Summary
وتستخدم على نطاق واسع نماذج مختلفة من الفئران وسط انسداد الشريان الدماغي (MCAO) في أبحاث الدماغ التجريبية. هنا، علينا أن نظهر نموذج عبر الجمجمة دائمة القاصي MCAO التي تنتج احتشاء القشرية ثابت من حجم الموافق الضرر الذي تفرضه غالبية السكتات الدماغية الإقفارية الإنسان.
Abstract
السكتة الدماغية هي ثالث سبب الأكثر شيوعا للوفاة والسبب الرئيسي في العجز المكتسب البالغين في البلدان المتقدمة. تتوفر لنسبة ضئيلة من مرضى السكتة الدماغية في المرحلة الحادة الخيارات العلاجية محدودة جدا فقط. البحوث الحالية هو البحث بشكل مكثف لوضع استراتيجيات علاجية جديدة وتركز بشكل متزايد على مرحلة شبه الحادة والمزمنة بعد السكتة الدماغية لأن أكثر المرضى قد تكون مؤهلة للحصول على التدخلات العلاجية في نافذة الوقت لفترة طويلة. وتشمل هذه الآليات تأخر مسارات الفيزيولوجية المرضية الهامة مثل التهاب آخر السكتة الدماغية، الأوعية الدموية، اللدونة العصبية والتجدد. من أجل تحليل هذه الآليات وتقييم الأهداف في وقت لاحق المخدرات الرواية، وسعى نماذج السكتة الدماغية التجريبية مع أهمية سريرية، ووفيات منخفضة واستنساخ عالية بعد. وعلاوة على ذلك، والفئران هي أصغر الثدييات التي آفة السكتة الدماغية التنسيق يمكن أن يتسبب والتي طائفة واسعة من النماذج المعدلة وراثيا هيالمتاحة. لذلك، نحن هنا وصف نموذج الفأر من الجمجمة، تخثر الدائمين في الشريان الدماغي الأوسط عبر الكهربي القاصي الشرايين lenticulostriatal، ما يسمى ب "نموذج التخثر". يقع احتشاء مما أدى إلى هذا النموذج أساسا في القشرة؛ حجم احتشاء نسبي في ما يتعلق بحجم الدماغ يتوافق مع غالبية السكتات الدماغية البشرية. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج يفي المعايير المذكورة أعلاه لاستنساخ وفيات منخفضة. في هذا الفيديو ونحن لشرح الطرق الجراحية من السكتة الدماغية الاستقراء في "نموذج التخثر" والإبلاغ أدوات التحليل النسيجي والوظيفي.
Introduction
السكتة الدماغية هي ثالث سبب الأكثر شيوعا للوفاة واحد من الأسباب الرئيسية المكتسبة الإعاقة البالغين في الدول المتقدمة 1. ويتسبب حوالي 80٪ من هذا المرض العصبية الحادة عن نقص التروية الدماغية الناتجة عن انسداد تدفق الدم الدماغي بينما تسبب حوالي 15٪ من قبل نزيف داخل المخ 2. على الرغم من البحوث الجارية، الوريد من الأنسجة منشط البلازمينوجين هو العلاج الدوائي الوحيد المعتمد للسكتة الدماغية الإقفارية حتى الآن ومتاحة فقط لأقلية من مرضى السكتة الدماغية بسبب نافذة زمنية قصيرة وافقت من 4.5 ساعة بعد ظهور السكتة الدماغية 3،4. كما لا توجد في المختبر النماذج التي يمكن نموذج صحيح التفاعلات المعقدة بين الدماغ، الأوعية الدموية والآليات الفيزيولوجية المرضية النظامية أثناء السكتة الدماغية، والنماذج الحيوانية ضرورية لإجراء البحوث قبل السريرية السكتة الدماغية.
لذا، وضعت عدة نماذج السكتة الدماغية في فاريإيتي الأنواع. واحد من النماذج السكتة الدماغية الأكثر شيوعا هو "نموذج خيوط" حيث يتم إدخال خيوط الدرز عابر في الشريان السباتي الداخلي وتوجيهها حتى occludes غيض أصل الشريان الدماغي الأوسط (MCA)، مما أدى إلى توقف تدفق الدم واحتشاء الدماغ اللاحقة أيضا المناطق تحت القشرية القشرية وفي حالة انسداد طويلة 5،6. في نماذج photothrombotic من السكتة الدماغية، يتم التوصل إلى انسداد الضوئية للسفينة القشرية المشع بعد حقن الضيائي مما أدى إلى آفات صغيرة مقيدة محليا 7. لا يمكن أن يتحقق انسداد دائم في القاصي MCA الشرايين lenticulostriatal قبل ربط الشريان، وضغط لعابرة أو دائمة 8،9 التخثر. واحتشاء مما أدى إلى هذا النموذج في الغالب يؤثر على القشرة المخية الحديثة 10 لأن انسداد MCA في هذا النموذج هو القاصي إلى lenticulostriatal الشرايين، التي تزود العقد القاعدية.
لأن غالبية من الآفات السكتة الدماغية الإنسان تقع في إقليم الشريان الدماغي الأوسط، كل من نماذج السكتة الدماغية شيوعا تشبه انسداد للMCA أو أحد فروعها 11. وMCA هو واحد من الشرايين الرئيسية التي توفر إمدادات الدم إلى الدماغ؛ فإنه ينشأ من الشريان السباتي الداخلي، والطرق على طول التلم الوحشي حيث ثم الفروع والمشاريع إلى العقد القاعدية والسطوح الجانبية للالجبهي، الجداري والفص الصدغي، بما في ذلك المحرك الأساسي والقشرة الحسية. ترتبط اليمين واليسار MCA إلى الشرايين الدماغية الأمامية والخلفية التواصل الشرايين، والتي تتصل الشرايين المخية الخلفية، وخلق دائرة ويليس (الشكل 1).
كما سبق وذكرت من قبل كارمايكل وآخرون 11، على غرار عوائق من قبل القاصي الدماغي الأوسط في ArTERY انسداد (MCAO) نموذج في الفئران تشمل حوالي 10-15٪ من نصف الكرة الأرضية، وبالتالي محاكاة أغلبية الآفات السكتة الدماغية الإنسان التي تقع في إقليم القشرية MCA 11،12. في عام 1981، تامورا وآخرون وصفت دائمة، عبر الجمجمة MCAO نموذج تجلط الدم في الفئران 8. ومع ذلك، فإن النموذج صفها تامورا ينطوي على انسداد القريبة من MCA من أجل الالتفاف على التشعب أكثر القاصي من الشريان. وبالتالي، الأصلي "نموذج تامورا" يحرض الآفات القشرية ولكن أيضا ليس فقط الجسم المخطط، على غرار الآفات التي حصلت عليها "نموذج خيوط" 6. هنا، نحن تصف نموذج MCAO القاصي دائمة بحلول الكهربي عبر الجمجمة في الفئران. بالإضافة إلى ذلك، ونحن التقرير النسيجية ذات الصلة والأساليب الفنية لتحليل نتائج السكتة الدماغية في هذا النموذج. وتستند جميع الأساليب على إجراءات التشغيل الموحدة المتقدمة والمستخدمة في مختبراتنا.
Protocol
بيان الأخلاق
وأجريت التجارب ورد في هذا الفيديو وفقا لمبادئ توجيهية وطنية لاستخدام حيوانات التجارب والبروتوكولات وتمت الموافقة من قبل اللجان الحكومية الألمانية (Regierung فون Oberbayern، ميونيخ، ألمانيا). وتستخدم 10 أسبوع من العمر، والفئران C57BL/6J الذكور في هذه الدراسة. وتم إيواء الحيوانات تحت درجة حرارة للرقابة (22 ± 2 درجة مئوية)، مع ضوء الظلام دورة فترة 12 ساعة والحصول على الغذاء مكعبات وبالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية المياه موصوفة. تسكين وتخدير البروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة الحكومية المحلية ولكن قد تختلف من البروتوكولات المستخدمة في المختبرات الأخرى.
1. إعداد المواد والأدوات
- ربط بطانية الحرارة من أجل الحفاظ على المنطقة الدافئة العملية والحفاظ على درجة حرارة الجسم الماوس أثناء التخدير (37 درجة مئوية).
- مقص إعداد تعقيمها، ملقط والأقطان، dexpanthإينول العين مرهم ومواد خياطة الجروح. تحضير حقنة مع محلول ملحي (بدون إبرة) للحفاظ على منطقة العملية رطب. تحضير غاز التخدير (70٪ N 2 O + 30٪ O 2 + isoflurane و).
- حقن المسكنات الغشاء البريتونى: Metamizol 200 ملغم / كغم، كاربروفين 4 ملغ / كغ وBuprenorphin 0.1 ملغم / كغم.
- ضع الماوس في غرفة الاستقراء مع معدل التدفق isoflurane وبنسبة 4٪ لتخدير حتى حركة عفوية من الجسم وvibrissae توقف.
- نقل الماوس في الموقف الجانبي مع أنفها في قناع التخدير والحفاظ على تركيز isoflurane وبنسبة 4٪ لحوالي دقيقة أخرى، ثم خفض وذلك في approx.1.5٪ للحفاظ على التخدير المناسبة.
- تطبيق ديكسبانتينول مرهم العين في كلتا العينين.
2. القاصي MCAO النموذجي
- جعل شق الجلد 1 سم بين الأذن والعين باستخدام مقص العملية قليلا بعد إعداد aseptical لموقع النقيب الجراحيةز الجلد مطهر.
- فصل الجلد وتوطين عضلة الصدغي.
- حدد في مولد تردد عال وظيفة تجلط الدم، ووضع القطبين، حدد 12 W وربط الكهربي ملقط مع كابل.
- إضافة قطرة من المياه المالحة واستخدام ملقط لفصل العضلات الصدغي من الجمجمة في الجزء القمي والظهرية، وبالتالي، مما يجعل رفرف العضلات دون إزالة تماما العضلات.
- تحديد MCA تحت الجمجمة شفافة، في جزء منقاري من المنطقة الزمنية، الظهرية إلى الجيوب الرجعية المدارية (الشكل 2A). إذا التشعب MCA غير مرئية (بسبب الاختلاف الطبيعي التشريحية) تحديد السفينة الأكثر منقاري.
- إضافة بعض المالحة على الجمجمة ورقيقة من العظم مع الحفر الحق فوق فرع مولودية الجزائر حتى لديه نسيج رقيقة وشفافة (الشكل 2B).
- سحب بعناية العظم فوق الشريان مع ملقط رقيقة جدا.
- تحديد وضع ثنائي القطب الأولن المولد عالية التردد في 7 دبليو تخثر الشريان مع ملقط الكهربي الداني القاصي وإلى التشعب (الشكل 2C). عندما التشعب غير مرئية بسبب متغير التشريحية، تخثر فرع MCA حددت بشكل صحيح (انظر أعلاه) في موقعين تقريبا. المسافة 1MM. فإنه ليس من الضروري لفهم الشريان مع ملقط لتجلط الدم، ولمس الشريان بعناية مع ملقط على كلا الجانبين من فوق يكفي ويدفع أقل الأضرار الميكانيكية.
- انتظر 30 ثانية وتلمس بلطف الشريان مع ملقط اضعافها للتحقق من أي تدفق الدم بسبب إعادة الاستقناء العفوية. في حالة إعادة الاستقناء تكرار الكهربي مرة واحدة.
- انتقال عضلة الصدغي لموقفها، الذي يغطي حفرة لدغ.
- خياطة الجرح ووضع الحيوان في صندوق التمريض في 32 ° C للتعافي من التخدير وإعادته إلى القفص. بشكل عام فإنه يأخذ 5-10 دقيقة للحيوان للتعافي من anesthESIA.
- حقن تسكين بعد العملية الجراحية (IP) بعد 24 ساعة وبعد ذلك يوميا حتى اليوم الخامس بعد العملية الجراحية: كاربروفين 4 ملغم / كغم.
3. عملية الشام
تنفيذ كافة الإجراءات مماثل للعملية المذكورة أعلاه - بما في ذلك التخفيف من الجمجمة وزواله - باستثناء لعدم التخثر في الشريان عرضة للخطر.
4. اسطوانة اختبار 13
- وضع الحيوان في اسطوانة شفافة زجاج الاكريليك (قطر: 8 سم، الطول: 25 سم) أمام اثنين من المرايا وشريط فيديو لمدة 5 دقائق. ضبط الكاميرا مركزيا أمام المرايا واثنين اسطوانة للحصول على الفيديو الأمثل (الشكل 3A).
- لتقييم استخدام forelimb مستقلة، والنتيجة (1) الاتصال من جدار الاسطوانة مع forelimb واحدة خلال الخلفية الكاملة و(2) الهبوط مع forelimb واحد فقط على الكلمة بعد الخلفية الكاملة. عد لا يقل عن 20 اتصالات لforelimb واحد باستخدام الحركة البطيئة أو الإطار حسب الابوظيفة AME من العميل فيديو لان (VLC) برامج مجانية ( http://www.videolan.org/vlc ).
- لتحليل خط الأساس قبل الجراحة: أداء الاختبار مرتين في الماوس، مع فاصل 1 ساعة بين التجارب. وأعرب عن استخدام Forelimb كنسبة من اليمين / اليسار من جانب، واستخدام forelimb مستقلة.
- بعد تخثر MCA: أداء الاختبار مرة أخرى مرتين في الماوس، مع فاصل 1 ساعة بين التجارب كما هو مبين أعلاه.
5. الإرواء
- تخدير الحيوانات (على سبيل المثال، من خلال الكيتامين وزيلازين 120/16 ملغم / كغم من وزن الجسم، على التوالي).
- إصلاح الحيوان في موقف ضعيف وفتح تجويف البطن مع خفض متوسط. إزالة التشققات والقص. إجراء شق صغير في الأذين الأيمن. إدراج قنية التروية في البطين الأيسر ويروي ببطء مع 20 مل من المياه المالحة.
- قطع رأس الحيوان، وفتح calvaria وفصل بلطف الدماغ من قاعدة الجمجمة.
6. عائق Volumetry
- Cryosectioning: قطع أدمغة متسلسل على ناظم البرد إلى 20 ميكرون أبواب سميكة كل 400 ميكرومتر على الشرائح وتخزين الشرائح في -20 درجة مئوية.
- البنفسجي cresyl (CV) تلطيخ:
- إعداد الحل تلطيخ: مزيج 0.5 غرام من خلات CV في 500 مل H 2 O. اثارة والحرارة (60 درجة مئوية) حتى تذوب البلورات. اسمحوا الحل باردة وتخزين في زجاجة داكنة. يسخن إلى 60 درجة مئوية والتصفية قبل كل استخدام.
- تجفيف الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة. ثم وضعها في الايثانول 95٪ لمدة 15 دقيقة ثم في الايثانول 70٪ لمدة 1 دقيقة، وبعد ذلك في 50٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة.
- وضع الشرائح في الماء المقطر لمدة 2 دقيقة، وتجديد الماء المقطر ووضعها في لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك وضع الشرائح في حل تلطيخ (60 درجة مئوية) وأو 10 دقيقة، وغسلها مرتين في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
- وضع الشرائح في الايثانول 95٪ لمدة 2 دقيقة. ثم وضعها في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق، تحديث الإيثانول بنسبة 100٪ ووضعها في لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك تغطية الشرائح مع تصاعد المتوسط.
- تحليل:
مسح الشرائح وتحليل حجم احتشاء غير المباشرة من خلال طريقة سوانسون 14 لتصحيح ذمة:
(منطقة الدماغية) = (منطقة اللحاء من الجانب المقابل) - (منطقة القشرة الدماغية من غير الجانب المماثل) (الشكل 4A).
Representative Results
بسبب الوقت والتخدير المعتدل الضرر قصيرة الدماغ، ما يقرب من 10 دقيقة بعد نقلها إلى أقفاصها وكانت جميع الحيوانات مستيقظا، والانتقال بحرية في القفص والتفاعل مع تتزاحم. كان معدل الوفيات أثناء الجراحة MCAO أقل من 5٪، وذلك أساسا نتيجة للنزف تحت العنكبوتية عرضي أو تخدير غير صحيحة. وفيات خلال فترة الملاحظة لمدة 7 أيام بعد السكتة الدماغية الحث يحدث إلا نادرا جدا في حوالي 1-2٪ من الحيوانات. في سلسلة من 10 عملية الحيوانات لهذا التقرير كل من الحيوانات على قيد الحياة العملية وفترة الملاحظة لمدة 7 أيام، وكان أيا منها لاستبعاد بسبب معايير الاستبعاد.
تم تقييم العجز السلوكية بعد MCA التخثر عن طريق اختبار اسطوانة استخدام تحليل 13 forepaw عدم التماثل. في هذا الاختبار، يتم قياس نسبة استخدام forepaw مستقلة اليسار واليمين في نقاط الوقت المشار إليه بعد السكتة الدماغية تحريض ومقارنة القيم الأساسية التي تم الحصول عليها 24ساعة قبل MCAO (الشكل 3B). قدم الحيوانات تغييرا كبيرا في استخدام أطرافهم التماثل للتنقيب مجتمعة الجدار في ساعة اسطوانة اختبار 24 (1.72 ± 0.326، P <0.05) و 3 أيام (1.36 ± 0.17، P <0.05) بعد MCAO. على الرغم من أن نسبة تحسن خلال فترة الملاحظة 1 أسبوع، كان التماثل السيارات تزال كبيرة بعد 7 أيام MCAO (1.35 ± 0.29، P <0.05) مقارنة مع القيم الأساسية.
أجرينا احتشاء volumetry باستخدام البنفسجي cresyl الملون المسلسل أقسام الدماغ الاكليلية بعد 7 أيام السكتة الدماغية الاستقراء (الشكل 4B). وكان متوسط حجم احتشاء 15.4 مم 3، مما يمثل 12٪ من واحدة نصف الكرة المخ (الشكل 4C). تباين هذا النموذج السكتة الدماغية هي منخفضة بشكل استثنائي مع انحراف معياري حوالي 10٪. يشمل منطقة الآفة الحسية الجسدية والقشرة الحركية مع المودة طفيفة فقط من الهياكل تحت القشرية. علاوة على ذلك، توطين احتشاءالمنطقة يمكن التنبؤ بها للغاية مع تقلب الحد الأدنى فقط كما هو مبين في الرسم البياني التخطيطي توزيع (الشكل 4D).
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للدائرة ويليس. يتم تشكيل الدائرة الشريانية ويليس من الشرايين الدماغية المتوسطة (MCA) والشرايين المخي الأمامي (ACA) التي فرع من الشريان السباتي الداخلي (ICA)، وكذلك من قبل الخلفي الشرايين الدماغية (PCA) والخلفي التواصل الشرايين (PComA). وMCA يعمل في التلم الوحشي حيث الفروع إلى القشرة المخية. فرع MCA المهيمنة تزويد جزء كبير من القشرة الحركية وجزء من القشرة الحسية الجسدية والمغطي بشكل دائم عن طريق نموذج أظهرت (اكوما = الأمامي الشريان التواصل؛ BA = الشريان القاعدي؛ SuCA = مخيخ العليا الشريان لار).
الشكل 2. الرأي عبر الجمجمة بعد إزالة العضلات الزمنية وتخطيطيا من MCA انسداد. (A) بعد إزالة العضلات الصدغي يمكن الاطلاع الشرايين القشرية من خلال الجمجمة الماوس شفافة جزئيا (في الفئران 8-12 أسبوع من العمر). ويمكن تحديد فرع MCA المهيمنة في جزء منقاري من وجهة النظر الزمنية فضلا عن مزيد من الشرايين المتفرعة من القشرية MCA وPCA في الجزء الذيلية. (B) عرض تخطيطي على فرع MCA المهيمن في التباين السائد مع التشعب على القشرة الزمانية الجانبية بعد حفر حفرة لدغ وإزالة الجمجمة. (C) تمثل المربعات السوداء المواقع التخثر MCA في الجانبين الداني والقاصي من التشعب.
في صفحة = "دائما"> 
الشكل 3. تحليل العجز السلوكية. (أ) اختبار اسطوانة انشاء: يتم وضع الماوس في اسطوانة الرأسي ويتم وضعها وراء المرايا من أجل تسجيل جميع حركات باستخدام كاميرا الفيديو (B) تم تحليل استخدام Forelimb التماثل باستخدام اختبار اسطوانة. تم حساب نسب يسار / يمين من استخدام forelimb مستقلة 24 ساعة قبل MCAO وعند نقاط الوقت المشار إليه بعد السكتة الدماغية الاستقراء. N = 10، * ع <0.05 نقطة بين الوقت المشار إليه، والأساس (السيطرة) القيمة.
الشكل 4. الحجمي التحليل واحتشاء نتيجة احتشاء بعد القاصي MCAO. (أ) صورة الممثل من البنفسجي cresyl الملون الصدرية الاكليليةفي القسم بعد 7 أيام MCAO. الخط الأصفر ويدل اختيار المقابل (يمين) القشرة والخط الأحمر هو اختيار غير احتشاء (الملون) قشرة الدماغ المماثل. منطقة شاحب في نصف الكرة المخية الأيسر يصور منطقة الأنسجة احتشاء. (B) تحليل حجم عائق من 10 العقول (كل نقطة تمثل الدماغ فرد واحد) على مدار 24 ساعة، 3 أيام و 7 أيام بعد القاصي MCA التخثر. الخط الأحمر الأفقي يمثل نفسه، أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. (C) الممثل البنفسجي cresyl أقسام الدماغ الاكليلية الملون بعد كل 400 ميكرومتر في 7 أيام MCA التخثر. (D) توزيع تخطيطي لأنسجة المخ احتشاء بعد 7 أيام MCAO. كل شريحة يصور المعلومات المتراكمة التوزيع احتشاء (ونا مميزا كما هو مبين) في قسم معين فيما يتعلق bregma (صورة معدلة من: Liesz وآخرون، الدماغ، 2011؛ بإذن من مطبعة جامعة أكسفورد). <وأ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" الهدف = "_blank"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يصف هذا البروتوكول نموذج تجريبي من السكتة الدماغية البعيدة، MCAO دائمة بحلول الكهربي عبر الجمجمة - ما يسمى ب "نموذج التخثر". هذا النموذج أصبح في الوقت نفسه واحدة من النماذج الحيوانية الأكثر استخداما في البحوث التجريبية السكتة الدماغية 12. بالمقارنة مع غيرها من نماذج نقص تروية الدماغ التنسيق، ونموذج تجلط الدم كما هو مبين في هذا الفيديو في الاستفادة من وقت العملية قصيرة جدا من ما يقرب من 10 دقيقة عندما يؤديها عالم المدربين. وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق مرات التخدير وجيزة في هذا النموذج، الذي هو سمة مواتية لنموذج تجريبي السكتة الدماغية بسبب تأثير التخدير على العصبية والسكتة الدماغية النتيجة غير معروفة 15. علاوة على ذلك، كما هو موضح سابقا من قبل كارمايكل وآخرون 11، ونحن تثبت أن حجم احتشاء الناتجة عنها، وتوطين بعد القاصي التخثر دائمة MCA يتوافق مع آفات الدماغ الإقفاري في غالبية الإنسانالسكتات الدماغية على نحو يتناسب مع حجم الدماغ. السكتة الدماغية الإنسان هو أساسا صغيرة في الحجم مع الآفات حوالي 5-15٪ من نصف الكرة الأرضية، على أساس الدراسات السكانية السابقة والتجارب السريرية التصوير 16-18، على النقيض من الآفات السكتة الدماغية واسعة مع الضغط ذمة الدماغ التي تحدث في أقل من 10٪ من السكتات الدماغية السريرية 19. وبالتالي، يمكن اعتبار الآفات السكتة الدماغية في إقليم MCA من حوالي 12٪ من نصف الكرة الأرضية من النموذج المقدم يتحقق كوحدة تخزين السكتة الدماغية ذات الصلة translationally. ومع ذلك، فإنه يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن سلالات مختلفة الماوس أو بروتوكولات التخدير المستخدمة قد يؤثر على حجم الآفة الناجمة 20.
الوفيات أثناء فترة المراقبة بعد الاستقراء السكتة الدماغية في هذا النموذج غائب تقريبا. المعدل العام للوفيات أقل من 5٪ يتكون أساسا من الوفيات أثناء العملية بسبب حدوث مضاعفات anesthesiological أو التضحية لأن التوصل إلى معايير الاستبعاد. من أجل تبرير الخامس منخفضariability من هذا النموذج واستنساخ ممتازة، نقترح معايير الاستبعاد التالية: 1) أي نزيف تحت العنكبوتية خلال العملية. 2) وقت عملية أطول من 15 دقيقة. 3) إعادة الاستقناء من MCA بعد محاولتين لالكهربي مع عابرة فقط MCAO. علاوة على ذلك، تحتاج إلى أن تدرس يوميا بعد MCAO (السلوك الفسيولوجية الأساسية، والمظهر الفراء ووزن الجسم) للسيطرة على الألم، وعدم الراحة أو سلوك المرض الحيوانات.
قد يتم تنفيذ عدة تدابير لتحليل نتائج السكتة الدماغية مثل قياس رقطة الليزر، والتصوير بالرنين المغناطيسي، والاختبارات السلوكية أو التحليل النسيجي. في هذا البروتوكول نقدم أساليب المثالية لتحليل السلوك وتحليل حجم احتشاء. وقد وضعت عدة لاختبار التحليل السلوكي بعد التنسيق نقص تروية الدماغ وتستخدم في البحوث التجريبية السكتة الدماغية. اختبارات مناسبة لضعف الحسية المستخدمة سابقا من قبل مجموعتنا في هذا النموذج السكتة الدماغية 21،22 نحنإعادة اختبار Rotarod 23، اختبار التسمية مثبت 24، ركن الاختبار 25 و 13 اسطوانة الاختبار، والذي يتجلى في هذا الفيديو. اختبار اسطوانة يصور باستمرار عدم التماثل السيارات في المرحلة الحادة بعد القاصي MCAO دائمة وأيضا بالكشف عن استعادة متتالية من وظيفة الحركة.
على الرغم من مزايا واضحة، بعض القيود لهذا النموذج السكتة الدماغية يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. أولا، هناك حاجة إلى نقب من الجمجمة من أجل تخثر الشريان، مما ينتج عنه إمكانية الوصول لشبه التشغيلية التهابات في الدماغ، على الرغم من الالتهابات البكتيرية في الجروح والعضلات الزمانية أو الدماغ نفسه لم يتم اكتشاف من قبل أنفسنا أو موثقة من قبل الآخرين باستخدام هذا النموذج. علاوة على ذلك، الأضرار الميكانيكية إلى القشرة خلال إعداد وتجلط الدم لا يمكن استبعاد ولكن يمكن أن تكون محدودة بسبب الحذر الحفر وإزالة الجمجمة، الترطيب المستمر للموقع الجراحية والحد الأدنى من شمال شرق cessary الكهربي (انظر معايير الاستبعاد). على الرغم من أن مسار MCA كما هو مبين في الشكل 2 تم العثور في معظم C57BL / 6 الفئران، وصفنا في البروتوكول كيفية المضي قدما في الاختلافات الطبيعية للدورة سفينة للحد من تقلب الطراز. وعلاوة على ذلك، فإننا نقترح استخدام متعددة (3 في حالة التشعب، 2 دون التشعب من MCA) مواقع انسداد للحد من خطر إعادة الاستقناء الجزئي للMCA، والتي في تجربتنا هو عامل مهم لتنوع هذا النموذج.
من حيث الاختبارات السلوكية، ويمكن الكشف فقط العجز السلوكية الطفيفة في الاختبارات السلوكية المذكورة أعلاه ويمكن ملاحظة التجديد وظيفية خلال الأسبوع الأول بعد السكتة الدماغية. وبالتالي، وأنظمة الاختبار أكثر تقدما مع ارتفاع حساسية والمعلمات اختبار النوعية مثل اختبار التوصل المهرة 27 قد يكون أكثر ملاءمة للكشف عن نتائج وظيفية طويلة الأجل في هذا النموذج.
ontent "> وأخيرا، وذلك بسبب تخثر الدائمين في MCA يمكن الحصول على أي ضخه، والتي هي ميزة لوحظ في نسبة كبيرة من مرضى السكتة الدماغية بسبب عفوية تحلل الجلطة أو العلاج 28. ومع ذلك، وهذا نموذج السكتة الدماغية الانسداد التجلطي موضح سابقا 26 يوفر الخيار لنموذج السكتة الدماغية مجانية مع ضخه من نقص تروية الدماغ القشرية. أخذت معا، واستنساخ عالية، والمراقبة على المدى البعيد بسبب الحد الأدنى من وفيات ومقارنة حجم احتشاء النسبية والتعريب فيما يتعلق السكتة الدماغية الإنسان تمييز "نموذج التخثر" باعتباره نموذجا قيما للأبحاث السكتة الدماغية الأساسية ومتعدية.Disclosures
والكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الكتلة التميز للمؤسسة الأبحاث الألمانية "ميونيخ الكتلة لأنظمة الأعصاب (التآزر)" ومؤسسة دايملر بنز لAL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera Canon Eos 500D | Canon | Optics: 18-55 mm; 30 fps; 640 x 480 video function | |
| Mirror | Kristallform | 2677089 | 30 x 30 cm |
| Transparent acrylic glass cylinder | H&S Kunststofftechnik | Diameter: 8 cm, height: 25 cm | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Mayo Scissors | FST | 1410-15 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Cottons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Bepanthen pommade | Bayer | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Electrosurgical device | ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät | ||
| Drill | Proxxon | D-34343 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Xylacine | Albrecht | ||
| 5ml Syringe | Braun | ||
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Acetic acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 |
References
- Donnan, G. A., et al. Stroke. Lancet. 371, 1612-1623 (2008).
- Di Carlo, A., et al. Frequency of stroke in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. ILSA Working Group and the Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Italian Longitudinal Study on Aging. Neurology. 54, 28-33 (2000).
- Hacke, W., et al. Thrombolysis with alteplase 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke. N. Engl. J. Med. 359, 1317-1329 (2008).
- Jauch, E. C., et al. Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44, 870-947 (2013).
- Longa, E. Z., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Engel, O., et al. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J. Vis. Exp. (47), e2423 (2011).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 123-135 (1997).
- Tamura, A., et al. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
- Chen, S. T., et al. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Tureyen, K., et al. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).
- Schallert, T., et al. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Swanson, R. A., et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J. Cereb. Blood Flow Metab. 10, 290-293 (1990).
- Kitano, H., et al. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1108-1128 (2007).
- Effect of intravenous recombinant tissue plasminogen activator on ischemic stroke lesion size measured by computed tomography. NINDS; The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) rt-PA Stroke Study Group. Stroke. 31, 2912-2919 (2000).
- Sowell, E. R., et al. Mapping cortical change across the human life span. Nat. Neurosci. 6, 309-315 (2003).
- Brott, T., et al. Measurements of acute cerebral infarction: lesion size by computed tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
- Hacke, W., et al. Malignant' middle cerebral artery territory infarction: clinical course and prognostic signs. Arch. Neurol. 53, 309-315 (1996).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Liesz, A., et al. Boosting regulatory T cells limits neuroinflammation in permanent cortical stroke. J. Neurosci. 33 (44), 17350-17362 (2013).
- Liesz, A., et al. Inhibition of lymphocyte trafficking shields the brain against deleterious neuroinflammation after stroke. Brain. 134, 704-720 (2011).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 259, 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nat. Protoc. 4, 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. J. Neurosci. Methods. 117, 207-214 (2002).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38, 2771-2778 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33, 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Arch. Neurol. 59, 1870-1873 (2002).
