Summary
Assay גיבוש הפוקוס מספק שיטה פשוטה להעריך את הפוטנציאל להפוך לאונקוגן מועמד.
Introduction
ניתן להבחין בתאי גידול מעמיתיהם הרגילים על ידי מגוון רחב של שינויים, מדפוסי ביטוי גנים לepigenomics לשינויים מורפולוגיים ושגשוג. בקרב האחרון, הפחית את התלות בסרום, אובדן קשר עיכוב (צפיפות), הרכישה של התפשטות מעגן-עצמאי וסופו של דבר, את היכולת ליצור גידולים כאשר הוזרקו לבעלי חיים הם אינדיקטורים שימושיים, הניתנים למדידה של שינוי הממאיר 3. כמה במבחנה ובמבחני vivo פותחו לשינוי סלולארי. במבחנה מבחני מכוונים לזיהוי ומדידת שינויים במורפולוגיה תרבות (assay היווצרות מוקד), דינמיקת התרבות (שיעור צמיחה, צפיפות רוויה) וגורם גדילה (צמיחה בסרום מופחת) או מעגן (צמיחה באגר רכה) דרישות. תקן הזהב לקביעת האופי הממאיר של סוג תא נשאר היווצרות גידול (xenografts) בחיות מעבדה. עם זאת, לאהוא יעלה ואורך של מחקרי in vivo לא תמיד להפוך אותם מוצדק כצעד ראשון אימות או הקרנה של אונקוגנים מועמד. למרות שאף assay במבחנה מספק הערכה ברורה של הפוטנציאל שבעור של גן, הם מספקים תובנה פוטנציאל שבעור שעשויה לצמצם את העתיד במחקרי vivo. אחת מהמערכות הנפוצות ביותר להערכת פוטנציאל סרטני במבחנה הוא Assay גיבוש הפוקוס 2. גישה זו מסתמכת על השימוש בפיברובלסטים עכבר NIH 3T3, קו תאים לא שינה שמראה עיכוב קשר חזק. ביטוי יתר של תוצאות אונקוגן באובדן צמיחת צפיפות תלויה; תאים הופכים יכולים לגדול אז במספר שכבות, ויצרו "מוקדים", דמיינו בקלות נגד monolayer הרקע של תאים-שינה הלא. גיבוש הפוקוס Assay, אז, מודד את היכולת של אונקוגן מועמד לגרום לשינוי ממאיר, כפי שמעיד על אובדן inhib קשרition כפנוטיפ למדידה. FFA נעשה שימוש כדי להעריך שינוי בביטוי יתר של החלבון קינאז (למשל, 4 Src, BRAF 5), גורמי שעתוק (למשל, N-myc 6) קולטנים, G-מצמידים חלבון (לדוגמא, 7 P2RY8) וGTPases (למשל , ראס 1), בין יתר. הקלות היחסית של assay זה הופכת אותו לבחירה טובה שתספק תשובה מהירה וחזותי ברורה אם ביטוי יתר של הגן די בכך כדי להפוך את תאי פיברובלסטים עכבר NIH 3T3 במבחנה.
FFA המתואר בפרוטוקול זה משתמש בקו Plat-E תא אריזה 8, המספק חלבוני אריזה נגיפיים, וpBABEpuro retroviral הווקטור 9 (פלסמיד Addgene 1764) כדי לייצר רטרו-וירוס. לאחר transfection עם מבנה pBABEpuro המכיל את הגן של עניין, שורת תאי Plat-E תפיק רטרו-וירוס ecotropic שיכול לשמש כדי להדביק תאי NIH 3T3. Tהשיטה הנגיפית של מסירת הגן היא יעילה יותר מאשר שיטות transfection הכימי מסורתיות והיא מציעה דרך לבטא את הגן 10-קיימא. התאגד ברגע שלתוך הגנום של תאי NIH 3T3, ביטוי יתר של הגן של עניין הוא מונע על ידי האמרגן חוזר מסוף ארוך הנגיפי (LTR) 11. ביטוי קבוע זה יכול לשמש כדי לקבוע אם הגן של עניין יש לו פעילות שבעור, כפי שהיא נמדדת על ידי יצירת מוקדים, על תאי NIH 3T3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ביצוע הווקטורים ויראליים
רצפי הקידוד עבור הגן של עניין, כמו גם בקרות החיוביות ושליליות, מוכנסים לתוך pBABEpuro על ידי שיטות מסורתיות שיבוט (PCR הגברה, עיכול הגבלה וקשירה). ישנם ארבעה אתרי הגבלה על הווקטור שבו ניתן להכניס את ה- DNA: BamHI, SnaBI, EcoRI וסאלי.
- הכן את ה- DNA פלסמיד כיתה transfection מהתאים מוסמכים באמצעות ערכת midi פלסמיד QIAGEN.
- למדוד ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop2000.
2. רטרו-וירוס הפקה
קו תא אריזת Plat-E ישמש להפקת רטרו-וירוס ecotropic שיספוק את cDNA של עניין לתאי NIH 3T3.
- הקמת תרבויות Plat-E מ תאים קפואים
- במהירות להפשיר תאי Plat-E באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהעביר צינור חרוטי 15 מיליליטר. לאט לאט להוסיף 9 מיליליטר של מדיום Plat-E (Duהנשר בינוני של lbecco שונה (DMEM) + 10% שור עוברי סרום (FBS) + פניצילין וסטרפטומיצין).
- צנטריפוגות הצינור ב 180 x גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant.
- להשעות מחדש את התאים עם 10 מיליליטר של מדיום Plat-E והעברה לצלחת תרבות 10 סנטימטרים.
- דגירה התאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור עד שהם% ומחוברות 80-90 (כ 2 ימים).
- פיצול תא
- לשאוב את המדיום ולשטוף תאי פעם עם PBS.
- הוסף 2 מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA דגירה דקות 1 ב RT.
- לנתק את התאים על ידי הקשה על אצבע, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום Plat-E, ולהעביר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר.
- צנטריפוגות הצינור ב 180 x גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant.
- Resuspend התאים עם 10 מיליליטר של מדיום Plat-E וזרעם במנות חדשות ב1: 4-1: 6 דילולים.
- Plat-E זריעה וTransfection
- זרע 2 x 10 6תאים לכל צלחת תרבות 10 סנטימטרים באמצעות מדיום Plat-E ללא כל אנטיביוטיקה.
- דגירה התאים O / N ב37 ° C, חממה 5% CO 2.
- למחרת, להעביר 300 μl של Opti-ממ לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge.
- להוסיף 27 μl של polyethylenimine (PEI), מגיב transfection חסכוני 12, אל הצינור מוכן עם Opti-MEM. מערבבים בעדינות על ידי הקשה על אצבע ודגירה של 5 דקות ב RT.
- הוסף 9 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד כיתה transfection לתוך צינור Opti-ממ / PEI, מערבב בעדינות על ידי vortexing, ודגירה במשך 15 דקות ב RT.
- מוסיף את ה- DNA / PEI ירידה מבחינת מורכבת לתוך צלחת Plat-E, ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- למחרת, לשאוב את המדיום המכיל את מגיב transfection ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום Plat-E הטרי (ללא אנטיביוטיקה).
- להחזיר את התאים לחממה.
3. תאי NIH 3T3 וזיהום
- הקמת NIHתרבויות 3T3 וזריעה
- במהירות להפשיר תאי NIH 3T3 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהעביר לצינור 15 מיליליטר. לאט לאט להוסיף 9 מיליליטר של מדיום NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS).
- צנטריפוגות הצינור ב 180 x גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant.
- Resuspend התאים עם 10 מיליליטר של מדיום NIH 3T3 והעברה לצלחת תרבות 10 סנטימטרים.
- דגירה התאים ב37 ° C, חממה 5% CO 2. זה מאוד חשוב כי תאי NIH 3T3 תמיד נשמרים underconfluent (50-60%), כתדר של שינוי ספונטני (ולכן רמות בסיסיות של היווצרות מוקדים) מגביר פעם בתרבות מגיעה confluency.
- זרע 3 x 10 5 תאים לכל צלחת 10 סנטימטרים ודגירת O / N לזיהום למחרת.
- זיהום
- קציר supernatant retroviral מצלחת Plat-E באמצעות מזרק חד פעמי מיליליטר 10, סינונו דרך מסנן קרום ניילון גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית, והעברתו ל-15 מיליליטרצינור.
- הוסף 10 מיליליטר של מדיום Plat-E הטרי לתאים (ללא אנטיביוטיקה), ולהחזיר אותם לחממה.
- לשאוב את המדיום מצלחת תא NIH 3T3 להיות נגועות, ולהוסיף 5 מיליליטר של מדיום NIH 3T3 רגיל ו -5 מיליליטר של supernatant המסונן המכיל וירוס.
- להוסיף polybrene לצלחת בריכוז של 6 מיקרוגרם / מיליליטר.
- דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- למחרת, חזור על השלבים 3.2.1 - 3.2.5 לסיבוב שני של זיהום.
- החלף את המדיום המכיל וירוס עם מדיום NIH 3T3 רגיל.
- אפשר תאי NIH 3T3 לגדול במשך 2-3 שבועות, החלפה הבינוני במידת צורך. בדוק ביטוי של החלבון של עניין על ידי אלקטרופורזה הקונבנציונלית החלבון וimmunoblot על lysates תא שלם מצלחות העתק.
4. מכתים וכימות
- קריסטל ויולט מכתים
- לשאוב את מדיום NIH 3T3 ולמקם את הכליםעל קרח.
- לשטוף הכלים פעמיים עם PBS קר כקרח.
- תקן את התאים עם מתנול קר כקרח במשך 10 דקות.
- הסר את המנות מהקרח, לשאוב מתנול, ולהוסיף 3 מיליליטר של 0.5% פתרון סגול גביש עשה ב 25% מתנול (RT).
- דגירה המנות במשך 5 דקות בRT.
- לשאוב את הפתרון סגול גביש ולשטוף היטב את המנה עם מילי- Q H 2 O עד שלא צבע יורד בשטיפה.
- לאפשר את הכלים לייבוש O / N בbenchtop (שנחשף).
- כימות מוקדים
- ברגע שהמנות יבשות, להשתמש בסרגל למדוד את האוספים צבעוניים הכהה של תאים על הצלחת. לספור רק את אלה שהם יותר מ 5 מ"מ בקוטר כ" מוקדים ". רשום את מספר המוקדים ולחשב ממוצעים והמשמעות בהשוואה לקבוצת הביקורת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MXD3 הוא גורם שעתוק הרוכסן לאוצין סליל לולאה, סליל בסיסי (bHLHZ) שהוא חבר של MYC / מקס / רשת MAD. זה חבר טיפוסי של משפחת MAD 13-15, וזה כבר דיווח להיות מעורב בהיווצרות הסרטן 16,17. בהשוואה לpBABEpuro (בקרה שלילית) וMYC (ביקורת חיובית), היו מנות NIH 3T3 בי MXD3 היה ביטוי יתר באופן משמעותי פחות מוקדים (איור 1 א). הנתונים באיור 1 ב נאספו מניסויים רבים כדי לקבוע משמעות.
היה עניין ראשוני בקביעת הפוטנציאל שבעור של MXD3 כי יש לו פעילות דומה לMYC (אונקוגן הידוע). עם זאת, תוצאות מassay זה מצביעים על כך שMXD3 אינו פועל כאונקוגן.
assay היווצרות 1. דגש איורתוצאות. הפוטנציאל שבעור של MXD3 נקבעו על ידי assay היווצרות מוקד (FFA) בתאי NIH 3T3. תמונות () של תאים מניסוי יחיד מוכתם בHema 3. הערה: Crystal יולט יכולות לשמש ככתם חלופי. (ב) תוצאות משולבות משלושה ניסויים. כל הניסויים בוצעו בשני עותקים. פוקוס סופר עבור כל ניסוי הם כדלקמן: # ניסוי 1: pBABEpuro (13, 11), MXD3 (3, 4), MYCN (23, 19); ניסוי מס '2: pBABEpuro (8, 7), MXD3 (1, 0), MYCN (22, 20); ניסוי מס '3: pBABEpuro (9, 20), MXD3 (3, 0), MYCN (21, 12). ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של מספר המוקדים על פני שלושה הניסויים. משמעות: ** p <0.01; *** P <0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FFA מספק שיטה קלה ומהירה כדי להעריך שינוי ממאיר במבחנה. זה ניתן להקרנה של מספר גדול יחסית של גני מועמדים, והדרישות הטכניות הצנועים שלה לעשות את זה יעיל וחסכוני. יתר על כן, ניתן coexpressed שתיים או יותר גנים (המכונה לעתים assay "שיתוף פעולה") כדי להעריך את הפוטנציאל הסרטני של השילוב. היתרונות של assay זה מסתמכים על הטכניקה הפשוטה שלו, שלה קל והכימות שלה קצר יחסית סיבוב סביב הזמן. יש להדגיש, עם זאת, שזה מציב את המגבלות של כל מבחני חוץ הגופייה. Assay מעריך שינוי שבעור על ידי מדידה אופיינית פנוטיפי אחד של תאים סרטניים, כלומר, היכולת שלהם לגדול מעבר monolayer בצלחת תרבות. תוצאות שליליות, ולכן, יש לפרש בזהירות, כאונקוגן מסוים עשויים לגרום לשינוי ללא קידום phenotyp המסוים הזהדואר או עשוי לדרוש Coexpression עם גן אחר (כלומר, שיתוף פעולה שהוזכר לעיל). במקרה זה, מומלץ להעריך שינוי בשיטות אחרות במבחנה, כגון קביעת קצב התפשטות ודרישות סרום ו / או צמיחה עצמאית מעגן על ידי, למשל, assay אגר הרך.
למרות שטכניקת FFA היא פשוטה, בכמה תנאים חייבים להיות שנצפו. והכי חשוב, זה קריטי להשתמש subclone של 3T3 תאים שמראה שינוי ספונטני נמוך מאוד. להיות מראש neoplasic (תכונה ההופכת את הקו הזה התא רגיש מאוד עבור assay זה), בקבוקונים מסוימים עשויים להכיל מספר רב של תאים שכבר הפכו, וכתוצאה מכך הרמות בסיסיות גבוהות בלתי מתקבל על הדעת עבור assay. כדי למזער את השינוי ספונטני זה מאוד חשוב שהתרבות מתחילה מתקבלת ממקור מהימן. בנוסף, יש subcultured תאים במרווחי זמן קבוע ולא אפשרו להגיע confluency.אנו ממליצים שעברו תרבויות, כאשר הם מגיעים confluency כ -50%. מסיבה זו, חשוב ליצור מבנים נוספים שישמשו כקבוצת ביקורת. בניסויים שלנו, השתמשנו pBABEpuro מכיל MYC (אונקוגן ידוע) 18 וpBABEpuro הריק לשמש כביקורת החיובית ושלילית, בהתאמה.
המבנה של עניין יכול להיות מוחדר לתאי 3T3 תוך שימוש במגוון של שיטות; הנפוץ ביותר, שיטות transfection מסורתיות היו בשימוש. בפרוטוקול המובא כאן, השימוש בתמרה ויראלית מספקת שיטה אמינה, יעילה ועקבית של מסירת הגן. יתר על כן, השימוש ברטרו-וירוס ecotropic עושה assay זה בטוח יחסית בעת טיפול במבנים שעור פוטנציאליים; עם זאת, צריך כמובן להיות אחרי אמצעי זהירות בטיחות ביולוגי נכונה.
בעת ביצוע הפרוטוקול לעיל, יש לבצע ניסויי צלחת העתק כדי שני תאי הכתם וקציר מאלה plאטס. תאים שנקטפו לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לאשר ביטוי יתר של הגן-של-עניין על ידי immunoblot.
למרות משלוח גנטי נגיפי מציג מספר יתרונות בהשוואה לשינוי, יש לציין שהיא עושה להציג כמה חסרונות, כמו גם, ומעבדות רבות עדיין משתמשות בפרוטוקולים סטנדרטיים שינוי. התמרה ויראלית לא יכולה להיות מתאימה כאשר יש צורך ביטוי יתר חזק; מצד השני, את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של רמות גבוהות מאוד של ביטוי שהושג על ידי transfection פלסמיד יכולות להיות מוטלות בספק.
לבסוף, יש להדגיש כי assay שני הוא בדרך כלל נדרש לוודא כי המוקדים הן בשל שינוי שבעור. ניתן לאסוף מוקדים (לפני הצביעה) וגדלו ברך-אגר כדי לאשר הפצת מעגן-עצמאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מניו Innovator תכנית פרס של מנהל ה- NIH (ED). AA נתמך בחלקו על ידי פרסים לתואר ראשון מהמכון הלאומי לסרטן והקרן הלאומי למדע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBABE-puro vector | Addgene | Plasmid 1764 | cloning vector |
| Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic | Cell Biolabs, Inc. | RV-101 | cell line for viral production |
| NIH 3T3 Cell Line murine | Sigma-Aldrich | 93061524 | cell line for focus formation assay |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe | BD Biosciences | 309604 | viral production reagent |
| 0.45 μm Puradisc Syringe Filter | Whatman | 6750-2504 | viral production reagent |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc. | 23966-2 | cell transfection reagent |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | EMD Millipore | TR-1003-G | cell transfection reagent |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | cell stain reagent |
| Plasmid Plus Midi Kit | QIAGEN | 12945 | plasmid purification |
| BD Falcon Tissue Culture Dishes | BD Biosciences | 353003 | cell culture supplies |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | cell culture media |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | cell culture supplies |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-062 | cell culture media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | cell culture media |
References
- Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. Biological assays for Ras transformation. Methods in enzymology. , 255-395 (1995).
- Celis, J. E. Cell biology : a laboratory handbook. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).
- Raptis, L., Vultur, A. Neoplastic transformation assays. Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).
- Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells. Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).
- Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene. IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).
- Yancopoulos, G. D., et al. N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).
- Fujiwara, S., et al. Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening. Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene. 7, 1063-1066 (2000).
- Morgenstern, J. P., Land, H. Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line. Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Klaver, B., Berkhout, B. Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus. Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).
- Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).
- Fox, E. J., Wright, S. C. S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells. The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).
- Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation. Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).
- Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression. Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).
- Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3. Cell cycle. 7, 423-427 (2008).
- Barisone, G. A., et al. Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells. PloS One. 7, e38508 (2012).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112, 193-205 (2003).
