Summary
يحتوي الجلد الثدييات مجموعة متنوعة من هياكل - مثل بصيلات الشعر والنهايات العصبية - التي تظهر أنماط مميزة من التنظيم المكاني. تحليل الجلد مثل جبل مسطح يستفيد من الهندسة 2 الأبعاد من هذا النسيج لإنتاج كامل سمك صور عالية الدقة من الهياكل الجلد.
Abstract
الجلد هو نسيج غير متجانس للغاية. وتشمل الهياكل داخل بصيلات الشعر عن طريق الجلد والعضلات مقف الشعرة، التخصصات البشرة (مثل مجموعات الخلايا ميركل) والغدد الدهنية والأعصاب والنهايات العصبية، والشعيرات الدموية. يتم التحكم في الترتيب المكاني لهذه الهياكل بإحكام على نطاق والمجهرية - كما رأينا، على سبيل المثال، في ترتيب منظم من أنواع الخلايا داخل بصيلات الشعر واحد - وعلى نطاق والعيانية - كما يراها توجهات متطابقة تقريبا الآلاف من الشعر جريبات داخل المنطقة المحلية من الجلد. تصور هذه الهياكل دون باجتزاء جسديا الجلد ممكن لأن للهندسة 2 الأبعاد لهذا الجهاز. في هذا البروتوكول، وتبين لنا أن الجلد الماوس يمكن تشريح، ثابتة، permeabilized، الملون، وأوضحت أنها سليمة اثنين الكائن الأبعاد، وهو جبل مسطح. بروتوكول يسمح التصور من السهل الهياكل الجلد في مجملها من خلال سمك كامل من مناطق واسعة من الجلد عن طريق التقيدباجتزاء كال وإعادة الإعمار. ويمكن أيضا صورا لهذه الهياكل أن تكون متكاملة مع المعلومات حول الموقف والتوجه النسبية لمحاور الجسم.
Introduction
الجلد هو واحد من أكبر الأجهزة في الجسم، مع وظائف هامة في somato-ضجة كبيرة، والعزل / الحراري، والدفاع المناعي 1. وقد فهم الأساس الجزيئي والخلوي للتنمية وظيفة الجلد من الاهتمام منذ فترة طويلة بسبب الأهمية الأساسية للالجلد كنظام البيولوجية وصلته الأمراض الجلدية. يحتوي الجلد الثدييات مجموعة متنوعة من هياكل متعددة الخلايا، بما في ذلك طبقات من الخلايا القرنية الطبقية، والنسيج الضام الجلدي، عدة أنواع من بصيلات الشعر والغدد الدهنية والعضلات مقف الشعرة، والأوعية الدموية، وما لا يقل عن اثني عشر فئات متميزة من وارد (الحسية) وصادر العصبية الألياف (الشكل 1). وترتبط مناطق مختلفة من الجسم مع أنواع مختلفة من الجلد بشكل مميز. في معظم الثدييات، وتغطي ما يقرب من سطح الجسم كله مع الجلد التي تعج بصيلات الشعر. [البشر والفئران الخلد عارية تشكل استثناءات لعشرهو النمط.] هو الشعر مفقودة من السطوح الراحي من اليدين والقدمين، والتي ترتبط أيضا مع أنماط المتخصصة البشرة (dermatoglyphs) والغدد خارجية الإفراز، والنهايات العصبية الحسية. الأحداث الخلوية والجزيئية التي تتحكم في النمو، والتمايز، والترتيب المكاني للخلايا داخل بصيلات الشعر هي التي تحظى باهتمام خاص حيث أن كل المعروضات المسام، في مصغرة، العديد من الميزات المركزية للتوالد 2. وتشمل هذه الميزات وجود الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية المتخصصة، والهجرات الخلية فشلت وجه التحديد، وتجميع هياكل متعددة الخلايا من مكونات متميزة جنيني.
توضح هذه المقالة الطرق للتشريح، وتحديد ووضع العلامات، والجلد الماوس التصوير باعتباره ورقة ثنائية الأبعاد سليمة، ويشار إليه على أنه "جبل بأكمله" أو "جبل مسطح" التحضير. منذ الجلد الماوس رقيقة نسبيا، فمن الممكن أن الصورة من خلال سمك كامل من التزلج بالارضن باستخدام المجهر متحد البؤر التقليدية. نهج جبل مسطح لتصوير الجلد الثدييات هو مفيد من الناحية الفنية لأنه يتجاوز الحاجة إلى باجتزاء المادية، مما يسمح الهياكل من أجل إعادة بنائها بالكامل من قبل باجتزاء البصرية. منذ ما يقرب تتم معالجة الجلد بأكمله ككائن واحد، وشقة جبل يسهل أيضا النهج التصوير من مناطق متعددة من سطح الجسم مع الحفاظ على المعلومات حول الموقف والتوجه النسبية لمحاور الجسم. أخيرا، والهياكل داخل الجلد وعادة ما تكون موجودة في الأنماط التي تتكرر على فترات منتظمة، مما يسهل جمع الصور من ممثلي متعددة من بنية معينة. هذه الخصائص هي مألوفة لبيولوجيا عصبية الذين يعملون على شبكية العين، وهي جزء ثنائي الأبعاد من الجهاز العصبي المركزي الذي تتمتع بمزايا مماثلة لدراسات مورفولوجيا الخلايا العصبية 3.
في جبل النهج شقة الموصوفة هنا هو من الفاءده خاصةذ لدراسة الهياكل التي تظهر التنظيم المكاني على نطاق واسع نسبيا داخل الطائرة ثنائية الأبعاد من الجلد. مثال واحد من التنظيم المكاني على نطاق واسع هو قطبية منسقة من بصيلات الشعر والهياكل المرتبطة بصيلات الشعر - مجموعات الخلايا ميركل، مقف العضلات الشعرة والغدد الزهمية، والنهايات العصبية 4. موجهة بصيلات الشعر في زاوية مع الاحترام لطائرة من الجلد، والمكون من ناقلات المسام التي تقع داخل الطائرة 2 الأبعاد من الجلد يسلك عموما التوجه فيما يتعلق محاور الهيئة التي تحدد بدقة لكل موقف على الجسم. على سبيل المثال، بصيلات الشعر على نقطة مرة أخرى من منقاري إلى الذيلية والشعر على السطح الظهري للقدم إشارة من الأقرب إلى القاصي. يتم التحكم جريب الشعر التوجه مستو قطبية الخلية إشارة (PCP؛ تسمى أيضا قطبية الأنسجة 5). تم اكتشاف هذا النظام الإشارات في ذبابة الفاكهة حيث صغيرةتم العثور على مجموعة من الجينات PCP الأساسية للتحكم في اتجاه الشعر جليدية وشعيرات. ثلاثة orthologues الثدييات من الجينات الأساسية PCP - homolog مقلى 6 (Fzd6، كما يشار إلى FZ6)، كادهيرين صندوق تعديل العولمة الأوروبي بفارق سبع تمريرة G-نوع مستقبلات 1 (Celsr1)، ومثل فانغ 2 (Vangl2) - تلعب أدوارا مماثلة في الثدييات الجلد وتنسيق توجهات بصيلات الشعر مع محاور الجسم. دراسات FZ6 الفئران خروج المغلوب (Fzd6 tm1Nat، يشار إليها فيما FZ6 - / -) تشير إلى أن الخلل الأساسي في غياب إشارات PCP هو التوزيع العشوائي الأولي أو الفوضى من التوجه بصيلات الشعر، مع عدم وجود تأثير على هيكل لا يتجزأ من بصيلات 6-8. يعمل نظام غير PCP الثانية في وقت لاحق إلى تعزيز التوافق المحلية من بصيلات المجاورة، الأمر الذي يؤدي إلى إنتاج أنماط الشعر على نطاق واسع مثل جدلات وخصلات.
والمثال الثاني على نطاق واسعويعتبر التنظيم المكاني داخل الجلد في الأشكال التضاريسية من العرش محوار الحسية. الخلايا العصبية الحسية التي يعصب الجلد لديهم أجسام الخلايا في الجذر الظهرية والعقد الثلاثي التوائم. هذه الخلايا العصبية كشف عن درجة الحرارة، والألم، وحكة، وأنواع مختلفة من التشوهات الميكانيكية التي تؤثر على الجلد والشعر 9. ويمكن تقسيمها إلى أنواع فرعية على أساس القطر محوار وسرعة التوصيل، ومحطة بنية نهاية العصبية، وأنماط التعبير من المستقبلات، وقنوات، والجزيئات الأخرى. بسبب كثافة عالية من تعصيب داخل الجلد، التحليلات التي تنطوي على تصور كل المحاور (على سبيل المثال، المناعية المضادة للخيط عصبي) أو حتى جميع محاور عصبية من فئة واحدة (كما رأينا عندما تم وضع علامة على نوع من الخلايا واحد عن طريق التعبير عن مراسل الفلورسنت) عموما يكشف تراكب كثيفة من المحاور التي تجعل من المستحيل تحديد مورفولوجية جذع الفردية. للتحايل على هذه المشكلة، ونحن قد استخدمت متفرق للغاية موجهة وراثيا لabeling لإنتاج عينات الجلد الظهرية التي هي تصور الفرد العرش محوار معزولة جيدا عن طريق التعبير عن مراسل النسيجية، الإنسان الفوسفاتيز القلوي المشيمة 10. هذا النهج يسمح التصور لا لبس فيها الفرد الأشكال التضاريسية محوار الشجرة وتعريف أنواع الخلايا العصبية الحسية الجسدية بناء على معايير مورفولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وقد تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للافق رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (IACUC) بروتوكول MO11M29 من مؤسسات جون هوبكنز الطبية. استشر الطبيب المبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية المحلية لأساليب المعتمدة من القتل الرحيم. ارتداء القفازات، معطف المختبر، والنظارات الواقية عند التعامل مع مثبتات ألدهيد أو المذيبات العضوية.
1. إعداد مواد
- صب لوحات Sylgard
- اتبع إرشادات الشركة المصنعة، مزيج من وكيل المعالجة مع القاعدة، ويحرك بقضيب من البلاستيك.
- ماصة 35 مل ~ Sylgard السائل لكل 10 سم القطر الأنسجة طبق الثقافة. أطباق زراعة الأنسجة هي أعمق من الأطباق البكتيرية القياسية؛ وهذا يوفر التخليص الرأسي للدبابيس الحشرات.
- وضع ديشيس على سطح أفقي في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. سوف فقاعات شكلت خلال خلط تختفي.
- بعد البلمرة، وتخزين لوحات Sylgard في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن تخزين لوحات Sylgard في درجة حرارة الغرفة لسنوات، وإعادة استخدامها عدة مرات حتى يفصل Sylgard من لوحة.
- حلول
- بنزوات البنزيل والكحول البنزيل (BBBA). خلط كميات بنزوات البنزيل 2 و 1 حجم البنزيل الكحول. متجر في الظلام في زجاجة مع سدادة الزجاج أو تفلون أعلى.
تنبيه: استخدم BBBA ينبغي التعامل معها بشكل مناسب على أنها نفايات المذيبات العضوية. لا تسمح BBBA في الاتصال البلاستيك. - الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إضافة 4 ز PFA إلى 80 مل من الماء، إضافة 0.1 مل 1 N هيدروكسيد الصوديوم، وإثارة على طبق ساخن في ~ 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ~ حتى يذوب تماما PFA، ثم إضافة 10 مل 10X PBS وتبرزي حجم إلى 100 مل مع الماء.
تنبيه: استنشاق الفورمالديهايد / PFA وBBBA الأبخرة ينبغي أن يكونالتقليل من حفظ هذه الحلول في حاويات مغطاة. الفورمالديهايد / PFA هو مادة مسرطنة. - النفط الأحمر O. إعداد الأوراق المالية بنسبة 0.5٪ في الأيزوبروبانول. فورا قبل الاستخدام تمييع مع الماء لتركيز النهائي من 0.3٪ زيت الأحمر O، ثم تصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرون.
- بنزوات البنزيل والكحول البنزيل (BBBA). خلط كميات بنزوات البنزيل 2 و 1 حجم البنزيل الكحول. متجر في الظلام في زجاجة مع سدادة الزجاج أو تفلون أعلى.
2. تشريح الجلد، تثبيت، والمقاصة
- الظهراني الجلد لالمناعية والميلانين التصوير
- بالنسبة للفئران الصغار جدا (على سبيل المثال، والأجنة ويوم بعد الولادة (P الجراء) 0-P3)، الموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق isoflurane و. الموت ببطء الفئران الأكبر سنا عن طريق الاستنشاق أو الحقن isoflurane والكيتامين / زيلازين تليها خلع عنق الرحم.
- إزالة الشعر مع الحلاقة الكهربائية وإزالة الشعر هلام. بالنسبة للفئران أصغر سنا من P8، يمكن تخطي هذه الخطوة.
- استخدام شفرة حلاقة لاجراء خفض أفقي من قاعدة الذيل على طول كل الجناح، ويمر على الجانب الظهري للقاعدة كل الأطراف، انطلاقا الجانبي للآذان ونهايةجي في الأنف.
- قشر بلطف الجلد من اجراءات الأنسجة الكامنة من الخلفي إلى الأمامي من خلال عقد الجلد بين أصابع القفاز بحيث لا يتم ذلك بواسطة ملقط مقروص. عند تقشير الجلد على مستوى الأذنين، وأول خطوة من نوعها قبالة آذان مع زوج من مقص والمضي قدما ببطء وخاصة الجلد يمكن المسيل للدموع في هذا الموقع.
- من هذه النقطة فصاعدا، توجيه الجلد مع الداخل مواجهة. دبوس الجلد لSylgard مع ~ 20 دبابيس الحشرات متباعدة بالتساوي حول محيط؛ لا تمتد أكثر من الجلد (الشكل 2B). تغطية الجلد مع 10-20 مل من برنامج تلفزيوني.
- تشريح بعيدا الدهون المرتبطة الجلد والنسيج الضام باستخدام ملقط الزاوية أو منحنية مع نهاية مدببة من ملقط تواجه أفقيا لتقليل المخاطر التي ملقط سوف تخترق الجلد. قذف أي فقاعات الهواء التي تم المحاصرين تحت الجلد من قبل المتداول بلطف قضيب من القطن ذات الرؤوس على سطح الجلد.
ملاحظة: إذا كان الجلد هو الذهابلاستخدامها في جبل المناعية شقة أو الكيمياء النسيجية، وإزالة أكبر قدر من النسيج الضام وقت ممكن؛ إذا كان الجلد هو على وشك أن يستخدم لتصور بصيلات الشعر على أساس الميلانين تصبغ، وإزالة أقل اكتمالا من النسيج الضام هو مرض. الجلد قبل الولادة تتطلب الحد الأدنى من "تنظيف" من النسيج الضام ملتصقة. - إصلاح الجلد عن طريق إضافة دبس 20 مل من الطازجة PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني أو 10٪ من الفورمالين مخزنة في 10 سم لوحة Sylgard (إذا كان سيتم استخدام الجلد للتصوير الميلانين أو الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) الكيمياء النسيجية) أو 20 مل من الطازجة 2٪ PFA / برنامج تلفزيوني (إذا كان سيتم استخدام الجلد لالمناعية المعدلة وراثيا أو تصور الكيراتين (كرت) 17-GFP 11)، وتناوب بلطف بين عشية وضحاها في غرفة باردة. في اليوم التالي، وغسل في برنامج تلفزيوني ل> 10 دقيقة.
ملاحظة: الفورمالين قياسي هو 37٪ الفورمالديهايد؛ وبالتالي، "10٪ من الفورمالين" هو 3.7٪ الفورمالديهايد. - لAP تلطيخ والمناعية، والاستمرار في القسم 3. للالميلانين ايماججي، يذوى الجلد من خلال سلسلة متدرجة الايثانول (70٪، 95٪، 100٪)، يوم واحد عن كل خطوة، مع تناوب الأفقي لطيف في درجة حرارة الغرفة. إزالة الأنسجة الضامة المتبقية.
- مع الجلد في الإيثانول بنسبة 100٪، وإزالة دبابيس الحشرات و، إذا رغبت في ذلك، وتقليم الجلد مع مقص لإزالة معظم الطرفية 1-2 ملم من الجلد مع ثقوب دبوس.
- نقل الجلد إلى 10 سم صحن الزجاج القطر، ووضع شريحتين المجهر الزجاج على الجلد لمنعها من الشباك، وإضافة 20 مل من BBBA. BBBA يصلب بسرعة الأنسجة لذلك من المهم للبشرة لتكون بالارض تحت وطأة من الشرائح الزجاجية قبل إضافة BBBA.
- خلال الساعات القليلة القادمة، ورفع الشرائح قبالة الجلد لبضع ثوان للسماح للBBBA لغسل فوق الجلد.
ملاحظة: ارتداء قفازات عند التعامل مع BBBA. يمكن اعتمادا على العمر ومكان الجلد يكون هناك ما يصل إلى 30٪ انكماش في BBBA.
- جلد القدم لتحليل الشعر جريب Patterning
ملاحظة: مجموعة من الأعمار فحص عادة هو P1-P8.- بعد القتل الرحيم، وقطع القدمين فوق مفصل الكاحل وجعل قطع على التوالي واحد على طول السطح البطني من خلال باطن القدمين.
- قشر بلطف الجلد من الأنسجة الكامنة، وانطلاقا في الاتجاه الأقرب إلى القاصي.
- قطع أرقام للافراج عن الجلد ويعلقون عليه لSylgard مع السطح داخل مواجهة (الشكل 2C). هناك الحد الأدنى من النسيج الضام في الجلد القدم.
- المعدلة وراثيا Krt17-GFP الجلد هو الآن على استعداد للتصوير. للتصوير الميلانين المضي قدما في تثبيت والجفاف وBBBA المقاصة كما هو موضح في القسم 2.1.
- جلد القدم لتصور الدهنية الغدد
- بعد القتل الرحيم، وإزالة الشعر عن طريق فرك الشعر مزيل هلام على سطح الجلد مع إصبع القفاز والإبهام؛ الانتظار لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: لا تستخدم الحلاقة الكهربائية، والتي سوف تضر الجلد الحساس القدم. - Wرماد سطح الجلد مع ماء الصنبور، ويعلقون تشريح الجلد لSylgard كما هو موضح في القسم 2.2.
- إصلاح مع 1٪ PFA / برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: للحصول على تصور الغدد الدهنية على القدمين، والذي وضع بعد أول أسبوع بعد الولادة، سن الأمثل للتحليل مع النفط الأحمر O هو P21، لأن هذا يمثل الدرك الأسفل من تصبغ الشعر خلال دورة الشعر الأولى 12، وبالتالي فإن الغدد الدهنية يمكن أن ينظر إليه بسهولة أكبر. مع الفئران البيضاء يمكن أن يؤديها هذا التحليل في أي سن. للحصول على ذرية البيضاء عبر فئرانا معدلة وراثيا المصطبغة إلى خط متحولة التيروزينيز مثل C57BL/6J-Tyr ج-2J.
- بعد القتل الرحيم، وإزالة الشعر عن طريق فرك الشعر مزيل هلام على سطح الجلد مع إصبع القفاز والإبهام؛ الانتظار لمدة 10 دقيقة.
- إعداد الذيل الجلد لتحليل توزيع الميلانين، الشعر جريب الاتجاه، والغدة الدهنية التصور
- بعد القتل الرحيم، وجعل قطع دائرية حول قاعدة الذيل، ثم شق الطولية التي تمتد على طول الذيل طول وجهه البطني. <لى> تقشر الجلد الذيل ابتداء من الساعة غيض من قبل يمسك بحزم طرف الذيل العظام و / أو النسيج الضام مع زوج واحد من ملقط والجلد مع الزوج الثاني من ملقط. دبوس الجلد الذيل لSylgard.
- لتحليل توزيع الميلانين وبصيلات الشعر والتوجه، وإصلاح ومعالجة الجلد كما هو موضح في القسم 2.1. لتحليل الغدد الدهنية، وقطع الجلد الذيل إلى سلسلة من قطاعات ~ 0،5-1 سم في الطول قبل التثبيت واحتضان قطعة الجلد في برنامج تلفزيوني / 5 ملي EDTA بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لإضعاف البشرة الأدمة-13 التصاق.
- قشر بلطف البشرة من الأدمة، دبوس البشرة لSylgard (الوجه الداخلي لأعلى)، واصلاحها في PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يغسل مع برنامج تلفزيوني، وصمة عار مع زيت الأحمر O كما هو موضح أدناه.
ملاحظة: الحلاقة الكهربائية و / أو إزالة الشعر هلام يمكن استخدامها قبل تشريح أقدم الجلد الذيل (على سبيل المثال، P21)، ولكن هذا العلاج هو اختياري منذ الشعر على الذيل ليستكثيفة كما في أماكن أخرى في الجسم.
3. ردود الفعل تلطيخ
- المشيمة البشرية الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) كيمياء الأنسجة لتصور وراثيا المسمى أكسون العرش 10،14،15 (أرقام 3A، B)
- بعد تثبيت PFA على Sylgard، ضع جلود ثابتة في طبق زجاج 10 سم ويغرق تحت PBS / 1 ملي MgCl 2. تناوب بلطف الطبق في حمام الماء عند 70 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لتدمير النشاط الفوسفاتيز الذاتية.
- تصور AP النشاط مراسل الكيميائيه النسيجيه مع 4-48 ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة في 0.1 M تريس، ودرجة الحموضة 9.5، 0.1 M كلوريد الصوديوم، و 50 ملي MgCl 2، 0.34 ميكروغرام / مل NBT، و0.175 ميكروغرام / مل BCIP، وعادة ما تستخدم 10-15 مل من محلول تلطيخ P21 في ظهري الجلد. رصد رد الفعل تحت مجهر تشريح، مع الحرص على عدم السماح لها المضي قدما إلى ما بعد الوقت الأمثل، والحكم عن طريق التفتيش البصري من محوار تلطيخ الكثافة النسبية لغير محددة NBT الترسيب. وقف رد فعل عن طريق الغسيل مع ثلاثة تغييرات من PBS/0.1٪ توين 20 على مدى 1 ساعة، وإعادة دبوس جلود لSylgard، يذوى والجلود من خلال سلسلة الإيثانول، ومن ثم نقل إلى جلود طبق 10 سم مع BBBA.
ملاحظة: BBBA يذوب ببطء راسب NBT. خلال الساعات القليلة الأولى في BBBA، سوف خلفية غرامة عجلت NBT حل؛ نتيجة لذلك، فإن الحل BBBA تلقي بظلالها، وسوف يخفف الجلد. تغيير BBBA جديدة بعد بضع ساعات. - بعد التصوير الجلد AP الملون، ونقل ذلك إلى الإيثانول ل> 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم تخزينها في الإيثانول النقي في -20 درجة مئوية. ويمكن تخزين الجلود AP الملون في هذا الطريق لعدة أشهر مع عدم فقدان إشارة.
- النفط الأحمر O تلطيخ لتصور الدهنية الغدد 4 (أرقام 3C-F)
- إزالة دبابيس الحشرات ونقل الأقدام الثابتة طفيفة أو جلود الذيل من لوحة Sylgard إلى الآبار من 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة، معما يصل الى اثنين عينات الجلد لكل بئر. يغسل 60:40 الأيزوبروبانول: الماء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- وصمة عار في 2 مل 0.3٪ زيت الأحمر O في 60:40 الأيزوبروبانول: المياه (انظر القسم 1.2) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
- يغسل 60:40 الأيزوبروبانول: الماء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها مياه الغسيل. تقليم بعناية بعيدا عن حواف من الجلد، بما في ذلك ثقوب دبوس، مع مقص غرامة بحيث يمكن جعل سطح الجلد كما شقة ممكن.
- وضع الجلد على شريحة مع السطح الخارجي مواجهة، إضافة بضع قطرات من الماء أو المائية المتوسطة المتزايدة، وتغطية الجلد مع ساترة، ثم الشريط بلطف ساترة إلى الشريحة لمزيد لشد الجلد.
- جبل مسطح المناعية 4،16،17 (أرقام الجيل الثالث 3G، H)
- قطع مستطيل من الجلد PFA ثابتة (على سبيل المثال 1 سم × 0.5 سم)، بمناسبة توجهها مع قطع غير المتماثلة (على سبيل المثال مقطع الزاوية اليمنى الأمامية). أداء الحضانة وغسل الخطوات مع دوران طيف على منصة أفقي بالتناوب. في الآبار من 6 - 12 أو جيدا نسيج لوحة الثقافة، وغسل عدة مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة المتبقي PFA، ويغسل مع ~ 10 التغييرات من برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ تريتون X-100 (0.3٪ PBST) أكثر من 5-8 ساعة على درجة حرارة الغرفة لpermeabilize الجلد.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية 0.3٪ في PBST مع 5٪ مصل الماعز و 20٪ DMSO لمدة خمسة أيام في درجة حرارة الغرفة. تغطية الآبار من لوحة واضحة مع الشريط أو البلاستيك لاصقة للقضاء على خسائر التبخر.
- تغسل مع التغييرات 10-15 من 0.3٪ أكثر من PBST 5-8 ساعة واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية في 0.3٪ PBST مع 5٪ مصل الماعز و 20٪ DMSO لمدة 3 أيام في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل مع التغييرات 10-15 من 0.3٪ أكثر من PBST 5-8 ساعة.
- يذوى في 25٪، 50٪، و 75٪ الميثانول لمدة 5 دقائق ثم كل 3X في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة لكل منهما.
- واضح بين عشية وضحاها في BBBA في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: شقة جبل المناعية للجلد تقل أعمارهم عن~ P1 لا يمكن أن يؤديها كما هو موضح أعلاه ولكن مع أقصر الحضانة ويغسل مرة. على سبيل المثال، يمكن immunostained P1 الجلد مع الحضانة بين عشية وضحاها في الأجسام المضادة الأولية والعديد من الحضانة ساعة في الضد الثانوية، ويغسل مع التدخل فقط 2-3 ساعة في 0.3٪ PBST. كما ذكر أعلاه، والجلود الأصغر سنا أيضا رقيقة بما فيه الكفاية بحيث يمكن تصويرها دون BBBA المقاصة.
- تصور ميركل الكتل الخليوي مع العصب الطرفي نيون صبغ امتصاص (أرقام 3I-L)
AMI-43 (الأخضر) وAM4-65 (الحمراء) هي الأصباغ الفلورية التي تدخل الخلايا يمكن حلها عبر القنوات غير انتقائية الموجبة 18. في الجلد يعيشون تؤخذ هذه الأصباغ بشكل انتقائي وحتى تتركز في خلايا ميركل.- حل 1 ملغ AM1-43-65 أو AM4 في 2 مل PBS وتخزينها في aliquots في -80 درجة مئوية.
- حقن تحت الجلد مع الجراء حديثي الولادة 2-10 ميكروغرام لكل غرام صبغ وزن الجسم باستخدام إبرة G 29.
- في وقت لاحق يوم واحد، الموت ببطء الفئران وديسيهط م جلود الظهرية.
- إصلاح جلود في PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية خلال الليل، ويغسل مع برنامج تلفزيوني، وجبل الجلد كما هو موضح في القسم 3.2.
4. التصوير وتحليل الصور
- التصوير جريب الشعر التوجيه (الشكل 4)
- استخدام مجهر تشريح لصورة الظهرية، القدم، أو جلود الذيل التي يتم المغمورة في BBBA، بالارض تحت شريحة زجاجية، والتي لا تزال في صحن الزجاج - هذا النهج يقلل التلوث BBBA المجهر.
- إلقاء الضوء على طبق من الأسفل. لتقليل التباين المكاني في شدة الضوء عبر مجال الرؤية، ورفع الطبق الزجاجي إلى ارتفاع ~ 10 سم فوق سطح العمل القياسية للمجهر تشريح ووضع البلاستيك نشرها أو لوحة من الزجاج أكثر من مصدر الضوء.
- عودة الجلد إلى الإيثانول بنسبة 100٪ للتخزين طويل الأجل في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: ترك الجلد في BBBA لأكثر من يوم واحد يسبب حبيبات الميلانين لكسرجزء. مرة واحدة على الجلد عولج BBBA أنها سوف تتصلب ويظل ثابتا من تلك النقطة فصاعدا. يمكن ترميز جلود مختلفة مع سلسلة من الشقوق في الأمامية و / أو الخلفية ينتهي، بحيث يمكن تخزين معا، لتوفير مساحة في الفريزر.
- التصوير والبحث عن المفقودين أكسون العرش (أرقام 3A، B)
- وضع AP الملون الجلد (القسم 3.1.3) بين لوحين من الزجاج من النوع المستخدم لالهلامية بروتين صغير. تجنب إدخال فقاعات الهواء بين لوحات والجلد، ثم الفتيل بعناية بعيدا أي BBBA الزائدة مع منشفة ورقية. وضع لوحة شطيرة الجلد لوحة على خشبة المسرح المجهر (الشكل 2D).
- استخدام مشرق الميدان أو DIC الإضاءة مع الهدف 10X و 2 ميكرون أو 5 ميكرون Z-الخطوات. استخدام مرحلة XY الميكانيكية لالتقاط الصور من المونتاج XY التي يتم خياطتها معا لخلق ثلاثي الأبعاد مجموعة البيانات على نطاق والرمادي واحد.
ملاحظة: للحصول على واحدة جذع محور عصبي كبير، يمكن أن تكون هذه المجموعة من البياناتق كبيرة مثل 5 غيغابايت. - أداء اليدوي، الآلي، أو تتبع شبه الآلي العرش محوار مع أي من مجموعة متنوعة من حزم البرمجيات.
ملاحظة: البرمجيات مثل Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) هو أداة إعادة الإعمار العصبية الحرة التي يتم تشغيلها في بيئة الكمبيوتر وسهلة نسبيا لإتقان 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التصوير Brightfield من flatmounts الجلد يمكن استخدامها لصورة afferents الحسية الجلدية (الشكل 3A 10) وأنماط بصيلات الشعر على أساس الميلانين تصبغ (الشكل 4). التصوير متحد البؤر من flatmounts الجلد يمكن استخدامها لتحديد هندسة (1) مجموعات الخلايا ميركل، تصور مع المضادة للcytokeratin-6 أو مع امتصاص AM صبغ (أرقام 3I-L)، (2) عضلات مقف الشعرة، تصور مع المضادة لل أكتين العضلات الملساء (أرقام الجيل الثالث 3G، H)، (3) الغدد الدهنية، وتصور مع النفط الأحمر O (أرقام 3C-F)، و (4) بصيلات الشعر، تصور مع التحوير Krt17-GFP أو تلطيخ مع الأجسام المضادة للKrt17 4 (أرقام 3E-G، K، L). فإنه واضح ومباشر ليسجل توجهات وترتيبات المكانية الهياكل في مثل هذه الصور يدويا عن طريق وضع النواقل الميول المعروفة على الهياكل باستخدام أدوبي فوتوشوب أو المصور، ثم quantifyinز السكان ناقلات الناتجة عن ذلك. في حين أن هذا النهج يكفي لمقياس من عدة مئات من ناقلات، فإنه سيكون شاقة باهظة على 10 - 100 أو أضعاف نطاق أوسع.
الشكل 1. تخطيطي من الجلد شعر الثدييات تظهر الهياكل الرئيسية. (حقوق الطبع والنشر، تيريز ينسلو.)
الشكل 2. تشريح الجلد والتعامل مع العينة. A) أدوات تشريح. B) A P5 الظهرية الجلد معلقة على لوحة Sylgard. C) A P5 الظهرية الخلفية جلد القدم معلقة على لوحة Sylgard. D) A الجلد الظهري شنت بين 2 وحات هلام الزجاج للتصوير ثإيث هدفا 10X ومدينة دبي للإنترنت أو إضاءة brightfield.
الرقم 3. الهياكل الجلد في شقة جبل وجهات النظر. A، B) وشجرة واحدة الجلدية الحسية (يسار) وصورتها تتبع (الحق) من الجلد P21 الظهرية من Brn3a CKOAP / +؛ NFL-CreER / + الماوس يتعرض لجرعة منخفضة تاموكسيفين في اليوم الحمل 17 نتائج هذا البروتوكول في إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة لمراسل في جزء صغير جدا من الخلايا العصبية الظهرية العقدة الجذر، وبالتالي وصفت جزء صغير من العرش الحسي الجلدي مع المشيمة الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) مراسل الإنسان. وتصور محاور المسمى مع NBT / BCIP الكيمياء النسيجية. يشار إليها باسم Brn3a مكافئ Pou4f1. C، D) الجلد الذيل ملطخة النفط الأحمر O لتصور من الغدد الدهنيةWT (يسار) وFZ6 - / - (الحق) في الفئران P21. وFZ6 - / - الهياكل غير منظمة. P، الداني؛ دال، القاصي الجلد القدم E، F) الظهرية من WT (يسار) وFZ6 - / - (يمين) الفئران تحمل Krt17-GFP. وكان حصاد الجلد في P21 وملطخة النفط الأحمر O. وFZ6 - / - الجلد لديه دوارة الشعر في وسطها. P، الداني؛ دال، القاصي G، H) الظهرية الجلد من الماوس في WT P21 تظهر بصيلات الشعر (تصور مع التحوير Krt17-GFP ومكافحة GFP المناعية؛ وحة G) والعضلات مقف الشعرة [تصور مع أكتين العضلات مكافحة سلس (SMA ) المناعية؛ لوحة H]. عمق داخل الصورة متحد البؤر Z-كومة هو ونا مميزا. A، الأمامي؛ P، الخلفية. IL) الكتلة الخلية A ميركل (تصور مع المناعية cytokeratin8 أو AM11-43 صبغ امتصاص) وبصيلات الشعر في وسط (في لوحات تصور K و L مع Krt17-GFP). تم الحصول على الصور من P1 الظهرية الجلد من المورثات المشار إليها. وFZ6 - / - الكتلة خلية ميركل يشكل دائرة مغلقة، في حين أن الكتلة الخلية WT ميركل مفتوح نحو الأمامي. A، الأمامي؛ P، الخلفية. أشرطة النطاق: A و B، و 300 ميكرومتر؛ C و D، و 500 ميكرومتر؛ E و F، و 500 ميكرومتر؛ G و H، و 200 ميكرومتر؛ IL، 50 ميكرومتر. (ألواح ألف وباء وترد من موبايلي elife وبروك. نتل. أكاد. العلوم. الولايات المتحدة الأمريكية، بإذن 4،10) الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الشعر وبصيلات الشعر في الجلد الظهري في P1 وP7 تصور مع الميلانين تصبغ. A، B) من الجلد P1 WT وFZ6 - / - الفئران C، D) P7 الجلد من FZ6 - / - الفئران. أشرطة النطاق: A و B، و 500 ميكرومتر؛ C و D، 1 مم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إتقان أساليب تشريح المذكورة أعلاه يتطلب الصبر فقط، مطرد من ناحية، وعدد قليل من الأدوات تشريح جيدة. تشريح الجلد الظهري من السهل نسبيا، ولكن الذيل والجلد القدم تشريح - وخاصة في سن مبكرة بعد الولادة - هي أكثر تحديا. في سن مبكرة قبل الولادة (على سبيل المثال، قبل E15)، والجلد من الصعب إزالة دون تمزق. ملائم، بالنسبة للعديد من الدراسات للنمو والزخرفة الهياكل الجلد في الفئران، والأحداث التي تهم تحدث بعد الولادة، كما رأينا على سبيل المثال في دراسات نمو العضلات مقف الشعرة 19.
التصوير في عمق الجلد في تكوين جبل مسطحة من الأمور الصعبة نظرا الجلد هو نسيج سهل الانكسار نسبيا. يصبح هذا التحدي أكبر مع نضوج الجلد يرجع ذلك إلى التفريق وزيادة سمك الطبقات المكونة لها. واحد حل جزئي لهذه المشكلة هو الفصل بين الأدمة والبشرة وتحليل epidermكما بنية منفصلة ("البشرة يتصاعد كله"). هذا النهج هو مفيد لتصور بصيلات الشعر والهياكل المرتبطة بها، وخصوصا للبشرة ذيل الماوس. ومع ذلك، والحصول على نوعية عالية البشرة يتصاعد كله من الماوس الظهرية الجلد من الصعب، ويفترض بسبب (1) كثافة عالية من بصيلات الشعر التي تمتد عميقا في الأدمة و (2) ركاكة من البشرة بين الجريبات 13.
في تجربتنا، والعلاج BBBA هي طريقة فعالة للغاية لجعل الجلد شفافة بصريا مع الحفاظ على إشارات مناعي من دون الحاجة إلى فصل البشرة والجلد طبقات. وقد استخدم البنزيل بنزوات، لمسح الأنسجة لعقود 20 ويتم استخدامه على نطاق واسع لمسح الضفادع والأسماك الأجنة. ومع ذلك، BBBA ديه عيب أن يبدل طبيعة GFP والبروتينات الفلورية الأخرى، يذوب النفط الأحمر O، وأنها يمكن أن تلوث المعدات (على سبيل المثال، والمجاهر). فإنه سيكون من ينتيريسر لمقارنة منهجية العلاج BBBA من الجلد مع توضيح أساليب أخرى مثل SeeDB 21، ClearT 22، مقياس 23، 3DISCO 24، 25 والوضوح، وبعضها متوافق مع البروتينات الفلورية. إذا تعامل BBBA العينات ليتم تصويرها باستخدام مجهر تشريح، وعلى ضوء / المجهر الفلورسنت التقليدية، أو المجهر متحد البؤر، ينبغي أن توضع العينات في صحن الزجاج أو بين اثنين من لوحات زجاجية كبيرة للحد من التلوث BBBA.
لم نناقش تحليل البيانات بأي قدر من التفصيل، وهذا هو أكثر الفقهي لهذه المسألة البيولوجية قيد التحقيق. لكن، وكما لوحظ في المقدمة، وجود العديد من الهياكل متطابقة تقريبا مثل بصيلات الشعر، ومجموعات الخلايا ميركل، والنهايات العصبية، واكتمال مع هذه الهياكل التي يمكن تصويرها في شقة يتصاعد يوفر فرصة لقياس المعلمات الهيكلية أو المورفولوجي في أماه صارمة إحصائياnner، كما رأينا على سبيل المثال في الدراسات الحديثة من الأشكال التضاريسية جلدي عصبي حسي 10 وبصيلات الشعر والهياكل المرتبطة جريب في نوع البرية وفئرانا معدلة وراثيا FZ6 4،8. مع تطور أدوات التحليل صورة أكثر تطورا، فإنه قد يكون من الممكن لأتمتة أو شبه أتمتة بعض التحليلات أنه في الوقت الحاضر، يتم تنفيذ يدويا، مما يسهل استخدامها على نطاق أوسع من الجلد جبل مسطح التصوير كأسلوب للتحقيق المبادئ الأساسية منظمة متعددة الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
