Abstract
Flere bakteriearter besidder evnen til at vedhæfte til overflader og kolonisere dem i form af tynde film kaldet biofilm. Biofilm, der vokser i porøse medier er relevante for flere industrielle og miljømæssige processer, såsom spildevandsrensning og CO 2-binding. Vi brugte Pseudomonas fluorescens, en gramnegative aerobe bakterie at undersøge biofilmdannelse i en mikrofluid enhed, der efterligner porøse medier. Den mikrofluidindretning består af en vifte af mikro-stillinger, der blev fremstillet ved brug af soft-litografi. Efterfølgende blev biofilmdannelse i disse enheder med strøm undersøgt og vi demonstrere dannelsen af trådformede biofilm kendt som streamers i vores enhed. De detaljerede protokoller for fabrikation og samling af mikrofluid anordning er tilvejebragt her sammen med bakteriekulturen protokoller. Detaljerede procedurer for eksperimenter med den mikrofluidindretning også præsenteret sammen med repræsentantresultater.
Introduction
Vi har for nylig demonstreret bakterielle biofilm dynamik i en mikrofluid anordning, der efterligner porøse medier 1. Bakterielle biofilm er hovedsagelig kolonier af overflade aggregeret bakterier, der er indkapslet af ekstracellulære polymere stoffer (EPS) 2-4. Disse tynde film af bakterier kan dannes i næsten enhver tænkelig niche spænder fra glatte overflader til langt mere kompleks levested af porøse medier. Valiei m.fl.. 1 brugte en mikrofluid enhed med en bred vifte af mikro-søjler til at simulere en porøs media struktur og studerede biofilmdannelse i denne enhed som en funktion af væske flow. De fandt, at trådformede biofilm kendt som streamers i et vist flow regime, begyndte at dukke op mellem forskellige søjler. Streamers kan bindes ved en eller begge ender til faste overflader, men resten af strukturen er suspenderet i væske. Streamer dannelse begynder typisk efter en indledende lag af biofilm har dannet og dens formation kan diktere den langsigtede udvikling af biofilm i sådanne komplekse levesteder. For nylig har flere forskere undersøgt dynamikken i streamer dannelse. Yazdi et al. 5 viste, at streamerne kan dannes i hvirvlende strømme, der hidrører fra en oscillerende boble. I et andet eksperiment, Rusconi et al. 6 undersøgte virkningen af kanalen krumning og kanal geometri på dannelsen af bånd. De fandt, at streamerne kan dannes i krumme dele af mikrokanaler og streamer morfologi er relateret til motilitet. Nyere forskning har vist, at streamere kan have vidtrækkende konsekvenser i forskellige naturlige og kunstige scenarier, da de kan virke som forstadier til dannelsen af modne strukturer i porøse grænseflader, medføre en hurtig og katastrofale biofilm spredning i et biomedicinsk systemer, og også forårsage betydelig gennemstrømningshastighed struktur interaktioner mv 1,7-9.
Biofilm streamers danner ofte jegn komplekse naturtyper som porøse medier. Forståelse biofilmvækst i porøse medier miljø er relevant for flere miljømæssige og industrielle processer som biologisk spildevandsrensning 10, opretholdelse brøndboring integritet i situationer som CO 2-opsamling 11 og tilstopning af porerne i jorden 12. Observation biofilmdannelse i sådanne komplekse levesteder kan ofte være en udfordring på grund af uigennemsigtighed porøse medier. I sådanne situationer kan mikrostrømning baserede porøse medieplatforme være yderst fordelagtig, da de giver mulighed for real-time og på levestedet overvågning. En anden fordel ved mikrofluidik er evnen til at bygge flere bioreaktorer på en enkelt biologisk mikrofluid platform og samtidig give mulighed for online overvågning og / eller inkorporering af sensorer. Den fleksibilitet til at gennemføre flere laboratorieforsøg i én enhed og evnen til at indsamle betydelige relevante data for præcis statistisk analyse er en vigtig advantage af mikrofluide systemer 13,14.
I forbindelse med ovenstående diskussion, vil forståelse streamer dannelse dynamik i et porøst materiale miljø være gavnlig for flere applikationer. I denne undersøgelse, vi udvikler protokollen for at efterforske streamer dannelse i en enhed, der efterligner porøse medier. Fabrikation af mikrofluid platform, er nødvendige trin i cellekultur og eksperimenter beskrevet. I vores forsøg blev vildtype bakteriel stamme af Pseudomonas fluorescens anvendes. S fluorescens, der findes naturligt i jord, spiller en central rolle i at opretholde jordens økologi 15. Den bakterielle stamme anvendt blevet genetisk manipuleret til at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) konstitutivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Udfør forsøgsprotokoller her i den rækkefølge, der er beskrevet nedenfor. Mikrofabrikation protokoller for at skabe mikrofluid platform er beskrevet i trin 1. Trin 2 beskriver bakteriekulturen protokollen (figur 2), og trin 3 angår samling af forsøgsopstillingen (figur 3). Endelig er det egentlige eksperimentelle trin beskrevet i trin 4.
1. Chip Fabrication Procedure
BEMÆRK: Korrekt sikkerhedsprocedurer skal følges for de processer, der er beskrevet nedenfor. Henvend dig til institutionelle sikkerhedsansvarlige for detaljer.
- Design masken med en passende software (f.eks L-Edit). Kanalen design består af en primær mikrokanalindretningen bredde 625 um. Det centrale område af kanalen indeholder en række mikro-stillinger 50 um i diameter, anbragt 25 um fra hinanden (se supplerende filer).
- Udskriv dette design på glas (5 "x 5" natronkalkglas), Der har en tykkelse på 0,09 "og er belagt med ca 70 nm tykt lag af chrom (Cr), ved hjælp af maskering for at forberede en fotomaske. Brug AZ400K udvikler for 1 min. Derefter ætse Cr lag ved hjælp Cr ætsemiddel til omkring 1 min acetone at fratage modstå og rengør det med koldt Piranha løsning. (H 2 SO 4 og H 2 O 2 i forholdet 3: 1).
- Fotolitografi
- Rengør et standard 4 "silicium wafer kemisk med Piranha løsning i 20 min.
- Skyl wafer med DI-vand og tørres.
- Varm skiven på en varm plade (200 ° C i 15 min).
- Coat silicium wafer med fotoresist. Her positiv fotoresist AZ4620 blev spin-coated på en siliciumskive ved 2000 rpm i 25 sekunder for at opnå en 12,5 um tykt lag.
- Fjern alt opløsningsmidlet ved bløde bagning af skiven på en varmeplade ved flydende skiven i 90 sekunder på en nitrogenstrøm ved 100 ° C. Så holde det i vakuum ved than samme temperatur i 60 sek.
- Placer skiven i en mørk kasse i 24 timer for dehydrering.
- Bring wafer for UV-lys med henblik på at overføre designet mønster fotoresisten.
- Fordyb wafer i fotoresist developer opløsning (AZ400K) til 240 sek. Derefter skylles wafer med isopropylalkohol og tørres ved anbringelse i en strøm af nitrogengas.
- ICP-DRIE (induktivt koblet plasma - Deep Reactive Ion ætsning) Proces
- Anvend DRIE ætsning. Vælg den relevante etch dybde ifølge slutdybden kræves for enheden (50 um i denne undersøgelse). Fotoresist fungerer som et maskerende lag under denne proces.
- Fjerne de resterende fotoresist med acetone og rense skive.
- PDMS (polydimethylsiloxan) Støbning
- Brug trichlormethylsilan (TCMS) til silanizing silicium mester skimmel. Hæld 2 eller 3 dråber trichlormethylsilan i et hætteglas og placere den i en ekssikkator ved siden afsilicium mester skimmel. Tillad 2-3 timer for silanizing processen for at fuldføre.
- I en separat beholder blandes Sylgard 184 silikone base med hærder vægtforhold på 10: 1 til fremstilling af PDMS. Afgasses PDMS ved at underkaste den vakuum (ca. 2 timer).
- Sæt silicium mester skimmel i en holder. Derefter hældes PDMS på silicium mester form til dannelse PDMS stempel. Sørg for, at bobler ikke danner i PDMS under denne proces.
- Cure PDMS i 2 timer ved 80 ° C.
- Træk PDMS stempel fra master formen. Derefter skæres PDMS stempel i separate mikrochips. Endelig bruge et skærende kerne bore huller til indløbet (r) og udløb (r).
- Limning af PDMS til glas
- Expose dækglasset og PDMS stempel til ilt plasma til 30 sek. Bond PDMS stempel til dækglasset.
- For at opnå korrekt tætning mellem PDMS stempel og dækglasset, annelere enheden ved at sætte det i ovnen ved 70 ° C i 10 min.
2. bakteriekultur
BEMÆRK: Korrekt biosikkerhed protokoller skal følges til Steps 2-4. Henvend dig til institutionelle sikkerhedsansvarlige for detaljer.
- Forbered LB-agarplader
- Der tilsættes 20 g Luria-Bertani (LB) agar (Miller) pulvere og 500 ml ultrarent vand til en 1 liters kolbe. Stir at opløse pulveret.
- Der steriliseres ved autoklavering ved 15 psi, 121 ° C i 15 min.
- Man lader kolben afkøle til 50-55 ° C på en bænk eller i et vandbad i biosikkerhed hætte.
- Tilføj antibiotikummet tetracyclin til opnåelse af en slutkoncentration på 50 ug / ml. Bland godt ved at slynge.
- Hæld blandingen i plader. Fyld hver plade indtil 1/2 - 2/3 fuld.
- Flamme luftbobler kort til pop dem, hvis de udgør. Størknede luftbobler er vanskelige at sprede bakteriekultur forbi.
- Lad pladerne til afkøling ved stuetemperatur natten over.
- Når de er cool,sætte plader tilbage i deres ærme, luk posen, etiket (antibiotika og dato), og opbevares ved 4 ° C.
BEMÆRK: Dæk bestanden af plader med sølvpapir, som lys deaktiverer mange antibiotika.
- LB Broth Fremstilling
- Tilsæt 20 g Luria-Bertani (LB) bouillon (Miller) pulver og 1 L af ultrarent vand til en kolbe. Stir at opløse pulveret.
- Der steriliseres ved autoklavering ved 15 psi, 121 ° C i 15 min.
- Lad kolben afkøle ned til 50-55 ° C på en bænk eller i et vandbad i biosikkerhed hætte.
- Tilføj antibiotikummet tetracyclin til opnåelse af en slutkoncentration på 50 ug / ml. Bland godt ved at slynge.
- Når den er kold, skal du placere den mærkede flaske ved 4 ° C.
BEMÆRK: Dæk flaske med sølvpapir, som lys deaktiverer mange antibiotika.
- Kultur Bakterier på en LB-agarplade (Denne protokol bruger Pseudomonas fluorescens)
- Tag den bakterielle bestand fra fryseren (-80 °; C) og placere den på is.
- Placer -80 ° C bakteriel materiel og en LB-agarplade inde i et biosikkerhed hætte.
- Træk bakteriestammen på en LB-agarplade i et zigzag-mønster. Dæk agarplade og inkuberes ved 30 ° C natten over. Endelig gemme pladen i køleskab ved 4 ° C.
- Forbered Bakteriel Solution (S1)
- Hæld 50 ml LB-bouillon medie til et autoklaveret kolbe. Udfør denne operation inde i en biosikkerhed hætte.
- Overfør en enkelt bakteriel koloni fra LB-agarplade til kolben. Denne operation skal også udføres inde i en biosikkerhed hætte.
- Sæt kolben i en rysteinkubator ved 30 ° C og 150 rpm i tilstrækkelig tid (4 timer).
- Den fortyndede Bakteriel Solution (S2)
- Hæld 5 ml LB-bouillon medier i en steriliseret plastikrør.
- Fortynd S1 ved blanding med LB bouillon medier. Derefter vortexes opløsningen. Fortynd opløsningen opnå den ønskede optikal densitet (OD måles ved 600 nm = 0,1).
BEMÆRK: Biofilm eksperimenter anvender typisk OD-værdier i denne omegn.
3. Forbered forsøgsopstillingen
- Brug pincet forbinde fleksible plastrør (0,20 "ID) ind i indløbet (r) og udløb (e) af mikrochip. Indløbene og udløbene tidligere blev boret ind PDMS del af mikrochip (trin 1.5.5). I denne undersøgelse , mikrochip består af to indløb og et udløb.
- Fyld sprøjten (r) med bakteriel opløsning (S2 opløsning) og fjerne alle de bobler i sprøjten (r).
- Slut sprøjtens spids (r) (30 g 0.5 "stump nål) i indløbsrøret (r). Tilslut derefter udløbsrør (s) til affaldsbeholder.
4. Kør eksperiment
- Forbind sprøjten (r) til sprøjtens spids (r).
- Sted og fix injektionssprøjte (r) på sprøjtepumpen. Derefter placerer mikrochippen under et optisk mikroskop med objektive linser af desired forstørrelse (f.eks 40X). Dæk mikrochip med en levende celle kammer enhed til at opretholde en konstant temperatur miljø for bakteriel vækst (30 ° C i P. fluorescens).
- Indstil pumpen til det ønskede flow niveau (sige 10 gl / time) og indlede væske pumpning.
- Når bakterier indføres i kammeret bliver biofilmdannelse også igangsat. Biofilm dannelse og modning forekommer typisk over en periode på flere timer eller endda dage. Observere og tage billeder af biofilm vækst gennem mikroskopet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af ovennævnte mikrofabrikation protokol blev en PDMS baseret mikrofluid anordning konstrueret. Figur 1 viser scanning elektron mikroskop (SEM) billeder af PDMS enheden. 1a viser indgangen af anordningen. En gaffel-lignende indgang er skabt til at udligne trykket hoved på tværs af enheden. Yderligere SEM billeddannelse viste også, at søjle vægge er næsten lodret (figur 1b). Den dyrkede bakterielle opløsning (figur 2) blev fortyndet og dets optiske densitet blev justeret til en værdi på 0,1. Vi undersøgte biofilmdannelse i mikrofluid enhed som en funktion af input strømningshastighed. Da P. fluorescens blev injiceret i enheden på et lavt flow-hastighed på 0,8 ul / time, bakteriel vedhæftning og biofilmdannelse forekom på væggene i enheden. Selv efter en længere periode (> 20 timer), ingen andre end overfladeaktive hugging biofilm bakterielle strukturer vire overholdt. Dernæst blev det samme forsøg gentaget ved en strømningshastighed på 8 ul / time. I dette tilfælde biofilmdannelse igen startede efter et par minutter af infusion af den fortyndede bakteriekultur. Men efter et par timer, udseende af filamentøse strukturer, der strækker sig mellem mikro-søjler blev observeret nær midtersektionen af enheden (figur 4). Disse trådformede strukturer kunne visualiseres gennem tilstedeværelsen af immobile bakterier. Disse strukturer er kendt som streamers og de er filamentøse biofilm, der kun bindes til den ene eller begge ender til overflader. Resten af strukturen, ofte suspenderet i det flydende medium (som i dette tilfælde). Figur 4 viser tid-evolution biofilm streamer struktur. Streamers sædvanligvis på grund af virkningen af fluid forskydning på viskoelastiske biofilm. Figur 5 viser strømlinierne og velocity konturer til strømning forbi en række søjler. Simuleringen viser, at de streamers, somform vores mikrofluid system væsentlige rettet ind langs fluidstrømmen strømlinier. Sammenhængen mellem flow strukturer og dannelse af biofilm streamere er endnu ikke godt forstået. Imidlertid har Das og Kumar 16 for nylig foreslået, at disse streamers dannes som meget tyktflydende væske tilstand uløseligt viskoelastiske biofilm. De baserede deres formodninger på den iagttagelse, at tidsrammen for biofilm streamer dannelse typisk langt overstiger de viskoelastiske afslapning tidsskalaer biofilm. Biofilm er kendt for at opføre sig som viskoelastiske væsker og dermed på tidsplanerne meget større end den viskoelastiske afslapning tidsskala, de væsentlige opfører sig som højviskose væsker 17. Ifølge denne formulering kan streamers forventes at stamme på steder med høje forskydningsspændinger. Figur 5 viser placeringen af høj hastighed i kanalen, og disse steder er sammenfaldende med placeringen af høje forskydningsspændinger. I den oprindelige PHA SE for vækst, er streamers observeret at stamme i nærheden af disse steder (Figur 4).
Figur 1. Scanning elektron mikroskop (SEM) billeder af mikrofluid kanal (top view). a) Indløbsstrækning, b) Region som indeholder mikro-søjler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. sekventielle trin, der er involveret i bakteriekultur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Opsætning for mikrofluide eksperimenter. 1 Optisk mikroskop (inverteret), 2-Sprøjte pumpe, 3-Billede og dataopsamling, 4-sprøjte indeholdende farvestof (ekstraudstyr), 5-sprøjte, der indeholder bakterier, 6-affald reservoir. venligst Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Time-lapse konfokal billeddannelse af udviklingen i streamere. Billede plan svarer til z = 25 um dvs midten af enheden. Stiplede ellipser demonstrere biofilm streamers. Klikher for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Computational fluid mekaniske simuleringer viser effektiviserer og hastighed konturerne af flowet forbi mikro-søjler. Fluid flow er fra top til bund og hastighed skala i m / sek. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viste en enkelt mikrofluid anordning, der efterligner porøse medier for at studere biofilm udvikling i komplekse levesteder. Der er flere kritiske trin, der bestemmer udfaldet af forsøgene. De omfatter enheden geometri. Mens stillingen geometri kan variere, er det nødvendigt tilstrækkelig pore-plads til streamers til at danne. Desuden Valiei et al. 1 har vist, at streamer dannelse kun forekommer i en bestemt strømningshastighed rækkevidde. Ved strømningshastigheder lavere end en grænseværdi, måske ikke overholdes deformation af biofilm i streamers. Alligevel over en vis anden tærskel flow værdi, kan biofilm fraktur dominere og ikke tillade dannelsen af streamers. Et andet problem, der kan plage disse eksperimenter er gasbobler, der kan blive fanget i array mikro-søjle. Normalt disse bobler skal fjernes ved at øge strømningshastigheden oprindeligt og derefter gradvist faldende til den ønskede værdi.
Mikrofluide platformesom disse har flere fordele og få begrænsninger. Platformen gør det muligt for os at arbejde med mængder kultur små, og har den fleksibilitet at indarbejde brugerdefinerede funktioner. For eksempel kan forskellige porøse strukturer simuleres ved ændring af de geometriske parametre for array mikro-søjle. Selv strukturer, der efterligner den tilfældige opbygning af fast porøse medier kan fremstilles på mikrofluide platforme 18. Desuden kan flere sådanne kanaler blive gennemført på en enkelt enhed giver mulighed for indsamling af væsentlige relevante data for præcis statistisk analyse. Imidlertid mikrofluide systemer typisk efterligner to-dimensionale struktur af porøse medier. Enheder, der kan efterligne den tredimensionale karakter af porøse medier er som regel ganske udfordrende at fremstille.
Dannelse og udvikling af streamers er ikke godt forstået endnu, og der er behov for yderligere forskning i denne retning. Forståelse af hvordan streamers danne og føre til formatetion af modne biofilm strukturer vil være relevante for en bred vifte af scenarier, herunder tilstopning af biomedicinsk udstyr såsom hjerte stents, biofilm i jord, og filtrering. Vores mikrofluid platform er et skridt i den retning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri dish | Fisher | 875712 | sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 incubator shaker series | |
| 50 ml sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene RNase-/DNase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 μg/ml |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole-Parmer |
References
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al. Encylopedia of Nanotechnology. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
