Summary
Zoogdierhuid bevat een divers scala aan structuren - zoals haarfollikels en zenuwuiteinden - die onderscheidend patronen van ruimtelijke organisatie vertonen. Het analyseren van de huid als een platte berg maakt gebruik van de 2-dimensionale geometrie van dit weefsel tot volledige dikte van hoge-resolutie afbeeldingen van de huid structuren te produceren.
Abstract
Huid is een zeer heterogeen weefsel. Intra-dermale structuren omvatten haarzakjes, haarspier spieren, epidermale specialisaties (zoals Merkel cel clusters), talgklieren, zenuwen en zenuwuiteinden, en haarvaten. De ruimtelijke ordening van deze structuren wordt streng gecontroleerd op microscopische schaal - zoals gezien, bijvoorbeeld in de geordende celtypen binnen een haarfollikel - en op microscopische schaal - zoals gezien door de bijna identieke oriëntaties van duizenden haren follikels binnen een lokaal gebied van de huid. Visualisering deze structuren zonder fysieke snijden de huid mogelijk door de 2-dimensionale geometrie van dit orgaan. In dit protocol, laten we zien dat de huid van muizen kan worden ontleed, vaste, gepermeabiliseerde, gekleurd, en verduidelijkt als een intacte twee dimensionaal object, een platte berg. Het protocol zorgt voor eenvoudige visualisatie van de huid structuren in hun geheel door de volledige dikte van grote delen van de huid door optical snijden en wederopbouw. Foto's van deze structuren kunnen ook worden geïntegreerd met informatie over de positie en oriëntatie ten opzichte van het lichaam assen.
Introduction
De huid is een van de grootste organen in het lichaam, met belangrijke functies in somato-sensatie, isolatie / thermoregulatie, en immuunsysteem 1. Het begrijpen van de moleculaire en cellulaire basis van de ontwikkeling en functie van de huid is geweest van langdurige interesse vanwege het fundamentele belang van de huid als een biologisch systeem en de relevantie ervan voor dermatologie. Zoogdierhuid bevat een verscheidenheid aan meercellige structuren, met inbegrip gelaagde lagen van keratinocyten, dermale bindweefsel, verschillende soorten van haarzakjes, talgklieren, haarspier spieren, bloedvaten, en minstens een dozijn verschillende klassen van afferente (sensorische) en efferente zenuw vezels (figuur 1). Verschillende gebieden van het lichaam geassocieerd met typisch verschillende huidtypes. In de meeste zoogdieren, is vrijwel het gehele lichaamsoppervlak bedekt met huid die dicht zit vol met haarfollikels. [Mensen en naakte mol ratten vormen uitzonderingen op eis patroon.] Haar ontbreekt in de palmaire oppervlak van de handen en voeten, die ook worden geassocieerd met gespecialiseerde epidermale patronen (dermatoglyphs), exocriene klieren, en sensorische zenuwuiteinden. De cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die de groei, differentiatie en ruimtelijke rangschikking van cellen in de haarfollikel regelen van bijzonder belang aangezien elke follikel vertoont, in het klein, veel essentiële kenmerken van organogenese 2. Deze functies omvatten het bestaan van stamcellen en een stamcel niche, nauwkeurig gechoreografeerde cel migraties, en de assemblage van meercellige structuren uit embryologically verschillende componenten.
Dit artikel beschrijft methoden voor het ontleden, het bevestigen, etikettering, en imaging muis huid als een intacte twee-dimensionale vel, aangeduid als een "geheel mount" of "flat mount 'voorbereiding. Aangezien muis huid is relatief dun, is het mogelijk om beeld door de volledige dikte van afgeplatte skin met conventionele confocale microscopie. De flat mount aanpak zoogdierhuid beeldvorming is technisch voordelig omdat het omzeilt de noodzaak van fysieke snijden, waardoor structuren volledig te worden gereconstrueerd door optische sectie. Aangezien bijna de gehele huid wordt behandeld als een object, het vlakke zet benadering vergemakkelijkt ook de beeldvorming van meerdere gebieden van het lichaamsoppervlak met behoud van informatie over de positie en oriëntatie ten opzichte van het lichaam assen. Tenslotte structuren binnen de huid zijn typisch in patronen die regelmatig herhaald, waardoor de verzameling afbeeldingen vergemakkelijken van meerdere vertegenwoordigers van een bepaalde structuur. Deze kenmerken zijn bekend neurobiologists die via de retina, een tweedimensionaal gedeelte van het centrale zenuwstelsel die soortgelijke voordelen heeft voor onderzoek naar neuronale morfologie 3 werken.
De vlakke montage aanpak hier beschreven is van bijzondere utility voor het bestuderen structuren die ruimtelijke organisatie vertonen op grotere schaal in het tweedimensionale vlak van de huid. Een voorbeeld van grootschalige ruimtelijke organisatie is de gecoördineerde polariteit van de haarzakjes en haren-follikel geassocieerd structuren - Merkel cel clusters, haarspier spieren, talgklieren en zenuwuiteinden 4. Haarzakjes georiënteerd onder een hoek ten opzichte van het vlak van de huid, en de component van de follikel vector die in de 2-dimensionale vlak van de huid ligt meestal vertoont een oriëntatie ten opzichte van het lichaam assen die nauwkeurig bepaald voor elk positie op het lichaam. Bijvoorbeeld, haarzakjes op de rug punt van rostraal caudaal en haren op het dorsale oppervlak van de voeten wijzen van proximale naar het distale. Haarfollikel oriëntatie wordt gecontroleerd door vlakke celpolariteit signalering (PCP, ook wel weefsel polariteit 5). Dit signaleringssysteem werd ontdekt in Drosophila waar een kleineset van kern PCP genen werd gevonden om de oriëntatie van cuticulair haren en haren te controleren. Drie zoogdieren orthologa van kern PCP genen - frizzled homoloog 6 (Fzd6, ook wel aangeduid als Fz6), cadherine EGF LAG uit zeven cycli G-receptor type 1 (Celsr1), en vang-achtige 2 (Vangl2) - spelen analoge rollen in zoogdiercellen huid, het coördineren van de oriëntaties van de haarzakjes met het lichaam assen. Studies Fz6 knockout muizen (Fzd6 tm1Nat, hierna Fz6 - / -) blijkt dat de primaire defect bij afwezigheid van PCP signalering een eerste randomisatie of desorganisatie van haarfollikel oriëntatie, zonder effect op de intrinsieke structuur van de follikels 6-8. Een tweede niet-PCP systeem werkt later plaatselijke aanpassing van nabijgelegen follikels, wat leidt tot de productie van grootschalige haar patronen zoals spiralen en bosjes bevorderen.
Een tweede voorbeeld van grootschaligeruimtelijke organisatie in de huid is te zien in de morfologie van sensorische axon priëlen. Sensorische neuronen die de huid innerveren hebben hun cellichamen in de dorsale wortel en trigeminus ganglia. Deze neuronen detecteren temperatuur, pijn, jeuk en diverse soorten mechanische vervormingen botst op de huid en haren 9. Ze kunnen worden ingedeeld in subtypes gebaseerd op axon diameter en geleidingssnelheid, eindstandige zenuwuiteinde structuur en de patronen van expressie van receptoren, kanalen en andere moleculen. Vanwege de hoge dichtheid van innervatie in de huid, analyses die gepaard visualiseren alle axonen (bijvoorbeeld anti-neurofilament immunokleuring) of zelfs alle axonen van een klasse (wanneer men een enkel celtype wordt gekenmerkt door expressie van een fluorescerende reporter) onthult algemeen een dichte opeenstapeling van axonen die het onmogelijk maakt om de morfologie van een individuele as definiëren. Om dit probleem te omzeilen, hebben we gebruik uiterst schaars genetisch gerichte lAbeling naar dorsale huid monsters waarin afzonderlijke goed geïsoleerde axon priëlen worden gevisualiseerd door de expressie van een histochemische verslaggever, menselijke placenta alkalische fosfatase 10 te produceren. Deze aanpak maakt het eenduidige visualisatie van individuele axon prieel morfologie en een definitie van de soorten somatosensorische neuron op basis van morfologische criteria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Alle dieren werden behandeld volgens de goedgekeurde institutionele Animal Care en gebruik Comite (IACUC) protocol MO11M29 van de Johns Hopkins Medical Institutions. Raadpleeg uw plaatselijke Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen voor goedgekeurde methoden van euthanasie. Draag handschoenen, labjas en veiligheidsbril bij het hanteren van aldehyde fixatives of organische oplosmiddelen.
1. Voorbereiding van Materialen
- Gieten Sylgard Plates
- De instructies van de fabrikant, meng de verharder met de basis en roer met een plastic staaf.
- Pipet ~ 35 ml vloeistof Sylgard per 10 cm diameter weefselkweek schotel. Weefselkweek gerechten zijn dieper dan de standaard bacteriële gerechten; dit levert doorvaarthoogte voor het insect pinnen.
- Plaats de dishes op een horizontaal vlak bij kamertemperatuur gedurende de nacht. Belletjes gevormd tijdens het mengen verdwijnt.
- Na polymerisatie, slaan de Sylgard platen bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Sylgard platen kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur jaar en hergebruikt meerdere keren totdat het Sylgard los van de plaat.
- Oplossingen
- Benzyl benzoaat en benzylalcohol (BBBA). Meng 2 volumes benzylbenzoaat en 1 volume benzylalcohol. Bewaren in het donker in een glazen fles met een glazen stop of teflon top.
LET OP: Gebruikt BBBA moeten naar behoren worden behandeld als afval van organische oplosmiddelen. Sta niet toe dat BBBA contact plastic. - Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 4 g PFA tot 80 ml water, voeg 0,1 ml 1 N NaOH, roer op een hete plaat bij ~ 70 ° C gedurende ca. 5 min. totdat de PFA volledig is opgelost en voeg 10 ml 10x PBS en breng het volume op 100 ml met water.
LET OP: Het inademen van formaldehyde / PFA en BBBA dampen moetengeminimaliseerd door het houden van deze oplossingen in afgedekte vaten. Formaldehyde / PFA is een kankerverwekkende stof. - Oil Red O. Bereid een 0,5% voorraad in isopropanol. Vlak voor het gebruik verdunnen met water tot een uiteindelijke concentratie van 0,3% Oil Red O, en dan filteren door een 0,2 um filter.
- Benzyl benzoaat en benzylalcohol (BBBA). Meng 2 volumes benzylbenzoaat en 1 volume benzylalcohol. Bewaren in het donker in een glazen fles met een glazen stop of teflon top.
2. Huid Dissection, Fixatie, en Clearing
- Dorsale Skin voor Immunokleuring en Melanine Imaging
- Voor zeer jonge muizen (bijvoorbeeld foetussen en postnatale dag (P) 0-P3 pups), euthanaseren de muizen door isofluraan inhalatie. Euthanaseren oudere muizen door isofluraan inhalatie of door ketamine / xylazine injectie, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Verwijder het haar met een elektrisch scheerapparaat en ontharing gel. Voor muizen jonger dan P8, kan deze stap worden overgeslagen.
- Gebruik een scheermesje om een horizontale snede te maken van de basis van de staart langs elke flank, doorgeven van de dorsale zijde van de basis van elke ledemaat, uitgaande lateraal van de oren en eindeing op de neus.
- Haal voorzichtig het vel van het onderliggende weefsel procedure van posterior naar anterior door het houden van de huid tussen gehandschoende vingers, zodat het niet is vastgeklemd door een tang. Bij het schillen van de huid ter hoogte van de oren, eerst afgesneden van de oren met een schaar en ga vooral langzaam als de huid kan scheuren op deze locatie.
- Vanaf dit punt, oriënteren de huid met de binnenkant naar boven. Speld de huid Sylgard met ~ 20 insect pinnen gelijkmatig verdeeld, over de periferie; niet over-rekken van de huid (figuur 2B). Bedek de huid met 10-20 ml PBS.
- Ontleden weg de huid geassocieerde vet en bindweefsel met schuine of gebogen pincet met de punt van de tang horizontaal gericht het risico dat de tang de huid doordringen minimaliseren. Extruderen eventuele luchtbellen die onder de huid zijn gevangen door zacht glooiende een wattenstaafje over het huidoppervlak.
OPMERKING: Als de huid gaatom te worden gebruikt voor platte mount immunostaining of orthopedie, verwijder zoveel mogelijk van het bindweefsel mogelijk; Als de huid zal worden gebruikt om haarzakjes visualiseren basis van melanine pigmentatie minder volledige verwijdering van bindweefsel bevredigend. Prenatale huid vereist minimale "schoonmaken" van het aanklevende bindweefsel. - Bevestig de huid vastgemaakt door toevoeging van 20 ml vers bereide 4% PFA / PBS of 10% gebufferde formaline per 10 cm plaat Sylgard (als de huid wordt gebruikt voor melanine beeldvorming of alkalische fosfatase (AP) histochemie) of 20 ml vers bereide 2% PFA / PBS (als de huid wordt gebruikt voor immunokleuring of visualiseren transgene Keratine (Krt) 17-GFP 11) en voorzichtig zwenken gedurende de nacht in een koude kamer. De volgende dag wassen in PBS gedurende> 10 minuten.
OPMERKING: Standaard formaline is 37% formaldehyde; Daarom, "10% formaline" 3,7% formaldehyde. - Voor AP kleuring en immunostaining, verder in hoofdstuk 3. Voor melanine imaging, uitdrogen van de huid door een ethanolreeks (70%, 95%, 100%), een dag voor elke stap, met zachte horizontale rotatie bij kamertemperatuur. Resten van bindweefsel.
- Met de huid in 100% ethanol, verwijder het insect pinnen en, indien gewenst, trim de huid met een schaar om de meest perifere 1-2 mm van de huid met de gaatjes te verwijderen.
- Breng de huid om een 10 cm diameter glazen schotel, plaats twee glazen microscoop dia's op de huid om te voorkomen dat het curling, en voeg 20 ml van BBBA. BBBA snel uithardt weefsel, zodat het belangrijk is dat de huid onder het gewicht van de glasplaatjes worden afgevlakt voor het toevoegen van de BBBA.
- In de komende uren, tilt u de dia's van de huid voor een paar seconden tot de BBBA te wassen over de huid.
OPMERKING: Draag handschoenen bij het werken met BBBA. Afhankelijk van de leeftijd en de locatie van de huid zijn maar liefst 30% krimp in BBBA kan zijn.
- Foot Skin voor de Analyse van Haarzakje Patterning
OPMERKING: Het bereik van typisch onderzocht leeftijden is P1-P8.- Na euthanasie, afgesneden van de voeten boven het enkelgewricht en maak een rechte snede langs het ventrale oppervlak door de zolen van de voeten.
- Haal voorzichtig het vel van het onderliggende weefsel, verloopt in een proximale naar distale richting.
- Snijd de cijfers om de huid los en speld het aan Sylgard met de binnenkant naar boven (figuur 2C). Er is minimaal bindweefsel op de voet huid.
- Transgene Krt17-GFP huid is nu klaar voor de beeldvorming. Voor melanine beeldvorming doorgaan met fixatie, uitdroging en BBBA clearing zoals beschreven in paragraaf 2.1.
- Foot Skin voor het visualiseren van talgklieren
- Na euthanasie, verwijder het haar door wrijven haar remover gel over de huid oppervlak met een gehandschoende vinger en duim; wacht 10 minuten.
OPMERKING: Gebruik geen elektrisch scheerapparaat, die de tere voet huid beschadigen. - Wverassing van het huidoppervlak met kraanwater, ontleden en speld de huid Sylgard zoals beschreven in paragraaf 2.2.
- Bevestig met 1% PFA / PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en daarna wassen in PBS.
OPMERKING: Bij visualiseren talgklieren op de voeten, die ontstaan na de eerste postnatale week, de optimale leeftijd voor analyse Oil Red O is P21, omdat markeert het dieptepunt van haarpigmentatie tijdens de eerste haar cyclus 12, en derhalve de talgklieren gemakkelijker kunnen worden gezien. Met albinomuizen deze analyse kan worden uitgevoerd op elke leeftijd. Om albino nakomelingen kruis gepigmenteerde mutante muizen te verkrijgen om een tyrosinase mutant lijn zoals C57BL/6J-Tyr c-2J.
- Na euthanasie, verwijder het haar door wrijven haar remover gel over de huid oppervlak met een gehandschoende vinger en duim; wacht 10 minuten.
- Staart Skin Voorbereiding voor de Analyse van Melanine Distributie, Haarzakje Oriëntatie, en Talgklier Visualisatie
- Na euthanasie, maken een cirkelvormige snede rond de basis van de staart, en dan een longitudinale spleet dat de lengte van de staart langs de ventrale gezicht loopt. <li> Verwijder de staart huid vanaf het puntje van stevig vast te grijpen het puntje van de staart-bot-en / of bindweefsel met een pincet en de huid met een tweede pincet. Speld de staart huid Sylgard.
- Voor de analyse van melanine distributie en haarfollikel oriëntatie, te repareren en de huid zoals beschreven in paragraaf 2.1 te verwerken. Voor de analyse van de talgklieren, snijd de staart huid in een reeks segmenten ~ 0,5 tot 1 cm lengte voor fixatie en incubeer de huid stukken in PBS / 5 mM EDTA nacht bij 37 ° C om de dermis-epidermis hechting 13 verzwakken.
- Haal voorzichtig de epidermis van de dermis, speld de epidermis te Sylgard (binnenkant naar boven), en zet deze in 4% PFA / PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was met PBS en kleuren met Oil Red O zoals hieronder beschreven.
Opmerking: Een elektrisch scheerapparaat en / of ontharing gel kan worden gebruikt voor het ontleden oudere staarthuid (bijv. P21), maar deze behandeling is optioneel omdat het haar op de staart nietzo dicht als elders op het lichaam.
3. Kleuring Reacties
- Menselijke Placenta alkalische fosfatase (AP) Histochemistry naar Visualiseer Genetisch-gelabelde Axon Assen 10,14,15 (Figuren 3A, B)
- Na PFA fixatie op Sylgard, plaatsen vaste huiden in een 10 cm glazen schaal en dompel onder PBS / 1 mM MgCl2. Voorzichtig zwenken de schotel in een waterbad bij 70 ° C gedurende 90 min om endogene fosfatase-activiteit te vernietigen.
- Zichtbaar AP reporteractiviteit histochemisch met 4-48 uur incuberen bij kamertemperatuur in 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 0,34 ug / ml NBT en 0,175 ug / ml BCIP, waarbij typisch 10-15 ml kleuroplossing per P21 dorsale huid. Bewaken van de reactie onder de microscoop ontleden, zorg niet te laten verder komt dan de optimale tijd, zoals beoordeeld door visuele inspectie van axon kleuringsintensiteit ten opzichte van niet-specifieke NBT afzetting. Stop de reactie door wassen met drie veranderingen van PBS/0.1% Tween-20 in de loop van 1 uur, re-pin de huiden Sylgard, dehydrateren de huid door een ethanolreeks en breng de achtergronden een 10 cm schaal met BBBA.
OPMERKING: BBBA lost langzaam op de NBT neerslag. Tijdens de eerste paar uur in BBBA, zal een fijne achtergrond van neergeslagen NBT te ontbinden; Daardoor zal de BBBA oplossing donkerder en de huid lichter. Verander de frisse BBBA na een paar uur. - Na de beeldvorming van de AP-gekleurde huid overdragen naar ethanol gedurende> 1 uur bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens opslaan in vers ethanol bij -20 ° C. AP-gekleurde achtergronden kunnen op deze wijze bewaard vele maanden zonder verlies van signaal.
- Oil Red O kleuring te visualiseren talgklieren 4 (Figuren 3C-F)
- Verwijder insect pinnen en breng het licht vaste voet of staart huiden van de Sylgard plaat aan de putjes van een 6-well weefselkweek plaat, metmaximaal twee huidsteekproeven per putje. Wassen met 60:40 isopropanol: water gedurende 5 min bij kamertemperatuur geroerd.
- Vlek in 2 ml 0,3% Oil Red O in 60:40 isopropanol: water (zie paragraaf 1.2) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Wassen met 60:40 isopropanol: water gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door wassen met water. Voorzichtig weggesneden de randen van de huid, zoals de pengaten, met fijne schaar zodat het oppervlak van de huid zo vlak mogelijk kan worden gemaakt.
- Plaats de huid op een dia met de buitenkant naar boven, voeg een paar druppels water of waterachtige montage medium, bedek de huid met een dekglaasje, en dan zachtjes tape de dekglaasje aan de dia aan de huid verder afvlakken.
- Flat Mount Immunokleuring 4,16,17 (figuren 3G, H)
- Snijd een rechthoek van PFA vaste huid (bijv. 1 cm x 0,5 cm), merken zijn oriëntatie met een asymmetrische snit (bv. clip de voorste rechterhoek). Voer de incubatie enwassen stappen met zachte rotatie op een draaiend platform horizontaal. In de putjes van een 6 - of 12-well weefselkweek plaat, was verscheidene malen met PBS om resterende PFA verwijderen, wassen met ~ 10 veranderingen van PBS met 0,3% Triton X-100 (PBST 0,3%) dan 5-8 uur bij kamertemperatuur om de huid permeabilize.
- Incubeer met het primaire antilichaam in 0,3% PBST met 5% geit serum en 20% DMSO gedurende vijf dagen bij kamertemperatuur geroerd. Bedek de putjes van de plaat met doorzichtige tape of zelfklevende plastic verdamping verliezen weg te werken.
- Wassen met 10-15 veranderingen 0,3% PBST dan 5-8 uur en geïncubeerd met secundair antilichaam in 0,3% PBST met 5% geit serum en 20% DMSO gedurende 3 dagen bij kamertemperatuur geroerd.
- Wassen met 10-15 veranderingen van 0,3% PBST meer dan 5-8 uur.
- Dehydrateer in 25%, 50% en 75% methanol gedurende 5 minuten elk en vervolgens 3x in 100% methanol gedurende 20 min. elk.
- Duidelijk in BBBA overnacht bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Flat mount immunostaining van huid jonger dan~ P1 kan worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven, maar met kortere incubatie en wassen keer. Zo kunnen P1 huid worden immunogekleurd met een overnacht incubatie in primair antilichaam en een aantal uur incubatie in secundair antilichaam en met tussenliggende wassen van slechts 2-3 uur in 0,3% PBST. Zoals hierboven opgemerkt, jongere achtergronden ook voldoende dun dat ze kunnen worden afgebeeld zonder BBBA clearing.
- Visualiseren Merkel Cell Clusters met TL zenuwuiteinde kleurstofopname (figuren 3I-L)
AMI-43 (groen) en AM4-65 (rood) zijn fixable fluorescerende kleurstoffen die cellen binnen te dringen via niet-selectieve kation kanaal 18. In de levende huid deze kleurstoffen worden selectief opgenomen en geconcentreerd in Merkel-cellen.- Los 1 mg AM1-43 of AM4-65 in 2 ml PBS en bewaar in monsters bij -80 ° C.
- Injecteren pasgeboren pups subcutaan met 2-10 ug kleurstof per gram lichaamsgewicht met behulp van een 29 G naald.
- Een dag later, euthanaseren de muizen en Dissect de dorsale skins.
- Bevestig de skins in 4% PFA / PBS bij 4 ° C gedurende de nacht, wassen met PBS, en monteer de huid zoals beschreven in paragraaf 3.2.
4. Beeldvorming en beeldanalyse
- Beeldvorming Haarzakje Oriëntatie (figuur 4)
- Gebruik een dissectiemicroscoop op de foto om rug-, voet, of de staart skins die worden ondergedompeld in BBBA, geplet onder een glasplaatje, en nog steeds in de glazen schaal - deze aanpak minimaliseert BBBA besmetting van de microscoop.
- Verlichten het gerecht van onderen. Ruimtelijke variatie in lichtintensiteit over het gezichtsveld beperken, verheffen de glazen schaal tot een hoogte ~ 10 cm boven de norm werkoppervlak van de dissectiemicroscoop en plaats een diffuse plastic of glazen plaat over de lichtbron.
- Zet de huid 100% ethanol voor langdurige opslag bij -20 ° C.
OPMERKING: Het verlaten van de huid in BBBA voor meer dan een dag zorgt ervoor dat de melanine korrels te breken eendeel. Nadat de huid is BBBA behandeld zal verharden en plat blijven vanaf dat moment. Verschillende achtergronden kunnen worden gecodeerd met een aantal uitsparingen aan de voorste en / of achterste einden, zodat ze kunnen worden opgeslagen samen, om ruimte te besparen in de vriezer.
- Imaging and Tracing Axon Assen (Figuren 3A, B)
- Plaats AP gekleurde huid (paragraaf 3.1.3) tussen twee glazen platen van het type gebruikt voor kleine eiwit gels. Voorkomen dat er luchtbellen tussen de platen en de huid, en vervolgens zorgvuldig lont overtollige BBBA weg met een papieren handdoek. Plaats de sandwich van plaat-huid-plaat op een microscoop podium (figuur 2D).
- Gebruik bright-field of DIC verlichting met een 10X objectief en 2 pm of 5 micrometer Z-stappen. Gebruik een gemechaniseerde XY podium om een montage van XY beelden die aan elkaar worden genaaid om een driedimensionaal grijsschaal gegevensset maakt vast te leggen.
OPMERKING: Voor een enkele grote axon prieel, kan deze dataset zijn eens groot als 5 Gb. - Voer handmatige, automatische of semi-automatische opsporing van axon priëlen met elk van een verscheidenheid aan software pakketten.
OPMERKING: Software zoals Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) is een gratis neuronale reconstructie tool die draait in een pc-omgeving en is relatief eenvoudig te beheersen 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Helderveld beeldvorming van huid flatmounts kan worden gebruikt om beelden cutane sensorische afferenten (Figuur 3A 10) en de haarfollikels patronen gebaseerd op melaninepigmentatie (figuur 4). Confocale beeldvorming van huid flatmounts kan worden gebruikt om de geometrie van (1) Merkel cell clusters, zichtbaar gemaakt met anti-cytokeratine-6 of AM kleurstofopname (figuren 3I-L), (2) haarspier spieren, zichtbaar gemaakt met anti-definiëren gladde spier actine (figuren 3G, H), (3) talgklieren, gevisualiseerd met Oil Red O (Figuren 3C-F) en (4) haarfollikels, zichtbaar gemaakt met een Krt17-GFP-transgen of door kleuring met anti-antilichamen Krt17 4 (Figuren 3E-G, K, L). Het is eenvoudig om handmatig de score van de oriëntaties en ruimtelijke opstellingen van structuren in zulke beelden door het plaatsen van vectoren van bekende oriëntatie op de structuren met behulp van Adobe Photoshop of Illustrator, en vervolgens quantifying de resulterende vector populaties. Hoewel deze aanpak is voldoende voor een schaal van enkele honderden vectoren, zou het onbetaalbaar vervelend zijn op een 10 - of 100-voudig grotere schaal.
Figuur 1. Schematische van zoogdier behaarde huid die de grote structuren. (Copyright, Terese Winslow.)
Figuur 2. Huid dissectie en behandelen van het monster. A) Dissection gereedschappen. B) Een P5 dorsale huid vastgemaakt aan een Sylgard plaat. C) A P5 dorsale achterste voet huid vastgemaakt aan een Sylgard plaat. D) Een dorsale huid gemonteerd tussen 2 glazen platen gel voor de beeldvorming wet een 10X objectief en DIC of helderveld verlichting.
Figuur 3. Huidstructuren in flat mount uitzicht. A, B) Een enkele cutane sensorische prieel (links) en haar getraceerd afbeelding (rechts) van een P21 dorsale huid van een Brn3a CKOAP / +;. NFL-creer / + muizen blootgesteld aan een lage dosis tamoxifen op een zwangerschapsduur van 17 Dit protocol resultaten in Cre-gemedieerde recombinatie van de reporter in een zeer kleine fractie van de dorsale wortel ganglion neuronen, dus een kleine fractie van cutane sensorische pergola gelabeld met de menselijke placentale alkalische fosfatase (AP) reporter. De gelabelde axonen worden gevisualiseerd met NBT / BCIP histochemie Brn3a is equivalent genoemd Pou4f1. C, D) Tail huid gekleurd met Oil Red O om talgklieren visualiseren van.WT (links) en Fz6 - / - (rechts) muizen P21. De Fz6 - / - structuren zijn ongeorganiseerd. P proximale; . D, distale E, F) Dorsale voet huid van WT (links) en Fz6 - / - (rechts) muizen die Krt17-GFP. De huid werd geoogst op P21 en gekleurd met Oil Red O. De Fz6 - / - huid heeft een haar krans in het midden. P proximale; . D, distale G, H) Dorsale huid van een WT muis op P21 tonen haarzakjes (gevisualiseerd met een Krt17-GFP transgen en anti-GFP immuunkleuring; panel G) en haarspier spieren [gevisualiseerd met anti-gladde spier actine (SMA ) immunostaining; paneel H]. Diepte in het imago van de confocale Z-stack is een kleurcodering. Een, anterior; P, posterior. IL) Een Merkel cel cluster (gevisualiseerd met cytokeratin8 immunostaining of AM11-43 dye-opname) en de centrale haarfollikel (gevisualiseerd in panelen K en L met Krt17-GFP). Beelden werden verkregen uit P1 dorsale huid van de aangegeven genotypen. De Fz6 - / - Merkel cel cluster vormt een gesloten cirkel, terwijl de WT Merkel cel cluster is geopend in de richting van de voorste. Een, anterior; P, posterior. Schaal bars: A en B, 300 micrometer; C en D, 500 micrometer; E en F, 500 micrometer; G en H, 200 micrometer; IL 50 urn. (Panelen A en B zijn overgenomen uit eLife en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, met toestemming 4,10) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Haar en de haarfollikels in de dorsale huid op P1 en P7 gevisualiseerd met melanine pigmentatie. A, B) P1 huid van WT en Fz6 - / -. muizen C, D) P7 huid tegen Fz6 - / - muizen. Schaal bars: A en B, 500 micrometer; C en D, 1 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beheersing van de dissectie hierboven beschreven methoden vereist alleen geduld, een vaste hand en een paar goede dissectie-instrumenten. De dorsale huid dissectie is relatief eenvoudig, maar de staart en de voet huid dissecties - vooral bij vroege postnatale leeftijden - zijn meer uitdagend. Bij vroege prenatale leeftijden (bijvoorbeeld voor E15), de huid moeilijk te verwijderen zonder scheuren. Gunstig voor veel studies van groei en patroonvorming van huidstructuren bij muizen, de belangrijke gebeurtenissen plaatsvinden postnataal, gezien bijvoorbeeld in studies van de groei van haarspier spieren 19.
Imaging diep in de huid in een platte berg configuratie is een uitdaging omdat de huid is een relatief refractiele weefsel. Deze uitdaging wordt nog groter als de huid rijpt als gevolg van de differentiatie en toegenomen dikte van de samenstellende lagen. Een gedeeltelijke oplossing voor dit probleem is de dermis en de epidermis scheiden en de epidermis analyserenals een afzonderlijke structuur ("epidermale whole mounts"). Deze benadering is handig voor het visualiseren haarzakjes en bijbehorende structuren, vooral muisstaart huid. Het verkrijgen van hoge kwaliteit epidermale whole mounts van muis dorsale huid moeilijk, waarschijnlijk door (1) de hoge dichtheid van haarfollikels die zich diep in de dermis en (2) de dunheid van de interfolliculaire epidermis 13.
Onze ervaring BBBA behandeling een zeer effectieve methode voor het weergeven huid optisch transparante behoud immunofluorescentie signalen zonder de noodzaak van het scheiden van de epidermale en dermale lagen. Benzyl-benzoaat is gebruikt om weefsels vrij te maken voor tientallen jaren 20 en het wordt veel gebruikt om kikker en vis embryo's te wissen. Echter, BBBA heeft het nadeel dat denatureert GFP en andere fluorescerende eiwitten, lost Oil Red O, en kan apparatuur (bijv. microscopen) verontreinigen. Het zou interes zijnt systematische vergelijking BBBA behandeling van de huid met andere verduidelijking methoden zoals SeeDB 21 ClearT 22 schaal 23, 3DISCO 24 en helderheid 25, waarvan sommige geschikt fluorescente proteïnen. Als BBBA behandelde monsters worden afgebeeld met behulp van een dissectie microscoop, een conventioneel licht / fluorescentiemicroscoop, of een confocale microscoop, moeten de monsters in een glazen schaal of tussen twee grote glazen platen worden geplaatst om BBBA besmetting te minimaliseren.
We hebben niet gegevensanalyse besproken in detail, omdat dit meer idiosyncratische de biologische vraag onderzochte. Echter, zoals vermeld in de inleiding, de aanwezigheid van vele bijna identieke structuren zoals haarfollikels, Merkel cel clusters, en zenuwuiteinden, en de volledigheid waarmee deze structuren kunnen worden afgebeeld in flat mounts biedt de gelegenheid om structurele of morfologische parameters te meten in een statistisch strenge manner, zoals te zien bijvoorbeeld in recente studies van cutane sensorische axon morfologie 10 en van de haarzakjes en follikel-geassocieerde structuren in wild-type en Fz6 mutante muizen 4,8. Met de ontwikkeling van meer geavanceerde beeldanalyse kan het mogelijk zijn te automatiseren of semi-automatiseren van enkele van de analyses die momenteel worden handmatig uitgevoerd, waardoor een ruimer gebruik van huid vergemakkelijken vlakke montage beeldvorming als een werkwijze voor het onderzoeken van de beginselen meercellige organisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
