Summary
このプロトコルは、抗癌剤BBR3464とピコプラチンの態様を組み合わせた多核白金錯体の合成に使用するのに好適な架橋配位子を形成するためのイソニコチン酸とジアミノアルカンのアミドカップリング反応の使用を記載している。
Introduction
白金抗癌薬は、ヒト癌の治療における1薬剤の最も広く使用されている家族の一員のままである。それらの成功にもかかわらず、それらは重篤な用量を制限する副作用2-4によってその適用が制限される。患者に投与することができる限定された用量はまた、腫瘍が抵抗5を開発できることを意味する。このように、新たな薬物はphenanthriplatin 6およびphosphaplatin 7のように、副作用プロファイルを改善し、獲得耐性を克服するために開発され続けている。
1990年代後半に、三核プラチナ薬が開発された、BBR3464（ スキーム1）8、すなわち大手プラチナ薬剤、シスプラチンより試験管内で最大1,000 Xより細胞傷害性である。 BBR3464はまた、ヒト癌細胞株のパネル9で取得された耐性を克服することができる。残念ながら、BBR3464の活性の増加は50にマッチさ - 100に - 高い毒性を折り、そのその使用10月12日に制限されます。それはまた、簡単に、薬物のほとんどを意味する、体内で分解されるには、9そのまま癌の核に到達した。
ピコプラチンは、2 -メチル-ピリジン配位子（ スキーム1）13 を含有する単核白金系薬物である。この薬のメチル基は、生物学的な求核攻撃から保護します。ペプチド/タンパク質14〜16を含む特定のシステインおよびメチオニン。このように、薬物は非常に安定であり、BBR3464 17およびシスプラチンの両方と比較して癌核に達するはるかに高い濃度を有する。その還元反応性もピコプラチンはBBR3464とシスプラチン10,18,19と比較して、より高い最大耐量を有している。
このプロジェクトは、したがって、改善された生物学的安定性や重症度の低い副作用EFFEを表示する獲得耐性を克服することができます新薬を生産するBBR3464とピコプラチンの特性を組み合わせるように努めたカラット（ 例えば 、 図1）。そうすることで、二核白金錯体の範囲は、ビスピリジン架橋配位子20で調製した。リガンドは、イソニコチン酸、又は2 - メチル - イソニコチン酸、可変長ジアミノアルカンのようなその誘導体とのアミドカップリング反応を用いて製造される。 transplatin二モル当量の配位子の1モル当量の反応は、所望の白金錯体（ スキーム1）を得る。
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Protocol
1 N、N 'の合成- （1 -アルカン酸n-ジイル）diisonicotinamide
- すべての水分を除去されていることを確認するために、オーブン（100ºC、1時間）の単一首や3口丸底フラスコを乾燥させます。
- 磁気撹拌棒と一緒にフラスコに、固体のイソニコチン酸、またはその誘導体を追加します。ジアミノリガンド（単数または複数）は、室温で固体である場合、（イソニコチン酸のモル数に対して）0.5モル、この段階でフラスコに添加する。
- ラバーセプタムでフラスコの首（複数可）キャップ、連続窒素気流を介して、または窒素を充填したバルーンを使用することでどちらの窒素でフラスコ内の空気を交換してください。
- 固体を溶解し、無水ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシド（イソニコチン酸又は2 - メチル - イソニコチン酸500mgの当たり4ml）に追加するために皮下注射針及び注射器を使用する。固体は容易に溶解しない場合は、溶液を穏やかに加熱する。
- Aに（7モル当量を追加トリエチルアミン（弱塩基）とジアミノアルカンの0.5モル当量の使用済みイソニコチン酸）のマウント。溶液は室温で液体である場合には、1.5モル当量を加える。
- 連続的に攪拌しながら1 - プロピルホスホン酸無水物（カップリング剤）の1モル当量を添加し、反応物を5から12時間かけて完了させる。
リガンドの2。精製
- 10以上のメチレン基を持つジアミノリガンドを使用して作らビスピリジンリガンドの、反応の進行に伴って溶液から析出させた製品を待つ。
- ビスピリジンリガンドがジアミノオクタンを用いて作製するために、〜に40mlの水を添加して生成物を沈殿させる。
- ビスピリジンのために〜水40mlを加え、二から六メチレン基のジアミノアルカンを使用して作られ、化合物は、1〜3日かけて結晶化することができます。
- 真空濾過により、各ビスピリジンリガンドを収集し、約400〜500ミリリットル200あたりの沸騰水から再結晶リガンドのミリグラム。注：詳細水は彼らの非常に減少水溶性のために長くビスピリジンリガンドのために必要です。
- 化合物は、再結晶の際に、遊離塩基であることを保証するために溶液をNaOHおよびKOH（pH値9）を追加します。
二核白金錯体の3。合成および精製
- 完全に明確な強く黄色溶液を生成するトランス diamminodichloridoplatinum（II）、transplatin、暑い中で（70から80℃）、水（transplatin 200mgの当たり150ミリリットル）を溶解。
- ビスピリジン配位子の0.5モル当量を追加し、リガンドが溶解（透明な溶液）になるまで温度で溶液を攪拌する。ソリューションは、近い無色回し、熱をオフにして、いくつかの追加時間室温で撹拌するのを待ちます。
- 黄色の粉末を得るであろう、回転蒸発により溶媒を除去。
- 最小暖かい水の量（〜50＆に溶解して、白金錯体（ES）を浄化する＃186、C）。残りの黄色または白色の固形物が存在する場合、これらのフィルタOFF。
- 金属錯体のポリマー形態であると思われ、反応生成物の10％までを表し、白色の沈殿物が形成されるまで溶液にアセトンを加える。これ以上沈殿が表示されなくなるまで（〜エクストラ20〜30ミリリットル）アセトンの添加を続ける。注：この白い沈殿物が不純物である。
- ナイロン製濾紙（孔径0.2μm）と、純粋な生成物が得られる乾固するまで残った溶液を、回転蒸発を介してコンテンツをフィルタリングすることにより、この沈殿物を除去する。注：必要に応じて複合体が純粋になるまで、追加のアセトン沈殿工程を行うことができる。
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Representative Results
ビスピリジンリガンドおよびそれらのそれぞれの二核白金錯体は1 H、13 Cおよび195にPt NMR（ 表1および2）、およびエレクトロスプレーイオン化質量分析により特徴付けられる。正確な融点は最高のC、HおよびNの含有率の元素分析によって決定される示差走査熱量測定および純度を用いて決定することができる。それが決定的に成功したアミドカップリングおよび白金配位（ 表1、表2）を示すことができるの共鳴との最終生成物の単離から数分以内に結果を与え、迅速かつ使いやすいように、ほとんどの使用の1 H-NMRである。
イソニコチン酸三共振を有し;芳香族領域（7〜9 PPM）とカルボン酸のプロトンは13 ppmの周りの非常に広い共鳴の2重線。ジアミノプロトン共鳴は、すべて1と4 ppmの脂肪族領域に位置している。 tと彼はメチレン共鳴の多くのジアミノアルカン鎖の長さが長くなるが同等となる、そのようなものとして、より少ないピークが予想されるよりも脂肪領域において観察され;それらは、かなりより強いであり、それらの統合（ 表1および2）によって緩く割り当てることができるが。例えば、化学構造およびN、N 'の1 H NMRスペクトルのために、 図1および図2を参照して- （オクタン-1,8 -ジイル）ビス（イソニコチンアミド）、彪、リガンド。分子内に、5つの対称性脂肪共鳴は、通常、彪について予想される;しかし4最も内側のメチレンのピークはすべて磁気的に等価であり、〜1.2 ppmの1の大きな共鳴として現れる。
非結合ジアミノアルカンチェーンのアミンプロトン共鳴は、脂肪族領域に位置して、カップリングトンに応じ、芳香族領域に、大幅にダウンフィールド移動するときに最も重要な共鳴ですカルボン酸O。その後のアミドプロトンの共鳴は比較的広い三重共鳴（ 図2）のように、これらのリガンドのすべての周り8.7 PPMを見られます。
ビスピリジンリガンドへの白金族の調整は選択的リガンドの芳香族の共鳴（HA共鳴の0.15 ppmの低磁場シフトとHbの共鳴のシフト高磁場0.07 ppm）でのシフトとのための二重共鳴上の白金結合の遵守を通して観察されるハプロトン（ 図3）。ビスピリジンリガンドに対する白金の配位基はまた、195のPt NMRを用いて容易に観察することができる。白金共鳴の化学シフトを直接21に配位原子の種類に関連している。 Chloridoリガンドは195 Ptが（0 PPMに向かって）低磁場共鳴をシフトして、（M）井野リガンドは（-2500 PPMに向かって）共振を高磁場シフトしています。ここで合成された二核白金錯体は、単一のRを表示 3×AM（M）井野1×chloridoの配位状態（ 図4）22による-2300 ppmの周りesonance。 2リガンドは、単一のtransplatin分子（4×AM（M）アミノ環境）と反応させた場合、この不純物は-2400 ppmの22の高磁場になるのに対し、未反応transplatin不純物を共鳴として周り-2100 PPMを示すであろう。
スキーム1白金薬物ピコプラチンおよびBBR3464とビスピリジンリガンドおよびそれらのそれぞれの二核白金錯体の合成のための一般的な合成スキームの化学構造; R = HまたはCH 3であり ; nは白金錯体1-6カウンターイオンが省略されている。ここに記載した方法を用い、それらは二塩化塩である。
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図1 N、N 'の化学構造- （オクタン-1,8 -ジイル）ビス（イソニコチンアミド）リガンド、彪、および1 H NMRにおける共鳴の割り当てに使用されるプロトンナンバリングスキーム等価注分子の中心部にある4メチレンプロトン（HE）の。
図2 1 H NMR（DMSO-D 6、400 MHz）のN、N 'のスペクトル- 。（オクタン-1,8 -ジイル）ビス（イソニコチンアミド）、彪で約8.7トリプレットアミド共鳴の場所を確認します。最高のカップリングの前にジアミノエチルアミン共鳴1-2 PPMからのppm、。
図3。トランス- [{PT（NH 3）2 Clで} 2μ-彪] 2 +の1 H NMR（D 2 O、400 MHz）のスペクトルが。8.82 ppmの芳香ハ共鳴白金カップリングに注意してください。
図4 195のPt NMR（D 2 O、400 MHz）でのスペクトルトランス- [{白金（NH 3）2} Clで2μ-彪] 2 + PTN 3 Clで環境と一致している単一の広い共鳴周り-2300 PPMに注意してください。; N = AM（M）INE。
表1 400MHzでDMSO-d 6中ビスピリジンリガンドの1 H NMR特性データ d =ダブレット。; T =トリプレット; Q =カルテット。 M =多重。
表2 D 2における二核白金錯体の1 H NMR特性データ</強い> O 400MHzで d =ダブレット。; T =トリプレット; Q =カルテット。 M =多重。
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Discussion
本研究では二核白金錯体は、潜在的な抗癌剤として合成されている。そうすることでビスピリジン架橋配位子は、イソニコチン酸可変長ジアミノアルカンを用いたアミドカップリング反応を介して合成した。以前は2〜8個のメチレン基およびそれらのそれぞれの白金錯体とビスピリジンリガンドおよびそのメチル類似体の合成が報告されている。本論文では、合成および精製方法は、それがより速く、より安く作る改訂されており、8、10および12のメチレン基（8メチレン基に最短でビスピリジン配位子を合成し、これを実証して、彪は、新しいを比較しました古いメソッドの精製法）。二核白金錯体はまた、これらの配位子を用いて行った。
ビスピリジン配位子の合成は、弱塩基としてトリエチルアミンを用いて無水溶媒中で、不活性窒素雰囲気下で完了したカップリング剤としてのプロピルホスホン酸無水物。ニコチン酸は、それがDMF中よりもDMSO中に良好に溶解するが、DMFまたはDMSOのいずれかが、溶媒として使用することができる。溶媒のいずれかのために、温水の走行流下で穏やかに加熱して溶解を補助するために使用することができる。
この従来の方法は、拡張反応時間（数日）、現在は解消されるのNaHCO 3とジエチルエーテルおよび中和に対する液体/液体抽出を含む多段階精製工程を必要とした。全ての反応は一段階で加算された後にリガンドの合成反応について、室温で数時間で完了する。ビスピリジンリガンドは、（8以下のメチレン基を有するリガンド）の水を添加して溶液から沈殿し、10および12のメチレン基リガンドの形成の際に溶液から沈殿する。すべてのリガンドは、彼らの遅いrecrystall沸騰水からそしてある場合には再結晶化させることができるブリダイゼーションは、X線回折に適した結晶を得ることができる。
二核白金錯体は、ビスピリジン配位子1モルに対してtransplatin 2モルを反応させることによって製造される。 chloridoリガンドのトランスlabializing効果は、主要な製品はビスピリジン配位子（環の窒素原子）上の単一のサイトを通じてプラチナ薬の調整であることが保証されます。二核白金錯体は、水、DMF及びDMSOの両方におけるジカチオン塩などの良好な溶解性を有する。
精製は、アセトンを用いて分別沈殿によって達成される。未同定の不純物が生成物の前に沈殿し、狭い細孔濾紙を通して濾過することにより除去される。それは、アセトン沈殿が精製される製品の量が増加するとのより良い動作することに注意することが重要です。 200ミリグラム未満の量で、方法は、同様に動作しないと繰り返してアセトン沈殿が必要になることができます。 200 mgまたは周囲の金額についてさらに我々は、単一のアセトン沈殿工程は、一般的にのみ必要であることがわかりました。
この論文は、特定のリガンドおよび白金錯体の合成を詳述しながら、ここで使用される技術は、リガンドおよび多核白金錯体のより広い範囲を合成するために適用することができる。例えば、適切な保護基で、例えばスペルミン及びスペルミジンなどの他のジアミノアルカンリガンドは、ビスピリジンリガンドを作製するために使用することができる。非対称ビスピリジンリガンドはまた他端に一端にイソニコチン酸及び2 - メチル - イソニコチン酸を用いて製造することができる。これらの非対称配位子は、ジアミノアルカン鎖の一端にFMOC / BOC-保護の使用によって生成することができる。鎖の非保護アミンを説明アミドカップリング反応を用いて、イソニコチン誘導体と反応させることができる。保護基は、次いで、ジアミノアルカン鎖から切断され、ニコチン酸の誘導体は、異なるANを使用して取り付けられている他のアミドカップリング反応。三核白金錯体はまた、潜在的に、三核を作るためピラゾリル系リガンドを使用する方法の適応を介してこれらのリガンドのいずれかを用いて作製BBR3464のような、22と錯体を形成することができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
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