Summary
توفر الفحص التركيز تشكيل طريقة واضحة لتقييم إمكانات تحويل من الجين الورمي مرشح.
Introduction
الخلايا السرطانية يمكن تمييزها عن نظيراتها العادية من قبل مجموعة واسعة من التعديلات، من أنماط التعبير الجيني لepigenomics إلى تغيرات شكلية والتكاثري. ومن بين هذه الأخيرة، وخفض الاعتماد على المصل، وفقدان الاتصال (الكثافة) تثبيط، واقتناء الانتشار مرسى مستقل، وفي نهاية المطاف، القدرة على تكوين الأورام عند حقنه في الحيوانات، مؤشرات قابلة للقياس مفيدة التحول الخبيث 3. عدة في المختبر والمقايسات فيفو تم وضعها من أجل التحول الخلوي. في المختبر فحوصات تهدف إلى تحديد وقياس التغيرات في التشكل الثقافة (التركيز تشكيل فحص)، وديناميات الثقافة (معدل النمو والكثافة التشبع)، وعامل النمو (النمو في انخفاض المصل) أو مرسى (النمو في أجار لينة) المتطلبات. لا يزال المعيار الذهبي لتحديد طبيعة الخبيثة من نوع الخلية تشكيل الورم (xenografts) في حيوانات التجارب. ومع ذلك، رانه يكلف وطول من الدراسات في الجسم الحي لا تجعل لهم دائما مبررا كخطوة أولى التحقق من صحة أو فحص الجينات المسرطنة مرشح. على الرغم من عدم الفحص في المختبر يوفر تقييم واضح للإمكانات أنكجنيك من الجين، فإنها توفر نظرة ثاقبة إمكانات أنكجنيك التي قد تضييق المستقبل في الدراسات المجراة. واحد من أكثر الأنظمة المستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانات أنكجنيك في المختبر هو التركيز تشكيل الفحص 2. ويعتمد هذا الأسلوب على استخدام NIH 3T3 الخلايا الليفية الماوس، خط خلية غير حولت الذي يظهر تثبيط اتصال قوية. overexpression من على النتائج الجين الورمي في فقدان النمو التي تعتمد على كثافة. الخلايا تحولت يمكن بعد ذلك تنمو في طبقات متعددة، وتشكيل "بؤر"، تصور بسهولة ضد أحادي الطبقة الخلفية للخلايا غير متحول. تشكيل التركيز الفحص، ثم، يقيس قدرة الجين الورمي مرشح للحث على التحول الخبيث، كما يتضح من فقدان الاتصال inhibition باعتباره النمط الظاهري للقياس. وقد استخدم FFA لتقييم التحول من overexpression من تحركات البروتينات (على سبيل المثال، SRC 4، BRAF 5)، عوامل النسخ (على سبيل المثال، N-MYC 6) مستقبلات، إلى جانب G-البروتين (على سبيل المثال، P2RY8 7) وGTPases (على سبيل المثال ورأس 1)، وغيرها. السهولة النسبية لهذا الاختبار يجعلها خيارا جيدا من شأنها أن توفر إجابة واضحة وسريعة بصريا ما إذا كان overexpression من الجينات يكفي لتحويل NIH 3T3 خلايا فأر الليفية في المختبر.
وFFA الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم بلات-E خط الخلية التعبئة والتغليف 8، والذي يوفر البروتينات الفيروسية التعبئة والتغليف، وفيروسات ناقلات pBABEpuro 9 (Addgene بلازميد 1764) لإنتاج الفيروس الارتجاعي. بعد ترنسفكأيشن مع بناء pBABEpuro التي تحتوي على الجينات في المصالح، فإن خط الخلية بلات-E تنتج الارتجاعي ecotropic التي يمكن استخدامها لتصيب خلايا NIH 3T3. تيطريقة الفيروسي له من توصيل الجينات هو أكثر فعالية من الأساليب ترنسفكأيشن الكيميائية التقليدية، وأنه يوفر وسيلة للتعبير عن هذا الجين على نحو مستدام 10. مرة واحدة دمجها في جينوم الخلايا NIH 3T3، والدافع overexpression من هذا الجين من الفائدة من جانب يكرر محطة الطويلة الفيروسية (LTR) المروج 11. ويمكن استخدام هذا التعبير المستمر لتحديد ما إذا كانت الجينات في المصالح والنشاط أنكجنيك، مقاسا تشكيل بؤر، على خلايا NIH 3T3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جعل النواقل الفيروسية
تسلسل الترميز لهذا الجين من الفائدة، فضلا عن الضوابط الإيجابية والسلبية، تندس في pBABEpuro بالطرق التقليدية الاستنساخ (PCR التضخيم، والهضم تقييد وربط). هناك أربعة مواقع قيود على ناقلات حيث يمكن إدخال DNA: إنزيم BamHI، SnaBI، EcoRI وسالي.
- إعداد ترنسفكأيشن الصف بلازميد DNA من خلايا المختصة باستخدام QIAGEN بلازميد ميدي عدة.
- قياس تركيز الحمض النووي باستخدام معمل NanoDrop2000.
2. الارتجاعي الإنتاج
سيتم استخدام خط الخلية التعبئة والتغليف بلات-E لإنتاج الفيروس الارتجاعي ecotropic التي سيلقي [كدنا] التي تهم خلايا NIH 3T3.
- إنشاء الثقافات بلات-E من خلايا مجمدة
- ذوبان الجليد بسرعة خلايا بلات-E في 37 ° C حمام الماء ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة ببطء 9 مل من بلات-E المتوسطة (دوlbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) + البنسلين والستربتوميسين).
- أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
- اعادة تعليق الخلايا مع 10 مل من بلات-E متوسطة ونقل إلى صحن ثقافة 10 سم.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة حتى تكون 80-90٪ متموجة (حوالي 2 أيام).
- تقسيم الخلايا
- نضح المتوسطة ويغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA واحتضان لمدة 1 دقيقة في RT.
- فصل الخلايا عن طريق الإصبع والتنصت، وإضافة 10 مل من بلات-E المتوسطة، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
- resuspend الخلايا مع 10 مل من بلات-E المتوسطة والبذور منها في أطباق جديدة في 1: 4-1: 6 التخفيفات.
- بلات-E البذر وترنسفكأيشن
- البذور 2 × 10 6خلايا لكل 10 سم صحن الثقافة باستخدام بلات-E وسيط وبدون أي المضادات الحيوية.
- احتضان الخلايا O / N في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة.
- اليوم التالي، ونقل 300 ميكرولتر من غروب-MEM إلى 1.5 مل microfuge أنبوب.
- إضافة 27 ميكرولتر من polyethylenimine (PEI)، وكاشف ترنسفكأيشن فعالة من حيث التكلفة 12، إلى أنبوب استعداد مع غروب-MEM. المزيج بلطف بواسطة الإصبع التنصت واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
- إضافة 9 ميكروغرام من DNA البلازميد ترنسفكأيشن الصف في أنبوب غروب-MEM / PEI، مزيج من قبل vortexing بلطف، واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
- إضافة DNA / PEI قطرة من الحكمة معقدة في طبق بلات-E، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- اليوم التالي، نضح في المتوسط تحتوي على كاشف ترنسفكأيشن وإضافة 10 مل من جديد بلات-E متوسطة (بدون المضادات الحيوية).
- عودة إلى الخلايا الحاضنة.
3. خلايا NIH 3T3 والعدوى
- إنشاء المعاهد الوطنية للصحة3T3 الثقافات والبذر
- ذوبان الجليد بسرعة خلايا NIH 3T3 في 37 ° C حمام الماء ونقل إلى أنبوب 15 مل. إضافة ببطء 9 مل من NIH 3T3 المتوسطة (DMEM + 10٪ FBS).
- أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 180 × ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
- resuspend الخلايا مع 10 مل من NIH 3T3 المتوسطة ونقل إلى صحن ثقافة 10 سم.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة. من المهم جدا أن الخلايا NIH 3T3 يتم الاحتفاظ دائما underconfluent (50-60٪)، كما تردد التحول التلقائي (وبالتالي مستويات القاعدية من تشكيل بؤر) يزيد مرة واحدة تصل إلى ثقافة confluency.
- البذور 3 × 10 5 خلايا لكل 10 سم طبق واحتضان O / N للعدوى في اليوم التالي.
- عدوى
- حصاد طاف فيروسات من الطبق بلات-E باستخدام 10 مل حقنة واحدة، وتصفية عليه من خلال 0.45 ميكرون حجم المسام النايلون مرشح غشاء، وتحويلها إلى 15 ملأنبوب.
- إضافة 10 مل من جديد بلات-E المتوسطة للخلايا (بدون المضادات الحيوية)، وإعادتها إلى الحاضنة.
- نضح المتوسطة من الطبق خلية NIH 3T3 للإصابة، وإضافة 5 مل من العادية المتوسطة NIH 3T3 و 5 مل من التي تحتوي على فيروس تصفيتها طاف.
- إضافة polybrene إلى الطبق بتركيز 6 ميكروغرام / مل.
- احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- اليوم التالي، كرر الخطوات من 3.2.1 - 3.2.5 لجولة ثانية من العدوى.
- استبدال المتوسطة التي تحتوي على الفيروس مع منتظم المتوسطة NIH 3T3.
- السماح للخلايا NIH 3T3 لتنمو لمدة 2-3 أسابيع، لتحل محل المتوسطة حسب الضرورة. تحقق من التعبير عن بروتين الاهتمام من جانب التقليدي الكهربائي البروتين وطخة مناعية على لست] خلية كاملة من لوحات طبق الأصل.
4. تلطيخ والكمي
- الكريستال البنفسجي تلطيخ
- نضح المتوسطة NIH 3T3 ووضع الأطباقعلى الجليد.
- غسل الأطباق مرتين مع PBS الجليد الباردة.
- إصلاح الخلايا مع الميثانول الجليد الباردة لمدة 10 دقيقة.
- إزالة أطباق من الجليد، ونضح الميثانول، وإضافة 3 مل من 0.5٪ محلول الكريستال البنفسجي المحرز في 25٪ الميثانول (RT).
- احتضان الأطباق لمدة 5 دقائق على RT.
- نضح الحل الكريستال البنفسجي وشطف بعناية الطبق مع ميلي-Q H 2 O حتى يأتي لا لون ثماره في الشطف.
- السماح للأطباق لتجف O / N على الفوق (كشف).
- بؤر الكمي
- مرة واحدة الأطباق جافة، استخدام مسطرة لقياس مجموعات الملونة على نحو مظلم من الخلايا على طبق من ذهب. الاعتماد فقط تلك التي هي أكبر من 5 ملم في القطر بأنها "بؤر". سجل عدد من البؤر وحساب المتوسطات وأهمية مقارنة مع الضوابط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MXD3 هو عامل النسخ الأساسي سحاب الحلزون حلقة حلزون ليسين (bHLHZ) الذي هو عضو من MYC / MAX / شبكة MAD. وهي عضو غير نمطية للأسرة MAD 13-15، وأفيد أن تشارك في التسرطن 16،17. بالمقارنة مع pBABEpuro (المراقبة السلبية) وMYC (مراقبة إيجابية)، كانت أطباق NIH 3T3 حيث تم overexpressed MXD3 أقل بكثير البؤر (الشكل 1A). وقد تم جمع البيانات في الشكل 1B من تجارب متعددة لتحديد أهمية.
كان هناك اهتمام الأولية في تحديد إمكانات أنكجنيك MXD3 لأنه لديها نشاط مماثل لMYC (على الجين الورمي معروفة). ومع ذلك، والنتائج من هذا الاختبار تشير إلى أن MXD3 لا يعمل كما هو الجين الورمي.
الشكل 1. التركيز تشكيل الفحصالنتائج. تم تحديد إمكانات أنكجنيك من MXD3 بواسطة فحص تشكيل التركيز (FFA) في الخلايا NIH 3T3. ويمكن استخدام كريستال البنفسج بمثابة وصمة عار بديلة: (A) الصور من الخلايا من تجربة واحدة ملطخة هيما 3. ملاحظة. (ب) النتائج المجمعة من ثلاث تجارب. وأجريت جميع التجارب في مكررة. التركيز التهم لكل تجربة هي كما يلي: تجربة # 1: pBABEpuro (13، 11)، MXD3 (3، 4)، MYCN (23، 19)؛ التجربة # 2: pBABEpuro (8، 7)، MXD3 (1، 0)، MYCN (22، 20)؛ التجربة # 3: pBABEpuro (9، 20)، MXD3 (3، 0)، MYCN (21، 12). أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري لعدد من البؤر عبر التجارب الثلاث. أهمية: ** p <0.01. *** P <0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر FFA طريقة سريعة وسهلة لتقييم التحول الخبيث في المختبر. فمن قابلة للفحص عدد كبير نسبيا من الجينات المرشحة، والمتطلبات التقنية المتواضعة جعلها فعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، اثنين أو أكثر من الجينات يمكن coexpressed (يشار إليها أحيانا باسم "التعاون" فحص) لتقييم إمكانات مكون للأورام الدمج. مزايا هذا الاختبار تعتمد على تقنية لها مباشرة، وسهولة القياس الكمي والقصير نسبيا بدوره حول الوقت. ويجب التأكيد على ذلك، ومع ذلك، أنه لا تشكل القيود المفروضة على جميع فحوصات في المختبر. فحص يقيم التحول أنكجنيك من خلال قياس واحدة من سمات المظهري من الخلايا السرطانية، وهي قدرتها على النمو خارج أحادي الطبقة في صحن الثقافة. نتائج سلبية، لذلك، ينبغي أن تفسر بحذر، وذلك الجين الورمي معين ربما تتسبب في تحول دون تعزيز هذا phenotyp خاصةالبريد أو قد تتطلب coexpression مع جين آخر (أي، أشار التعاون أعلاه). في هذه الحالة، فمن المستحسن لتقييم التحول التي كتبها أخرى في المختبر الأساليب، مثل تحديد معدل انتشار ومتطلبات المصل و / أو النمو مرسى مستقل، على سبيل المثال، وفحص أجار لينة.
على الرغم من أن تقنية FFA واضح ومباشر، يجب مراعاة عدة شروط. الأهم من ذلك، فمن الأهمية بمكان أن استخدام subclone من 3T3 الخلايا التي يظهر منخفض جدا التحول التلقائي. يجري قبل neoplasic (وهي الميزة التي تجعل هذا الخط خلية حساسة جدا لهذا الفحص)، قد تحتوي على بعض قوارير عدد كبير من الخلايا تحولت بالفعل، مما أدى إلى المستويات القاعدية مرتفعة بشكل غير مقبول للمقايسة. للحد من التحول التلقائي من المهم جدا أن ثقافة بدءا تم الحصول عليها من مصدر موثوق. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي subcultured الخلايا على فترات منتظمة ولم يسمح للوصول إلى confluency.ونحن نوصي يمر الثقافات عندما تصل حوالي 50٪ confluency. لهذا السبب، من المهم لخلق بنيات إضافية لاستخدام والضوابط. في تجاربنا، وكنا pBABEpuro تحتوي على MYC (أ الجين الورمي معروفة) 18 وpBABEpuro فارغة لتكون بمثابة السيطرة الإيجابية والسلبية، على التوالي.
ويمكن إدخال التركيبة من الفائدة إلى خلايا 3T3 باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب؛ الأكثر شيوعا، وقد استخدمت أساليب ترنسفكأيشن التقليدية. في بروتوكول المعروضة هنا، واستخدام تنبيغ الفيروسية يوفر طريقة موثوق وفعال وثابت من توصيل الجينات. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الارتجاعي ecotropic يجعل هذا الاختبار آمنة نسبيا عند التعامل مع ثوابت أنكجنيك المحتملة؛ ومع ذلك، ينبغي بالطبع أن يتبع الاحتياطات المناسبة للسلامة الأحيائية.
عند إجراء البروتوكول المذكور أعلاه، يجب أن يتم تنفيذ التجارب لوحة نسخة طبق الأصل من أجل كل من وصمة عار وحصاد الخلايا من تلك ررآتش. ويمكن بعد ذلك الخلايا التي تحصد أن تستخدم لتأكيد overexpression من الجينات-الاهتمام من جانب طخة مناعية.
وعلى الرغم من توصيل الجينات الفيروسية يقدم العديد من المزايا بالمقارنة مع التحول، وتجدر الإشارة إلى أنه لا يقدم بعض العيوب أيضا، والعديد من المعامل لا تزال تستخدم بروتوكولات التحول القياسية. تنبيغ الفيروسية قد لا تكون مناسبة عند الحاجة overexpression قوية؛ من ناحية أخرى، يمكن أن أهمية الفسيولوجية للمستويات عالية جدا من التعبير البلازميد ترنسفكأيشن حققت تكون موضع شك.
وأخيرا، ينبغي التأكيد على أن الفحص الثاني هو عادة اللازمة للتحقق من أن بؤر ومن المقرر أن التحول أنكجنيك. بؤر يمكن التقاطها (قبل تلطيخ) ونمت في لينة أجار لتأكيد الانتشار مرسى مستقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من جديد مبتكر برنامج جائزة مدير المعاهد الوطنية للصحة في (ED). وأيد AA في جزء من الجوائز البكالوريوس من المعهد الوطني للسرطان ومؤسسة العلوم الوطنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
- Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
- Celis, J. E. Cell biology : a laboratory handbook. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).
- Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
- Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
- Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
- Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
- Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
- Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
- Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
- Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
- Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
- Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
- Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
- Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508 (2012).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).
