Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Экстракорпоральное поджелудочной железы Organogenesis от дисперсных мышиных эмбриональных прародителей

doi: 10.3791/51725 Published: July 19, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Трехмерная способ культивирования описано в данном протоколе повторяет развитие поджелудочной железы от дисперсных эмбриональных клеток-предшественников мышь поджелудочной железы, включая их существенного расширения, дифференцировки и морфогенеза в разветвленной органа. Этот метод поддается визуализации, функциональной вмешательства и манипуляции нише.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Органная культура предоставляет полезную модель, мосты разрыв между комплекса, но весьма актуальны в естественных условиях исследований и удобный, но приблизительное моделирование моделей клеточных линий. В случае поджелудочной железы, нет клеточной линии совершенно эквивалентна поджелудочной железы предшественников хотя преобразуются клеточных линий, имитирующих эндокринных и экзокринных клетках. Весь поджелудочной железы взрослых не могут культивироваться; изолированные эндокринные островки может поддерживаться в течение нескольких недель без клеточной пролиферации и Срезы ткани могут быть сохранены в пробирке в течение нескольких часов 5. Эмбриональные поджелудочной железы культура была широко используется не только для изучения ее развитие, но и исследовать эпителиальные-мезенхимальных взаимодействия 4,6,7, чтобы изображение обрабатывает 8 или химически мешать них 9. Два органа способы культивирования в основном используются: первый заключается в культивировании поджелудочной рецепторы на фибронектина покрытием пластин 2, что является удобnient для целей визуализации; Второй вариант заключается в культуре органы на фильтрах на воздух и жидкой фаз 3,4, который наилучшим образом сохраняет морфогенез. Хотя очень полезно, эти методы приводят к определенной степенью выравнивания; расширение предшественников очень ограничено по сравнению с нормальным развитием и исходного население комплекс, включающий все типы клеток поджелудочной железы и клеток мезенхимы.

Возможность культуры и расширить распределенных первичных клеток является ценным для изучения клональные отношения и раскрыть внутренние свойства изолированных типов клеток 10. Сугияма и др. 11. Может поддерживать поджелудочной железы предшественников и эндокринные клетки-предшественники, которые сохранили некоторые функциональные символы в течение 3-5 дней в культуре на фидерных слоях. Pancreatospheres, сродни нейросферы 12 и mammospheres 13, были расширены от взрослых островков и протоков клеток хотя природа прародителей / стволовых клеток, которые генерируют эти сферы не ясно. Кроме того, в отличие от физиологического развития, pancreatospheres содержится некоторые нейроны 14,15. Сферы были также недавно получены из эмбриональных поджелудочной железы предшественников 16,17 и регенерации поджелудочных желез 18 с хорошим расширением предшественников и последующего дифференцирования, но не повторять морфогенез.

3D модели от дисперсных и часто определенных клеток, которые самоорганизуются в миниатюрных органов в последнее время процветала и имитации развития или взрослых оборот нескольких органов, таких как кишечник 19,20, желудка 21, печень 22 простаты 23 и трахеи 24. В некоторых случаях, морфогенез развития и дифференциации были обобщены в 3D от ЭС клеток, как это имеет место в оптических чашек 25, 26 кишечник или головного мозга 27.

Здесь мы десывают способ расширить диссоциированные мультипотентные поджелудочной предшественники в эшафот 3D Matrigel, где они могут дифференцироваться и самоорганизовываться.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол направлен расти поджелудочной органоиды, полученные из мышиных E10.5 диссоциирован эпителиальные клетки поджелудочной железы.

Протокол требует этического одобрения экспериментов на животных.

1. Препарирование спинной поджелудочной Bud от E10.5 эмбрионов мыши

  1. Жертвоприношение приурочена-беременных мышей в эмбриональный день (E) 10,5 откройте живота с ножницами, удалите два рога матки и разместить их в блюдо 10 см Петри заполнены холодной растворе фосфатного буфера (PBS) или Дульбекко изменение поддерживающая среда (DMEM), держится на льду. Общая эксперимент от жертвы, чтобы посева клеток делается в 60-90 мин, чтобы предотвратить повреждение клеток.
  2. Отделите матку на отдельные сегменты эмбрионов с использованием маленькие ножницы. Трансфер одного эмбриона, чтобы блюдо 35 мм чашки с холодной PBS и визуализировать его под микроскопом рассекает с подсветкой сверху. С рассечение пинцетом удалить окружающий мышцы, децидуальной и желток сас и подвергать эмбрион. Поместите эмбриона обратно в холодную DMEM среде. Эмбрионы могут быть легко переданы с помощью 3 мл пластик передачи пипетки / капельницу. Изолировать каждого отдельного эмбриона таким же образом, прежде чем продолжить.
  3. Наведите эмбрион в чистую 35 мм чашки Петри в PBS.
    1. Используйте тонкие щипцы (0,05 мм ширины), чтобы удалить переднюю конечность. Аккуратно вставьте щипцы в открытии отделить пищеварительный тракт от региона спинного мозга (рис. 1). ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Чтобы удобнее видеть желудок, снять верхнюю часть тела эмбриона, до сердца и хвостовой области ниже желтка стебля.
    2. Найдите желудка, печени и кишечника. Используя щипцы, изолировать желудочно-кишечный тракт от желудка до кишечника и поместите его в холодную DMEM на льду (рис. 1). Спинной поджелудочной бутон крепится на спинке, кзади от желудка (рис. 1).
    3. Изолировать каждого отдельного желудочно-кишечного тракта в СимиЛар образом, прежде чем продолжить. Если эмбрионы должны быть генотипированы, собирать хвост в момент вскрытия и сохранить каждый индивидуальный желудочно-кишечного тракта в другом лунку в 24-луночный планшет с холодной DMEM на льду.
  4. Поместите один желудочно-кишечного тракта в чистом 35 мм чашки Петри в холодной PBS. Теперь использовать подсветку снизу в светлом поле, чтобы визуализировать и анализировать спинной поджелудочной бутон под микроскопом рассечение. Эти условия будут оптимизировать визуализацию объемов. Использование электролитическим-заточенные иглы вольфрама или 20 г шприц иглы, изолировать поджелудочной бутон с минимальными мезенхимы, как это возможно вокруг эпителия (рис. 1).
    1. Передача изолированный почка в чашку Петри, содержащую холодный раствор диспазы (1,25 мг / мл) в течение 2-3 мин. С этой точки, передача может наиболее удобно делать с пламенем вытащил 50 мкл стеклянных капилляров, прикрепленных к ротовой управлением гибкой трубки. В качестве альтернативы, но с более RISK потерять почку, использовать 10 мкл автоматической пипетки (Pipetman) с соответствующими пластиковыми наконечниками.
    2. Выполните поджелудочной бутон стремление и выброс под микроскопическим контролем. Поставьте поджелудочной бутон назад в ФБР. Далее очистить изолированный поджелудочной бутон из мезенхимы с иглами и нежным стремление с помощью стеклянный капилляр (рис. 1).
    3. Когда весь мезенхимы удаляется, промойте поджелудочной бутон в холодной PBS; передавать каждый бутон в холодной среде DMEM в отдельные лунки (60-луночные лотки мини-заполнены 10 мкл холодной DMEM). Важно, чтобы не удалить мезенхиму в диспазы, что делает ткань очень липким.

2. Покрытие и культура дисперсных клеток

  1. Перенести расчлененный эпителий от всех эмбрионов с пламенем вытащил стеклянный капилляр в конических скважин 60-а мини-ящиках с 10 мкл PBS для полоскания.
    1. Перенести бутон в 10 мкл трипсина 0,05% ай пусть это инкубируют при 37 ° С в течение 4 мин. Инактивации трипсина путем передачи бутон в скважину с 10 мкл DMEM + 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS).
    2. Диссоциируют клеточной суспензии стремлением через тонкий капилляр вытащил с пипетки съемник. Важно, чтобы избежать пузырьков на этой стадии в то время как пипетки вверх и вниз для диссоциации клеток. Поджелудочная железа органоиды оптимально начинать с небольших групп по 5-15 клеток и, следовательно, частичное диссоциации рекомендуется (рис. 1).
  2. Бассейн клетки от нескольких эмбрионов в пробирку Эппендорфа с целью минимизации изменений, возникающих из-за индивидуальной обработки. Развести клеточной суспензии в охлажденном Матригель в соотношении 1:03. Аликвоты этой смеси в 96-луночный планшет, 8 мкл / лунку или в пластине оптимизированной для работы с изображениями (см. ниже).
  3. Инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин, позволяя Матригель сгущаться. Заполните лунки 70 мкл среды выбора (Органоид или сфера, см. таблле 1 и 2) и оставить в увлажненной среде, содержащей 5% СО 2 и 95% воздуха при 37 ° С
  4. Замените носитель каждый 4-й день. Ежедневно следить за укреплением поджелудочной колонии и документировать процесс визуализации.
  5. Малые молекулы или белки интереса может быть добавлен в среду на этой стадии для интерференционных экспериментов, как сообщалось ранее 28.

Таблица 1: Органоид среда.

Название материала Фото со Концентрация Концентрация в конечном среды Объем складе
Пенициллин-стрептомицин 100% 1% 50 мкл
Замена Сыворотка KnockOut (дополнение) 100% 10% 500 мкл
2-меркаптоэтанол 14.3 М 0,1 мм 1 мкл
Форболмиристатацетата (РМА) 16 мкМ 16 нМ 5 мкл
Y-27632 (ингибитор ROCK) 50 мМ 10 мкм 1 мкл
EGF 50 мкг / мл 25 нг / мл 2,5 мкл
Рекомбинантного человеческого R-spondin 1 250 мкг / мл 500 нг / мл 10 мкл
- Или -
Рекомбинантный мышь R-spondin 1 250 мкг / мл 500 нг / мл 10 мкл
Рекомбинантного человеческого FGF1 (кФРФ) 100 мкг / мл 25 мкг / мл 1,25 мкл
Гепарин (Liquemin) 2500 ед / мл 2,5 Ед / мл 2 мкл
Рекомbinant человека FGF10 100 мкг / мл 100 нг / мл 5 мкл
DMEM/F-12 4,412.25 мкл
Общий 5000 мкл

Таблица 2: Сфера среднего.

Название материала Фото со Концентрация Концентрация в конечном среды Объем складе
Пенициллин-стрептомицин 100% 1% 50 мкл
B27 x50 (дополнение) 100% 10% 100 мкл
Рекомбинантного человеческого FGF2 (оФРФ) 100 мкг / мл 64 нг / мл 3.2 мкл
Y-27632 (ингибитор ROCK) 50 мМ 10 мкм 1 мкл
DMEM/F-12 4845,8 мкл
Общий 5000 мкл

3. Визуализация Прогрессирование развития Органоид

  1. Органоиды изображения либо в день или по промежуток времени микроскопии с использованием флуоресцентного покадровой микроскоп. Для визуализации промежуток времени, использовать XY (Z) автоматизированные перевернутый флуоресцентный микроскоп.
  2. Депозитные маленькие капельки 3 мкл в 4-луночных планшетах или стеклянным дном пластин, заполненных 2-5 мл среды. Изображение с 10-кратным дальней цели. Примечание: Трансгенные мыши, экспрессирующие люминесцентные индикаторов могут быть использованы. Фильм 1 показывает например первоначальное расширение органоидов от Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + мышей 4. Ядерный GFP позволяет пользователю отслеживать клетки как отдельные объекты, но аналогичные принципы могут быть применены для отслеживания клетки с флуоресценции мембран, такихкак мТл / мг мышей 29.
  3. Начните покадровой визуализации 3 ч после посева клеток, чтобы избежать фокус заносы и установить программное обеспечение, контролирующее автоматизации принять 1 изображения / час в течение 3 и более дней в течение определенных вручную позиций. Для каждой позиции, приобрести дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения, а также сигнал GFP, отчетности флуоресцентный выражение маркер.

4. Восстановление органоидов для гистологии

  1. Поместите 96-луночного планшета на льду и удалить среды, заменив его льдом PBS. Это частично depolymerizes Матригель.
  2. Осторожно аспирации каждого отдельного Органоид, удаляя окружающую Матригель помощью чаевых 1000 мкл для того, чтобы не нарушить общую архитектуру. Трансфер друг Органоид в колодец с ледяной холодной PBS. Держите тарелку на льду. Прямая фиксация в Матригель также возможно.
  3. Закрепить Органоид в течение 15 мин в 4% параформальдегида (PFA), криоконсервированием его в сахарозе и вставлять его в желатин. Процесс другОрганоид для cryosectioning и гистологии как описано ранее (Johansson и соавт., 2007) 4.

5. Восстановление органоидов для ПЦР и биохимии

  1. Поместите 96-луночного планшета на льду и удалить среды. Добавить 60 мкл на лунку RNAlater того, чтобы стабилизировать и защищать клеточную РНК.
  2. Лишить гель в каждую лунку механически частично деполимеризующим его на льду. Либо восстанавливать отдельные органоиды помощью чаевых 1000 мкл для того, чтобы не нарушить общую архитектуру или восстановить весь колодец (с Матригель), нарушая гель механически с мкл кончика 200. С помощью наконечника с 1000 мкл для передачи содержания также в РНКазы свободной нелипкой пробирку Эппендорфа хранили на льду.
  3. Вымойте скважин с 60 мкл RNAlater и добавить оставшийся контент к той же трубки Эппендорф.
  4. Спин пробирки в течение 5 мин при 500-1000 мкг при 4 ° С.
  5. Удалить супернатант, оставив только 20-30 мклиз RNAlater в трубке вместе с осадком. Для биохимии, хранить образцы как можно более сухой.
  6. Не стоит сразу же заморозить образцы в RNAlater; хранить при 4 ° CO / N (чтобы RNAlater тщательно проникают в ткани). Ткань можно хранить при -20 ° С в течение длительного хранения и в дальнейшем могут быть обработаны для разрушения ткани и извлечения небольшого количества РНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

E10.5 спинной поджелудочной предшественники диссоциированные и высевают в 3D Матригель резюмировать развитие поджелудочной железы. Предшественники легче всего следуют с люминесцентными журналистами. В нашем случае мы использовали трансгенных мышей, которая выражает ядерного GFP белка контролируется Pdx1 промоутер (Pdx1-Ngn3-ER ТМ-nGFP) (фильм 1) в отсутствие тамоксифена и, таким образом, не активируя Neurog3 4 (рис. 2).

С Органоид среды, начальное уплотнение малых кластеров клеток происходит в первые часы. Расширение может быть обнаружена и на расширение кластеров в течение первых 4 дней (рис. 2А). Из 5-й день, филиалы формируют в 20% крупнейших органоидов. Отдельные клетки не расширяются и теряют выражение Pdx1 в то время как большие кластеры сохраняют Pdx1 выражение 28.

В этих условиях, предшественники пройти спецификациюtacular морфогенез с появлением разветвленных эпителиальных структур. Этот процесс происходит только тогда, когда прародители высевают в ≥ 4-клеток кластеров, указывает на высокую потребность в общественных сигналов. Гистологический анализ показывает, что после 7-й день культуры, в результате мини-органы состоят из поджелудочной железы предшественников (Sox9 + / HNF1B + / Pdx1 + клеток: рис. 3б) и дифференцированных клеток, экспрессирующих либо экзокринной (амилаза +) или эндокринные (инсулин + или Глюкагон +) маркеры (Фиг.3А, C). Дифференцировка эндокринных клеток в меньше, чем в эндогенном поджелудочной железы (около 0,1%), но увеличивается до 1%, когда FGF1 не добавляется в культуральной среде 28. Примечательно, что не только в отобранные предшественники дифференцируются в ожидаемых поджелудочной линий, но они также спонтанно принять нормальное поджелудочной архитектуру. Хотя E10.5 мультипотентные поджелудочной железы предшественники не поляризованы, клетки в культуре поляризовать о чем свидетельствует сегрегации Mucin1 и aPKC в мембраны, обращенной центральные просвет и они организуют в разветвленной трубчатой ​​сети. Районированы "наконечник и магистральные" домены появляются: HNF1B + предшественники и эндокринные клетки локализованы в центральной области, в то время как ацинарные клетки расположены на периферии в качестве частичной или полной короне клеток. В органоиды можно поддерживать в культуре в течение 10 дней; после этого периода, они обычно теряют свою архитектурную организацию и стать кистозный (не показан). Пассирование может быть сделано после частичной диссоциации но быстро приводит к образованию кист, явление, которое уменьшается путем добавления БМП ингибитора Noggin 28.

С сферы среды, расширение более частыми и видно из 2% от одиночных клеток; тем не менее эффективность формирования сферы коррелирует с размером seedeг кластеры 28. В день 2/3, просвет обнаружен в небольших кластеров и расширяется после этого, что приводит к значительной степени моно-слоистый полые сферы с редкими местных многослойных областях (фиг. 2B). Эти сферы рухнет, когда извлекается из Матригель (рисунок и 3D-H). В этих условиях, в результате структуры в основном состоят из поджелудочной железы предшественников, с небольшой процент дифференцированных экзокринных и эндокринных клеток на 7-й день (фиг. 3D-H). Предшественники в сферах также стал на вершине поляризованным, о чем свидетельствует сегрегации aPKC на мембраны, обращенной центральный просвет всех клеток (рис. 3F). Pancreatospheres может быть пассируют, по крайней мере в два раза (не показан).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение procedurэ. желудочно-кишечного тракта изначально расчлененный из эмбриона, а затем спинной поджелудочной бутон изолирован. Мезенхима снимается и поджелудочной предшественники разобщены, используя трипсин. Полученные частично диспергированные клетки затем высевали при низкой плотности в фактор роста обедненного Матригель. Масштаб бара:. 1,00 мм для результирующего Органоид картины, где шкала бар является 200 мкм кроме Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Прогресс культуры с течением времени. (А) Маленькая группа поджелудочной предшественников, выращенных с Органоид среды и затем с покадровой микроскопии от 3 ​​часов после посева, в течение 60 часов. В боttom панели, Органоид после 7 дней культуры. Шкала бар: 200 мкм; относится ко всем панелей в А. (В) Пример сфере последовали в 60 час покадровой и захватили в 7-й день культуры. Шкала бар: 200 мкм; относится ко всем панелей в B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Гистология. (AC) Серийные срезы из 7-дневного Органоид окрашивали на прародителя (B - HNF1B) и дифференциация (- амилаза, C - инсулина) маркеры. Органоид состоит из эпителиальных (- E-кадгерина) и на вершине поляризован (B - mucin1) клетки. Пунктирная линия соответствует не-ацинозной центральной области (А), гдеHNF1B (В) и эндокринной (С) клетки обнаруживаются (DH) Разделы 7-дневных сферах окрашенных для прародителя. (G - HNF1B; H - Sox9) и эндокринные (D - инсулин и глюкагон) маркеры. Сферы состоят из верхушке поляризован (D, F - aPKC) эпителиальных (Е - Е-кадгерин) клетки. Шкала бар:. 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Крупномасштабное производство функциональных бета-клеток в пробирке остается неэффективной 1. В этом сложном контексте, развития биологические исследования могут помочь расшифровать точные сигналы, которые необходимы для дифференциации функциональных бета-клеток. Этот протокол позволяет для поддержания, расширения и дифференциации эмбриональных панкреатических клеток-предшественников в пробирке. Это включает в себя формирование производящих инсулин бета-клеток, которые не со-выражать других эндокринных гормонов, имеют высокий уровень Pdx1, выразить про-конвертаз со сроком погашения инсулин и имеют обработанный инсулин 28. Важные ключевые факторы в системе являются активность FGF (экзогенно стимулируется добавленной FGF потенцированной гепарином) и Нотч (эндогенный) сигнальных путей, а также рок-ингибирование Y-27632: в отсутствие этих факторов, нет или очень ограниченное количество органоидов и сфер были получены 28. Требование FGF и неч активность легко понять на основе их значение для развития поджелудочной железы в естественных условиях 28. Ингибитор ROCK могут быть замещены blebbistatin, обнаруживая таким образом, что гиперактивацию динамики микрофиламентных на диссоциации приводит как повышенной гибели клеток, сильный ингибирования транскрипции предшественников фактора Pdx1 и отсутствие расширения. Интересно, что многие дополнительные компоненты Органоид среде, доказано, что индивидуально ненужным, но их общий отсутствие привело к потере эпителиального ветвления 28. В дополнение к некоторых основных компонентов среды, важно контролировать уровень диссоциации клеток-предшественников. Действительно, распространение предшественников и обслуживание Pdx1 существенно способствует в группах более 4 клеток. Уплотнения можно наблюдать в течение первых 12 ч и неудачи в компактных приводит к неспособности поддерживать Pdx1 и расширения. Ингибитор ROCK имеет важное значение для этогоПроцесс.

На данный момент органоидами не образуют после сортировки FACS но эффективность системы потенциально может быть улучшена путем reaggregating контролируемое количество клеток-предшественников. Другим важным компонентом этой системы культуры является 3D матрица. Клетки надеть Матригель или в Матригель слишком близко к нижней части распространения пластины и потерять выражение Pdx1. Матригель скорее всего обеспечивает биохимические компоненты, в частности, ламинин, а также механическую сигналы 28. Действительно, жесткость матрицы играет ключевую роль. Жесткие гидрогели не разрешительный для поддержания и расширения 28 поджелудочной предшественников и разбавляют Матригель не либо. Когда Матригель разбавляют 1:10 поджелудочной железы предшественников не может быть культурным.

Органоид система может быть использована для проверки воздействия малых молекул и рекомбинантных белков на поджелудочной предшественников в плане выживания, пролиферации, дифференцировки, поляризации и ветвление28. Он также может быть использован для тестирования сотрудничество различных типов клеток во время развития поджелудочной железы 28. Мы уверены, что доступность поджелудочной клеток-предшественников также позволит генетические манипуляции, такие как вирусный таргетинга, как показано на других Органоид систем 17,27. Это может быть использовано для скрининга 17 с системой, которая позволяет морфогенез в отличие от ранее описанных сфер, а также здесь 16,17,28. Условия культивирования мы разработали также представить то преимущество, что бессывороточной, питатель, свободной и лишенным мезенхимы и кровеносных сосудов, тем самым снижая клеточный и биохимический сложности. Однако существует ограничение в способности прохода органоидов и, таким образом, чтобы получить большие количества предшественников. Это можно обойти в будущем адаптации протокола к более поздних стадиях развития, где предшественники, более богатые, к источникам поджелудочной предшественников, полученных из эмбрионаМикросхема стволовые (ES) клетки или индуцированных стволовых плюрипотентных (IPS) клетки. Это открывает путь для 3D модели человеческого развития поджелудочной железы.

Эта система может также потенциально быть использованы для производства клеток поджелудочной железы в будущем точки зрения терапии. В этом контексте, производство функциональных бета-клеток для трансплантации бы потенциально помочь в терапии диабета. Адаптация системы к человеку ES или плюрипотентных клеток будет иметь важное значение для этой цели. До сих пор неясно, должна ли быть использованы органоидные или сфера условия. В органоидные условия позволяют для производства клеток, которые имеют несколько характеристик зрелых бета-клеток, но их функция еще предстоит проверить. Однако, эти клетки в настоящее время не многочисленны и смешивают среди других клеток. Вероятно также, что раннее появление неоднородности в Органоид системы приводит к неконтролируемой сигнализации между клетками и поэтому вредны для производства.

Тон сфера система, которая поддерживает клетки-предшественники, в принципе, предпочтительнее для контролируемого расширения и пассирования клеток-предшественников, но их последующее дифференцирование остается под контролем. Другие недавно произведенный pancreatospheres которые могут быть эффективно дифференцированы. Важно, чтобы сравнить характер сфер, полученных в текущем протоколе, лишенной сыворотки фидеров и в сферах, полученных с другими протоколами 16,17. С терапевтической точки зрения, сложность и биологического происхождения из Матригель может представлять собой проблему воспроизводимости, здоровья и масштабируемости. Предварительные результаты показали, что мягкие гидрогели функционализованные ламинином более снисходительны поджелудочной расширения предшественников в пробирке. Дальнейшая оптимизация требуется, поскольку эти гели еще не так эффективно, как Матригель 28.

Производство бета-клеток в их естественном контексте может также потенциально быть полезным для испытуемых лекарственных средств, которые повышают бетаактивность клеток или увеличения их выживание или пролиферацию, но для этого будет важно сначала проверить степень зрелости бета-клеток, чтобы повысить эффективность их дифференциации и для проверки условия культуры, представленные здесь лучше поддерживать островки, чем ток подвески культур. Производство экзокринной поджелудочной железы также может быть полезно для разработки лекарств для целевых поджелудочной железы и панкреатита. Здесь снова, степень зрелости экзокринных клеток, продуцируемых должен быть тщательно расследованы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась последовательно на НКРС границ в генетике пилотного премии, в отношении несовершеннолетних диабета исследовательский фонд Гранта 41-2009-775 и Грант 12-126875 от Det Фри Forskningsråd / Sundhed ог Sygdom. Авторы благодарят лабораторию Spagnoli за проведение видеосъемки.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
KnockOut Serum replacement (supplement) Gibco 10828-028 Stock kept at -20 °C
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich 3148-25ML Stock kept at 4 °C
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Calbiotech 524400-1MG Stock kept at -20 °C
Y-27632 (ROCK inhibitor) Sigma Aldrich ab120129 Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems.
EGF Sigma Aldrich E9644-2MG Stock kept at -80 °C
Recombinant Human R-spondin 1 R&D 4645-RS-025/CF Stock kept at -80 °C
Recombinant Mouse R-spondin 1 R&D 3474-RS-050 Stock kept at -80 °C
Recombinant Human FGF1 (aFGF) R&D 232-FA-025 Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin) Drossapharm Stock kept at 4 °C
Recombinant Human FGF10 R&D 345-FG-025 Stock kept at -80 °C
DMEM/F-12 Gibco 21331-020
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063 Stock kept at -20 °C
B27 x50 (supplement) Gibco 17504-044 Stock kept at -20 °C
Recombinant Human FGF2 (bFGF) R&D 233-FB-025 Stock kept at -80 °C
Matrigel Corning 356231 Stock kept at -20 °C
Trypsin 0.05% Gibco 25300-054 Stock kept at 4 °C
RNAlater - RNA stabilizing reagent Qiagen 76104 Store at RT
Dispase  Sigma Aldrich D4818-2MG Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C
BSA for reconstitution Milipore 81-068 For reconstituition of cytokines  - stock kept at -20 °C
Fetal calf serum (FCS) Gibco 16141079 Stock kept at -20 °C
60-well MicroWell trays Sigma Aldrich M0815-100EA
4-well plates Thermo Scientific 176740
95-well plates F bottom Greiner Bio 6555180
Glas bottom plates Ibidi 81158
Disposal glass micropipettes Blaubrand 708745
Microscope Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box.
Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface.
Objective Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance;
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
  2. Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
  3. Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
  4. Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
  5. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
  6. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
  7. Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. 3979 (2012).
  9. Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
  10. Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
  11. Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  13. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
  14. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
  15. Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
  16. Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
  17. Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
  18. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. (2013).
  19. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. (2009).
  20. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  21. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
  22. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
  23. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
  24. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
  25. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  26. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  27. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
  28. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
<em>Экстракорпоральное</em> поджелудочной железы Organogenesis от дисперсных мышиных эмбриональных прародителей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).More

Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors. J. Vis. Exp. (89), e51725, doi:10.3791/51725 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter