Introduction
배아 줄기 (ES) 세포를 포배기 배아 (1)의 내부 세포 덩어리로부터 유도된다. 적절한 배양 조건에서 그들은 자기 갱신과 만능 남아있다. 2006 년 야마나카와 동료들은 성숙한 세포가 전사의 강제 식으로 소위 유도 만능 줄기 (IPS) 세포로 요인을 재 프로그램 될 수 있다는 것을 보여 주었다 월 4, KLF-4, 삭스-2, C-Myc와 (OKSM) 2. IPS 세포는 ES 세포와 같은, 신체의 모든 세포 유형을 야기 할 수 있지만, 그것들은 ES 세포의 3 세대를 둘러싼 윤리적 제약 자유 롭다. 또한, 유도 만능 줄기 세포는 개인 재생 의학의 약속을 수행하고 4,5를 선별 질병 모델링과 같은 애플리케이션을 위해 체외 약물에 엄청난 잠재력을 보유. 이 발휘하기위한 재 프로그래밍 기술을 위하여, 핵 리 프로그래밍의 기본 메커니즘은 완전히 이해 될 필요가있다. 그러나 노력은 프로그램을 다시 두드려 해부하기hway는 세포의 매우 작은 숫자 (0.1 %)을 재 프로그래밍한다는 사실에 의해 방해되어왔다. 성공적으로 재 프로그램 섬유 아세포 리 프로그래밍, 내인성 능성 코어 네트워크 11-14의 활성화의 최종 단계에서 전이 상피 및 간엽에 6-10 포함 이벤트의 고유 일련 겪는 것으로보고되었다. 우리 등 12,13,15-17 최근 내화물 벌크 모집단 드문 중간체의 분리를 허용 세포 표면 마커의 세트를 확인했다. 프로그램을 다시 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)은 2 주 동안 재 프로그래밍 과정 15시 네 - 1.2, Ssea1하고 (다른 사람의 사이에서)는 EpCAM의 표현의 변화를 겪는다. 초기 MEFs의 일부를 재 프로그램하는 동안 섬유 아세포의 정체성 마커 (네 - 1.2)의 발현을 하향 조절 한 다음 만능 관련 마커 SSEA-1 (12)을 표현 시작합니다. 재 프로그래밍 Ssea1 양성 세포의 마지막 단계 동안 reactiv같은 월 4 10-13,15 같은 내인성 만능 유전자를 먹었다. 이 마지막 천이 검출는 EpCAM의 식 (도 1 참조) 또는 후단 PECAM (15)에 의해 세포 표면에 표시된다. 최근 오말리 등 알. 재 프로그래밍 중간체의 식별을위한 네 - 1.2 및 SSEA-1을 대체 또는 보완 등의 CD44와 iCAM1의 사용을보고했다. 우리는 이전에 FACS이 세포 표면 마커 15, 18을 기준으로 0 일, 3 일, 6 일, 9 일 및 12 일 재 프로그래밍 문화 프로그램을 다시 중간체뿐만 아니라에서 설립 된 만능 줄기 세포주를 추출했다. 아래에 설명 된 리 프로그래밍 시스템 및 조건을 위해 우리는 인구가 균일 조용하지만, 확인 된 중간 집단의 이질성 어느 정도의가 있음을 단일 세포 수준에서 나타났습니다. 이들 개체군 내의 셀의 서브 세트는 각각 다음 STA에 진출 할 수 있다는 점에 유의재 프로그래밍 과정의 GE와 광범위 이전에 15,19을 특징으로 한 다른 효율성에서 유도 만능 줄기 세포 식민지에 상승을 제공합니다. 또한, 이러한 인구의 재 프로그래밍 효율은 재 도금과 문화 조건에뿐만 아니라 따라 달라집니다. 실험 재현성을 높이기 위해 우리는 Rosa26 궤적의 제어 및 독시사이클린 반응 촉진제 (20, 21)의 제어하에있는 polycistronic OKSM 카세트에서 transcriptional transactivator로 (m2rtTA)를 표현하기 위해 설계되었습니다 재 프로그래밍 가능한 마우스 변형을 사용합니다. 이 마우스 모델을 사용하여 만능 줄기 세포의 발생, 즉, 숫자와 바이러스 인서트의 삽입 부위의 위치에서 전지 셀과 변동 이종 초기 모집단의 전통적인 방법의 바이러스 성 부작용을 우회. 두 유전자 변형 마우스 변종 (OKSM, m2rtTA), 잭슨 연구소의 동형 접합체 (homozygote) 설립자 동물로 사용할 수는 reprogra를 확립하기 위해 교차되어야한다mmable 마우스 모델 (도 2 참조). 이 논문에서는, MEFs를 유도 만능 줄기 세포를 생성하고, FACS에 의해 변환 과정의 여러 단계에서 리 프로그래밍 중간체를 분리하는 방법에 대해 상세히 설명한다.
Protocol
1 장비 설정 / 시약 준비 / 유전자형
- 만능 줄기 세포 배지를 준비 : 5 ㎖의 비 필수 아미노산, 500 μL의 β 머 캅토 에탄올 75 ml의 소 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖의 L-글루타민으로, 5 × 5 단위 백혈병 억제 인자를 500 ㎖의 넉 아웃 DMEM 매체를 보충 ( LIF). 이 원고의 맥락에서 사용되는 시약은 제품 및 구매 정보 자료 목록을 참조하십시오.
- MEF 매체를 준비 : 50 ML의 FBS, 5 ㎖의 L-글루타민, 5 ㎖의 비 필수 아미노산, 5 피루브산 나트륨, 500 μL의 β-메르 캅토 에탄올과 함께 500 ㎖의 DMEM 미디어 보조 식품.
- 10 ML은 DMSO의 1 ml의 FBS의 9 ml의 결합 : 중간 동결 준비합니다.
- 준비 젤라틴은 요리를 잘 사용하기 전에 적어도 10 분 흡인 실온에서, T75 플라스크에 3 ~ 5 ㎖의 0.1 %, 돼지의 젤라틴 용액을 추가 배양 코팅.
- 10 ML 들어 FBS의 0.1 ml의 PBS의 9.9 ML을 결합 : FACS 라벨 매체를 준비합니다.
- 수행Rosa26 m2rtTA 궤적에 대한 유전자형 PCR은 : 제조업체의 지침에 따라의 Taq DNA 중합 효소와 반응을 수행합니다. 사용 MgCl2를 3.5 mM의 다음과 같은 세 프라이머 -concentration 수정 : oIMR8052 : 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545 : 5'AAA의 GTC의 GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546 : 5'GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. 사이클링 조건 : 3 분 94 ° C; (30 초 동안 94 ° C, 1 분 동안 65 ° C, 1 분 동안 72 ° C)의 35주기; 2 분 동안 72 ° C; 12 ° C에서 개최합니다. 예상 제품 크기 : 야생형 대립 유전자에 대한 650 BP와 돌연변이 대립 유전자 340 bp의.
- 콜라겐 StemCa / OKSM 궤적에 대한 유전자형 PCR를 수행 지침에 따라의 Taq DNA 중합 효소 반응을 수행합니다. 사용 MgCl2를 2.5 mM의 다음과 같은 세 프라이머 -concentration 수정 : COL / FRT-B : 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', COL / frtA1 : 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', COL / frtC1 : 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. 사이클링 조건 : 1 분 동안 95 ° C (30 초 동안 94 ° C, 45 초 동안 70 ° C)의 2주기의 6주기 (30 초 동안 94 ° C, 45 초 동안 68 ° C) 30 회 (20 초 동안 94 ° C, 1 분 동안 60 ° C)의; 5 분 동안 72 ° C; 12 ° C에서 개최합니다. 예상 제품 크기 : 야생형 대립 유전자 331 bp의 돌연변이 대립 유전자 551 bp의.
- 4 ℃에서 3 분 동안 400 XG에서 모든 원심 분리 단계를 수행하십시오.
마우스 배아 섬유 아세포의 2 세대
- m2rtTA 균주의 이성의 일원으로 OKSM 변형의 동물 사이의 시간이 초과 짝짓기를 수행합니다. 어머니 컬링과 자궁 경적을 제거하여 배아 일 13.5에서 수확 배아. 종래 자궁 뿔의 제거에, 미생물 오염을 피하기 위해, 80 % 에탄올 용액으로 복부를 스프레이.
- (무균 인산염 완충 식염수 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 PB를 자궁 뿔을 전송S). (B를도 3a 참조) 한 배아를 포함하는 조각으로 자궁 뿔을 잘라 멸균 수술 등급 가위를 사용합니다.
- 조심스럽게 자궁 봉투 및 각 배아를 둘러싼 여분의 배아 세포막을 제거하기 위해 절개 (이상적으로는 조직 문화 후드 내에 위치) 현미경 및 멸균 집게를 사용합니다. PBS의 10 ㎖로 별도의 10cm 접시에 각각의 배아를 전송합니다.
- 태아의 머리, 사지, 꼬리와 집게로 내부 장기 (심장, 간, 대장 등)을 제거하여 진행합니다 (그림 3C 참조). 1.5 ㎖의 튜브에 태아의 머리를 전송하고, 필요한 경우에는 마스크 유전자형에 사용할 수 있도록 아래로 동결.
- 빈 10cm 접시에 배아의 몸통을 전송하고 2 분 동안 배아를 말하다이 수술 블레이드를 사용합니다. 다진 배아의 상단에 트립신 / EDTA 용액 200 μl를 추가하고 실온에서 3 ~ 5 분 동안 배양한다. , 추가로 2 분 동안 닦지 계속에서에 MEF 미디어 2 ㎖를 추가 트립신을 활성화 한 다음 15 ML 튜브로 전송합니다.
- 더 기계적으로 부드러운 피펫으로 조직을 떼어 놓다 1000 μL 피펫을 사용합니다. 젤라틴 코팅 10cm 접시에 전송하고 MEF 매체의 추가로 10 ML을 추가합니다. , 두 정상 산소 저산소 창업 보육 센터가 문화에 사용할 수 있습니다 자세한 내용은 설명을 참조하십시오합니다.
- 24 ~ 48 시간 후 판은 밀도가 MEFs으로 덮여해야합니다.
- 대안 적으로, 상기 세포는 그 다음 아래로 전파 또는 동결 될 수있다. 세포의 동결 들어, 배양 배지를 제거 PBS 3 ml의 트립신 / EDTA 용액으로 미디어 및 오버레이의 흔적을 제거하기 위해 10 ㎖의 접시를 헹군다. 37 ° C에서 3 ~ 5 분 동안 품어 15 ㎖의 원심 분리 관에 MEF 미디어 및 전송 5 ㎖를 추가하여 트립신 소화를 비활성화. 스핀 다운 및 미디어를 동결 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 3 cryovials에 전송하고 세포 냉동 컨테이너에 아래로 동결.
MEFs의 3 재 프로그래밍
"ove_content> 참고 : 펠렛은 4 ° C에서 5 분 동안 200 XG에 원심 분리하여 세포 리 프로그래밍을위한 정상 산소 조직 문화 인큐베이터를 사용 그것은 파생 저산소 상태 (5 % 산소에서 MEFs을 확장, 자세한 내용은 설명을 참조하기 위해 도움이 될 수 있습니다. ).- 빠르게 물 목욕 (37 ° C)의 낮은 통로 cryovial (P0-P1, 2-3 미오 셀) 해동 및 예열 MEF 매체의 10 ml의 튜브에 내용을 전송합니다. 펠렛 세포는 12 ㎖의 신선한 MEF 매체에 resuspend는 젤라틴 코팅 T75 배양 용기에 전송하고, 세포를 진행하기 전에 24 ~ 48 시간 동안 복구 할 수 있습니다. 참고 : MEFs가 직접 유도 한 후 사용할 수 있습니다.
- 문화 미디어의 제거 후, 트립신 / EDTA 용액 (37 ° C에서 3 ~ 5 분 동안 3 ml)로 중첩에 의해 PBS와 cellularize와 MEFs을 씻는다. MEF 매체 5 ㎖를 첨가하여 켄 칭하고 트립신 및 추가 10 ㎖ 피펫으로 부드러운 혼합하여 세포를 해리. 혈구를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
- reprogra 들어mming 실험, 6.7 × 103 세포 / cm 2의 밀도에서 젤라틴 코팅 T75 플라스크 위에 씨앗 MEFs (~ 플라스크 당 0.5 미오 셀) 2 μg / ml의 독시 싸이클린을 포함 IPSC 미디어에서. 각 시점에 대한 주위 미오 리 프로그래밍이 중간체를 수득 표 1에 관한 시딩 추천 정보를 참조. 주 : 리 프로그래밍은 독시사이클린 (2 μg / ㎖)의 첨가로 개시 매체를 보충
- 첫번째 육일 미디어를 대체 들어 신선한 독시사이클린 (doxycycline)와 다른 모든 일이 IPSC 미디어 (T75 플라스크 당 미디어의 12 ml)에 보충. 높은 셀 번호가 있으면이 시점 이후 매일 갱신 매체. 미디어 변경 할수마다 다른 일을 수행 할 수 있는지 배양 부피를 두배.
- 필요한 시점에서 수확 리 프로그래밍 중간체 : 위해 (3 ml의 PBS의 적절한 음량 (T75 플라스크에 10 ㎖)으로 세척하고 트립신-EDTA 용액으로 중첩 매체를 제거하여 (제안 일 3, 6, 9, 12) T75 플라스크). 품다37 ° C에서 3 ~ 5 분 동안 부드러운 피펫 다음 IPSC 미디어 5 ㎖를 추가하여 해소.
- 원심 분리에 의해 혈구 세포와 서스펜션 (상기 참조), 펠렛 카운트 트립신의 흔적을 제거하는 PBS 10 ㎖에 재현 탁하고 세포 상등액을 흡인. 다시 한번 펠렛은 세포 흡인 뜨는 및 재 프로그래밍 중간체를 분리하는 단계 4.1를 진행합니다. 주 : 리 프로그래밍을받은 세포는 냉동 보존 및 이후 단계에서 FACS 격리를위한 해동 할 수있다.
- 완전히 재 프로그래밍 만능 문화를 확립하기 위해, 더 4~7일에 DOX없는 IPSC 미디어에서 세포를 성장. 참고 : 성공적으로 재 프로그램 배양 12 일에 의해 콜로니를 다수 포함하고 (도 4 참조). 이 시간 동안 계속 OKSM 표현을 필요로 탈선 만능 줄기 세포가 사라집니다.
- 초기에 15 × 103 세포 / cm 2의 밀도로 조사 MEFs를 시드 : 대안 적으로, 나머지 완전히 재 프로그래밍 만능 배양을 전파
- 다음으로, 트립신-EDTA 용액 3 ㎖의 중첩 및 37 ° C에서 3 ~ 5 분 동안 배양, PBS 10 mL로 T75 플라스크를 세척, 미디어를 제거하여 cellularize 만능 줄기 세포 배양. 부드러운 혼합 한 다음 IPSC 미디어 5 ㎖를 추가하여 트립신을 끄다 15 ML 원뿔 튜브로 전송, 스핀 다운 한 다음 10 ㎖의 만능 줄기 미디어에 재현 탁.
- 조사 MEFs (T75 플라스크)에이 세포 현탁액 500 μl를 전송하고 문화 4 ~ 5 일 동안 성장 할 수 있습니다. 주 : 설립 만능 문화가 냉동 보관 또는 실험에 사용 할 수 있습니다. 클론 세포주 해부 현미경 (22)에서 개별 IPSC의 식민지를 선택하여 유도 될 수있다.
- MEFs 2.8에 설명 된 곳을 알아내는이 합류 IPSC 문화를 보존 할 수 있습니다.
(4) 항체 라벨링
- 에, 3 장에서 제조 된 프로그램을 다시 문화의 재현 탁 세포 펠렛,항체 보충 FACS 라벨 용지 (1 안티 네 - 1.2 태평양 파랑 : 400, 항 SSEA-1 비오틴 1 : 400 및 안티는 EpCAM FITC 1 : 400). 5000000 세포 당 보충 라벨 믹스 200 μl를 사용하여 얼음에 품어.
- 10 분 후 부드럽게 얼음에 추가로 10 분 동안 세포를 재현 탁하고 배양 할 수있는 튜브를 누릅니다. 튜브 당 차가운 PBS의 10 ML을 추가하고 스핀 다운.
- 5000000 세포 당 각 튜브 (200 일) 1 ㎕의 스트렙 타비 딘-PeCy7 보충 라벨 용지 200 μl를 준비 스테인드합니다. 세포 펠렛되면, 조심스럽게 스트렙 타비 딘-PeCy7 보충 라벨 미디어의 적절한 볼륨에 뜨는에 resuspend을 대기음.
- , 재현 탁 얼음에 또 다른 10 분 동안 품어, 튜브 당 차가운 PBS 10 ㎖를 추가, 스핀 다운 및 흡인 뜨는 살짝 눌러 10 분 동안 얼음에 세포를 보관하십시오.
- 라벨 매체에 재현 탁 된 세포 펠렛은 약 1 × 10 7 세포 / ml에서 요오드화 프로피 듐 (PI) (2 μg / ml)로 보충. 70 μm의 여과기를 통해 서스펜션을 전달하여 세포 덩어리를 제거합니다. 적절한 FACS 튜브에 세포를 전송하고 얼음에 보관하십시오.
- 개별 항체를 개별의 샘플을 준비합니다 (안티 - 네 - 1.2, 항 SSEA-1 및 안티는 EpCAM). NOTE : 이러한 분석에 사용되는 세 개의 채널의 색상 보정을 수행하기 위해 요구된다. 또한, 레이블이없는 세포를 정렬하는 전압과 게이트를 설정하는 데 필요합니다. 이상적으로 유도 만능 줄기 세포는 보상을 위해 사용됩니다 조사 MEFs에서 유지 관리 0.5 × 10 6 만능 줄기 세포의 주식은 액체 질소에 cryovials에 저장됩니다. MEFs의 존재는 네 - 1.2 채널 신호를 얻기 위해 필수적이다.
- MEFs (섹션 3)에 대하여 기술 된 바와 같이 유도 만능 줄기 세포의 cryovial을 해동. 원심 분리 후, 라벨 버퍼 800 μL이 샘플 200 μL에 재현 탁 세포는 레이블이없는 컨트롤로 따로 설정되어 있습니다.
- 보상 컨트롤로 남아있는 세포를 사용합니다. 세 15 ML 튜브 및 추가 항체 사이 나누기 세포퍼시픽 블루 보상 제어가 : 안티 - 네 - 1.2 퍼시픽 블루 항체의 0.5 μl를 추가 다음과 같은. FITC 보상 관 : 안티는 EpCAM-FITC 항체의 0.5 μl를 추가합니다. PE-Cy7 보상 제어 : SSEA-1 항 - 비오틴 항체 0.5 μL.
- 10 분 동안 얼음에 세포 항체 샘플을 계속 눌러 혼합하고 얼음에 10 분 동안 배양한다.
- 10 ㎖의 차가운 PBS로 세척 샘플은, 언 바운드 항체를 제거 아래로 세포를 스핀 뜨는을 대기음합니다. FACS 라벨 용지를 200 μL에 재현 탁 세포 펠렛.
- 안티-SSEA-1-비오틴 표지 된 시료를 들어, 스트렙 타비 딘-PeCy7 접합체 (200 ㎕를 세포 당 1 μL)을 추가한다. 라벨 세포로서 일차 항체 (SSEA-1-비오틴)에 대해 설명했다.
- 70 μm의 여과기를 통해 레이블이없는 컨트롤을 포함하여 모든 샘플을 전달하고 PI (2 μg / ㎖)를 추가합니다. FACS 튜브에 세포를 전송하고 필요한 때까지 얼음에 보관하십시오.
중간체의 5 FACS 격리
참고 :세포는 405 nm의, 488 nm에서 560 nm의 여기 레이저와 100 μm의 노즐 형광 활성 세포 분류기를 사용하여 분류되어 있습니다.
- 세포군 적절히 시각화되도록 전방 및 측면 스 캐터에 설정된 전압. 파편을 제외도 5a에 표시된 세포 주위에 게이트를 그립니다. 참고 : 셀 소터에 전압의 올바른 셋업이 복잡하고 숙련 된 FACS 연산자를 필요로 할 수 있습니다.
- FSC 영역 대를 사용하여 앞으로 분산 형 (FSC) 높이 집계 (그림 5B)를 제외한다.
- PI 부정적인 살아있는 세포 (그림 5C)에 게이트에 FSC 대 PI 채널을 시각화.
- PB, FITC / GFP, PE-Cy7의 형광 채널의 전압을 조정하는 레이블이없는 세포를 사용합니다. 이상적으로, 각 채널의 하단부에 세포군 위치.
- 하위 부분 재 프로그래밍 숭배 그림 6A, B에서와 같이 레이블이없는 대조군 세포와 게이트를 설정일 3, 6에을 마련해 9 인구 : SSEA-1 / 네 - 1.2 + 세포; SSEA-1 / 네 - 1.2 ~ 세포; 및 리 프로그래밍이 SSEA-1 + / - 1.2 ~ 네 셀 중간체.
- 또한 9 일 SSEA-1을 분할 + / - 1.2 ~ 네 부분 FITC 오점 대 PE-Cy7을 사용하여; SSE-A1 + /는 EpCAM + 세포와 SSEA-1 + / Epcam- 세포 주위에 게이트를 그립니다. 그림 6C, D와 같이 레이블이없는 대조군 세포와 게이트를 설정합니다.
- 원하는 부분 집단을 (MEFs에 대한 대표 FACS 프로필, 3 일 / 6 일 / 9 일 / 일 12 문화와 유도 만능 줄기 세포에 대한 그림 7 참조) 정렬 전에 만능 줄기 세포 미디어 (1-2 mL)로 적절한 수집 튜브를 미리 기입.
- FACS 정렬 프로토콜을 제조에 따라 수행합니다.
- FACS 분리 한 후 분자 프로파일 링 (RNA / 단백질 추출, 크로 마틴 면역 침강, DNA의 methylome 분석 등)에 세포를 제출합니다. 대안 적으로, 다양한 세포 분획을 배양 할 수있다.
Representative Results
E13.5 마우스 태아의 박리, 세분화 및 도금 후 10cm 접시 약 1~2일 포화 상태에 도달 할 것으로 예상된다. 문화가 제대로 cellularized되지 않은 조직의 일부 부착 조각을 포함하는이 단계에서, 그것은 정상입니다. 이러한 계대 후 사라집니다.
독시 싸이클린 유도되면, 재 프로그래밍 MEFs는 별개의 형태 학적 변화를 겪는다. 일 6 주위에, 초기 식민지 같은 패치 (그림 4C)를 등장하기 시작해야한다. 이들은 또한 문화에 따라 크기가 계속 증가 할 것이다 (그림 4D, E 참조). 좋은 프로그램을 다시 실험은 처음에 5 × 10 5 세포 (그림 4E) 글로리 T75 500>에서 식민지를 발생한다. 설립 만능 문화 특성 돔 모양의 식민지를 소유하고 대부분은 분화 된 세포 (그림 4 층)의 결여해야한다. 유도 만능 줄기 cultu의 경우에 추가 계대입술은 미분화 / 부분적으로 재 프로그램 세포를 제거해야 할 수 있습니다; 세포의 합류 플라스크 조사 MEFs의 피더 레이어 상 1:10 비율로 분할 될 수있다.
전술 한 바와 같이, 재 프로그래밍 동안 형태 학적 및 분자 변화는 네-1.2, SSEA-1, 궁극적으로는 EpCAM (도 7A-F 참조) FACS 프로필의 변화에 의해 반영된다. MEFs가 네 - 1.2 주로 긍정적 인 다른 마커에 대한 부정적인 반면, 이전에 12,15 보도 된 바와 같이, 3 일 문화는 이미 크게 다를. 세포의 큰 비율은 네-1.2의 표현이 네 - 1.2 음성 세포의 아주 작은 부분 집합 SSEA-1,이 시점에 대한 중간 실제 재 프로그래밍 양성되고있다을 통제하기 시작했다. 일에서 3 문화를 추출 할 수 있습니다 재 프로그래밍 중간체의 수의 비율이 매우 예측할 수 SSEA-1 + / 네 - 1.2 ~ 일반적으로 viabl 1-10 % 사이의 범위에있다전자 셀. 6 및 9 일간 SSEA-1 + 세포의 증가 된 백분율에서, 보통 10 % 이상으로 잘 검출 할 수있다. 일 12도는 EpCAM 양성 라벨을 감지 할 수 SSEA-1 양성 세포의 부분 집합 주위. 가변적이며 대개 모든 생균만을 2~4%의 범위에 빠진다 SSEA-1.2 + /는 EpCAM + 세포의 비율로 12 일째 배양, 3 일 배양 같이, 중간체의 정제에 병목 현상을 나타낸다. 표 1에 제시된 리 프로그래밍 중간체 예상 수가 단지 거친 근사치로서 기능한다. 설립 선의의 유도 만능 줄기 세포 배양은 SSEA-1과는 EpCAM 강력하게 긍정적 인 것입니다.
재 프로그래밍 경로 동안 그림 1 표면 마커의 변화 : 섬유 아세포의 정체성 마커 네-1.2의 다운 규제의 업 규정에 의해 다음에SSEA-1. 능성 상태를 향해 SSEA-1 양성 세포의 부분 집합의 전환은 하루 12 주위는 EpCAM의 인수로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 재 프로그래밍 마우스 모델의 도식 표현은 :. m2rtTA 표현이 재하 활성 Rosa26 궤적의 제어하에 독시사이클린 (doxycycline)의 존재에서 (DOX)가 m2rtTA 단백질은 콜라겐 1A1에서 테트라 사이클린 의존성 프로모터 (tetOP)에 결합 (Col1a1) 네 가지 요인 카세트의 발현을 초래 궤적. 두 개의 시스 트론 카세트는 내부 리보솜 항목 사이트 (IRES)에 의해 연결되어있다. 월 4 / KLF-4와 삭스-2 / C-Myc와 오픈 읽기 프레임 푸 아르 자기 절단 F2A 및 E2A 시퀀스가 나오지였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 배아 해부 : 10 ml의 PBS와 (B)로 채워진 10cm 접시에 (A) 전송 자궁 뿔은 한 배아를 포함하는 조각으로 잘라. (C) 집게 추가 배아 조직에서 배아를 해제하고 머리, 사지, 꼬리와 내장을 제거 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 리 프로그래밍 동안 4 형태 학적 변화. 식민지 같은 패치 이후 일 6에서 문화 명백해질. 타고난 iPSCs는 돔 모양의 형태를 특징으로한다. (A)의 날 0 / MEFs, (B) 3 일, (C) 6 일, (D)의 날 (9), (E)의 날 (12), (F)는 세포 배양을 유도 만능 줄기. 스케일 바 :. 200 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 기본 FACS 설정은. (A) 앞으로 분산 형 지역 오점 대 사이드 분산과 파편을 제외합니다. (B)앞으로 분산 높은 오점 대 앞으로 분산 형 지역 단일 세포 인구에 게이팅에 의해 비 파편에서 집계를 제외합니다. (C). 얼룩 앞으로 분산 형 지역 대 PI 채널과 PI 낮은 사건에 게이팅에 의해 단일 세포 인구에서 죽은 세포를 제외 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 게이팅. 네 - 1.2 + / SSEA-1 세포, 네 - 1.2 ~ / SSEA-1 세포에 대한 게이트를 설정 레이블이없는 대조군 세포를 사용하여 (A, B) 네 - 1.2 ~ / SSEA-1 + 세포. (C)는 EpCAM 긍정적는 EpCAM 부정적인 세포 게이트를 설정하는 레이블이없는 대조군 세포를 사용합니다. + / - 1.2 ~ 네 세포를 분리 할 수 SSEA-1 (D)긍정적는 EpCAM 부정적인 인구로는 EpCAM로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 네 - 1.2 재 프로그래밍 과정의 여러 단계에서 SSEA-1 FACS의 말 대. (A)의 날 0 / MEFs, (B) 3 일, (C) 6 일, (D)의 날 (9), (E)의 날 12 (F) 만능 줄기 세포 배양.
표 1은 OKSM 및 m2rtTA에 대한 배아 이형의 P1 MEFs에 파종 밀도, 플라스크 번호와 예상 결과를 제시했다. 시간을 클릭 해주세요감수는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
| 일 | T75 플라스크의 수 일 0에 시드 | FACS 후 Ssea1 + 세포의 총 수 | FACS 후 Ssea1 + /는 EpCAM + 세포의 총 수 |
| 3 | 8 | 2000000 | |
| 6 | 4 | 2000000 | |
| 9 | 4 | 2000000 | |
| 12 | 10 | 10000000 | 2000000 |
Discussion
성공적 IPS 세포로 재 프로그램 MEFs 높은 양으로 재 프로그래밍 중간체를 정제하기 위하여는 전체 효율에 영향을 미치는 요인을 인식하는 것이 필수적이다. 특히, FBS의 배치 해로운 영향을 미칠 수 만능 용지를 보충하기 위해 사용된다. 일반적으로 긍정적 인 경험에서 배아 줄기 (ES) 세포 자격을 갖춘 FBS하지만 싼 대안을 식별 할 수 다양한 공급 업체에서 혈청의 배치 테스트를 하였다.
재 프로그래밍 효율에 미치는 영향은 MEFs 15,20의 유전자형 또 다른 요인. OKSM 및 재 프로그램 할 m2rtTA 궤적, homozygousity 일에서 이상 재 프로그래밍 효율성의 두 궤적 결과 모두 쥐 이형 (HET)에서 파생 된 MEFs 있지만. 헤트 / 헤트 <호모 / 헤트 <헤트 / 호모 <호모 / : 사실, OKSM 및 m2rtTA 십자가의 자손에서 유래 MEFs는 다음과 같은 순서 (OKSM / m2rtTA)에서 재 프로그래밍 효율의 증가를 보여호모 (표 1에 주어진 번호는 노한 / HET 동물 바랍니다 참고). 남성 호모 / 호모 동물이 확인 된 드문 경우에, 여러 m2rtTA 암컷과 짝짓기 하렘은 설정할 수 있습니다. 이 십자가의 모든 자손이 각각 OKSM / m2rtTA 궤적에 대한 / 호모 HET됩니다. 번식 젊은 쥐 (생후 6~15주)를 사용할 때 더 큰 새끼를 얻을대로 또한, 새끼의 급속한 유전자형을 권장합니다.
또한, 재 프로그래밍에 대한 낮은 통로 MEFs의 사용은 23를 강조한다. MEFs가 정상 산소 조직 문화 인큐베이터에서 파생 된 확장한다면 우리는 강력하게 만 그러나 통로 (2)에이 세포를 사용하는 것이 좋습니다, 실험자 MEFs의 유도 및 확장을위한 저산소 배양기에 대한 액세스를 (5 % 산소)가있는 경우, 여전히 양호한 결과를 수득한다 (23) 3만큼 높은 통로 번호.
경우 실험자들은 재 프로그래밍과 관련된 문제가 발생, 설명한 바와 같이, 대부분의 설명은 DOX 첨가 부정확 쥐 유전자형 또는 만능 줄기 세포 생성에 도움이되는 없습니다 FBS의 사용시의 높은 통로 번호이다. 그러나 드문 경우에 우리는 MEFs도 이상적인 조건에서 재 프로그램 할 수 없었던 것을 관찰했다. 이 경우 m2rtTA의 오픈 리딩 프레임 내에서 자연 드 노보 삭제 근본적인 이유 확인되었다.
이 방법론은 성공적으로 자기 세포 분리 (MACS)를 통해 SSEA-1 + 중간체를 추출하도록 하였다. MACS를 사용에서 클리어 시간 이점이있다, 그러나, SSEA-1 + 세포 집단 '순도 세포 포즈 수도 향하는 실험의 종류에 따라 80~90%보다는 95 % 이상으로 감소된다 문제. 따라서, 옵션 SSEA-1 + / +는 EpCAM 및 SSEA-1 + / Epcam- 세포로 순도 및 / 또는 분획을 늘릴 FACS이어서 SSEA-1 + 세포 풍부 MACS를 사용하는 것이다.
설명 된 프로토콜과 마우스 모델에 의해 생성 IPS 세포가 다 능성하고 효과적으로 키메라 동물 15,20 모든 조직에 기여할 도시되었지만 "> 완전히 배체 보완 통해 이들 만능 줄기 세포로 구성 배아를 생산 감소 용량왔다 24를 보여 주었다. DLK-DIO3 유전자 클러스터에서의 비정상적 메틸화 패턴 근본적인 원인 24로 확인되었다. 그러나, 리 프로그래밍 동안 미디어에 50 μg / ml의 농도로 아스코르브 산의 첨가를 배체 보완 유능한 IPS 세포 (24)를 생산한다. 대안으로 재기록 가능한 마우스 모델에서도 아스코르브 산 처리 (25)의 부재하에 배체 유능한 만능 줄기 세포를 제조 할 수있는 다른 화학 양론에 리 프로그래밍 인자를 발현하도록 조작 된 것을 알려드립니다. 그러나 우리 손 세포에서 상당히 낮은 주파수를 비교하여이 균주 다시 프로그래밍에서 본원에 사용 된 마우스 모드리터.이 논문에 기재된 방법은, 모집단의 내화물 벌크로부터 리 프로그래밍 중간체의 분리를 허용하고 예를 해부 프로파일 링 unfractioned 인구를 사용할 필요없이 이전의 한계를 제거, 재 프로그래밍 과정을 이해하기 위해 유용한 도구 (것처럼 보여야 내화성 셀로부터 하이 신호 노이즈). 본원에 기재된 항체의 조합은 그러나 추가적인 세포 표면 마커는 더 높은 순도 중간체를 수득 할 수 앞으로 발견 될 가능성이 높은 순도 마우스 세포에서 중간체의 분리를 허용한다. SSEA-1의 발현은 인간의 유도 만능 줄기 세포의 특징되지 않고,이 프로토콜로 인간 기원의 세포를 재 프로그래밍에 사용할 수 없음을 유의하시기 바랍니다. 결론적으로, 한 번 설명한 방법과 격리 재 프로그래밍 중간체 발현 profilin 포함한 분자 분석을 위해 사용될 수있다g, 크로 마틴 면역 침강, methylome 분석, 단백질 분석.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 모나 쉬 Larkins 프로그램에서뿐만 아니라 NHMRC CDF와 NHMRC 프로젝트 기금에서 재정 지원을 인정하고 싶습니다. 또한, 우리는 비디오를 생산하는 그들의 도움에 대한 그녀의 지원 (특히 아담 Dinsdale에서) 모나 쉬 Flowcore 팀에 대 한 그녀의 건설적인 제안 에드 위나 McGlinn를 슈 메이 임에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue | eBioscience | 48-0902-82 | |
| Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin | eBioscience | 13-8813 | |
| Streptavidin PE-Cy 7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc | eBioscience | 48-5791-82 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10439024 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-070 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Propidium Iodide solution (PI) | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Gelatine from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Doxycyclin hyclate | Sigma-Aldrich | 33429-100MG-R | |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | ESG1107 | |
| DMEM High Glucose | Life Technologies | 11960-044 | |
| DPBS (Dulbecco's phosphate buffer saline) | Life Technologies | 14190-144 | |
| KnockOut DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Irradiated MEFs | Life Technologies | S1520-100 | |
| 75-cm2 Tissue culture flasks | Corning/BD Bioscience | 430641 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Corning/BD Bioscience | 430829 | |
| Disposable surgical blades | Clifford Hallam | SM0501 | |
| Cryogenic vials | Corning/BD Bioscience | 430487 | |
| 70 µm Cell strainer | BD Bioscience | 352340 | |
| Taq DNA Polymerase | Life Technologies | 10342-020 |
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