Abstract
Verschillende bacteriële species bezitten het vermogen om te hechten aan oppervlakken en koloniseren ze in de vorm van dunne films genaamd biofilms. Biofilms die groeien in poreuze media zijn voor verschillende industriële en ecologische processen, zoals de behandeling van afvalwater en CO2 vastlegging relevant. We gebruikten Pseudomonas fluorescens, een Gram-negatieve aërobe bacterie, om biofilmvorming in een microfluïdische apparaat dat werkt poreuze media onderzoeken. De microfluïdische inrichting bestaat uit een array van micro-posten, die zijn vervaardigd met behulp van zachte lithografie. Vervolgens biofilmvorming in deze apparaten met stroom werd onderzocht en we tonen de vorming van biofilms draadvormige bekend als streamers in ons apparaat. De gedetailleerde protocollen voor de fabricage en assemblage van microfluïdische apparaat worden hier voorzien, samen met de bacteriecultuur protocollen. Gedetailleerde procedures voor experimenten met de microfluïdische apparaat worden ook gepresenteerd samen met de representatieveresultaten.
Introduction
Onlangs toonden we aan bacteriële biofilmvorming dynamiek in een microfluïdische apparaat dat poreuze media 1 nabootst. Bacteriële biofilms zijn in wezen kolonies van oppervlakte geaggregeerd bacteriën die worden omhuld door extracellulaire polymere stoffen (EPS) 2-4. Deze dunne films bacteriën kan vormen in bijna elke denkbare niche variërend van gladde oppervlakken de veel complexere habitat poreuze media. Valiei et al. 1 gebruikte een microfluïdische inrichting met een reeks micro-pijlers te simuleren een poreuze media structuur en bestudeerd biofilmvorming in deze inrichting als functie van de stroomsnelheid. Zij vonden dat in een bepaalde flow regime, draadvormige biofilms bekend als streamers begon te ontstaan tussen de verschillende pijlers. Wimpels kan worden vastgebonden op een of beide uiteinden aan vaste oppervlakken, maar de rest van de structuur wordt gesuspendeerd in vloeistof. Streamer vorming begint meestal na een eerste laag van biofilm heeft gevormd en het formaation kan de evolutie van biofilm langdurige dicteren dergelijke complexe habitats. Onlangs hebben een aantal onderzoekers de dynamiek van de streamer vorming onderzocht. Yazdi e.a.. 5 bleek dat de streamers in wervelende stromen afkomstig van een oscillerende luchtbel kan vormen. In een ander experiment, Rusconi e.a.. 6 onderzochten het effect van het kanaal kromming en geometrie kanaal op de vorming van streamers. Zij vonden dat de streamers in gebogen secties microkanalen kunnen vormen en streamer morfologie heeft betrekking op motiliteit. Recent onderzoek heeft aangetoond dat streamers brede vertakkingen in verschillende natuurlijke en kunstmatige scenario's kunnen hebben als ze kunnen fungeren als voorlopers van de vorming van volwassen structuren in poreuze interfaces, leiden tot een snelle en katastrofisch biofilm proliferatie in een biomedische systemen, en ook aanzienlijke flow veroorzaken structuur interactions, etc 1,7-9.
Biofilm streamers vormen i vaakn complexe habitats zoals poreuze media. Inzicht biofilmgroei in poreuze media omgeving is verschillende ecologische en industriële processen relevante zoals biologische afvalwaterzuivering 10, onderhouden goed boring integriteit in situaties zoals CO2 afvang 11 en verstopping van poriën in de bodem 12. Waarnemen biofilmvorming in dergelijke complexe habitats vaak moeilijk als gevolg van de ondoorzichtigheid van poreuze media. In dergelijke situaties kan microfluidics gebaseerd poreuze media platforms blijken uiterst voordelig als zij toestaan dat real-time en in situ monitoring. Een ander voordeel van microfluïdische is de mogelijkheid om meerdere bioreactoren bouwen op een bio-microfluidic platform en tegelijkertijd zorgen voor online monitoring en / of opname van sensoren. De flexibiliteit meerdere laboratoriumexperimenten uitvoeren in een apparaat en het vermogen om significante relevante gegevens te verzamelen voor nauwkeurige statistische analyse is een belangrijke bijwoordantage van microfluïdische systemen 13,14.
In de context van de bovenstaande discussie, zou begrijpen streamer vorming dynamiek in een poreuze media milieu gunstig verscheidene toepassingen. In deze studie hebben we de ontwikkeling van het protocol voor het onderzoek streamer vorming in een apparaat dat bootst poreuze media. Fabricage van de microfluïdische platform nodige maatregelen voor celcultuur en experimenten beschreven. In onze experimenten werd de wildtype bacteriële stam van Pseudomonas fluorescens P. toegepast. fluorescens, nature in de bodem, speelt een belangrijke rol bij het handhaven bodemecologie 15. De bacteriestam werkzaam waren genetisch gemanipuleerd groen fluorescent eiwit (GFP) constitutief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voer de testprotocollen hier in de hieronder beschreven volgorde. Microfabricage protocollen voor het creëren van microfluïdische platform worden besproken in Stap 1 Stap 2 wordt de bacteriecultuur protocol (figuur 2), en Stap 3 betreft de montage van de experimentele opstelling (figuur 3). Ten slotte wordt de werkelijke experimentele stap beschreven in stap 4.
1 Chip Fabrication Procedure
OPMERKING: De juiste veiligheidsprocedures moeten worden gevolgd voor de hieronder beschreven processen. Raadpleeg de institutionele veiligheidsfunctionaris voor details.
- Het ontwerp van de masker met een geschikte software (bijvoorbeeld L-Edit). Het kanaal ontwerp bestaat uit een hoofdgebouw micro-kanaal van de breedte 625 micrometer. Het centrale gebied van het kanaal bevat een array van micro-posten 50 micrometer diameter, afstand 25 urn elkaar (zie brief Files).
- Print dit ontwerp op glas (5 "x 5" sodakalkglas), Die een dikte van 0,09 "heeft en bekleed met ongeveer 70 nm dikke laag chroom (Cr), maskerprocedures om een fotomasker te bereiden. Gebruik AZ400K ontwikkelaar voor 1 min. Vervolgens etsen de Cr-laag met Cr etsmiddel voor ongeveer 1 min Gebruik aceton te strippen de resist en maak hem schoon met koud piranha-oplossing. (H 2 SO 4 en H 2 O 2 in een verhouding van 3: 1).
- Fotolithografie
- Reinig een standaard 4 "silicium wafer chemisch met piranha-oplossing gedurende 20 minuten.
- Spoel de wafer met DI-water en droog het.
- Verwarm de wafer op een hete plaat (200 ° C gedurende 15 min).
- De vacht van de silicium wafer met fotolak. Hier, de positieve fotoresist AZ4620 werd spin-gecoat op een silicium wafer bij 2000 rpm gedurende 25 sec tot 12,5 urn dikke laag te verkrijgen.
- Verwijder het oplosmiddel door zacht bakken van de wafer op een hete plaat door drijvende de wafer gedurende 90 seconden op stikstofstroom bij 100 ° C. Dan houd het in vacuüm bij thij dezelfde temperatuur gedurende 60 sec.
- Plaats de wafer in een donkere doos voor 24 uur voor uitdroging.
- Maak de wafer aan UV-licht om het ontworpen patroon overbrengen naar de fotoresist.
- Dompel de wafer in fotolak ontwikkelaar oplossing (AZ400K) voor 240 sec. Spoel daarna de wafer met isopropyl alcohol en drogen door in een stroom stikstofgas.
- ICP-DRIE (inductief gekoppeld plasma - Deep Reactive Ion ets) Proces
- Solliciteer DRIE etsen. Kies de gewenste etsdiepte volgens einddiepte vereist voor toestel (50 urn in dit onderzoek). Fotoresist werkt als een maskerende laag tijdens dit proces.
- Verwijder de resterende fotolak met aceton en het reinigen van de wafer.
- PDMS (polydimethylsiloxaan) Gieten
- Gebruik trichloromethylsilane (TCMS) voor silaniseren het silicium meester mal. Giet 2 of 3 druppels trichloromethylsilane in een flacon en plaats het in een exsiccator naast desilicium meester schimmel. Laat 2-3 uur voor het silaneren proces te voltooien.
- In een afzonderlijke houder, meng de Sylgard 184 siliconenbasis met verharder gewichtsverhouding van 10: 1 tot PDMS bereiden. Ontgas de PDMS door het aan voorwaarden (ongeveer 2 uur) stofzuigen.
- Zet het silicium meester schimmel in een houder. Vervolgens giet de PDMS op silicium meester mal de PDMS stempel te vormen. Zorg ervoor dat belletjes vormen niet in het PDMS tijdens dit proces.
- Genezen van de PDMS gedurende 2 uur bij 80 ° C.
- Verwijder de PDMS stempel van de meester mal. Snij vervolgens de PDMS stempel in afzonderlijke microchips. Gebruik ten slotte een snij-kern om gaten te boren voor de inlaat (s) en de aansluiting (en).
- Verlijmen van PDMS aan Glass
- Expose de cover slip en PDMS stempel zuurstof plasma gedurende 30 sec. Bond PDMS stempel op de cover slip.
- Om een goede afdichting tussen de PDMS stempel en dekglas bereiken, hybridiseren de inrichting door deze in oven bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
2 Bacteriële Cultuur
OPMERKING: Proper bioveiligheid protocollen moeten worden gevolgd voor Steps 2-4. Raadpleeg de institutionele veiligheidsfunctionaris voor details.
- Bereid LB agarplaten
- Voeg 20 g Luria-Bertani (LB) agar (Miller) poeders en 500 ml ultrazuiver water in een 1 L kolf. Roer tot het poeder op te lossen.
- Steriliseren in autoclaaf bij 15 psi, 121 ° C gedurende 15 minuten.
- Laat de kolf op een bankje of in een waterbad in de bioveiligheid kap afkoelen tot 50-55 ° C.
- Voeg het antibioticum Tetracycline tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml te bereiken. Meng goed door werveling.
- Giet het mengsel in platen. Vul elke plaat tot 1/2 - 2/3 vol.
- Flame luchtbellen kort om ze pop als ze vormen. Verhard luchtbellen moeilijk bacteriekweek via spreiden.
- Laat de platen overnacht afkoelen bij kamertemperatuur.
- Wanneer ze zijn cool,zet borden terug in hun mouw, sluit de zak, label (antibiotica en datum), en bewaar bij 4 ° C.
OPMERKING: Bedek de voorraad van de platen met aluminiumfolie, zo licht deactiveert veel antibiotica.
- LB Broth Voorbereiding
- Voeg 20 g Luria-Bertani (LB) bouillon (Miller) poeders en 1 L van ultrapuur water in een kolf. Roer tot het poeder op te lossen.
- Steriliseren in autoclaaf bij 15 psi, 121 ° C gedurende 15 minuten.
- Laat fles op een bankje of in een waterbad in de bioveiligheid kap afkoelen tot 50-55 ° C.
- Voeg het antibioticum tetracycline tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml te bereiken. Meng goed door werveling.
- Wanneer ze afgekoeld zijn, plaatst u de gelabelde fles bij 4 ° C.
OPMERKING: Bedek de fles met aluminiumfolie, zo licht deactiveert veel antibiotica.
- Cultuur Bacteriën op een LB Agar Plate (Dit protocol maakt gebruik van Pseudomonas fluorescens)
- Neem de bacteriële voorraad uit de diepvries (-80 °; C) en plaats het op het ijs.
- Plaats de -80 ° C bacteriële voorraad en een LB-agar plaat in een bioveiligheid kap.
- Streak de bacteriestam op een LB-agar plaat in een zigzag patroon. Bedek de agar plaat en incubeer bij 30 ° C 's nachts. Tenslotte worden opgeslagen plaat in de koelkast bij 4 ° C.
- Bereid de Bacteriële Solution (S1)
- Giet 50 ml LB-bouillon-medium naar een kolf geautoclaveerd. Voer deze bewerking in een bioveiligheid kap.
- Transfer een enkele bacteriële kolonie van de LB-agar plaat aan de kolf. Deze operatie moet ook worden uitgevoerd in een bioveiligheid kap.
- Plaats de kolf in een shaker incubator bij 30 ° C en 150 rpm gedurende voldoende tijd (4 uur).
- Bereid de Verdun Bacteriële Solution (S2)
- Giet 5 ml LB-bouillon media in een steriele plastic buis.
- Verdun S1 door mengen met LB-bouillon media. Vervolgens geschud oplossing. Verdun de oplossing te komen van de gewenste optischeal dichtheid (OD gemeten bij 600 nm = 0,1).
OPMERKING: Biofilm experimenten doorgaans OD-waarden in deze omgeving in dienst.
3 Bereid de opstelling van de proef
- Met een pincet verbinding flexibele kunststofbuizen (0,20 "ID) in de inlaat (s) en uitlaat (s) van de microchip. De inlaten en uitlaten zijn vooraf geboord in de PDMS deel van de microchip (stap 1.5.5). In dit onderzoek , de microchip bestaat uit twee inhammen en een stopcontact.
- Vul de spuit (en) met bacteriële oplossing (S2-oplossing) en verwijder alle luchtbellen in de spuit (en).
- Sluit de spuit tip (s) (30 G 0.5 "stompe naald) in de inlaat buis (s). Sluit vervolgens afvoerbuis (s) op de verpakking te verspillen.
4 Voer het Experiment
- Sluit de spuit (en) aan de spuit tip (s).
- Plaats en fix spuit (en) op de injectiepomp. Plaats dan de microchip onder een optische microscoop met objectieven van desired vergroting (bijvoorbeeld 40X). Bedek de microchip met een levende cel kamer inrichting een constante temperatuur omgeving voor bacteriegroei (30 ° C voor P. fluorescens) handhaven.
- Stel de pomp naar de gewenste stroomsnelheid niveau (bijvoorbeeld 10 ul / uur) en initiëren fluïdum pompen.
- Zodra bacteriën worden aangebracht in de kamer, is de vorming van biofilm ook begonnen. Biofilmvorming en rijping zich meestal over een periode van enkele uren of zelfs dagen. Observeren en foto's maken van biofilm groei door de microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van bovenstaande microfabricage protocol werd een PDMS microfluïdische gebaseerd is geconstrueerd. Figuur 1 toont de scanning elektronenmicroscoop (SEM) beelden van de PDMS apparaat. Figuur 1a toont de ingangssectie van de inrichting. Een vork-achtige ingang wordt gecreëerd om de druk het hoofd te egaliseren over het apparaat. Verdere SEM beeldvorming toonde ook aan dat de pilaar muren bijna verticale (Figuur 1b). De gekweekte bacteriële oplossing (figuur 2) werd verdund en de optische dichtheid werd ingesteld op een waarde van 0,1. We onderzochten biofilmvorming in de microfluïdische inrichting als functie van de input stroomsnelheid. Toen P. fluorescens werd geïnjecteerd in het apparaat bij een lage stroomsnelheid van 0,8 ul / uur, bacteriële hechting en biofilmvorming traden op de wanden van de inrichting. Ook na langere tijd (> 20 uur), geen andere dan oppervlakte koesteren biofilms bacteriële structuren weopnieuw waargenomen. Vervolgens werd hetzelfde experiment herhaald met een stroomsnelheid van 8 ul / uur. In dit geval biofilm vorming op gang komen na een paar minuten van infusie van het verdunde bacteriële kweek. Na enkele uren verschijnen van filamenteuze structuren uitstrekt tussen micro-pijlers waargenomen nabij het middelste gedeelte van de inrichting (figuur 4). Deze filamenteuze structuren kunnen worden gevisualiseerd door de aanwezigheid van immobiele bacteriën. Deze structuren zijn bekend als streamers en zij filamenteuze biofilms die alleen zijn gebonden aan een of beide uiteinden van oppervlakken. De rest van de structuur is vaak gesuspendeerd in het vloeibare medium (zoals in dit geval). Figuur 4 toont de tijd-evolutie van biofilm streamer structuur. Streams vormen meestal onder invloed van vocht afschuiving op de visco-elastische biofilm. Figuur 5 toont de stroomlijnen en snelheid contouren voor stroming langs een reeks zuilen. De simulatie toont aan dat de streamers dievorm ons microfluïdische systeem hoofdzaak uitgelijnd langs de fluïdumstroom stroomlijnen. De correlatie tussen de stroom structuren en de vorming van biofilm streamers is nog niet goed begrepen. Echter, Das en Kumar 16 onlangs voorgesteld deze streamers vormen als zeer viskeuze vloeibare toestand van de intrinsiek visco-elastische biofilms. Zij baseerden hun gissingen op de observatie dat de tijdschaal van biofilm wimpel formatie doorgaans veel groter dan de visco-elastische ontspanning tijdschalen van biofilms. Biofilms zijn bekend te gedragen als visco-elastische vloeistoffen en daarmee op tijdschalen veel groter dan de viscoelastische relaxatietijd schaal die in hoofdzaak gedragen als zeer viskeuze vloeistoffen 17. Volgens deze formulering kan wimpels verwachting ontstaan op plaatsen van hoge schuifspanning. Figuur 5 toont de locaties van hoge snelheid in het kanaal, en deze locaties samenvallen met locaties van hoge schuifspanning. In de eerste pha se groei worden waargenomen streamers afkomstig dichtbij deze plaatsen (figuur 4).
Figuur 1 Scanning elektronenmicroscoop (SEM) beelden van de microfluïdische kanaal (bovenaanzicht). a) Inlaat sectie, b) regio die micro-pijlers. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 opeenvolgende stappen die betrokken zijn bij bacteriecultuur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Stel voor microfluïdische experimenten. 1-optische microscoop (omgekeerde), 2-spuit pomp, 3-Beeld en data-acquisitie, 4-spuit met kleurstof (optioneel), 5-Spuit met bacteriën, 6-afval reservoir. aub klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Time-lapse confocale beeldvorming van de evolutie van streamers. Beeldvlak overeen met z = 25 pm dwz midden van het apparaat. Binnen de ellipsen demonstreren biofilm streamers. Klikhier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Computational vloeistof mechanische simulaties tonen stroomlijnt en snelheid contouren van de stroming langs micro-pijlers. Stroomrichting is van boven naar beneden en de snelheid schaal is in m / sec. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben laten zien een eenvoudige microfluïdische apparaat dat poreuze media nabootst voor het bestuderen van biofilm ontwikkeling in complexe habitats. Er zijn verschillende belangrijke stappen die de uitkomst van de experimenten bepalen. Zij omvatten geometrie apparaat. Terwijl de paal geometrie kan variëren, voldoende porie-ruimte voor streamers te vormen noodzakelijk. Bovendien Valiei et al. 1 hebben aangetoond dat streamer vorming treedt alleen in bepaalde Luchtdebiet. Bij een flow lager dan een drempelwaarde, kan vervorming van biofilms in streamers niet in acht worden genomen. Maar boven een bepaalde drempel een ander debiet waarde, kan biofilm fractuur domineren en niet de vorming van streamers mogelijk te maken. Een ander probleem dat deze experimenten kunnen teisteren is gasbellen die gevangen in de micro-pijler-array kan worden. Meestal deze bellen te verwijderen door het verhogen van de stroomsnelheid eerst en vervolgens geleidelijk afneemt naar de gewenste waarde.
Microfluïdische platformsDergelijke bieden verscheidene voordelen en weinig beperkingen. Het platform stelt ons in staat om te werken met kleine volumes cultuur, en heeft de flexibiliteit van het opnemen van door de gebruiker gedefinieerde functies. Zo kunnen verschillende poreuze structuren worden gesimuleerd door het veranderen van de geometrische parameters van het micro-pijlers array. Zelfs structuren die de willekeurige structuur van real poreuze media nabootsen kunnen worden vervaardigd op microfluïdische platforms 18. Bovendien kunnen meerdere van dergelijke kanalen worden uitgevoerd op een enkel apparaat waardoor de collectie van belangrijke relevante gegevens voor een nauwkeurige statistische analyse. Echter, microfluïdische systemen kenmerkend nabootsen tweedimensionale structuur van poreuze media. Apparaten die de drie-dimensionale karakter van poreuze media kan nabootsen zijn meestal vrij uitdagend om te fabriceren.
Vorming en evolutie van streamers zijn nog niet goed begrepen, en verder onderzoek is nodig in deze richting. Begrip van hoe streamers vormen en leiden tot de indelingion van rijpe biofilm structuren om diverse scenario zoals verstopping van biomedische apparaten zoals hart stents, biofilms in grond, en filtersystemen relevant zijn. De microfluïdische platform is een stap in die richting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri dish | Fisher | 875712 | sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 incubator shaker series | |
| 50 ml sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene RNase-/DNase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 μg/ml |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole-Parmer |
References
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al. Encylopedia of Nanotechnology. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
