Abstract
יש להם הפרעות הקשורות למוח רבים מוות של תאים עצביים המעורב בפתופיזיולוגיה שלהם. השתפר בדגמי מבחנה ללמוד השפעות נוירו או רעילות של תרופות ומסלולים במורד הזרם המעורבים יעזרו לקבל תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים של neuroprotection / רעילות עצבית ועלולים להקל על פיתוח תרופה. עם זאת, יש לי מבחני קיימים רבים במבחנה רעילות מגבלות עיקריות - רוב להעריך רעילות עצבית וneuroprotection בנקודת זמן אחת, לא מאפשר לראות בזמן הקורס וקינטיקה של ההשפעה. יתר על כן, את ההזדמנות כדי לאסוף מידע על מסלולי איתות במורד הזרם מעורבים בneuroprotection בזמן אמת תהיה בעל חשיבות רבה. בפרוטוקול הנוכחי אנו מתארים את השימוש של מנתח תא עכבה מבוססת בזמן אמת כדי לקבוע את ההשפעות להחדיר 2A סרוטונין (2A 5-HT) אגוניסטים קולט בשורת תאים עצביים תחת קונדיט התווית חופשית וזמן אמתיונים באמצעות מדידות עכבה. יתר על כן, אנו מראים כי מעכבים של מסלולי שליח שני יכולים לשמש כדי להתוות מולקולות במורד הזרם מעורבות בהשפעת ההגנה העצבית. אנו גם מתארים את השירות של טכניקה זו כדי לקבוע אם השפעה על שגשוג תאים תורמת לאפקט הגנה עצבי שנצפה. המערכת מנצלת צלחות המיקרואלקטרוניקה מיוחדות המכונים E-צלחות שמכילים לסירוגין מערכי microelectrode זהב על המשטח התחתון של הבארות, המשמשים כחיישני תא. קריאת העכבה היא שונה על ידי מספר התאים חסיד, כדאיות תא, מורפולוגיה, וההידבקות. פרמטר ממדים הנקרא Cell המדד נגזר ממדידות העכבה חשמליות ומשמש כדי לייצג את מצב התא. בסך הכל, מנתח תא העכבה מבוססת בזמן אמת מאפשר בזמן אמת, הערכה ללא תווית של neuroprotection ורעילות עצבי, וההערכה של מעורבות מסלולי שליח שנייה, שתרם ליותרהערכה מפורטת ותפוקה גבוהה של תרכובות הגנה עצביות פוטנציאליות במבחנה, לבחירת מועמדים טיפוליים.
Introduction
מוות של תאים עצביים ממלא תפקיד קריטי בהפתופיזיולוגיה של הפרעות הקשורות למוח רבים 1. הזמינות של תפוקה גבוהה אמינה ובמבחני רעילות מבחנה היא קריטית כדי לקבל תובנות טובות יותר את המנגנונים של רעילות עצבית וכדי לעזור לבחור מולקולות הגנה עצביות כמועמדים טיפוליים בפיתוח תרופות 2. עם זאת, יש מגבלות רבות לשימוש נרחב ביותר בassays.They רעילות העצבית המבחנה להעריך רעילות עצבית / neuroprotection בנקודת זמן אחת שאינו מאפשר רזולוציה קינטית; לעתים קרובות להשתמש בתווית או בדיקה שיכולה להפריע למסלולי האיתות ולהגביל מחקרים נוספים באותה אוכלוסיית תא, ולעתים קרובות הן עתיר עבודה, ובמקרים רבים לא מספק תובנה מכניסטית. במחקר הנוכחי אנו להדגים את התועלת של מנתח תא עכבה מבוססת בזמן אמת כדי לקבוע רעילות עצבית וneuroprotection בשורת תאים עצבי בזמן אמת ותחת ללא תוויתתנאים ולספק תובנות לגבי מנגנונים במורד הזרם באמצעות ניתוח של מסלולי שליח שני המעורבים בהשפעה.
מחקרים קודמים אישרו את תוקפו של מנתח התא בזמן אמת כדי לקבוע רעיל, כמו גם השפעות על שגשוג תאים בשורות תאים בהשוואה ל3,4,5,6 טכניקות סטנדרטי. לדוגמא, מתאם טוב נצפה בין קריאות של assay כדאיות תא WST-1 הסטנדרטי וערכי אינדקס סלולריים במספר נקודות זמן בתנאי התפשטות בסיסיים ולאחר שתי פרדיגמות רעילות שונות בתאי הלה 3. בA549 והתפשטות תאי MDA-MB-231 ורעיל עורר עם פקליטקסל מייצב microtubule הראה ערכים דומים מאוד כאשר הוערך על ידי מדידות מדד התא וsulforhodamine B משמש standardly (SRB) assay 4. בשורת התאים העצבית של הנוירונים בהיפוקמפוס הנציחו מדידות מדד HT-22 ניידים אומתו לt היכולת שלהםo לזהות התפשטות תאים, cytotoxicity גלוטמט וcytoprotection נגד 3 (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) בשימוש נרחב assay 2,5-diphenyltetrazolium-רומיד (MTT) 5. באותו המחקר תוצאות assay MTT ומדידות מדד התא גם בקורלציה גם במדידת התפשטות עצבית ותאים, רעיל אחרי קיפוח גורמי גדילה והצלה של cytotoxicity ידי QVD המעכב פאן-caspase 5. Cytotoxicity המושרה בתאי NIH 3T3 ידי Vandetanib (הקולטן לגורם צמיחה של אנדותל כלי דם ומעכבי הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס) הראה תוצאות דומות נמדדו בערכי מדד תא או assay ספיגה אדומה הניטרלי 6.
יש לנו בשימוש לאחרונה מערכת מנתח תא בזמן אמת כדי להעריך השפעות להחדיר 2A סרוטונין אגוניסט הקולטן (2A 5-HT) hydrochloride (±) -2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine (DOI) בשורת תאים עצביים ( תאי SK-N-SH) והוקרנו למעורבות של הערוץnd מסלולי שליח באמצעות ניטור ההשפעה של העיכוב הכימי שלהם על neuroprotection נצפה 7. מעניין, יש קולטן 2A 5-HT אגוניסטים שתי הזיה וnonhallucinogenic (כמו DOI וlisuride, בהתאמה), שעשוי להפעיל את שניהם מסלולי שליח שני נפוצים ומובחנים 8.
היתרונות של הטכניקה שהוצגה הם שהיא מאפשרת לאסוף מידע בזמן אמת על הישרדות תא שבמהלך ימים, כדי להתוות מסלולים שני שליח מעורב, על מנת להעריך את תרומתה האפשרית של תופעות התפשטות לneuroprotection, וכדי לבחור זמן אופטימלי ללימודי נקודת סיום נוספים על אותה אוכלוסיית התאים. תרשים סכמטי של זרימת העבודה בפרוטוקול הנוכחי מוצג באיור 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנה
- הנח התחנה של מנתח התא בזמן אמת בתרבית רקמת חממה נקבעה על 37 מעלות צלזיוס ועם 5% CO 2. לבצע את כל הטיפול בתרבית התאים וטיפולים תרופתיים במכסת מנוע בתרבית רקמה בתנאים סטריליים.
- הערה: שורות תאים עצבית הדורשות הגדרות טמפרטורה שונות בהשוואה לתנאים סטנדרטיים לתרבות, צריכים להיות בהתאם. לשורות תאים בחולשה חסיד, להשתמש סוכני ציפוי כדי להקל על האינטראקציה של תאים עם microelectrodes הזהב בחלקו התחתון של הבארות של E-פלייט 96.
- הכן את פתרונות 1,000X המניה של התרכובות תרופתי לטיפול בתרבית תאים (סוכני הגנה עצביים או מעכבי מסלולי שליח שני בממס המתאים - dimethylsulfoxide או מים סטריליים) ולאחסן אותם ב-20 מעלות צלזיוס. השתמש בממס כרכב בטיפולים הבאים.
- תאי נוירובלסטומה האנושית תרבות SK-N-SH בDMEM / F12 בינוניים בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) (בינוני התפשטות) בצלוחיות תרבית תאים עם 175 2 סנטימטר משטח לצפיפות של כ -75%. לשמור על מספר מעבר תא בטווח (של כ 10 מעברים) כדי לוודא התאמה בין ניסויים במונחים של שיעור התפשטות תאים ותגובה לרעיל. מספרי מעבר נמוכים יותר עדיפים.
- שטוף את שכבת תאי SK-N-SH חסיד עם PBS, וtrypsinize עם 0.05% פתרון טריפסין-EDTA במשך 5 דקות ב37 ג. צנטריפוגה התאים ב170 גרם × למשך 5 דקות כדי להסיר טריפסין. Resuspend התאים בינוני התפשטות 10 מ"ל. ספירת התאים עם דלפק תא שרביט השלטון ולהתאים מספר סלולארי ל300,000 תאים / מ"ל על ידי דילול תאים עם מדיום הפצת נשק גרעיני.
2 ציפוי והתפשטות של תאי SK-N-SH
- הוסף בינוני התפשטות 100 μl היטב בכל E-פלייט 96 ולהשאיר אותה למשך 30 דקות במכסת המנוע בתרבית הרקמה בRT לאזן. הכנס את E-Plate 96 בתחנת מנתח תא בזמן אמת בחממת CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
- הפעל את תוכנת מנתח תא בזמן אמת. בדף הפריסה בחר בבארות ייכללו בניסוי ולהיכנס בתיבות עריכת המידע על סוג התא, מספר תאים, שמות וריכוזים של תרכובות כימיות המשמשות לטיפול בתאים.
הערה: למטרות פרוטוקול זה לפחות 4 חזרות מומלצות לכל טיפול. - בדף תוכנת לוח זמנים לקבוע "מדרגות" שנכללו בניסוי, על ידי בחירת מספר מטאטא מדידה נייד אינדקס והמרווח בין ניגוב לניגוב לכל שלב. מאז שלב 1 נקבע מראש למדידת רקע, בחר באפשרות "הוסף צעד" ושלב להגדיר 2 כדי למדוד את מדד התא כל 15 דקות ל96 שעה.
הערה: לקבלת טיפולים, שבו אפקטים עם קינטיקה מהירה צפויים, להגדיר סריקות במרווחים קצרים יותר. - לחץ על התחל כדי להתחיל בשלב שנקבע מראש באופן אוטומטי 1ולמדוד את עכבת הרקע של התקשורת. ערך זה הוא מפחית באופן אוטומטי על ידי התוכנה בכל נקודת נתונים פעם אחת את התאים נוספים לבארות.
- השתמש ההשעיה התא שהוכן קודם לכן בשלב 1.5) של 300,000 תאים / מ"ל במדיום הפצה. 30,000 תאים / היטב לתא רעילות / לימודי neuroprotection ו15,000 תאים / היטב עבור מחקרי התפשטות תאים. קח את E-הצלחת ולהוסיף 100 השעיה תא μl בכל טוב לרעילות תא מחקרי neuroprotection / ולהוסיף השעיה תא 50 μl ובינוני התפשטות 50 μl בכל טוב ללימודי התפשטות תאים. מספר התאים מצופים בכל טוב צריך להיות מותאם עבור כל שורת תאים באופן אמפירי.
- מערבולת בעדינות את E-פלייט 96 אפילו ציפוי של התאים. השאר את E-פלייט 96 ל30 דקות במכסת המנוע בתרבית הרקמה בRT כדי לאפשר את התאים להתיישב באופן שווה לתחתית הבארות.
- הכנס את E-פלייט 96 בתחנת מנתח תא בזמן אמת ולהתחיל שלב 2 בעמ 'לוח זמניםגיל. צג ערכי אינדקס תא לאורך כל הניסוי על ידי הצגת עקומות התא בדף המגרש ונתוני מדד תא גלם בתא עמוד ראשי של התוכנה.
.3 סרום מניעת
- 24 שעות לאחר ציפוי התאים, להשהות את הניסוי, ולהסיר את E-פלייט 96 מתחנת מנתח תא בזמן אמת. לדלל מעכבי שליח שני ממניות 1,000X עם מדיום סרום ללא / F12 DMEM - 200 × הריכוז הסופי. פנק את התאים עם 1 מעכבי μl של מסלולי שליח שני להיבדק על מעורבותם ברעילות העצבית / neuroprotection 30 דקות לפני ביצוע רעיל, כדי לעכב את המסלולים בהתאמה. חזור E-פלייט 96 לתחנה ולחדש את מדידות אינדקס סלולארי ניסיוניות.
- לאחר 30 דקות להשהות את הניסוי שוב. מוציאים בזהירות בינונית התפשטות מלאה מE-פלייט 96 בארות עם טפטפת (או רב ערוצי פיפטה), נזהר שלא לשבש את שכבת תאים חסידעל ידי הפניית הקצה של קצה פיפטה לפינה של הבאר. הוסף 200 μl / גם של הסרום ללא DMEM / בינוני F12 (בינוני קיפוח בסרום). להבטיח חילופי מהירים של מדיום תרבות תא כדי למזער תסיסה מכאנית של התאים.
- לדלל תרכובות להיבדק להשפעות נוירו ממניית 1,000X עם מדיום DMEM / F12 סרום ללא 200 × הריכוז הסופי. הוספת תרכובות μl 1 להיבדק להשפעות נוירו ו1 מעכבי μl של מסלולי שליח שני בבארות בודדות על פי התכנית הניסיונית.
- בתאים ללימודי התרבות אינו משנה בינוני. לדלל תרכובות להיבדק ממניות 1,000X 200 × הריכוז הסופי במדיום הפצה, טיפול עם μl 1 לכל טוב ואמשיך תרבות במדיום הפצת נשק גרעיני.
- קורות חיים הניסוי להמשיך במדידות מדד תא כל 15 דקות ל96 שעות כפי שנקבע בעבר.
.4 נתוניםnalysis
- לרעילות עצבית / נתונים neuroprotection לנרמל סלולארי אינדקס לנקודת הזמן האחרון לפני טיפול תרופתי או שינוי בינוני כדי להפחית את השונות בין ניסויים על ידי בחירה "Cell אינדקס מנורמל" ו "לנרמל זמן" בדף מגרש.
- סמן את הבארות בדף מגרש לתנאי הניסוי של עניין ולחץ על "הוסף" כדי להתוות עקומות מדד תא מנורמלות. שים לב לקינטיקה של ההשפעה הרעילה למערכת העצבים / הגנה העצבית, או של עיכוב שליחים שני כמו עקומות מדד תא מנורמלות כפונקציה של זמן.
- שים לב לעקומות מדד תא לטיפולים תרופתיים נבדקו במדיום התרבות כפונקציה של זמן כדי להעריך אם השפעה על התפשטות מעורבת בהשפעת נוירו / העצבים.
- לייצא את המידע הניסיוני עבור כל נקודות Cell זמן אינדקס מתא דף תוכנת האינדקס לקובץ Excel ליזום הערכה סטטיסטית של התוצאות
- לניתוח סטטיסטי של הבדלים בערכי אינדקס סלולריים בתנאי טיפול שונים בנקודות זמן ספציפיות, ערכי מדד תא בחרו בנקודות זמן המתאימות מקובץ Excel מיוצא. נתח את ערכי האינדקס הסלולרי לנקודתי הזמן שנבחרו עם הניתוח בכיוון אחד או דו כיוונית של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן שלאחר הוק באמצעות תוכנה סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קיפוח סרום גורם להפחתה בערכי מדד תא, אשר יכול להיות במעקב רציף עם מנתח התא בזמן אמת
גירויים עצביים לתאים להוביל לירידה בערכי מדד תא, אשר יכול להיות במעקב בזמן אמת עם הטכניקה שהוצגה ואת הדינמיקה שבם היא תלוי בגירוי העצבי הספציפי וסוג התא למד. איור 2 מדגים את העלייה ב אינדקס תא כאשר תאי SK-N-SH גדלים במדיום התפשטות עד שמגיעים לרמה (קו ירוק) והירידה של מדד תא ואחרי התייצבות ברמות נמוכות יותר החדשות לאחר החלפת התאים לסרום בינוני קיפוח (קו אדום). ירידה זו עשויה לייצג שינוי בהידבקות סלולרית בשל נסיגה של הסרום.
השפעות להחדיר טיפול תרופתי יכולות להיות מנוטרות באופן רציף עם מנתח התא בזמן אמת
"> אפקט ההגנה העצבי של תרכובות הוסיפו לפני (לפני הטיפול), באותו הזמן (שיתוף טיפול) או לאחר גירוי עצבי (המצביע על התאוששות תא) יכול גם להיות אחרי ברציפות עם מנתח התא בזמן אמת, ובכך לספק מידע על . השיעור ומשך הזמן של השפעת נוירו איור 3 מציג תוצאות נציג של הדינמיקה של neuroprotection של שני אגוניסטים 5-HT 2A - 5 מיקרומטר DOI (איור 3 א) ו20 lisuride מיקרומטר (איור 3 ב) הוסיף בזמן מיתוג תאים לתוך בינוני קיפוח בסרום.מנתח התא בזמן אמת מאפשר להבחין בין השפעות על הישרדות תא וחלוקה של תאים
שאלה חשובה במחקרי neuroprotection בשורות תאים עצביים היא האם השפעה על שגשוג תאים תורמת לאפקט המתחם נצפה על הישרדות תא. עם אנאלי תא בזמן אמתyzer ההשפעה על התפשטות ניתן לבדוק באותו E-פלייט 96 רעילות עצבית הערכה. איור 4 מראה את חוסר ההשפעה של טיפול DOI 5 מיקרומטר על התפשטות תאי SK-N-SH, המצביע על השפעה על התפשטות אינו תורם לנצפה אפקט הגנה עצבי.
מנתח התא בזמן אמת מאפשר לקבוע אילו מסלולי שליח שני מעורבים בהשפעות נוירו / רעילות
הפעלת קולטן יוזמת לגל של תוצאות שליחים השניה. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר למסך למעורבותם של מספר השליחים השני בהשפעת נוירו / רעילה בזמן אמת באמצעות טיפול מקדים במעכבי שלהם. שכן ההשפעה של שליחים שני מעכבים על הישרדות תא יכולים להיות מבוטא, והוא שבמקרים רבים לא ליניארי עם זמן, בעקבות קינטיקה שלה הוא מאוד אינפורמטיבי. איור 5 מציג את ההשפעה של phos 10 מיקרומטרphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) מעכב LY294002 על הישרדות תא וneuroprotection DOI בתאי SK-N-SH-מקופח בסרום. בגרף מוצג, 10 מיקרומטר LY294002 מנע את אפקט ההגנה העצבי של DOI בקיפוח בסרום, אבל גם היה כמה השפעה רעילה משלו.
מסלולי שליח שני ורלוונטיים מעכבים ניתן לקבוע ריכוזים עבור כל מתחם נבדק באמצעות חיפוש בספרות. התאמת ריכוזים של מעכבי שליחים שני צריכה להיות מאומת, ואם יש צורך מותאם באופן ניסיוני. המטרה של אופטימיזציה היא לבחור ריכוז, שבו יש השפעה מינימאלית על ערכי אינדקס תא בכוחות עצמו, בזמן שעדיין מעכב ביעילות את השליח השני בהתאמה. כדוגמא, כמה מעכבי מסלולי שליח שני, שיכול להיות רלוונטי לקולטן 2A 5-HT, מוצגים בטבלה 1 מעכבים אלה היו בשימוש בעבר כדי להעריך מטרות במורד הזרם מעורבות בגידול serotonergic של שלוחהזירחון racellular מוסדר אות קינאז 9. הראנו השירות שלהם כדי להעריך את המסלולים במורד הזרם מעורבים בneuroprotection על ידי אגוניסטים קולט 2A 5-HT לאחר אישור ובמקרים מסוימים אופטימיזציה הריכוזים שלהם לפרדיגמה הניסויית שלנו 7.
איור 1 תרשים סכמטי של זרימת העבודה שהוצגה בפרוטוקול הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אפקט איור 2 של קיפוח בסרום בתא אינדקס. קיפוח סרום (קו אדום) גורם לירידה מהירה בתא מדד, בהשוואה לעלייה ההדרגתית בערכי מדד תא במדיום הפצה (קו ירוק). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אפקט איור 3 של אגוניסטים 2A 5-HT בתא אינדקס לאחר חסך בסרום. טיפול עם תרופות cytoprotective (בDOI 5-HT זה ניסוי אגוניסטים 2A (5 מיקרומטר) (א) (קו מגנטה) וlisuride (20 מיקרומטר) (B ) (קו מגנטה כהה) באופן חלקי משחזר ערכי אינדקס סלולארי ירד ב חסך בסרום (קו אדום). אנא לחץכאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ערכי איור 4 Cell מדד בקורס של שגשוג תאים. הטיפול עם תרופות במדיום הפצה (בDOI מיקרומטר הנוכחי ניסוי 5) (קו מגנטה) מאפשר להעריך את ההשפעה על שגשוג בהשוואה לטיפול ברכב (קו ירוק). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.5 מעכבי שליח שני איור עשויים להשפיע על הישרדות תא בכוחות עצמם וניתן להשתמש בו למסך להשפעה של מסלולי שליח שני בobseמטופלת neuroprotection rved. בניסוי זה תאים היו נתונים לקיפוח סרום עם רכב (קו אדום), DOI (קו מגנטה) 1 מיקרומטר, pretreated עם 10 מיקרומטר PI3-K מעכב LY294002 וטופל במיקרומטר DOI 1 (קו כחול) או pretreated עם 10 מיקרומטר LY294002 וטופל ברכב (קו שחור). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלת 1: דוגמאות למעכבי שליח שני, שיכול להיות רלוונטי למסלולי קולט 2A 5-HT במורד הזרם והריכוזים שלהם המשמשים אותנו בניסויי מנתח תא בזמן אמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מציג את התועלת של מנתח תא בזמן אמת כדי להעריך באופן רציף ובתנאים ללא תווית השפעות נוירו / הרעילות של תרכובות בשורות תאים עצביות וכדי לקבל תובנה מסלולי השליח השני המעורבים בהשפעה.
למרות שהשירות של מנתח התא בזמן אמת ללמוד רעיל והשפעות של תרופות על שגשוג תאים מוכר בדרך כלל, רק מעט מחקרים השתמשו בו בסוגי תאים קשורים עצביים. הראינו בעבר את תוכנית השירות של מנתח התא בזמן אמת לנטר neuroprotection של אגוניסט קולטן 2A 5-HT בתאי SK-N-SH נוירובלסטומה האנושית, בעוד גלנטי et al., הראה שהוא יכול לשמש כדי להעריך את הרעילות עצבית של פפטידים בטא עמילואיד בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה האנושית 7,10. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי בעוד שמנתח התא בזמן אמת המדידה באופן מהימן תא התפשטות ומוות של תאים בשורת תאי euronal ותאי מבשר עצביים, הדיוק שלו בהערכת המוות של תאים בנוירונים עיקרי תלויות בחומרה של העלבון 5. חשוב לציין, זרם חילופין משמש למערכת מנתח תא בזמן אמת הוא בסדר גודל נמוך מאוד, שהניבו microampere זרמים. זרמים אלה הם הרבה מתחת לפוטנציאל הסף של תאים להתרגש כמו תאי עצב. מערכת מנתח תא בזמן אמת מסתמכת על מדידות עכבה מהמשטח התחתון של 96 בארות E-פלייט, ולכן מידת דבקות תא היא בעל חשיבות קריטית. יתכן כי אופטימיזציה נוספת של ציפוי של בארות E-הצלחת עם חלבוני מטריצה תאיים לדבקות טובה יותר עשויה לשפר את התוצאות שהושגו עם נוירונים עיקרי.
כתב היד הנוכחית מדגימה גישה חדשנית של שימוש במערכת מנתח תא בזמן אמת כדי להתוות מסלולי שליח שני מעורבים בneuroprotection. הפרוטוקול שלנו מסתמך על העיכוב הכימי של Messe השניאצבעות שאמורות להיות מעורבות בפעולה של סוכן הגנה עצבי. טבלה 1 כמה מעכבים נפוצים שני מסלולי שליח, שיכול להיות רלוונטי לקולטן 2A 5-HT לדוגמא ירושלים, וריכוזיהם מתאימים לפרדיגמה הניסויית שהוצגה. עיצוב ניסיוני זה מאפשר להקרנה מהירה של מסלולי שליח שני שעשויים להיות רלוונטיים, לבחור מטרות במורד הזרם למחקרים מפורטים יותר באמצעות גישות משלימות.
יתרון חשוב של מנתח התא בזמן אמת גם את היכולת להעריך אם השפעה על התפשטות היא חלק מאפקט הגנה עצבי שנצפה. שימוש בשורות תאים עצביים במקום נוירונים העיקרי במבחני רעילות מציעה כמה יתרונות, כמו מחיר נמוך יותר, גישה נוחה וללא צורך בניסויים בבעלי חיים. עם זאת, בשל העובדה ששורות תאים עצביות בניגוד לנוירונים עיקרי להתרבות, השפעה אפשרית על התפשטות צריכה להיות מבוקרת במבחני רעילות עצביים. הזדמנות מנתח התא בזמן אמת מציע לבצע בקרה זו באותו E-צלחת ניסוי 96, מקלה על עיצוב ניסיוני.
פרמטרים טכניים כמה צריכים להילקח בחשבון בניסויים עם מנתח התא בזמן אמת. מספר התאים להיות מצופה בכל טוב צריך להיקבע באופן אמפירי באמצעות ניסוי טיטרציה לכל סוג תאים שנבדק. כל cytotoxicity וטיפול התפשטותם החלו לאחר 24 שעות חניכה של תרבית תאים, כדי לאפשר לדבקות מלאה של התאים. תוצאות אופטימליות בניסויים רעילים החל מפגש 65-70% כאשר תאים הגיעו התקבלו בפרוטוקול הנוכחי. לניסויי התפשטות מפגש תא תחתון הוא מועדף (20-30%) כדי לעקוב אחר ההשפעה של תרופה על עקומת התפשטות.
בסרום הפרוטוקול הנוכחי הפרדיגמה רעילות עצבית קיפוח מוצגת בשל חוסנה, קל שימוש ושירות לקירובחסך תזונתי בתיווך מוות עצבי, וזה חשוב במהלך התפתחות, מוח חריף או טראומת עצב, וניוון מוחיה 11. עם זאת, מגוון רחב של פרדיגמות רעילות עצביות יכול להיות בשימוש עם מערכת מנתח תא בזמן אמת. כאן, שיתוף טיפול עם סוכן cytoprotective בעת רעילה מוצג. עם זאת, יכול גם להיות מועסק לפני הטיפול או טיפול לאחר (התאוששות תא הערכה) אירוע רעיל בהתאם לתרכובות שנבדקו.
בסך הכל, הפרוטוקול הנוכחי מצביע על התועלת של מערכת מנתח תא בזמן אמת כדי להעריך רעילות עצבית וneuroprotection בשורות תאים עצביים ברציפות וללא תווית וכדי לקבל תובנה המסלולים במורד הזרם המעורב בתופעות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עלויות פרסום לוידאו המאמר הנוכחי היו בחסות "ACEA Biosciences".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | Supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| Tissue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | Automated cell counter |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | For washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| Lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | For dissolving LY-294002 and lisuride maleate |
References
- Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , Health Protection Agency. (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
