Abstract
Flere bakteriearter har evnen til å feste seg til overflater og kolonisere dem i form av tynne filmer som kalles biofilmer. Biofilm som vokser i porøse medier er relevant for flere industrielle og miljømessige prosesser som rensing av avløpsvann og CO 2-håndtering. Vi brukte Pseudomonas fluorescens, en Gram-negative aerobe bakterien, for å undersøke biofilmdannelse i et mikrofluid enhet som etterligner porøse medier. Den mikrofluidenheten består av en rekke mikro-innlegg, som ble fremstilt ved hjelp av myk-litografi. Deretter ble biofilmdannelse i disse enhetene med flyt undersøkt og vi demonstrere dannelsen av trådformede biofilmer kjent som streamere i vår enhet. De detaljerte protokoller for fabrikasjon og montering av mikrofluid enhet er gitt her sammen med bakteriekultur protokoller. Detaljerte prosedyrer for eksperimentering med microfluidic enhet er også presentert sammen med representantresultater.
Introduction
Nylig viste vi bakterielle biofilmdannelse dynamikk i en microfluidic enhet som etterligner porøse medier en. Bakterielle biofilmer er i hovedsak kolonier av overflate aggregeres bakterier som er omsluttet av ekstracellulære polymere stoffer (EPS) 2-4. Disse tynne filmer av bakterier kan dannes i nesten enhver tenkelig nisje alt fra glatte flater til mye mer kompleks habitat av porøse medier. Valiei et al. Benyttet 1 en mikrofluidteknisk apparat med en matrise av mikrosøyler for å simulere et porøst medium struktur og studert biofilmdannelse i denne anordningen som en funksjon av fluidets strømningshastighet. De fant at i en bestemt strømningsregime, filamentøse biofilmer kalt hydrofonkabler begynte å komme ut mellom forskjellige søyler. Streamere kan være bundet til en eller begge ender for faste overflater, men resten av strukturen er suspendert i væske. Streamer dannelsen starter vanligvis etter en innledende lag av biofilm er dannet og dens formation kan diktere den langsiktige utviklingen av biofilm i slike komplekse habitater. Nylig har flere forskere undersøkt dynamikken i streamer formasjon. Yazdi et al. Fem viste at streamerne kan dannes i virvelstrømmer som stammer fra en oscillerende boble. I et annet eksperiment, Rusconi et al. Seks undersøkte effekten av kanalen kurvatur og kanalgeometri på dannelsen av streamere. De fant at streamerne kan dannes i krumme deler av mikrokanaler, og streamer morfologi er relatert til motilitet. Nyere forskning har vist at kabler kan ha store konsekvenser i en rekke naturlige og kunstige scenarier som de kan virke som forløpere for dannelsen av modne strukturer i porøse grensesnitt, føre til rask og katastrofale biofilm proliferasjon i en biomedisinsk systemer, og også forårsake betydelig strømnings struktur interaksjoner, etc 1,7-9.
Biofilm streamere ofte danner jegn komplekse habitater som porøse medier. Forståelse biofilm vekst i porøse medier miljø er relevant for flere miljø og industrielle prosesser som for eksempel biologisk rensing av avløpsvann 10, opprettholde brønnborings integritet i situasjoner som for eksempel CO 2-fangst 11 og plugging av porene i jorda 12. Observere biofilmdannelse i slike komplekse habitater kan ofte være utfordrende på grunn av tettheten av porøs medier. I slike situasjoner kan Microfluidics basert porøse medieplattformer bevise svært fordelaktig som de tillater sanntid og in situ overvåking. En annen fordel med MicroFluidics er evnen til å bygge flere bioreaktorer på en enkelt bio-mikrofluid plattform, og samtidig gi rom for elektronisk overvåking og / eller inkorporering av sensorer. Fleksibiliteten til å implementere flere laboratorieforsøk i en enhet, og evnen til å samle vesentlige relevante data for nøyaktig statistisk analyse er en viktig advantage av microfluidic systemer 13,14.
I sammenheng med diskusjonen ovenfor, ville forståelse streamer formasjons dynamikk i en porøs mediemiljø være gunstig for flere programmer. I denne studien, utvikler vi protokollen for å undersøke streamer formasjonen i en enhet som etterligner porøse medier. Fabrikasjon av mikrofluid plattformen, er nødvendige skritt for cellekultur, og eksperimentering er beskrevet. I våre forsøk, ble villtype bakteriell stamme av Pseudomonas fluorescens som anvendes. P. fluorescens, som finnes naturlig i jord, spiller en nøkkelrolle i å opprettholde jord økologi 15. Bakteriestammen ansatt hadde blitt genmodifisert til å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP) konstitutivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utfør de eksperimentelle protokoller her i den rekkefølge som er beskrevet nedenfor. Microfabrication protokoller for å skape mikrofluid plattform er beskrevet i trinn 1. Trinn 2 beskriver bakteriekultur-protokollen (figur 2), og Trinn 3 vedrører montering av det eksperimentelle oppsettet (figur 3). Til slutt blir den faktiske eksperimentelle trinn er beskrevet i trinn 4.
1. Chip Fabrication Prosedyre
NB: Riktig sikkerhetsprosedyrer må følges for prosessene som er beskrevet nedenfor. Konsultere institusjonelle verneleder for detaljer.
- Design maske med et egnet programvare (f.eks L-Edit). Kanalen utforming består av en hovedmikrokanal med bredde 625 um. Den sentrale region av kanalen inneholder en matrise av mikro innlegg 50 pm i diameter, i avstand 25 mikrometer fra hverandre (se Supplemental filer).
- Skriv ut dette designet på glass (5 "x 5" soda lime glass), Som har en tykkelse på 0,09 ", og er belagt med omtrent 70 nm tykt lag av krom (Cr), ved hjelp av maskeringsmiddel for å fremstille en fotomaske. Bruk AZ400K utvikler i 1 min. Deretter etse Cr sjikt ved hjelp av Cr ets i omtrent 1 min Bruk aceton for å fjerne resisten og rense det med kaldt piranha løsning. (H 2 SO 4 og H 2 O 2 i et forhold på 3: 1).
- Fotolitografi
- Rengjør en standard 4 "silisium wafer kjemisk med piraja løsning for 20 min.
- Skyll wafer med DI vann og tørk det.
- Varm skiven på en varm plate (200 ° C i 15 min).
- Coat silisiumskiven med fotoresist. Her er den positive fotoresist AZ4620 ble rotasjonsbelagt på en silisiumskive ved 2000 rpm i 25 s for å oppnå en 12,5 mikrometer tykt sjikt.
- Fjern alt løsningsmiddel ved moderat brenning av skiven på en varm plate ved flytende skiven i 90 sekunder på nitrogenstrøm ved 100 ° C. Deretter holde den i vakuum ved tHan samme temperatur i 60 sek.
- Plasser wafer i en mørk boks for 24-timers for dehydrering.
- Utsett wafer for UV-lys for å overføre designet mønsteret til fotoresist.
- Fordyp wafer i fotoresist fremkallerløsning (AZ400K) for 240 sek. Deretter skylles wafer med isopropylalkohol og tørket ved å plassere det i en strøm av nitrogengass.
- ICP-DRIE (induktivt koblet plasma - Deep Reaktiv Ion Etching) Process
- Påfør DRIE etsing. Velg riktig etch dybde i henhold til endelig dybde som kreves for enheten (50 mikrometer i denne undersøkelsen). Fotoresist fungerer som et maskeringslag i løpet av denne prosessen.
- Fjern det gjenværende fotoresist med aceton og rense skiven.
- PDMS (polydimethylsiloxane) Casting
- Bruk trichloromethylsilane (TCMS) for silanizing silisium mester mold. Hell 2 eller 3 dråper trichloromethylsilane i hetteglass og legg den i en eksikkator ved siden avsilisium mester mold. Tillat 2-3 timer for silanizing prosessen fullføres.
- I en separat beholder, bland Sylgard 184 silikon base med herder ved vektforhold på 10: 1 for å klargjøre PDMS. Avgasse PDMS ved å utsette det for vakuum betingelser (ca. 2 timer).
- Sett silisium mester mold i en holder. Deretter helle PDMS på silisium mester mold å danne PDMS stempel. Sørg for at bobler ikke danner i PDMS under denne prosessen.
- Kurere PDMS i 2 timer ved 80 ° C.
- Trekk av PDMS stempel fra master mold. Deretter kuttet de PDMS stemple inn i separate microchips. Til slutt, bruk skjærekjerne å bore hull for innløpet (s) og utløp (e).
- Liming av PDMS til Glass
- Expose dekkglass og PDMS stempel til oksygen plasma for 30 sek. Bond PDMS stempel til dekkglass.
- For å oppnå en skikkelig tetning mellom PDMS stempel og dekkglass, varmebehandles i apparatet ved å sette den i ovn ved 70 ° C i 10 min.
2. bakteriekultur
MERK: Riktig biosikkerhet protokoller må følges for trinn 2-4. Konsultere institusjonelle verneleder for detaljer.
- Forbered LB agar plater
- Tilsett 20 g Luria-Bertani (LB) agar (Miller) pulver og 500 ml ultrarent vann til en 1 L kolbe. Rør til pulveret er oppløst.
- Steriliser ved autoklavering ved 15 psi, 121 ° C i 15 min.
- Tillat kolben avkjøles til 50-55 ° C på en benk eller i et vann-bad i biosikkerhet hette.
- Tilsett antibiotikum Tetracycline for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml. Bland godt ved å svinge.
- Hell blandingen i platene. Fyll hver plate till 01.02 til 02.03 full.
- Flame luftbobler kort for å pop dem hvis de danner. Størknede luftbobler er vanskelige å spre bakteriekultur over.
- Tillater platene å avkjøles ved romtemperatur over natten.
- Når de er kule,sette platene tilbake i ermet, forsegle posen, etikett (antibiotika og dato), og oppbevar ved 4 ° C.
MERK: Dekk lager av plater med aluminiumsfolie, som lys deaktiverer mange antibiotika.
- LB buljong Forberedelse
- Tilsett 20 g Luria-Bertani (LB) kjøttkraft (Miller) pulver og en L av ultrarent vann til en kolbe. Rør til pulveret er oppløst.
- Steriliser ved autoklavering ved 15 psi, 121 ° C i 15 min.
- Tillat kolben avkjøles til 50-55 ° C på en benk eller i et vann-bad i biosikkerhet hette.
- Tilsett antibiotisk tetracyklin for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml. Bland godt ved å svinge.
- Når kjølig, plassere den merkede flasken ved 4 ° C.
MERK: Dekk til flasken med aluminiumsfolie, som lys deaktiverer mange antibiotika.
- Kultur bakterier på en LB agarplate (Denne protokollen bruker Pseudomonas fluorescens)
- Ta bakteriell lager fra fryseren (-80 °, C) og plassere den på is.
- Plasser -80 ° C bakteriell lager og en LB agar plate inne i en biosikkerhet hette.
- Streak bakteriestammen på en LB agar plate i sikksakk mønster. Dekk agar plate og inkuber det ved 30 ° C over natten. Til slutt lagrer den plate i kjøleskap ved 4 ° C.
- Klargjør Bakteriell Solution (S1)
- Hell 50 ml LB buljong media til en Autoclaved kolbe. Utføre denne operasjonen inne i en biosikkerhet hette.
- Overfør en enkelt bakteriekoloni fra LB agarplate til kolben. Denne operasjonen bør også utføres inne i en biosikkerhet hette.
- Sett kolben i en risteinkubator ved 30 ° C og 150 rpm i tilstrekkelig tid (4 timer).
- Klargjør Fortynn Bakteriell Solution (S2)
- Hell 5 ml LB buljong media i en sterilisert plastrør.
- Fortynn S1 ved blanding med LB-næringsmediet. Deretter, vortex-løsning. Fortynn løsningen oppnå den ønskede optiskal tetthet (OD målt ved 600 nm = 0,1).
MERK: Biofilm eksperimenter bruker vanligvis OD verdiene i denne nærhet.
3. Klargjør Forsøksoppsett
- Ved hjelp av en pinsett koble fleksible plastrør (0,20 "ID) inn i innløpet (ene) og utløp (e) av mikrochip. De innløp og utløp, er tidligere boret inn i PDMS parti av mikrobrikke (trinn 1.5.5.) I denne undersøkelsen består microchip av to innløp og ett utløp.
- Fyll sprøyte (e) med bakteriell oppløsning (S2-løsning) og fjerne alle boblene i sprøyten (e).
- Koble sprøytespissen (e) (30 g 0,5 "stump nål) i innløpsrøret (ene). Deretter kobler utløpsrør (e) til avfallsbeholder.
4. Kjør Experiment
- Koble sprøyten (e) til sprøytespissen (e).
- Sted og fix sprøyte (e) på sprøytepumpen. Deretter plasserer microchip under en optisk mikroskop med objektiv på Desired forstørrelse (f.eks, 40X). Dekk mikrobrikke med en levende celle kammer-enhet for å opprettholde en konstant temperatur miljø for bakteriell vekst (30 ° C i P. fluorescens).
- Sett pumpen til ønsket flow rate nivå (si 10 mL / t) og initiere væske pumping.
- Når bakteriene innføres i kammeret, er biofilmdannelse også initiert. Biofilm dannelse og modning vanligvis skje over en periode på flere timer eller dager. Observere og ta bilder av biofilm vekst gjennom mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av den ovenfor nevnte microfabrication protokollen, ble en PDMS baserte mikrofluidinnretning som er konstruert. Figur 1 viser scanning elektronmikroskop (SEM) bilder av PDMS-enheten. Figur 1a viser inngangsdelen av enheten. En gaffel-lignende inngangen er opprettet for å utjevne trykket hodet over enheten. Videre SEM bildebehandling viste også at pilar veggene er nesten loddrett (Figur 1b). Den kultiverte bakterieløsning (figur 2) ble fortynnet, og dens optiske densitet ble justert til en verdi på 0,1. Vi undersøkte biofilmdannelse i mikrofluidenhet som en funksjon av inngangsstrømningshastigheten. Når P. fluorescens ble injisert inn i apparatet ved en lav strømningshastighet på 0,8 mL / time, bakteriell feste og biofilmdannelse forekom ved veggene i enheten. Selv etter en lengre periode (> 20 timer), ingen andre bakterielle andre enn overflate hugging biofilm strukturer vire observert. Deretter ble samme forsøk gjentatt med en strømningshastighet på 8 mikroliter / time. I dette tilfellet, biofilmdannelse på nytt startet etter noen få minutter av infusjon av den fortynnede bakteriekultur. Imidlertid, etter noen timer, ble utseendet av filamentstrukturer som strekker seg mellom mikro-søyler observert i nærheten av midtpartiet av enheten (figur 4). Disse trådformede strukturer kunne visualiseres ved tilstedeværelsen av ubevegelige bakterier. Disse strukturene er kjent som streamere, og de er filamentøse biofilmer som bare er tjoret til den ene eller begge ender til overflater. Resten av strukturen er ofte opphengt i det flytende medium (som i dette tilfelle). Figur 4 viser tids utviklingen av biofilm streamer struktur. Streamere danner vanligvis på grunn av virkningen av fluidskjær på viskoelastisk biofilm. Figur 5 viser strømlinjene og hastighets konturer for strømning forbi en rekke pilarer. Simuleringen viser at streamerne somform i vårt mikrofluidsystem er i det vesentlige innrettet langs fluidstrømningsstrømlinjene. Korrelasjonen mellom strømningsstrukturer og dannelse av biofilm streamere er ennå ikke godt forstått. Imidlertid har Das og Kumar 16 nylig foreslått at disse streamere form som svært tyktflytende væske tilstand av egen viskoelastiske biofilm. De baserte sin gjetning på observasjonen om at tiden skala av biofilm streamer dannelse vanligvis langt overstiger de viskoelastiske avslapping tidsskalaer av biofilm. Biofilmer er kjent for å oppføre seg som væsker viskoelastiske og dermed på tidsskalaer er mye større enn den viskoelastiske relaksasjonstid skala, at de i det vesentlige oppfører seg som høyviskøse væsker 17. I henhold til denne formelen, kan strømmen være forventet å stamme på steder med høye skjærspenninger. Figur 5 viser plasseringen av høy hastighet i kanalen, og disse steder sammenfaller med plasseringen av høye skjærspenninger. I den innledende pha SØ for vekst, er streamere observert å stamme i nærheten av disse stedene (figur 4).
Figur 1. Scanning elektronmikroskop (SEM) bilder av mikrofluidkanalen (top-view). a) Inlet delen. b) Region inneholder mikro søyler Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sekvensiell trinnene involvert i bakteriekultur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sett opp for microfluidic eksperimenter. 1-optisk mikroskop (invertert), 2-sprøytepumpe, 3-Image og datainnsamling, 4-sprøyte inneholder fargestoff (valgfritt), 5-sprøyte inneholdende bakterier, 6-Avfall reservoaret. Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Time-lapse confocal avbildning av utviklingen av streamere. Bildeplanet tilsvarer z = 25 mikrometer dvs. midten av enheten. Stiplede ellipser demonstrere biofilm streamere. Vennligst klikkher for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Computational Fluid mekaniske simuleringer som viser strømlinjene og hastighet konturene av flyt forbi mikro-stolpene. Væske forbruk er fra topp til bunn og hastighetsskalaen er i m / sek. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viste en enkel microfluidic enhet som etterligner porøse medier for å studere biofilm utvikling i komplekse habitater. Det er flere viktige skritt som dikterer utfallet av forsøkene. De omfatter geometri enhet. Mens stillingen geometri kan variere, er det nødvendig for tilstrekkelig pore-mellomrom for å danne streamere. Videre Valiei et al. 1 har vist at streamerdannelse forekommer bare i en viss strømningshastighet rekkevidde. Ved strømningshastigheter som er lavere enn en terskelverdi, kan deformasjon av biofilmer i streamere ikke observeres. Ennå over en viss annen terskel flow rate verdi, kan biofilm brudd dominere og ikke tillate dannelsen av streamere. Et annet problem som kan plage disse eksperimentene er gassbobler som kan settes fast i mikro-pilaren array. Vanligvis er disse bobler har til å bli fjernet ved å øke strømningshastigheten begynne med og deretter gradvis avtagende den til den ønskede verdi.
Microfluidic plattformerslik som disse tilbyr flere fordeler og få begrensninger. Plattformen gjør det mulig for oss å jobbe med små kultur volumer, og har fleksibilitet til å innlemme brukerdefinerte funksjoner. For eksempel kan forskjellige porøse strukturer bli simulert ved å endre de geometriske parameterne for den mikro-søyle array. Selv strukturer som etterligner den tilfeldige strukturen i ekte porøse medier kan være fabrikkert på microfluidic plattformer 18. Dessuten kan flere slike kanaler kan implementeres på en enkelt enhet slik at for innsamling av betydelige relevante data for nøyaktig statistisk analyse. Imidlertid microfluidic systemer vanligvis etterligner to-dimensjonale strukturen av porøse media. Enheter som kan etterligne den tredimensjonale art av porøst medium er vanligvis ganske vanskelig å fremstille.
Dannelsen og utviklingen av streamere er ikke godt forstått ennå, og videre forskning er nødvendig i denne retningen. Forståelse av hvordan streamere danne og lede til formatetion av modne biofilm strukturer vil være relevant for en rekke scenarier inkludert tilstopping av biomedisinske enheter som hjerte stenter, biofilm i jord, og filtrering systemer. Vår microfluidic plattform er et skritt i den retningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri dish | Fisher | 875712 | sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 incubator shaker series | |
| 50 ml sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene RNase-/DNase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 μg/ml |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole-Parmer |
References
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al. Encylopedia of Nanotechnology. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
