Summary
聚焦形成分析提供了一个简单的方法来评估候选基因的转化潜力。
Introduction
肿瘤细胞可以从他们的正常对应来区分由范围广泛的改变，从基因表达模式以表观基因组形态学和增生性改变。在后者，降低血清依赖性，接触（密度）抑制损失，收购的锚定非依赖性增殖，最终，当注射到动物形成肿瘤的能力是恶变3是有用的，可衡量的指标。几种体外和体内试验已经开发了用于细胞转化， 在体外测定的目的是识别测定改变培养形态（焦点形成实验），培养动力学（生长率，饱和密度）和生长因子（生长血清减少的）或锚地（生长在软琼脂）的要求。的黄金标准，用于确定细胞类型的恶性性质仍然肿瘤形成（异种移植物）中的实验动物。然而，T他花费和体内研究的长度并不总是使它们正当作为候选癌基因的第一个验证步骤或筛选。虽然没有在体外测定提供了一个基因的致癌潜力的一个明确的评估，它们提供的洞察致癌潜力，可能在体内研究缩小将来。其中最广泛使用的系统，用于在体外评估致癌潜力的是焦点形成分析2。这种方法依赖于使用的NIH 3T3小鼠成纤维细胞，非转化细胞系，显示强烈的接触抑制。在密度依赖性生长的丧失的癌基因的过度表达的结果;然后转化的细胞可以生长在多个层，形成“病灶”，很容易地可视化对未转化细胞的背景单层。焦点形成分析，那么，衡量一个候选人癌基因的能力引起恶变，就证明了接触INHIB损失银行足球比赛作为衡量的表型。 FFA的已使用蛋白激酶的过表达（ 例如 ，Src蛋白4，BRAF 5），转录因子（ 例如 ，N--myc基因6），G-蛋白偶联受体（ 例如 ，P2RY8 7）和GTP酶（ 例如 ，以评估转换，拉斯1），等等。相对容易此测定的使得它一个很好的选择，这将提供一个快速和视觉上明确的答案的基因的过表达是否足以转化的NIH 3T3小鼠成纤维细胞在体外 。
在这个协议中所描述的FFA使用开发平台-E包装细胞系8，它提供了病毒包装蛋白和逆转录病毒载体pBABEpuro 9（Addgene质粒1764）产生逆转录病毒。转染用含有感兴趣的基因的pBABEpuro构建体后，将开发平台-E的细胞系将产生亲嗜性逆转录病毒可以用于感染的NIH 3T3细胞。牛逼基因传递，他的病毒的方法比传统的化学转染方法更高效，它提供了一种可持续表达基因10。一旦掺入NIH 3T3细胞的基因组中，所关注的基因的过表达是由病毒长末端重复序列（LTR）启动子11驱动。这个常量表达式可以被用来确定感兴趣的基因是否具有致癌活性，如通过形成病灶，在NIH 3T3细胞测定。
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Protocol
1.使病毒载体
为感兴趣的基因，以及阳性和阴性对照的编码序列，插入pBABEpuro通过传统的克隆方法（PCR扩增，限制性消化和连接）。上有矢量4的限制性位点，其中该DNA可被插入：BamHI位，SnaBI位，EcoRI和SalI位。
- 从准备使用QIAGEN质粒Midi试剂盒感受态细胞转染级质粒DNA。
- 使用NanoDrop2000分光光度计测量DNA浓度。
2.逆转录病毒生产
该开发平台-E包装细胞系将被用于产生亲嗜性逆转录病毒，将提供感兴趣的NIH 3T3细胞中的cDNA。
- 建立从冷冻细胞开发平台-E培养
- 迅速解冻开发平台-E细胞在37℃水浴并转移到一个15毫升的锥形管。慢慢加入9毫升开发平台-E介质（杜lbecco改进的Eagle培养基（DMEM）+ 10％胎牛血清（FBS）+青霉素和链霉素）。
- 离心管，在180× 克5分钟，并弃去上清液。
- 重新悬浮细胞用10ml开发平台-E培养基并转移到10cm的培养皿中。
- 孵育所述细胞在37℃，5％CO 2的培养箱中，直到它们80-90％汇合（约2天）。
- 细胞分裂
- 吸出培养基，用PBS洗一次细胞。
- 加2ml的0.05％胰蛋白酶-EDTA和孵化在室温1分钟。
- 分离攻丝细胞通过手指，加入10 mL开发平台-E培养基中，将细胞悬液转移到15毫升管。
- 离心管，在180× 克5分钟，并弃去上清液。
- 悬浮细胞10毫升开发平台-E介质和种子在他们的新菜，在1：4-1：6稀释。
- 开发平台-E播种和转染
- 种子2×10 6个细胞每使用开发平台-E中无任何抗生素10厘米培养皿。
- 孵育在37°C，5％ 二氧化碳培养箱细胞O / N。
- 次日，转移300微升的Opti-MEM的入1.5mL微管中。
- 添加27微升的聚乙烯亚胺（PEI），具有成本效益的转染试剂12，向制备的管的Opti-MEM。通过手指敲击轻轻混匀，并培育5分钟在室温。
- 添加9微克染同类的质粒DNA导入的Opti-MEM / PEI管，通过涡旋轻轻混匀，并孵育15分钟，在室温。
- 添加DNA / PEI复杂滴进开发平台-E盘，孵化O / N在37℃，5％CO 2。
- 第二天，吸出含有转染试剂的培养基中，并添加10ml新鲜开发平台-E培养基（无抗生素）。
- 返回的细胞培养箱。
3. NIH 3T3细胞和病毒感染
- 建立NIH3T3文化和播
- 迅速解冻NIH 3T3细胞在37℃水浴中，并转移到15毫升管。慢慢加入9毫升NIH 3T3培养基（DMEM + 10％FBS）的。
- 离心管，在180× 克5分钟，并弃去上清液。
- 将细胞重悬于10毫升NIH 3T3介质和传输到10cm的培养皿中。
- 孵育在37℃，5％CO 2培养箱中的细胞。这是非常重要的是，NIH 3T3细胞始终保持underconfluent（50-60％），作为自发变换（和灶形成的，因此基础水平）的频率增加，一旦培养达到汇合。
- 每10 cm培养皿种子3×10 5细胞，并培育O / N感染的第二天。
- 感染
- 通过使用10ml的一次性注射器，通过0.45μm孔径的尼龙膜过滤器过滤它，并将其转移到一个15毫升的收获从开发平台-E盘的逆转录病毒上清液管。
- 加入10毫升新鲜开发平台-E中的细胞（无抗生素），并将其返回到孵化器。
- 吸从NIH 3T3细胞中盘被感染的介质，并加入5ml含病毒过滤的上清液的定期NIH 3T3介质和5毫升。
- 加入聚凝胺至培养皿以6微克/ ml的浓度。
- 孵育细胞在o / n 37℃下，5％的CO 2。
- 第二天，重复步骤3.2.1 - 3.2.5第二轮感染。
- 更换含有病毒的培养基定期NIH 3T3中。
- 允许在NIH 3T3细胞中生长2-3周，更换培养基是必要的。检查的目的蛋白质的表达通过常规蛋白电泳和免疫印迹上从复制平板全细胞裂解液。
4.染色和定量
- 结晶紫染色
- 吸出NIH 3T3中，将菜在冰上。
- 用冰冷的PBS两次洗碗。
- 固定的细胞用冰冷的甲醇中10分钟。
- 从冰取出盘子，吸出甲醇，并加入3毫升0.5％结晶紫溶液中的25％甲醇（RT）下进行。
- 孵育菜为5分钟在室温。
- 吸出的结晶紫溶液并小心地冲洗用Milli-Q H 2 O的培养皿直至没有颜色在漂洗脱落。
- 让菜干O / N在工作台上（发现）。
- 佛慈定量
- 一旦菜是干的，用尺子来测量上盘细胞的深颜色的集合。只计数那些大于5毫米，直径为“焦点”。记录病灶的数量，并计算平均值和与对照相比的显着性。
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Representative Results
MXD3是一个基本的螺旋 - 环 - 螺旋亮氨酸拉链（bHLHZ）转录因子是这样的MYC / MAX / MAD网络中的成员。它是MAD家族13-15的非典型构件，并且它已经被报道参与致癌16,17。相比pBABEpuro（阴性对照）和MYC（阳性对照），美国国立卫生研究院3T3菜肴其中MXD3过表达有显著更少灶（ 图1A）。在图1B中的数据是从多个实验收集的，以确定显着性。
有确定MXD3的致癌性，因为它也有类似的活动，以MYC（已知基因）最初的兴趣。然而，从该测定结果表明，MXD3不充当癌基因。
图1.聚焦形成实验的结果。MXD3的致癌潜力是通过在NIH 3T3细胞焦点形成试验（FFA）测定。 （A）中 ，从一个单一的实验沾上赫马3.记细胞的图片：结晶紫可用作替代污点。 （B）的结合的结果从三个实验。所有实验一式两份进行。焦点计数每个实验如下：试验＃1：pBABEpuro（13，11），MXD3（3，4），MYCN（23，19）;实验＃2：pBABEpuro（8,7），MXD3（1,0），MYCN（22，20）;实验＃3：pBABEpuro（9，20），MXD3（3，0），MYCN（21，12）。误差棒代表灶在三个实验数目的标准偏差。意义：** P <0.01; *** P <0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在FFA提供了一种快速简便的方法来评估在体外恶性转化。它是适合于相对大数目的候选基因的筛选，并且其适度的技术要求，使其符合成本效益。此外，两个或多个基因可以共表达（有时被称为一个“合作”测定）来评价该组合的致瘤潜力。该测定的优势依赖于它的简单的技术，其易于定量和它的相对短的周转时间。然而，必须强调的是，它不构成所有的体外测定法的限制。该测定法通过测量癌细胞中的一个表型特征进行评估致癌性转化，即，它们的能力增长超过单层在培养皿。阴性结果，因此，应谨慎解释，因为一个特定基因可诱导转化且不促进这个特定phenotype或可能需要共同表达与其他基因（ 即合作上面提到的）。在这种情况下，建议通过其它体外方法，如测定增殖率和血清要求和/或由锚地依赖性生长，例如，在软琼脂测定法来评估转化。
虽然FFA方法很简单，几个条件必须遵守。最重要的是，要使用3T3细胞的亚克隆，显示非常低的自发转化这一点至关重要。被预先neoplasic（一个功能，使得该细胞系用于该测定非常敏感），某些小瓶可以含有显著数目已经转化的细胞，从而导致不可接受的高基础水平的测定法。为了尽量减少自发改造就是这起文化是从一个有信誉的来源获得的非常重要的。此外，细胞应定期继代培养并决不允许达到汇合。我们建议路过的文化，当他们到达约50％汇合。出于这个原因，重要的是要创造额外构建体作为对照使用。在我们的实验中，我们使用含有MYC（一种已知的癌基因）18和空pBABEpuro作为阳性和阴性对照，分别pBABEpuro。
感兴趣的构建体可被引入到使用各种方法的3T3细胞;最常见的是，传统的转染方法已被使用。在这里介绍的协议，使用病毒转导提供了基因递送的一个可靠的，高效的和一致的方法。此外，使用亲嗜性逆转录病毒的处理潜在致癌构建体时，使此测定相对安全的;然而，正确的生物安全防范措施当然应该遵循。
在进行上述协议时，副本板的实验应该以执行从这些PL两种染色和收获细胞阿泰。收获的细胞然后可以用于证实通过免疫印迹所述的感兴趣的基因的过表达。
虽然相比于转化的病毒基因递送呈现若干优点，但应注意的是，它确实存在一些缺点，并且许多实验室仍然使用标准转化方案。病毒转导可能不适合在需要强表达;另一方面，非常高的水平以质粒转染实现表达的生理相关性可能是有问题的。
最后，应该强调的是，第二测定法通常需要以验证灶是由于致癌性转化。灶可以拾取（染色前）和生长在软琼脂确认锚定非依赖性增殖。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院主任的新的创新奖计划（ED）的赠款支持。 AA是由美国国家癌症研究所和美国国家科学基金会本科奖项部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
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