faktisk er stamfar spredning og Pdx1 vedlikehold betydelig fremmet i grupper på mer enn 4 celler. En komprimering kan observeres innenfor den første 12 timer og unnlatelse av å kompakte resultater i unnlatelse av å opprettholde Pdx1 og utvide. Den ROCK inhibitor er avgjørende for denneprosess.
I øyeblikket organoids danner ikke etter FACS sortering, men effektiviteten i systemet potensielt kan forbedres ved reaggregating et kontrollert antall stamceller. En annen viktig komponent i dette kultursystem er det 3D matrisen. Celler satt på Matrigel eller i Matrigel for nær bunnen av platen spredning og mister Pdx1 ekspresjon. Matrigel gir mest sannsynlig biokjemiske komponentene, særlig laminin samt mekaniske pekepinner 28. Faktisk, stivheten i matrisen spiller en sentral rolle. Stive hydrogeler er ikke ettergivende for bukspyttkjertelen stamfedre vedlikehold og utvidelse 28 og fortynnes Matrigel er ikke heller. Når Matrigel er fortynnet 1:10 bukspyttkjertelen stamfar ikke kan dyrkes.
Den organoid systemet kan brukes til å teste effekten av små molekyler og rekombinante proteiner på bukspyttkjertelen stamfedre i form av overlevelse, spredning, differensiering, polarisering og forgrening28. Kan den også brukes til å teste samarbeidet av ulike celletyper i bukspyttkjertelen utvikling 28. Vi er sikre på at tilgjengeligheten av bukspyttkjertelen stamceller vil også tillate genetiske manipulasjoner, for eksempel viral målretting, som sett i andre organoid systemer 17,27. Dette kan brukes til screening av 17 med et system som gjør det mulig morphogenesis i motsetning til kulene som er beskrevet tidligere, så vel som her 16,17,28. De dyrkningsbetingelser vi utviklet også presentere den fordelen at serumfritt, mater-fri og blottet for mesenchyme og blodkar og dermed redusere den cellulære og biokjemiske kompleksitet. Det er imidlertid en begrensning i muligheten til passasjen de organoids og dermed for å oppnå store mengder av progenitorer. Dette kan omgås i fremtiden ved tilpasninger av protokollen til senere stadier av utvikling der stamfedre er mer rikelig, til kilder av bukspyttkjertelen stamfedre produsert fra embryonic stamceller (ES) celler eller indusert pluripotent stem (iPS-celler). Dette baner vei for en 3D-modell av menneskelig bukspyttkjertelen utvikling.
Dette systemet kan også potensielt anvendes for fremstilling av pankreatiske celler i fremtiden perspektiv av behandlingen. I denne sammenheng ville produksjonen av funksjonelle beta-celler for transplantasjon potensielt hjelpe i diabetesterapi. De tilpasninger av systemet til menneskelige ES eller iPS-celler vil være viktig for dette formålet. Det er fortsatt uklart om de organoid eller sfære forhold bør brukes. De organoid forhold tillater for fremstilling av celler som har flere karakteristikker av modne beta-celler, men deres funksjon gjenstår å bli testet. Imidlertid er disse celler er for tiden ikke er tallrike og er blandet blant andre celler. Det er også sannsynlig at den tidlige opptreden av heterogenitet i organoid system fører til ukontrollert signalering mellom cellene og er derfor uheldig for produksjonen.
THan sfære-system som opprettholder progenitorer i prinsippet er å foretrekke for kontrollert ekspansjon og aging av stamceller, men deres påfølgende differensiering gjenstår å bli kontrollert. Andre har nylig produsert pancreatospheres som effektivt kan differensiert. Det vil være viktig å sammenligne innholdet av kulene oppnådd i denne protokoll blottet for forer og serum til sfærer som oppnås med de andre protokoller 16,17. Fra et terapeutisk synspunkt, kan kompleksiteten og biologisk opprinnelse Matrigel utgjøre et problem for reproduserbarhet, helse og skalerbarhet. Foreløpige resultater har vist at myke hydrogel funksjon med laminin er ettergivende for bukspyttkjertelen stamfar ekspansjon in vitro. Ytterligere optimalisering er nødvendig, da disse gelene er ikke så effektiv som Matrigel 28..
Produksjonen av beta-celler i deres naturlige sammenheng kan også potensielt være nyttige for test medikamenter som øker betacelleaktivitet eller øke deres overlevelse eller proliferasjon, men for dette formål vil det være viktig å teste første grad av modenhet av beta-celler, for å øke effektiviteten av deres differensiering og for å teste hvorvidt de dyrkningsbetingelser som presenteres her bedre opprett holmer enn dagens suspensjonskulturer. Produserer eksokrin pancreas kan også være nyttig for å utvikle medikamenter for å målrette bukspyttkjertel kreft og pankreatitt. Her igjen, må graden av modenhet av de eksokrine celler produsert for å bli grundig undersøkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert sekvensielt av en NCCR Frontiers in Genetics pilot award, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 og Grant 12-126875 fra Det Frie Forskningsråd / sundhed og Sygdom. Forfatterne takker Spagnoli lab for hosting videoopptak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock kept at -20 °C |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock kept at 4 °C |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock kept at -20 °C |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production |
| Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock kept at 4 °C | |
| Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock kept at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock kept at -20 °C |
| Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock kept at -80 °C |
| Matrigel | Corning | 356231 | Stock kept at -20 °C |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock kept at 4 °C |
| RNAlater - RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at RT |
| Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C |
| BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines - stock kept at -20 °C |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock kept at -20 °C |
| 60-well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | |
| Disposal glass micropipettes | Blaubrand | 708745 | |
| Microscope | Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box. Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface. |
||
| Objective | Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance |
References
- Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
- Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
- Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
- Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
- Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , 3979 (2012).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
- Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
- Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. , (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. , (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
