Summary
Pattedyrhud inneholder et variert utvalg av strukturer - for eksempel hårsekkene og nerveendene - som viser karakteristiske mønstre av romlige organiseringen. Analysere huden som en flat monterings utnyttet to-dimensjonal geometri i dette vev for å produsere fulltykkelse høyoppløselige bilder av hud strukturer.
Abstract
Skin er en svært heterogen vev. Intra-dermal strukturer inkluderer hårsekkene, arrector pili muskler, epidermal spesialiseringer (som Merkel celle klynger), talgkjertler, nerver og nerveender, og kapillærer. Den romlige anordning av disse strukturene er kontrollert på en mikroskopisk målestokk - som sett, for eksempel i en ordnet anordning av celletyper i en enkelt hårsekken - og på en makroskopisk målestokk - som sett av de nesten identiske orienteringer av tusener av hår follikler innenfor et lokalt område av huden. Visualisering av disse strukturene uten fysisk seksjonering huden er mulig på grunn av den to-dimensjonal geometri i dette organ. I denne protokollen, viser vi at mus huden kan bli dissekert, fast, permeabilized, farget, og avklares som en intakt todimensjonale objekt, en flat mount. Protokollen muliggjør enkel visualisering av hud strukturer i sin helhet gjennom hele tykkelsen av store områder av huden ved optical seksjonering og gjenoppbygging. Bilder av disse strukturene kan også integreres med informasjon om posisjon og orientering i forhold til kroppens akse.
Introduction
Huden er en av de største organene i kroppen, med viktige funksjoner i somato-sensasjon, isolasjon / termoregulering, og immunforsvaret en. Forstå det molekylære og cellulære grunnlag av huden utvikling og funksjon har vært av langvarig interesse på grunn av den grunnleggende betydningen av huden som et biologisk system og dets relevans for dermatologi. Pattedyrhud inneholder en rekke flercellede strukturer, inkludert lagdelte lag av keratinocytter, dermal bindevev, flere typer hårsekker, talgkjertler, arrector pili muskler, blodårer, og minst et dusin forskjellige klasser av afferente (sensoriske) og efferent nerve fibre (figur 1). Forskjellige regioner av kroppen, er forbundet med karakteristisk forskjellige typer hud. I de fleste pattedyr, er nesten hele kroppsoverflaten er dekket med hud som er tettpakket med hårsekker. [Mennesker og nakne muldvarp rotter utgjør unntak til ther mønster.] Hair mangler fra palmar flater av hender og føtter, som også er forbundet med spesialiserte epidermal mønstre (dermatoglyphs), eksokrine kjertler, og sensoriske nerveender. Cellulære og molekylære hendelser som styrer vekst, differensiering, og romlig organisering av celler i hårsekken er av spesiell interesse som hver hårsekken utstillinger, i miniatyr, mange av de sentrale funksjonene i organogenesen to. Disse funksjoner inkluderer eksistensen av stamceller og en stamcelle nisje, nettopp koreografert cellevandring, og montering av flercellede strukturer fra embryologisk forskjellige komponenter.
Denne artikkel beskriver metodene for å dissekere, festing, merking, og avbildnings mus huden som en intakt todimensjonalt ark, referert til som en "hel mount" eller "flat montere" preparat. Siden muse huden er relativt tynt, er det mulig å bilde gjennom den fulle tykkelse av flat skin ved hjelp av konvensjonelle konfokalmikroskopi. Den flate mount tilnærming til bildebehandling pattedyrhud er teknisk fordelaktig fordi den omgår behovet for fysisk seksjonering, og dermed lar strukturer som skal rekonstrueres i sin helhet av optisk snitting. Siden nesten hele huden behandles som en enkelt gjenstand, flat monterings tilnærmingen muliggjør også avbildning av flere regioner av kroppsoverflaten og samtidig bevare informasjon om posisjon og orientering i forhold til kroppens akse. Endelig strukturer i huden er vanligvis til stede i mønstre som gjentas med jevne mellomrom, noe som letter oppsamling av bilder fra flere representanter for en gitt konstruksjon. Disse egenskapene er kjent for nevrobiologer som arbeider på netthinnen, en to-dimensjonal del av sentralnervesystemet som nyter analoge fordeler for studier av neuronal morfologi tre.
Den flate montere tilnærmingen som beskrives her er av spesiell Utility for å studere strukturer som utviser romlig organisering på en forholdsvis stor skala i løpet av de to-dimensjonale planet av huden. Ett eksempel på storskala romlige organiseringen er koordinert polaritet av hårsekkene og hårsekken-assosiert strukturer - Merkel celle klynger, arrector pili muskler, talgkjertler, og nerveender fire. Hårsekker er orientert med en vinkel med hensyn til planet av huden, og den komponent av hårsekken vektor som ligger innenfor det to-dimensjonale planet av huden generelt fremviser en orientering med hensyn til kroppens akse det er nettopp bestemt for hvert stilling på kroppen. For eksempel til hårsekkene på baksiden punktet fra rostral hale og hår på framsiden av føttene peker fra proksimale til distale. Hårsekken orientering styres av planar celle polaritet signale (PCP, også kalt tissue polaritet 5). Denne signaleringssystem ble oppdaget i Drosophila der et litesett av kjerne PCP gener ble funnet til å styre retningen på cuticular hår og bust. Tre pattedyr orthologues av kjerne PCP gener - frizzled homologe 6 (Fzd6, også referert til som FZ6), cadherin EGF LAG sju-pass G-type reseptor 1 (Celsr1), og vang lignende 2 (Vangl2) - spille analoge roller i pattedyr hud, koordinere orienteringer av hårsekkene med kroppens akser. Studier av FZ6 knockout mus (Fzd6 tm1Nat, heretter referert til som FZ6 - / -) viser at den primære defekten i fravær av PCP signalering er en første randomisering eller uorden av hårsekken orientering, og har ingen effekt på den indre struktur av follikler 6-8. En annen ikke-PCP systemet fungerer senere å fremme lokal justering av nærliggende follikler, noe som fører til produksjon av store hår mønstre som spinnehjul og dusker.
Et annet eksempel på storskalaromlige organiseringen innenfor huden er sett i morfologi av sensoriske axon lysthus. Sensoriske nevroner som innerverer huden har sine celle organer i dorsal root og trigeminusgangliene. Disse neuroner detektere temperatur, smerte, kløe, og forskjellige typer av mekaniske deformasjoner impinging på huden og håret 9.. De kan deles inn i undertyper basert på axon diameter og ledningshastighet, terminal nerve slutt struktur, og mønstrene av ekspresjon av reseptorer, kanaler og andre molekyler. På grunn av den høye tettheten av innervasjon i huden, analyser som involverer visualisere alle aksoner (f.eks anti-neurofilament farging) eller til og med alle axons av en enkelt klasse (sett når en enkelt celletype er preget av uttrykk av et fluorescerende reporter) åpenbarer generelt en tett superposisjon av aksoner som gjør det umulig å definere morfologien til et individ Arbor. For å omgå dette problemet, har vi brukt svært sparsom genetisk rettet labeling å produsere rygghuden prøver hvor enkelt godt isolerte axon arbors er visualisert ved uttrykk for et histochemical reporter, human placenta alkalisk fosfatase 10. Denne tilnærmingen gjør det entydig visualisering av individuelle axon arbor morfologi og en definisjon av somatosensoriske nevroner typer basert på morfologiske kriterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Alle dyrene ble håndtert i henhold til godkjent institusjonelle dyr omsorg og bruk komité (IACUC) protokoll MO11M29 av Johns Hopkins Medical Institutions. Kontakt lokale Institutional Animal Care og bruk Komiteens retningslinjer for godkjente metoder for aktiv dødshjelp. Bruk hansker, frakk og vernebriller ved håndtering av aldehyd fiksativ eller organiske løsemidler.
En. Utarbeidelse av materialer
- Helle Sylgard Plates
- Følg produsentens instruksjoner, blande herder med basen, og rør med en plaststang.
- Pipette ~ 35 ml væske Sylgard per 10 cm diameter vev kultur parabolen. Vevdyrkningsskåler er dypere enn standard bakterielle retter; dette gir vertikal klaring for insekt pinnene.
- Plasser dihun er på en horisontal flate i romtemperatur over natten. Bobler som dannes under blandingen vil forsvinne.
- Etter polymerisasjonen lagre Sylgard platene ved romtemperatur.
MERK: Sylgard plater kan lagres i romtemperatur i mange år og brukes flere ganger til Sylgard løsner fra platen.
- Solutions
- Benzylbenzoat og benzylalkohol (BBBA). Bland to volumer benzylbenzoat og en volum benzylalkohol. Oppbevares i mørket i en glassflaske med en glasskork eller Teflon topp.
FORSIKTIG: Brukes BBBA bør være hensiktsmessig behandles som organisk løsemiddelavfall. Ikke la BBBA å kontakte plast. - Fosfatbufret saltvann (PBS). Til 4 g PFA til 80 ml vann, tilsett 0,1 ml 1 N NaOH, røre på en varm plate ved ~ 70 ° C i ~ 5 min inntil PFA er fullstendig oppløst, og deretter tilsettes 10 ml 10 x PBS og bringe volumet til 100 ml med vann.
ADVARSEL: Innånding av formaldehyd / PFA og BBBA damper bør væreminimeres ved å holde disse løsningene i dekket beholdere. Formaldehyd / PFA er et kreftfremkallende. - Olje Red O. Forbered en 0,5% lager i isopropanol. Umiddelbart før bruk fortynnes med vann til en sluttkonsentrasjon på 0,3% Oil Red O, og deretter filtrere gjennom et 0,2 mikrometer filter.
- Benzylbenzoat og benzylalkohol (BBBA). Bland to volumer benzylbenzoat og en volum benzylalkohol. Oppbevares i mørket i en glassflaske med en glasskork eller Teflon topp.
2. Skin Dissection, Fiksering, og Clearing
- Rygghuden for Immunostaining og Melanin Imaging
- For svært unge mus (f.eks fostre og postnatal dag (P) 0-P3 valper), avlive mus ved isofluran innånding. Avlive eldre mus ved isofluran inhalering eller med ketamin / xylazin injeksjon etterfulgt av cervical dislokasjon.
- Fjern hår med en elektrisk barbermaskin og hårfjerning gel. For mus yngre enn P8, kan dette trinnet hoppet over.
- Bruk et barberblad for å gjøre et vannrett snitt fra haleroten langs hver flanke, passerer på den dorsale side av bunnen av hver lem, som beveger seg sideveis til ørene og endeing på nesen.
- Forsiktig skrelle huden fra det underliggende vevet fortsetter fra bakre til fremre ved å holde huden mellom hansker på hendene slik at den ikke blir klemt av tang. Når peeling huden på nivå med ørene, første kuttet av ørene med en saks og fortsett spesielt sakte som huden kan rive på dette stedet.
- Fra dette punktet videre, orientere huden med innsiden vendt opp. Pin huden til Sylgard med ~ 20 insekt pinner jevnt fordelt rundt omkretsen; ikke over-strekke huden (figur 2B). Dekk til huden med 10-20 ml PBS.
- Dissekere bort huden assosierte fett og bindevev ved hjelp av skråstilte eller buede tang med den spisse ende av tangen som vender horisontalt for å minimere risikoen for at tangen skal trenge gjennom huden. Extrude eventuelle luftbobler som er fanget under huden av bølgende en bomull-tipped applikator over hudoverflaten.
MERK: Hvis huden kommerå bli brukt for flat monterings farging eller histokjemi, fjerne så mye av bindevevet som mulig; hvis huden er tenkt å bli brukt til å visualisere hårsekkene basert på melanin pigmentering, er mindre fullstendig fjernelse av bindevev tilfredsstillende. Prenatal hud krever minimal "rengjøring" av tilhenger bindevev. - Fest låste huden ved å legge til 20 ml nylaget 4% PFA / PBS eller 10% formalin per 10 cm Sylgard plate (hvis huden vil bli brukt til melanin bildebehandling eller alkalisk fosfatase (AP) histokjemi) eller 20 ml av nylaget 2% PFA / PBS (hvis huden skal brukes til farging eller visualisere transgen Keratin (Krt) 17-GFP 11), og forsiktig rotere over natten i et kaldt rom. Den neste dagen, vask i PBS for> 10 min.
MERK: Standard formalin er 37% formaldehyd; derfor er "10% formalin" 3,7% formaldehyd. - For AP farging og farging, fortsetter i kapittel 3. For melanin imaging, tørke huden gjennom en gradert etanolserie (70%, 95%, 100%), en dag for hvert trinn, med forsiktig horisontal rotasjon ved romtemperatur. Fjern rest bindevev.
- Med huden i 100% etanol, fjerne de insekt pinnene og, om ønsket, trim huden med saks for å fjerne den mest perifere 1-2 mm av huden med pinnehullene.
- Overfør huden til en 10 cm diameter glassfat, plasserer du to glass objektglass på huden for å hindre den fra curling, og tilsett 20 ml av BBBA. BBBA stivner hurtig vev slik at det er viktig for huden til å bli flattrykt under vekten av de glassplater før tilsetning av BBBA.
- I løpet av de neste timene, løfte lysbildene av huden for et par sekunder for å la BBBA å vaske over huden.
MERK: Bruk hansker når du arbeider med BBBA. Avhengig av alder og plassering av huden er det kan være så mye som 30% krymping i BBBA.
- Foot Skin for analyse av hårsekken Patterning
MERK: Utvalget av aldre typisk undersøkt er P1-P8.- Etter dødshjelp, kuttet av føttene over ankelleddet og lage en enkelt rett snitt langs ventral overflaten gjennom fotsålene.
- Forsiktig skrelle huden fra underliggende vev, fortsetter i et proksimalt for distal retning.
- Skjær sifrene for å frigjøre huden og feste det til Sylgard med innsiden vendt opp (Figur 2C). Det er minimal bindevev på foten huden.
- Transgen Krt17-GFP hud er nå klar for bildebehandling. For melanin bildebehandling fortsette med fiksering, dehydrering og BBBA clearing som beskrevet i pkt. 2.1.
- Foot Skin for å visualisere talgkjertler
- Etter dødshjelp, fjerne håret ved å gni håret remover gel over hudoverflaten med en hansker fingeren og tommelen; Vent i 10 minutter.
MERK: Ikke bruk en elektrisk barbermaskin, som vil ødelegge den delikate foten huden. - Wash hudoverflaten med vann fra springen, dissekere og pin huden til Sylgard som beskrevet i kapittel 2.2.
- Fiks med 1% PFA / PBS i 30 min ved romtemperatur og deretter vaske i PBS.
MERK: For å visualisere talgkjertler på føttene, som utvikler seg etter den første postnatal uken, er den optimale alder for analyse med Oil Red O P21, fordi dette markerer nadir av hår pigmentering under første håret syklus 12, og derfor talgkjertlene kan ses lettere. Med albino mus denne analysen kan utføres når som helst alder. For å få albino avkom kryss pigmentert muterte musene til en tyrosinase mutant linje som C57BL/6J-Tyr c-2J.
- Etter dødshjelp, fjerne håret ved å gni håret remover gel over hudoverflaten med en hansker fingeren og tommelen; Vent i 10 minutter.
- Tail Skin Forberedelse til Analyse av Melanin Distribution, hårsekken Orientering, og Talg Gland Visualisering
- Etter eutanasi, få et sirkulært snitt rundt haleroten, og en langsgående sliss som løper lengden av halen langs sin ventrale ansikt. <li> Trekk av halen huden begynner ved spissen av ta godt tak i enden av halebenet og / eller bindevev med en pinsett og huden med et andre par tenger. Pin halen huden til Sylgard.
- For analyse av melanin distribusjon og hårsekken orientering, fikse og behandle huden som beskrevet i pkt. 2.1. For analyse av talgkjertler, skjære halen huden inn i en serie av segmenter ~ 0,5 til 1 cm i lengde forut for fiksering og inkuberes i huden stykker i PBS / 5 mM EDTA over natten ved 37 ° C for å svekke dermis-epidermis adhesjon 13..
- Forsiktig skrelle epidermis fra dermis, pin epidermis til Sylgard (innersiden opp), og fikse det i 4% PFA / PBS for en time ved romtemperatur. Vask med PBS, og flekker med olje Red O som beskrevet nedenfor.
MERK: En elektrisk barbermaskin og / eller hårfjerning gel kan brukes før dissekere eldre hale huden (f.eks, P21), men denne behandlingen er valgfritt fordi håret på halen er ikkeså tett som andre steder på kroppen.
Tre. Beisingsreaksjonene
- Menneskelig Morkake alkalisk fosfatase (AP) histokjemi å Visualgente merket Axon Arbors 10,14,15 (Tall 3A, B)
- Etter PFA fiksering på Sylgard, plassere faste skins i et 10 cm glassfat og senk henhold PBS / 1 mM MgCl 2. Rotèr fatet i et vannbad ved 70 ° C i 90 minutter for å ødelegge endogene fosfataser aktivitet.
- Visual AP rapportøraktivitet histochemically med en 4-48 timers inkubering ved romtemperatur i 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 0,34 mg / ml NBT, og 0,175 ug / ml BCIP, vanligvis ved hjelp av 10 til 15 ml farvestoff oppløsning pr P21 dorsal hud. Overvåk reaksjonen under dissekere mikroskop, tar seg ikke å la det fortsette utover den optimale tid, som bedømt ved visuell inspeksjon av axon fargeintensitet i forhold til uspesifikke NBT deponering. Stopp reaksjonen ved å vaske med tre endringer av PBS/0.1% Tween-20 i løpet av en time, re-pin skins til Sylgard, dehydrere skins gjennom en etanol-serien, og deretter overføre skins til en 10 cm tallerken med BBBA.
MERK: BBBA oppløser NBT utfelling sakte. I løpet av de første timene i BBBA, vil en fin bakgrunn av utfelt NBT oppløses; som et resultat, vil det BBBA løsning mørkere, og huden vil lysne. Bytt til frisk BBBA etter noen timer. - Etter bildebehandling AP-farget hud, overføre den til etanol for> 1 time ved romtemperatur og deretter lagre den i frisk etanol ved -20 ° C. AP-farget skinn kan lagres på denne måte i mange måneder uten tap av signal.
- Olje Red O Farging å visualisere talgkjertlene 4 (Tall 3C-F)
- Fjern insekt pinner og overføre lett fast fot, eller hale skinn fra Sylgard platen til brønnene i en 6-brønn vevkulturplate, ogopptil to hudprøver per brønn. Vask med 60:40 isopropanol: vann i 5 min ved romtemperatur.
- Beis i 2 ml 0,3% Olje Red O i 60:40 isopropanol: vann (se avsnitt 1.2) ved romtemperatur i 2 timer.
- Vask med 60:40 isopropanol: vann i 5 min ved romtemperatur, fulgt av en vannvask. Nøye trimme bort kantene på huden, inkludert pinnehull, med fin saks, slik at overflaten av huden kan gjøres så flat som mulig.
- Plasser huden på et lysbilde med den ytre overflaten vendt opp, tilsett noen dråper vann eller vandig montering medium, dekke huden med et dekkglass, og deretter forsiktig tape dekkglass på lysbildet til ytterligere flate huden.
- Flat Mount Immunostaining 4,16,17 (Tall 3G, H)
- Klipp et rektangel av PFA fast hud (f.eks 1 cm x 0,5 cm), merking sin orientering med en asymmetrisk klipp (f.eks klippet fremre høyre hjørne). Utfør inkubasjon ogvaske trinn med forsiktig rotasjon på en roterende horisontal plattform. I brønnene i en 6 - eller 12-brønners vevkulturplate, vaskes flere ganger med PBS for å fjerne rester av PFA, vask med ~ 10 endringer av PBS med 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) mer enn 5-8 timer ved romtemperatur til permeabilize huden.
- Inkuber med det primære antistoff i 0,3% PBST med 5% geiteserum og 20% DMSO i fem dager ved romtemperatur. Dekk til brønnene av platen med klar tape eller klebe plast for å eliminere fordampningstap.
- Vask med 10 til 15 endringer i 0,3% PBST løpet av 5-8 timer og inkuber med sekundært antistoff i 0,3% PBST med 5% geiteserum og 20% DMSO i 3 dager ved romtemperatur.
- Vask med 10-15 endringer på 0,3% PBST enn 5-8 timer.
- Dehydrerer i 25%, 50% og 75% metanol i 5 minutter hver, og deretter 3 ganger med 100% metanol i 20 minutter hver.
- Klart i BBBA over natten ved romtemperatur.
MERK: Flat montere farging av huden yngre enn~ P1 kan utføres som beskrevet ovenfor, men med kortere inkubasjonstid og vasketider. For eksempel kan P1 huden bli immunostained med en inkubering over natten i primære antistoff, og en flere timers inkubasjon i sekundært antistoff, og med mellomliggende vaskinger av kun 2-3 timer i 0,3% PBST. Som nevnt ovenfor, bor skall er også tilstrekkelig tynne at de kan avbildes uten BBBA clearing.
- Visualisering Merkel celle klynger med Fluorescent Nerve Terminal Dye Opptak (figur 3I-L)
AMI-43 (grønn) og AM4-65 (rød) er løsbart fluorescerende fargestoffer som kommer inn celler via ikke-selektiv kationekanalen 18. I den levende hud disse fargestoffer blir selektivt tatt opp og konsentrert i Merkel celler.- Løs opp 1 mg AB1-43 eller AM4-65 i 2 ml PBS og oppbevar i alikvoter ved -80 ° C.
- Injisere nyfødte valper subkutant med 2-10 mg fargestoff per gram kroppsvekt ved hjelp av en 29 G nål.
- En dag senere, avlive mus og dissect rygghuden.
- Fest skins i 4% PFA / PBS ved 4 ° C over natten, vask med PBS, og montere huden som beskrevet i kapittel 3.2.
4. Imaging og bildeanalyse
- Imaging hårsekken Orientering (figur 4)
- Bruk en dissekere mikroskop til bilde dorsal, fot eller hale skinn som er nedsenket i BBBA, flatet under en glass-slide, og fortsatt i glassfat - denne tilnærmingen minimerer BBBA forurensning av mikroskopet.
- Belyse fatet nedenfra. For å minimalisere romlig variasjon i lysintensiteten over hele synsfeltet, heve glassform til en høyde ~ 10 cm over standard arbeider overflaten av disseksjonsmikroskop og plassere et spredende plast-eller glassplate over lyskilden.
- Returnere huden til 100% etanol for langtidslagring ved -20 ° C.
MERK: Hvis du lar huden i BBBA for mer enn en dag fører til at melanin granulater å bryte endel. Når huden har blitt BBBA behandlet det vil stivne og forblir flatt fra det punktet videre. Forskjellige skinn kan kodes med en rekke hakk på sin fremre og / eller bakre ender, slik at de kan lagres sammen, for å spare plass i fryseren.
- Bildebehandling og Følge Axon Arbors (Tall 3A, B)
- Plasser AP farget huden (avsnitt 3.1.3) mellom to glassplater av den type som brukes for små protein geler. Unngå å innføre luftbobler mellom platene og huden, og deretter nøye veken vekk overflødig BBBA med et papirhåndkle. Plasser sandwich av plate-hud-platen på et objektbord (figur 2D).
- Bruk lyse-feltet eller DIC belysning med en 10X objektiv og to mikrometer eller fem mikrometer Z-trinn. Bruk en mekanisert XY scenen for å fange en montasje av XY bilder som er sydd sammen for å lage et enkelt tredimensjonalt grå-skala datasett.
MERK: For en eneste stor axon arbor, kan dette datasettet være enKoreas store som 5 Gb. - Utføre manuell, automatisk eller semi-automatisert sporing av axon lysthus med noen av en rekke programvarepakker.
MERK: Programvare som Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) er et gratis nevronale rekonstruksjon verktøy som kjøres i et PC-miljø og er relativt lett å mestre 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lysfelt avbildning av hud flatmounts kan brukes til å avbilde kutane sensoriske afferenter (figur 3A) og 10 hårsekken mønstre basert på melanin pigmentering (figur 4). Confocal avbildning av hud flatmounts kan brukes til å definere geometrien av (1) Merkel celleklynger, visualisert med anti-cytokeratin-6 eller med AM fargestoffopptak (figur 3I-L), (2) arrector pili muskler, visualisert med anti glatt muskulatur aktin (figurene 3G, H), (3) talgkjertler, visualisert med Oil Red O (figurene 3C-F), og (4) hårsekker, visualisert med en Krt17-GFP transgenet, eller ved farging med anti-antistoffer Krt17 4 (figur 3E-G, K, L). Det er enkelt å manuelt score orienteringer og romlige arrangementer av strukturer i slike bilder ved å plassere vektorer av kjent orientering på strukturer ved hjelp av Adobe Photoshop eller Illustrator, og deretter quantifying de resulterende vektor populasjoner. Mens denne tilnærmingen er tilstrekkelig til en skala på flere hundre svektorer, ville det være uoverkommelig langtekkelig på en 10 - eller 100-ganger større skala.
Figur 1. Skjematisk av pattedyr hårete hud som viser de store strukturene. (Copyright, Terese Winslow.)
Figur 2. Hud disseksjon og prøvehåndtering. A) Disseksjonsverktøyer. B) En P5 rygghuden låst til en Sylgard plate. C) En P5 rygg bakfot huden festet til en Sylgard plate. D) En rygghuden montert mellom to glass gel plater for bildebehandling wed en 10X objektiv og DIC eller lysfelt belysning.
Figur 3. Skin strukturer i flat montere utsikt. A, B) En enkelt cutaneous sensoriske arbor (til venstre) og dens spores bildet (til høyre) fra en P21 rygghuden av en Brn3a CKOAP / +;. NFL-creer / + mus eksponert for lav dose tamoksifen ved svangerskaps dag 17 Denne protokollresultatene i Cre-formidlet rekombinasjon av reporteren i en meget liten brøkdel av dorsal root ganglion neuroner, og derfor er en liten brøkdel av kutane sensoriske arbors er merket med human placental alkalisk fosfatase (AP) reporter. De merkede aksoner er visualisert med NBT / BCIP histokjemi. Brn3a er ekvivalent referert til som Pou4f1. C, D) Hale skin farget med Oil Red O for å visualisere talgkjertler fraWT (til venstre) og FZ6 - / - (høyre) mus ved P21. Den FZ6 - / - strukturer er uorganisert. P, proksimale; . D, distal E, F) Dorsal foten hud fra WT (til venstre) og FZ6 - / - (høyre) mus som bærer Krt17-GFP. Huden ble høstet på P21 og farget med Oil Red O. FZ6 - / - Huden har et hår spinnehjul i midten. P, proksimale; . D, distal G, H) Dorsal hud fra en WT mus på P21 viser hårsekkene (visualisert med en Krt17-GFP transgenet og anti-GFP farging, panel G) og arrector pili muskler [visualisert med anti-glatt muskel aktin (SMA ) farging; panel H]. Dybde innenfor confocal Z-stack bildet er fargekodet. A, anterior; P, posterior. IL) En Merkel celle klynge (visualisert med cytokeratin8 farging eller AM11-43 fargestoff opptak) og dets sentrale hårsekken (visualisert i paneler K og L med Krt17-GFP). Bilder ble innhentet fra P1 rygghuden fra de angitte genotyper. Den FZ6 - / - Merkel celle cluster danner en lukket krets, mens den WT Merkel celle klynge er åpen mot den fremre. A, anterior; P, posterior. Scale barer: A og B, 300 mikrometer; C og D, 500 mikrometer; E og F, 500 mikrometer; G og H, 200 mikrometer; IL, 50 mikrometer. (Paneler A og B er gjengitt fra eLife og Proc. Natl. Acad. Sci. USA, med tillatelse 4,10) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Hår og hårsekkene i rygghuden på P1 og P7 visualisert med melanin pigmentering. A, B) P1 hud fra WT og FZ6 - / -. mus C, D) P7 hud fra FZ6 - / - mus. Scale barer: A og B, 500 mikrometer; C og D, 1 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mestring av disseksjon metodene beskrevet ovenfor krever bare tålmodighet, en stødig hånd, og et par gode Disseksjonsverktøyer. Rygghuden disseksjon er relativt enkel, men halen og fot hud disseksjoner - spesielt på tidlig postnatal aldre - er mer utfordrende. På tidlig prenatal aldre (f.eks før E15), huden er vanskelig å fjerne uten å rive det. Beleilig, for mange studier av vekst og fordelingen av hud strukturer i mus, hendelsene oppstår interesse postnatalt, sett for eksempel i studier av veksten av arrector pili muskler 19.
Imaging dypt inn i huden på en flat monteringskonfigurasjon er utfordrende fordi huden er en relativt refraktile vev. Denne utfordringen blir større etter hvert som huden modnes på grunn av differensiering og økt tykkelse som den består av lag. En delvis løsning på dette problemet er å skille dermis og epidermis og analysere epidermer som en separat struktur ("epidermale hele monteringer"). Denne tilnærmingen er nyttig for å visualisere hårsekkene og tilhørende strukturer, spesielt for musehale hud. Men å oppnå høy kvalitet epidermal hele mounts fra mus rygghuden er vanskelig, antagelig på grunn av (1) den høye tettheten av hårsekker som strekker seg dypt inn i dermis og (2) tykkelse på interfollicular epidermis 13.
I vår erfaring, er BBBA behandling en svært effektiv metode for å gjengi hud optisk transparent og samtidig bevare Immunofluorescent signaler uten behov for å skille de epidermal og dermal lagene. Benzyl-benzoat har blitt brukt til å fjerne vev i flere tiår 20 og det er mye brukt for å fjerne frosk og fisk embryoer. Imidlertid har BBBA den ulempe at det denatures GFP og andre fluorescerende proteiner, oppløser den Oil Red O, og det kan forurense utstyr (f.eks mikroskop). Det ville være av interest å systematisk sammenligne BBBA behandling av huden med andre avklarings metoder som SeeDB 21, ClearT 22, Scale 23, 3DISCO 24, og klarheten 25, og noen av disse er forenlige med fluorescerende proteiner. Hvis BBBA behandlede prøvene skal avbildes ved hjelp av et disseksjonsmikroskop, et konvensjonelt lys / fluorescerende mikroskop eller en konfokal mikroskop, bør prøvene plasseres i en glassform eller mellom to store glassplater for å minimalisere BBBA forurensning.
Vi har ikke diskutert dataanalyse i enhver detalj, da dette er mer idiosynkratisk til det biologiske spørsmål under etterforskning. Men, som nevnt i innledningen, tilstedeværelsen av mange nesten identiske strukturer som hårsekkene, Merkel celle klynger, og nerveender, og fullstendigheten som disse strukturene kan avbildes i flate mounts gir en mulighet til å måle strukturelle eller morfologiske parametere i en statistisk strenge manner, sett for eksempel i nyere studier av cutaneous sensoriske axon morfologi 10 og av hårsekkene og hårsekken-assosiert strukturer i villtype og FZ6 muterte musene 4,8. Med utviklingen av mer avanserte bildeanalyse verktøy, kan det være mulig å automatisere eller halvautomatisere noen av de analyser som det i dag, blir utført manuelt, kan derved muliggjøre mer utstrakt bruk av huden flat monterings avbildning som en metode for å undersøke de prinsipper som ligger til grunn flercellet organisasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
