Summary
Den tredimensionella kultur metod som beskrivs i detta protokoll rekapitulerar bukspottkörteln utveckling från spridda embryonala mus bukspottkörteln progenitorceller, inklusive deras betydande expansion, differentiering och morfogenes i ett grenat orgel. Denna metod är mottaglig för bildbehandling, funktionella störningar och manipulation av nisch.
Introduction
Organkultur ger en användbar modell som överbryggar klyftorna mellan den komplexa men mycket relevant in vivo-undersökningar och bekvämt men ungefärlig simulering av cellinje modeller. I fallet med bukspottkörteln, det inte finns någon cell linje perfekt motsvarar pankreas progenitorer även om det är transformerade cellinjer som simulerar endokrina och exokrina celler. Den vuxna Hela bukspottkörteln kan inte odlas; isolerade endokrina cellöar kan upprätthållas under några få veckor, utan att celltillväxt och vävnadsskivor kan hållas in vitro under några timmar 5. Embryonala bukspottkörteln kultur har använts i stor utsträckning inte bara för att studera dess utveckling, men också för att undersöka epitelceller-mesenkymala interaktioner 4,6,7, att bilden processer 8 eller kemiskt störa dem 9. Två organodlingsmetoder används främst: den första består i att odla pankreas knoppar på fibronektin belagda plattor 2, vilket är convenient för avbildningsändamål; det andra alternativet är att odla organ på filter på luft-vätske-gränssnittet 3,4 som bäst bevarar morfogenes. Även mycket användbara, är dessa metoder leder till en viss grad av tillplattning; expansionen av progenitorceller är mycket begränsad i jämförelse med den normala utvecklingen och utgångspopulationen är komplex innefattande alla typer av pankreatiska celler och mesenkymala celler.
Förmågan att kulturen och expandera spridda primära celler är värdefullt att studera härstamning relationer och avslöja de inneboende egenskaper isolerade celltyper 10. Sugiyama m.fl. 11. Skulle kunna behålla pankreas stamceller och endokrina stamfäder som behållit vissa funktionella tecken i 3-5 dagar i kultur på matarskikt. Pancreatospheres, besläktad med neurosfärer 12 och mammospheres 13, har utökats från vuxna cellöar och duktala celler även om vilken typ av progenitorer / stamcellersom genererar dessa sfärer är inte klart. Dessutom, i motsats till fysiologisk utveckling innehöll pancreatospheres vissa nervceller 14,15. Klot har också nyligen producerat från embryonala pankreasgångare 16,17 och regenere pancreata 18 med god stamfader expansion och efterföljande differentiering men misslyckades med att rekapitulera morfogenes.
3D-modeller från spridda och ofta definierade celler som själv organiserar i miniatyriserade organ har nyligen blomstrade och simulera utvecklingen eller en vuxen omsättning på flera organ såsom tarm 19,20, magen 21, lever 22, prostata 23 och luftstrupen 24. I vissa fall har utvecklings morfogenes och differentiering valts rekapituleras i 3D från ES-celler, såsom är fallet med optiska kopparna 25, tarmen 26 eller hjärn 27.
Här, vi desCribe en metod att expandera dissocierade multi pankreas stamceller i en 3D Matrigel byggnadsställning där de kan differentiera och självorganisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll ska växa pankreas organoids härrör från mus-E10.5 dissocierade epithelial celler i bukspottkörteln.
Protokollet kräver etiskt godkännande för djurförsök.
1. Dissektion av Dorsal bukspottskörteln Bud från E10.5 musembryon
- Offra tidsinställd-dräktiga möss på embryonala dag (E) 10.5, öppna buken med en sax, ta bort de två livmoderhornen och placera dem i en 10 cm petriskål fylld med kall fosfatbuffert saltlösning (PBS) eller Dulbeccos modifierade essentiella medium (DMEM), som hölls på is. Den totala experiment från offret till cell sådd sker i 60-90 minuter för att förhindra cellskador.
- Separera livmodern i individuella embryosegment som använder en liten sax. För över ett embryo till en 35 mm petriskål med kall PBS och visualisera den under ett dissekera mikroskop med belysning från ovan. Med dissektion pincett bort den omgivande muskler, decidua och äggula sac och exponera embryot. Placera embryo tillbaka i kall DMEM-medium. Embryon kan enkelt överföras med hjälp av en 3 ml plast överföringspipett / pipett. Isolera varje enskilt embryo på ett liknande sätt innan det fortsätter.
- Placera ett embryo till en ren 35 mm petriskål i PBS.
- Använd tunna pincett (mm bredd 0,05) för att ta bort frambenet. Försiktigt in pincetten i öppningen för att lösgöra matsmältningskanalen från ryggmärgen regionen (Figur 1). EXTRA: För mer bekvämt se magen, ta bort överkroppen av embryot, ner till hjärtat och svansregionen under gulan stjälken.
- Leta reda på magen, levern och tarmen. Med hjälp av pincett, isolera mag-tarmkanalen från magsäcken till tarmen och placera den i kallt DMEM på is (Figur 1). Den dorsala pankreas knopp är fäst dorsalt, posterior till magsäcken (Figur 1).
- Isolera varje individ mag-tarmkanalen i en liknande sätt innan du fortsätter. Om embryona måste genotypade samla svansen vid tidpunkten för dissektion och hålla varje individs mag-tarmkanalen i en annan brunn i en 24-brunnars platta med kall DMEM på is.
- Placera en mag-tarmkanalen i en ren 35 mm petriskål i kall PBS. Nu använder belysning underifrån i starkt fält för att visualisera och dissekera den dorsala bukspottskörteln knopp under dissektion mikroskop. Dessa villkor kommer att optimera visualisering av volymer. Använda elektrolytiskt vässade volfram nålar eller 20 G kanyler, isolera pankreas knopp med så lite mesenkymet som möjligt runt epitel (Figur 1).
- Överför den isolerade knopp i en petriskål innehållande en kall dispas-lösning (1,25 mg / ml) under 2-3 min. Från denna punkt, kan överföring bekvämast göras med flam-drog 50 pl glaskapillärer bundna till en mun-kontrollerad flexibla röret. Alternativt, men med fler risk att förlora sin linda, använd en 10 pl automatisk pipett (Pipetman) med lämpliga plastspetsar.
- Utför pankreas knopp aspiration och utstötning under mikroskopisk kontroll. Sätt tillbaka i PBS pankreas knopp. Ytterligare rengör isolerade pankreas knopp från mesenkymet med nålar och varsam aspire använder glaskapillär (Figur 1).
- När hela mesenkymet avlägsnas, skölj pankreas knopp i kall PBS; överföra varje knopp till kall DMEM i enskilda brunnar (60 brunnar mini brickor fyllda med 10 pl kall DMEM). Det är viktigt att inte ta bort mesenkymet i dispas, vilket gör att vävnaden mycket klibbiga.
2. Plating och kultur av spridda celler
- Överför dissekerade epitel från alla embryon med en eld-dras glas kapillär i koniska brunnar av 60-brunnars mini brickor fyllda med 10 l PBS för sköljning.
- Överför knopp i 10 pl av trypsin 0,05% ennd låt inkubera vid 37 ° C under 4 min. Inaktivera trypsin genom att överföra sin linda i en brunn med 10 | al DMEM + 10% fetalt kalvserum (FCS).
- Dissociera cellsuspensionen genom aspiration genom en tunn kapillär dras med en pipett avdragare. Det är viktigt att undvika bubblor i detta skede medan pipettera upp och ner för att dissociera cellerna. Bukspottkörteln organoids börja optimalt från små grupper om 5-15 celler och därmed partiell dissociation rekommenderas (figur 1).
- Slå samman celler från flera embryon i ett Eppendorf-rör för att minimera skillnader på grund av individuell behandling. Späd cellsuspensionen i kyld Matrigel vid ett 01:03-förhållande. Alikvoter av denna blandning till en 96-brunnsplatta, 8 | il / brunn eller i en platta optimerad för avbildning (se nedan).
- Inkubera plattan vid 37 ° C under 5 min vilket gör Matrigel tjockna. Fyll brunnarna med 70 l av medium val (organoid eller sfär, se Tables 1 och 2) och låt stå i en fuktig miljö innehållande 5% CO2 och 95% luft vid 37 ° C.
- Byt mediet var 4: e dag. Övervaka den växande bukspottskörteln kolonierna dagligen och dokumentera processen med bildbehandling.
- Små molekyler eller proteiner av intresse kan tillsättas till mediet i detta skede för interferens experiment, som tidigare 28 rapporterats.
Tabell 1: organoid medium.
| Namn på material | Stock Koncentration | Koncentration i slutlig mediet | Volym i lager |
| Penicillin-streptomycin | 100% | 1% | 50 | il |
| Knockout Serum Byte (tillägg) | 100% | 10% | 500 | il |
| 2-merkaptoetanol | 14,3 M 0,1 mM | 1 pl | |
| Forbolmyristatacetat (PMA) | 16 | iM | 16 nM | 5 ^ il |
| Y-27.632 (ROCK-hämmare) | 50 mM | 10 | iM | 1 pl |
| EGF | 50 | ig / ml | 25 ng / ml | 2,5 ^ il |
| Rekombinant Humant R-spondin en | 250 | ig / ml | 500 ng / ml | 10 | il |
| - Eller - | |||
| Rekombinant Mouse R-spondin 1 | 250 | ig / ml | 500 ng / ml | 10 | il |
| Recombinant Human FGF1 (aFGF) | 100 | ig / ml | 25 | ig / ml | 1,25 | il |
| Heparin (Liquemin) | 2500 U / ml | 2,5 U / ml | 2 | il |
| Rekomnant Human FGF10 | 100 | ig / ml | 100 ng / ml | 5 ^ il |
| DMEM/F-12 | 4,412.25 ^ il | ||
| Totalt | 5000 | il |
Tabell 2: Sphere medium.
| Namn på material | Stock Koncentration | Koncentration i slutlig mediet | Volym i lager |
| Penicillin-streptomycin | 100% | 1% | 50 | il |
| B27 x50 (tillägg) | 100% | 10% | 100 | il |
| Recombinant Human FGF2 (bFGF) | 100 | ig / ml | 64 ng / ml | 3,2 ^ il |
| Y-27.632 (ROCK-hämmare) | 50 mM | 10 | iM | 1 pl |
| DMEM/F-12 | 4845,8 il | ||
| Totalt | 5000 | il |
3. Avbildning av progressionen av organoid utveckling
- Bild organoids antingen dagligen eller efter tidsförlopp mikroskopi med hjälp av en fluorescerande time-lapse mikroskop. För tids lapse avbildning, använd en XY (Z) automatisk inverterat fluorescensmikroskop.
- Insättning små droppar av 3 pl i 4-brunnar eller glasbottnade plattor fyllda med 2-5 ml medium. Bild med en 10x långväga mål. OBS: Transgena möss som uttrycker fluorescerande spårämnen kan användas. Film 1 visar till exempel den första expansionen av organoids från Pdx1-Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + möss 4. Kärnkrafts GFP möjliggör för användaren att spåra celler som enskilda objekt, men liknande principer kan tillämpas för att spåra celler med membran fluorescens sådansom mT / mg möss 29.
- Starttidsförlopp imaging 3 timmar efter sådd cellerna för att undvika fokus drivor och ställa mjukvaran kontrollerar automatisering för att ta 1 bild / timme för 3 eller fler dagar vid manuellt definierade positioner. För varje läge, skaffa en differential interferens kontrast (DIC) bild samt GFP signalen, rapporterar fluorescerande markör uttryck.
4. Återvinning av organoids för histologi
- Placera 96-brunnar på is och avlägsna mediet och ersätta den med iskall PBS. Detta depolymeriserar delvis Matrigel.
- Aspirera försiktigt varje enskild organoid, ta bort den omgivande Matrigel använda en 1000 l spets för att inte störa den övergripande strukturen. Överför varje organoid till en väl med iskall PBS. Förvara plattan på is. Direkt fixering i Matrigel är också möjligt.
- Fäst organoid i 15 min i 4% paraformaldehyd (PFA), cryopreserve den i sackaros och bädda in den i gelatin. Bearbeta varjeorganoid för kryosektionering och histologi såsom beskrivits tidigare (Johansson et al., 2007) 4.
5. Återvinning av organoids för PCR och biokemi
- Placera 96-brunnar på is och ta bort mediet. Addera 60 pl av RNAlater per brunn för att stabilisera och skydda cellulärt RNA.
- Störa gelen i varje brunn mekaniskt genom att delvis depolymerizing den på is. Antingen återställa enskilda organoids använder en 1.000 l spets för att inte störa den övergripande arkitekturen eller återkräva hela väl (med Matrigel) genom att störa gel mekaniskt med en 200 l spets. Använd en 1000 ul spets att överföra innehållet väl in i en RNAs-fritt icke-klibbig Eppendorf-rör på is.
- Tvätta brunnarna med 60 pl RNAlater och lägga till resterande innehåll till samma Eppendorf-rör.
- Centrifugera rören i 5 min vid 500-1000 x g vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten, bara lämnar 20-30 plav RNAlater i röret tillsammans med pelleten. För biokemi, förvara proverna så torra som möjligt.
- Frys inte prover i RNAlater omedelbart; förvara vid 4 ° CO / N (för att låta RNAlater att grundligt penetrera vävnad). Vävnaden kan lagras vid -20 ° C för långtidslagring och kan senare behandlas för störningar vävnad och utvinning av små mängder av RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E10.5 dorsala bukspottskörteln stamceller dissocierade och heat i 3D Matrigel rekapitulera bukspottkörteln utveckling. Stamceller kan enklast följas med fluorescerande reportrar. I vårt fall använde vi en transgen mus som uttrycker en nukleär GFP protein styrs av Pdx1 promotor (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (film 1) i avsaknad av tamoxifen och därmed utan att aktivera Neurog3 4 (figur 2).
Med organoid medium, en första packning av små kluster av celler som förekommer i de första timmarna. Expansion kan sedan detekteras med utvidgningen av klustren i de första 4 dagarna (Figur 2A). Från dag 5, grenar bildas i de 20% största organoids. Enstaka celler inte expandera och förlora Pdx1 uttryck medan de stora kluster behålla Pdx1 uttryck 28.
Under dessa förhållanden föregångare genomgå en spectacular morfogenes med uppkomsten av grenade epiteliala strukturer. Detta sker först när stamceller är seedade i ≥ 4-celler kluster, vilket tyder på en stark krav för samhällssignaler. Histologisk analys visar att efter dag 7 av kultur, är de resulterande mini-organ som består av pankreasgångare (SOX9 + / HNF1B + / Pdx1 + celler: Figur 3B) och differentierade celler som uttrycker antingen exokrin (Amylas +) eller endokrina (Insulin + eller Glukagon +)-markörer (figur 3A, C). Differentieringen i endokrina celler är lägre än i den endogena bukspottkörteln (omkring 0,1%), men ökas till 1% när FGF1 inte tillsätts till odlingsmediet 28. Anmärkningsvärt, inte bara de seedade stamceller differentieras till de förväntade pankreasutvecklingslinjer, men också spontant anta normal pankreas arkitekturen. Även E10.5 multi bukspottkörteln stamceller är inte polariserad, de celler i kultur polarisera vilket framgår av den segregering av Mucin1 och aPKC i membranet inför den centrala lumen och de organisera sig i en förgrenad rörformat nät. Regionalized "spets-och trunk" domäner framträda: HNF1B + progenitorer och endokrina celler är lokaliserade i den centrala regionen, medan acinarceller är belägna vid periferin som en partiell eller fullständig krona av celler. De organoids kan upprätthållas i odling under 10 dagar; efter denna period, är de i allmänhet förlorar sin arkitektoniska organisation och bli cystisk (ej visad). Passaging kan göras efter partiell dissociation men snabbt leder till cystbildning, ett fenomen som är reducerad genom tillsättning av BMP-inhibitor Noggin 28.
Med sfär mediet, är vanligare expansion och ses från 2% av enskilda celler; icke desto mindre effektiviteten av sfär bildning korrelerar med storleken på seeded kluster 28. På dag 2/3, är en lumen upptäckts i små kluster och expanderar därefter, vilket leder till stor del mono-lager ihåliga kulor med enstaka lokala flerskiktade områden (Figur 2B). Dessa sfärer kollapsar när de hämtas från Matrigel (Figur 3D-H). Under dessa betingelser är de resulterande strukturerna huvudsakligen sammansatt av pankreatiska progenitorceller, med en liten andel av differentierade exokrina och endokrina celler vid dag 7 (figur 3D-H). Stamfäder i sfärerna blir också apikalt polariserade, vilket framgår av segregeringen av aPKC på membranet som vetter den centrala lumen i alla celler (fig. 3F). Pancreatospheres kan passera åtminstone två gånger (icke visat).
Figur 1. Schematisk representation av den procedure. Det gastrointestinala området är inledningsvis dissekeras från embryot och därefter den dorsala pankreas knopp isoleras. Mesenkymet tas bort och de bukspottkörtel stamceller dissocieras använda trypsin. De erhållna partiellt dispergerade cellerna såddes sedan vid låg densitet i tillväxtfaktor-utarmade Matrigel. Skala barer:. 1.00 mm, utom för den resulte organoid bilden där skalan bar är 200 um klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Framsteg av kultur över tiden. (A) Ett litet kluster av pankreas stamceller som odlas med organoid medium och följde med time-lapse mikroskopi från 3 timmar efter plätering, under 60 timmar. I boTTom paneler, en organoid efter 7 dagars odling. Skala bar: 200 nm; gäller alla paneler i A. (B) Exempel på en sfär som följts på en 60 hr tidsförlopp och fångades på dag 7 av kultur. Skala bar: 200 nm; gäller alla paneler i B. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Histologi. (AC) Seriella sektioner av en 7-dagars organoid färgades för progenitor (B - HNF1B) och differentiering (A - amylas, C - insulin) markörer. Den organoid består av epitel (A - E-cadherin) och apikalt polariserad (B - mucin1) celler. Den streckade linjen motsvarar den icke-acinar centrala området (A), därHNF1B (B) och endokrina (C) celler detekteras (DH) Delar av 7-dagars sfärer färgade för stamfader. (G - HNF1B, H - SOX9) och endokrina (D - insulin och glukagon) markörer. De områden består av apikalt polariserad (D, F - aPKC) epitelial (E - E-cadherin) celler. Skala bar:. 50 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Storskalig produktion av funktionella betaceller in vitro är fortfarande ineffektivt 1. I detta utmanande sammanhang, kan utvecklingsbiologiska studier hjälpa dechiffrera de exakta signaler som krävs för differentiering av funktionella betaceller. Detta protokoll möjliggör för underhåll, utbyggnad och differentiering av embryonala pankreas stamceller in vitro. Detta omfattar bildandet av insulinproducerande betaceller som inte samar uttrycka andra endokrina hormoner, har höga nivåer av Pdx1, uttrycker pro-konvertaser som förfaller insulin och har den bearbetade insulin 28. Viktiga nyckelfaktorer inom systemet är aktiviteten hos FGF (exogent stimulerad av lagt FGF förstärkas av heparin) och Notch (endogena) signalvägar, samt ROCK-hämning av Y-27.632: i avsaknad av dessa omständigheter ingen eller mycket begränsat antal organoids och sfärer genererades 28. Kravet på FGF och intech aktivitet är lätt att förstå utifrån deras betydelse för bukspottkörtelutveckling in vivo 28. ROCK-inhibitor kan vara substituerad med blebbistatin, vilket visar att överaktivering av mikrofiladynamik vid dissociation leder till både ökad celldöd, en stark hämning av progenitor transkriptionsfaktör Pdx1 och brist på expansion. Intressant nog har många fler komponenter i organoid mediet visat sig vara för sig onödig, men deras sammanlagda frånvaro resulterade i förlust av epitel förgrening 28. Vid sidan av vissa viktiga komponenter i mediet, är det viktigt att kontrollera nivån av dissociation av progenitorer. Faktum är stamfader spridning och Pdx1 underhåll betydligt främjas i grupper om mer än 4 celler. En packning kan observeras inom de första 12 tim och underlåtenhet att kompakta resultat i underlåtenhet att upprätthålla Pdx1 och expandera. Den ROCK-hämmare är en förutsättning för dettaprocessen.
Vid ögonblicket organoids inte bildar efter FACS-sortering men effektiviteten hos systemet kan potentiellt förbättras genom reaggregating ett kontrollerat antal stamceller. En annan viktig komponent i denna kultur-systemet är det 3D-matrisen. Celler sätta på Matrigel eller i Matrigel för nära botten av plattan spridning och förlora Pdx1 expression. Matrigel ger troligen biokemiska komponenter, särskilt laminin samt mekanisk ledtrådar 28. Faktum är att styvheten hos matrisen spelar en central roll. Stiff hydrogeler inte tillåt för pankreasgångare underhåll och utbyggnad 28 och utspädd Matrigel är inte heller. När Matrigel späds 1:10 bukspottkörteln gångare inte kan odlas.
Den organoid systemet kan användas för att testa effekterna av små molekyler och rekombinanta proteiner på pankreasgångare i fråga om överlevnad, proliferation, differentiering, polarisering och förgrening28. Den kan också användas för att testa samarbetet mellan olika celltyper under bukspottkörteln utveckling 28. Vi är övertygade om att tillgängligheten till bukspottskörteln stamceller också kommer att tillåta genetiska manipulationer, till exempel virus inriktning, som sett i andra organoid system 17,27. Detta kan användas för att screena 17 med ett system som gör det möjligt för morfogenes i motsats till de sfärer som beskrivits tidigare såväl som här 16,17,28. Odlingsbetingelserna vi utvecklade också har fördelen av att vara serumfritt, feeder-fria och saknar mesenkym och blodkärl och därigenom minska den cellulära och biokemiska komplexitet. Emellertid finns det en begränsning i förmågan att passagen de organoids och således för att erhålla stora kvantiteter av progenitorer. Detta skulle kunna kringgå det genom anpassningar av protokollet till senare utvecklingsstadier där stamceller är mer rikligt, källor till pankreas stamceller som framställts av Embryonenic stamceller (ES-celler) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler). Detta banar väg för en 3D-modell av den mänskliga bukspottkörteln utveckling.
Detta system kan också potentiellt användas för produktion av pankreatiska celler i framtiden perspektiv av terapi. I detta sammanhang skulle produktionen av funktionella betaceller för transplantation potentiellt bidra i diabetesbehandling. De anpassningar av systemet till humana ES eller iPS-celler skulle vara viktigt för detta ändamål. Det är fortfarande oklart om organoid eller sfärförhållanden bör användas. De organoid förhållandena tillåter för produktion av celler som har flera egenskaper hos mogna betaceller, men deras funktion återstår att testas. Emellertid är dessa celler finns för närvarande inte många och blandas bland andra celler. Det är också troligt att den tidiga uppkomsten av heterogenitet i organoid systemet leder till okontrollerad signalering mellan celler och är därför skadligt för produktionen.
Than sfär system som bibehåller progenitorer i princip är att föredra för kontrollerad expansion och passage av progenitorer men deras efterföljande differentiering förblir som skall styras. Andra har nyligen producerat pancreatospheres som effektivt kan differentierade. Det är viktigt att jämföra den typ av sfärer som erhållits i det nuvarande protokollet saknar matare och serum till sfärer som erhållits med de andra protokollen 16,17. Ur terapeutisk synvinkel, kan komplexiteten och biologiskt ursprung Matrigel utgör en fråga om reproducerbarhet, hälsa och skalbarhet. Preliminära resultat har visat att mjuka hydrogeler funktionaliserats med laminin är permissiva för bukspottkörtel progenitor expansionen in vitro. Ytterligare optimering krävs eftersom dessa geler är ännu inte så effektiva som Matrigel 28.
Produktionen av betaceller i deras naturliga sammanhang kan också potentiellt vara bra att testa droger som ökar betacellsaktivitet eller öka sin överlevnad eller proliferation men för detta ändamål är det viktigt att först testa mognadsgrad av betacellerna, för att öka effektiviteten i deras differentiering och att pröva om villkoren kultur presenteras här bättre bibehålla holmar än den nuvarande suspensionskulturer. Producera exokrina pankreas kan också vara användbart för att utveckla läkemedel som riktar pankreas cancer och pankreatit. Även här behöver mognadsgrad av exokrina celler producerade för att undersökas grundligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats sekventiellt av en NCCR Frontiers i genetik pilot utmärkelse, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 och Grant 12-126875 från Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Författarna tackar Spagnoli labbet för värd för videoinspelning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock kept at -20 °C |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock kept at 4 °C |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock kept at -20 °C |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock kept at -20 °C. Attention! Stability/source is a frequent source of problems. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock kept at -80 °C |
| Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock kept at -80 °C - do not include to increase beta cell production |
| Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock kept at 4 °C | |
| Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock kept at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock kept at -20 °C |
| B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock kept at -20 °C |
| Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock kept at -80 °C |
| Matrigel | Corning | 356231 | Stock kept at -20 °C |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock kept at 4 °C |
| RNAlater - RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at RT |
| Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Working concentration: 1.25 mg/ml. Stock kept at -20 °C |
| BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines - stock kept at -20 °C |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock kept at -20 °C |
| 60-well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| 95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | |
| Disposal glass micropipettes | Blaubrand | 708745 | |
| Microscope | Cell® imaging station (motorized inverted Olympus IX81 stand) equipped with a Hamamatsu ORCA ER B7W camera and the Ludin Cube and Box. Leica DMI6000 B stand surrounded with a Ludin Cube and Box, equipped with a Leica DFC365 FX camera and the AF6000 Expert/Matrix software command interface. |
||
| Objective | Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X long distance; Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X long distance |
References
- Pagliuca, F. W., Melton, D. A. How to make a functional beta-cell. Development. 140, 2472-2483 (2013).
- Percival, A. C., Slack, J. M. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Attali, M., et al. Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme. Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).
- Johansson, K. A., et al. Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types. Dev Cell. 12, 457-465 (2007).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).
- Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Dev Biol. 4, 242-255 (1962).
- Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development. Development. 125, 1017-1024 (1998).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. , 3979 (2012).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).
- Hope, K., Bhatia, M. Clonal interrogation of stem cells. Nat Methods. 8, 36-40 (2011).
- Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Sugiyama, T., et al. Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. , (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. , (2009).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494, 247-250 (2013).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 10, (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
