Summary
Кожа млекопитающих содержит разнообразные структур - таких как волосяных фолликулов и нервных окончаний - которые отличаются определенным закономерности пространственной организации. Анализируя кожу в виде плоской горе использует в своих интересах 2-мерной геометрии этой ткани для производства полной толщины изображения с высоким разрешением структур кожи.
Abstract
Кожа представляет собой весьма неоднородны ткани. Интра-кожные структуры включают волосяные фолликулы, arrector Пили мышцы, эпидермиса специализации (например, клеточных кластеров Меркель), сальные железы, нервы и нервные окончания и капилляры. Пространственное расположение этих структур строго контролируется на микроскопическом уровне - как видно, например, в упорядоченную структуру типов клеток в пределах одного волосяного фолликула - и на макроскопическом уровне - как видно по почти идентичных ориентаций тысяч волос фолликулы в локальной области кожи. Визуализация этих структур без физического секционирования кожу возможно из-за 2-мерной геометрии этого органа. В этом протоколе, мы показываем, что кожа мыши можно разрезать, фиксированной, проницаемыми, витражи, и пояснил, как нетронутыми двумерного объекта, плоской горе. Протокол позволяет легко визуализации структуры кожи во всей своей полноте через всю толщину больших участках кожи с помощью флажкаческих срезов и реконструкция. Изображения этих структур также может быть интегрирован с информацией о положении и ориентации относительно осей тела.
Introduction
Кожа является одним из крупнейших органов в организме, с важных функций в сомато-ощущения, изоляции / терморегуляции и иммунной защиты 1. Понимание молекулярной и клеточной основу развития кожи и функции была многолетней интерес из-за принципиальной важности кожи как биологической системы и ее значение для дерматологии. Кожа млекопитающих содержит множество многоклеточных структур, в том числе слоистых слоев кератиноцитов, кожной соединительной ткани, нескольких типов волосяных фолликулов, сальных желез, arrector пилей мышц, кровеносных сосудов и, по меньшей мере дюжины различных классов афферентных (сенсорных) и эфферентных нервных волокна (рис. 1). В разных регионах тела связаны с характерно разных типов кожи. У большинства млекопитающих, почти вся поверхность тела покрыта кожей, которая плотно упакованной с волосяных фолликулов. [Люди и голые землекопы составляют исключения йявляется рисунок.] волос отсутствует в ладонной поверхностях рук и ног, которые также связаны со специализированными моделей эпидермиса (dermatoglyphs), железы внешней секреции, а также чувствительных нервных окончаний. Клеточные и молекулярные события, которые контролируют рост, дифференцировку и пространственное расположение клеток в волосяных фолликулах, представляют особый интерес, поскольку каждый фолликул экспонатов, в миниатюре, многие из центральных особенностей органогенеза 2. Эти функции включают в себя существование стволовых клеток и стволовых клеток нишу, точно хореографии миграции клеток и сборку многоклеточных структур из эмбриологически различных компонентов.
В этой статье описываются методы для рассечения, крепление, маркировка, и кожа изображений мышь в качестве неповрежденной двумерного листа, называют "вся гора" или "плоская гора" подготовки. Так как кожа мыши относительно тонкой, можно изображение через всю толщину уплощенной лыжин использованием обычного конфокальной микроскопии. Квартира крепление подход к визуализации кожу млекопитающего технически выгодно, потому что она обходит необходимость физического срезов, тем самым позволяя структуры будет реконструирован полностью оптической срезов. Поскольку почти вся кожа обрабатывается как единый объект, квартиры смонтировать подход также облегчает съемку нескольких участках поверхности тела, сохраняя информацию о положении и ориентации относительно осей тела. Наконец, структуры внутри кожи, как правило, присутствует в модели, которые повторяются через определенные промежутки времени, облегчая тем самым коллекцию изображений с нескольких представителей данной структуры. Эти характеристики знакомы нейробиологов, которые работают на сетчатке, двумерной части центральной нервной системы, которая пользуется аналогичные преимущества для изучения нейронной морфологии 3.
Квартира смонтировать Описанный здесь подход имеет особое utilitY для изучения структуры, которые обладают пространственной организации на относительно больших масштабах в течение двумерной плоскости кожи. Одним из примеров масштабного пространственной организации является скоординированное полярность волосяных фолликулов и волосяных фолликул связанных структур - кластеров клеток Меркеля, arrector Пили мышц, сальных желез и нервных окончаний 4. Фолликулы волос ориентированы под углом по отношению к плоскости кожи, и компонент вектора фолликула, которая лежит в пределах 2-мерной плоскости кожи обычно проявляет ориентацию относительно осей тела, которое точно определяется для каждого Положение на теле. Например, волосяные фолликулы на задней точки от ростральнее до основания хвостового и волосы на спинной поверхности ног указывают от проксимальных к дистальным. Волосы ориентация фолликул контролируется плоской сигнализации клеточной полярности (PCP; также называется ткань полярности 5). Эта система сигнализации было обнаружено у дрозофилы, где небольшоенабор основных генов PCP было установлено, управлять ориентацией кутикулярных волосками и щетинками. Три ортологами млекопитающих из основных генов PCP - Frizzled гомологов 6 (Fzd6, также упоминается как FZ6), кадгерином ЭФР LAG семь частот G-типа рецептора 1 (Celsr1) и Ванг-как 2 (Vangl2) - играть аналогичные роли в млекопитающих кожа, координации ориентации волосяных фолликулов с осями тела. Исследования FZ6 мышей с (Fzd6 tm1Nat, далее по тексту FZ6 - / -) показывают, что первичный дефект при отсутствии PCP сигнализации является начальным рандомизации или дезорганизация ориентации волосяного фолликула, при отсутствии эффекта от внутренней структуры фолликулов 6-8. Вторая система не-РСР действует позже содействовать развитию местной выравнивание близлежащих фолликулов, что приводит к производству крупномасштабных волос шаблонов, таких как оборотах и пучки.
Второй пример крупномасштабногопространственная организация в коже проявляется в морфологии сенсорных аксонов беседок. Сенсорные нейроны, которые иннервируют кожу имеют свои клеточных тел в корне спинной и тройничного ганглиев. Эти нейроны обнаружить температуру, боль, зуд, а также различные типы механических деформаций, падающего на кожу и волосы 9. Их можно разделить на подтипы на основе диаметра аксона и скорости проводимости, терминала структуры нервных окончаний, и паттернов экспрессии рецепторов, каналов и других молекул. Из-за высокой плотности иннервации в коже, анализирует, которые включают все аксоны визуализации (например, анти-нейрофиламентов иммунное окрашивание) или даже все аксоны из одного класса (как видно, когда один тип клеток отмечена при экспрессии флуоресцентного репортера) как правило, показывает плотное наложение аксонов, которые делает невозможным определить морфологию индивидуальной беседке. Чтобы обойти эту проблему, мы использовали очень разреженный генетически-направленный лabeling производить спинной образцы кожи, в которой отдельные хорошо изолированы аксонов оправки визуализируются путем экспрессии репортера гистохимических, человеческой плацентарной щелочной фосфатазы 10. Данный подход позволяет однозначно визуализацию отдельных морфологии аксона беседка и определение типов соматосенсорной нейронных основе морфологических критериев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было выполнено в строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных Институтов Здоровья. Все животные были обработаны в соответствии с утвержденным институциональная уходу и использованию животных комитета (IACUC) протокол MO11M29 из Johns Hopkins медицинских учреждений. Ознакомьтесь с местными принципы Институциональный комитет Уход и использованию животных для утвержденных методов эвтаназии. Надевайте перчатки, халат и защитные очки при работе альдегидные фиксаторы или органические растворители.
1. Подготовка материалов
- Заливка Sylgard Плиты
- Следуйте инструкциям производителя, смешать отвердитель с базой, и перемешать с пластиковым стержнем.
- Внесите ~ 35 мл жидкости Sylgard на 10 см диаметром блюдо культуры ткани. Тканевой культуре блюда глубже, чем стандартные бактериальных блюд; это обеспечивает вертикальный зазор для штифтов насекомых.
- Поместите диShes на горизонтальной поверхности при комнатной температуре в течение ночи. Пузырьки образуются во время перемешивания исчезнет.
- После полимеризации хранить пластины Sylgard при комнатной температуре.
Примечание: Sylgard пластины можно хранить при комнатной температуре в течение многих лет и повторно использовать несколько раз, пока не Sylgard отделяется от пластины.
- Решения
- Бензил бензоат и бензиловый спирт (BBBA). Смешайте 2-х томах бензилбензоат и 1 объема бензиловый спирт. Хранить в темноте в стеклянной бутылке с пробкой или тефлоновой вершине.
ВНИМАНИЕ: Используется BBBA должны быть соответствующим образом обрабатываются как органических отходов растворителей. Не позволяйте BBBA связаться пластика. - Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Добавить 4 г PFA 80 мл воды, добавить 0,1 мл 1 N NaOH, размешать на горячей плите при ~ 70 ° C в течение ~ 5 мин, пока PFA полностью не растворится, а затем добавить 10 мл 10x PBS и довести объем до 100 мл водой.
ВНИМАНИЕ: Вдыхание паров формальдегида / PFA и BBBA должно бытьсведено к минимуму, сохраняя эти решения в закрытые контейнеры. Формальдегид / PFA является канцерогеном. - Нефть Красный О. Подготовьте 0,5% акций в изопропаноле. Непосредственно перед использованием разбавляют водой до конечной концентрации 0,3% Oil Red O, а затем фильтруют через 0,2 мкм фильтр.
- Бензил бензоат и бензиловый спирт (BBBA). Смешайте 2-х томах бензилбензоат и 1 объема бензиловый спирт. Хранить в темноте в стеклянной бутылке с пробкой или тефлоновой вершине.
2. Вскрытие кожи, фиксация и посредничества
- Спинной кожи для Иммуноокрашивание и меланин изображений
- Для очень молодых мышей (например, плодов и послеродовой день (Р) 0-P3 щенков), усыпить мышей на изофлурана ингаляции. Эвтаназии старых мышей на изофлуран ингаляции или путем инъекции кетамина / ксилазина с последующим смещением шейных позвонков.
- Удалить волосы с электрической бритвой и удаления волос гель. Для мышей в возрасте до P8, этот шаг можно пропустить.
- Используйте лезвие, чтобы сделать горизонтальный разрез от основания хвоста вдоль каждой фланге, проходя по спинной стороне основания каждой конечности, исходя сбоку от ушей и концеING в нос.
- Аккуратно очистить кожу от основной ткани, исходя из задней к передней, удерживая кожу между пальцами в перчатке, чтобы он не был зажат на щипцы. Когда пилинга кожа на уровне ушей, сначала отрезал уши с ножницами и перейти особенно медленно, так как кожа может порваться в этом месте.
- С этого момента, ориентироваться кожу изнутри вверх. Pin кожу Sylgard с ~ 20 насекомых штифты равномерно распределены по периферии; не слишком растягивать кожу (рис. 2б). Накройте кожу 10-20 мл PBS.
- Отсечь кожу-ним жира и соединительной ткани, используя угловые или изогнутых щипцов с заостренным концом щипцов, стоящих по горизонтали, чтобы свести к минимуму риск, что щипцы будет проникать в кожу. Выдавите пузырьки воздуха, что оказались в ловушке под кожей на покатых ватный-наконечником аппликатором по поверхности кожи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если кожа собираетсякоторые будут использоваться для плоской горы иммуноокрашивания или гистохимии, удалить как можно больше соединительной ткани, как это возможно; если кожа будет использоваться для визуализации волосяных фолликулов на основе меланина пигментации, менее полное удаление соединительной ткани является удовлетворительным. Пренатальная кожи требует минимального "Очистка" прилипшей соединительной ткани. - Закрепите возлагали кожу путем добавления 20 мл свежеприготовленного 4% PFA / PBS или 10% буферный формалин на 10 см Sylgard пластины (если кожа будет использоваться для меланина изображений или щелочной фосфатазы (AP) гистохимия) или 20 мл свежеприготовленного 2% PFA / PBS (если кожа будет использоваться для иммуноокрашивания или визуализации трансгенных кератина (Krt) 17-GFP 11), и аккуратно поверните на ночь в холодной комнате. На следующий день, мыть в PBS в течение> 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный формалина на 37% формальдегида; Поэтому, "10%-ного формалина" составляет 3,7% формальдегида. - Для AP окрашивания и иммуноокрашивания, продолжают в разделе 3. Для меланина мнимойIng, обезвоживают кожу через серии градуированных этанола (70%, 95%, 100%), в один прекрасный день для каждого шага, с нежным горизонтального вращения при комнатной температуре. Удалить остатки соединительных тканей.
- С кожи в 100% этаноле, удалить насекомых флажки и, если желательно, обрезать кожу ножницами, чтобы удалить наиболее периферической 1-2 мм от кожи с точечных отверстий.
- Трансфер кожу к 10 см диаметр стеклянную посуду, поставить две предметные стекла микроскопа на коже, чтобы предотвратить его от скручивания, а также добавить 20 мл BBBA. BBBA быстро затвердевает ткани, поэтому важно для кожи сплющиваться под тяжестью стеклянных слайдов перед добавлением BBBA.
- В течение следующих нескольких часов, поднимите слайды с кожи в течение нескольких секунд, чтобы позволить BBBA мыть по коже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте перчатки при работе с BBBA. В зависимости от возраста и местоположения кожи может быть столько, сколько 30% усадка в BBBA.
- Ноги Кожа для анализа Волосяной фолликул Patterning
ПРИМЕЧАНИЕ: диапазон возрастов обычно рассмотренных является P1-P8.- После эвтаназии, отрезали ноги над голеностопного сустава и сделать один прямой разрез вдоль брюшной поверхности через подошвы ног.
- Аккуратно очистить кожу от подлежащих тканей, исходя в проксимальных к дистальном направлении.
- Обрежьте цифры, чтобы освободить кожу и закрепить его на Sylgard с внутренней поверхностью вверх (рис. 2в). Существует минимальный соединительной ткани на кожу ног.
- Трансгенные Krt17-GFP кожа готова для работы с изображениями. Для визуализации меланина продолжить фиксации, обезвоживания и BBBA очистки, как описано в разделе 2.1.
- Ноги Кожа для визуализации сальных желез
- После эвтаназии, удалить волосы, потерев удаления волос гель по поверхности кожи с палец в перчатке и большим пальцем; ждать в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте электрическую бритву, которая может привести к повреждению нежную кожу ног. - Wпепел поверхность кожи с водой из-под крана, препарировать и пин-код кожу Sylgard, как описано в разделе 2.2.
- Исправить с 1% PFA / PBS в течение 30 мин при комнатной температуре и затем промывают в ЗФР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации сальных желез на ногах, которые развиваются после первого послеродовой недели, оптимальный возраст для анализа с нефтяной Red О является P21, потому что это знаменует собой низшую точку пигментации волос во время первого цикла волос 12, и, следовательно, сальные железы можно видеть более легко. С белых мышей этот анализ может быть выполнена в любом возрасте. Для получения альбиноса потомства кросс пигментированные мутантных мышей к тирозиназы мутантной линии, таких как C57BL/6J-Tyr с-2J.
- После эвтаназии, удалить волосы, потерев удаления волос гель по поверхности кожи с палец в перчатке и большим пальцем; ждать в течение 10 мин.
- Подготовка кожи хвоста для анализа меланина Distribution, волосяной фолликул Ориентация и сальных желез Визуализация
- После эвтаназии, сделать круговые разрез вокруг основания хвоста, а затем продольный разрез, который работает по всей длине хвоста вдоль его вентральной поверхности. <литий> Снимите хвостовую кожи, начиная с кончика, крепко держа кончик хвоста кости и / или соединительной ткани с одной парой щипцов и кожи с второй парой щипцов. Прикрепите хвост кожу Sylgard.
- Для анализа распределения меланина и волосяного фолликула ориентации, исправить и обрабатывать кожу, как описано в разделе 2.1. Для анализа сальных желез, сократить кожи хвоста в ряд сегментов ~ 0,5 до 1 см в длину до фиксации и инкубировать куски кожи в PBS / 5 мМ ЭДТА в течение ночи при 37 ° С, чтобы ослабить дермы-эпидермиса адгезии 13.
- Аккуратно очистить эпидермис от дермы, контактный эпидермис в Sylgard (внутренняя поверхность вверх), и зафиксируйте его в 4% PFA / PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть PBS, и окрашивают с масляным красным O как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: электрическая бритва и / или удаление волос гель может быть использован до рассечения старую кожу хвост (например, P21), но это лечение является обязательным, поскольку волосы на хвосте неплотнее другом месте на теле.
3. Окрашивание Реакции
- Плаценты человека щелочной фосфатазы (AP) Гистохимия визуализировать генетически меченных Axon Беседки 10,14,15 (3А, Б)
- После PFA фиксации на Sylgard, разместить фиксированные скины в 10 см стеклянную посуду и погрузите в PBS / 1 мМ MgCl 2. Осторожно повернуть антенну в водяной бане при 70 ° С в течение 90 мин, чтобы разрушить эндогенный активность фосфатазы.
- Визуализация активность репортера AP гистохимически с 4-48 ч инкубации при комнатной температуре в 0,1 М Трис, рН 9,5, 0,1 М NaCl, 50 мМ MgCl 2, 0,34 мкг / мл NBT и 0,175 мкг / мл BCIP, как правило, с использованием 10-15 мл окрашивания раствора на P21 спинной кожи. Контролировать реакцию под микроскопом рассекает, заботясь, чтобы не позволить ему перейти за рамки оптимального времени, если судить по визуальным осмотром окрашивания аксонов интенсивности по отношению к неспецифической осаждения НБТ. Остановить реакцию промывкой трех сменах PBS с 0,1% Твин-20 над курсом 1 часа, повторно-контактных шкуры до Sylgard, обезвоживает шкуры через серии этанола, а затем передать шкуры 10 см блюдо с BBBA.
ПРИМЕЧАНИЕ: BBBA медленно растворяет осадок NBT. В течение первых нескольких часов в BBBA, штраф фоне осажденного НБТ будет растворяться; в результате, решение BBBA потемнеет, и кожа будет светлее. Изменение на свежий BBBA через несколько часов. - После визуализации AP-окрашенных кожу, перенести его на этанол в течение> 1 час при комнатной температуре, а затем сохранить его в свежем этанола при -20 ° С AP-окрашенных оболочек можно хранить таким образом в течение многих месяцев без потери сигнала.
- Нефть Красный О Окрашивание визуализировать сальных желез 4 (рис. 3C-F)
- Удалить насекомых булавками и передать слегка фиксированную ногу или хвост шкуры с Sylgard пластины лунки планшета для культуры ткани 6-а, сдо двух образцов кожи на лунку. Промыть 60:40 изопропанол: вода в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Пятно в 2 мл 0,3% Oil Red О в 60:40 изопропанол: вода (см. раздел 1.2) при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Промыть 60:40 изопропанол: вода в течение 5 мин при комнатной температуре с последующим промыванием водой. Осторожно обрежьте края кожи, в том числе дополнительные отверстия, с мелкими ножницами так, чтобы поверхность кожи можно сделать как можно более плоскими.
- Поместите кожу на слайде с наружной поверхностью вверх, добавить несколько капель воды или водного монтажную среду, покрывают кожу с покровным, а затем аккуратно лента покровное к слайду для дальнейшего сгладить кожу.
- Квартира Гора Иммуноокрашивание 4,16,17 (рис. 3G, H)
- Вырежьте прямоугольник PFA фиксированной кожи (например, 1 см х 0,5 см), отмечая его ориентацию с асимметричным разрезом (например обрезать передний правый угол). Выполните инкубации имыть шаги с легким вращением на вращающейся горизонтальной площадке. В лунки 6 - или 12-луночного планшета для культуры ткани, промывают несколько раз PBS, чтобы удалить остаточный PFA, промывают ~ 10 изменений PBS с 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) в течение 5-8 ч при от комнатной температуры до проницаемыми кожу.
- Инкубировать с первичным антителом в 0,3% PBST с 5% козьей сывороткой и 20% ДМСО в течение пяти дней при комнатной температуре. Обложка лунки пластины с четко ленты или липкой пластика для устранения потерь на испарение.
- Промыть 10-15 изменений 0,3% PBST в течение 5-8 ч и инкубируют с вторым антителом в 0,3% PBST с 5% козьей сывороткой и 20% ДМСО в течение 3 дней при комнатной температуре.
- Промыть 10-15 изменений 0,3% PBST более 5-8 часов.
- Высушить в 25%, 50% и 75% метанолом в течение 5 мин, а затем каждой 3x в 100% метаноле в течение 20 мин каждый.
- Ясно BBBA ночи при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Квартира смонтировать иммуноокрашивания кожи моложе~ P1 может быть выполнена, как описано выше, но с более короткой инкубации и мыть раз. Например, P1 кожи можно иммунному окрашиванию с инкубации в течение ночи в первичных антител и нескольких часов инкубации в вторичными антителами, и с промежуточными промыли всего 2-3 часа в 0,3% PBST. Как отмечалось выше, младшие шкуры также достаточно тонким, что они могут быть отображены без BBBA очистки.
- Визуализация клеток Меркеля кластеров с Люминесцентная Nerve Terminal Dye Поглощение (рис. 3i-L)
АМИ-43 (зеленый) и АМ4-65 (красный) поправимо флуоресцентные красители, которые входят клетки через неизбирательного канала катионов 18. В живой кожи эти красители избирательно поглощают и концентрируют в Merkel клеток.- Растворите 1 мг АМ1-43 или АМ4-65 в 2 мл PBS и хранить в аликвоты при -80 ° С
- Введите новорожденные щенки подкожно 2-10 мкг красителя на грамм массы тела с помощью 29 г иглы.
- Через день, усыпить мышей и DisseКТ спинной кожи.
- Fix шкуры в 4% PFA / PBS при 4 ° С в течение ночи, промывают PBS, и смонтировать кожу, как описано в разделе 3.2.
4. Изображений и анализ изображений
- Визуализация Волосяной фолликул Ориентация (рис. 4)
- Используйте рассекает микроскопом, чтобы изображения спинной, пешком, или хвост скинов, которые погружены в BBBA, сплющенный под стекло, и до сих пор в стеклянную посуду - такой подход минимизирует BBBA загрязнения микроскопом.
- Освещать блюдо снизу. Чтобы свести к минимуму пространственной вариации интенсивности света поперек поля зрения, поднять стекла блюдо на высоте ~ 10 см выше стандартной рабочей поверхности вскрытии микроскопом и поместите рассеивающий пластик или стеклянную пластинку над источником света.
- Возврат к коже 100% этаноле в течение длительного хранения при -20 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставляя кожу в BBBA для более суток вызывает гранулы меланина сломатьчасть. После того, как кожа была BBBA лечиться затвердеет и остаются квартиры от этого момента. Различные шкуры могут быть закодированы с серией пазов в их передней и / или заднего концов, так что они могут быть хранить вместе, чтобы сэкономить место в морозильной камере.
- Работа с изображениями и Трассировка Axon Беседки (3А, Б)
- Наведите AP окрашивали кожу (раздел 3.1.3) между двумя стеклянными пластинами типа используемого для небольших гелей белка. Избегайте введения пузырьков воздуха между пластинами и кожей, а затем тщательно фитиль от избытка BBBA с бумажным полотенцем. Поместите бутерброд пластинчатых кожи пластины на столике микроскопа (рис. 2D).
- Используйте светлого поля или DIC освещения с целью 10X и 2 мкм или 5 мкм Z-шагов. Используйте механизированную сцену XY захватить монтаж XY изображений, которые сшиты вместе, чтобы создать единую трехмерную набор данных, черно-белое.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для одного большого аксона беседки, этот набор данных может бытьы большой, как 5 Гб. - Выполните инструкцию, автоматизированная или полуавтоматической трассировки аксонов беседок с любой из множества программных пакетов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение таких как Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) является свободным нейронов инструмент реконструкции, которая работает в среде ПК и относительно легко освоить 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Светлое визуализации flatmounts кожи могут быть использованы для изображения кожных сенсорных афферентных (фиг.3А 10) и образцов волосяного фолликула на основе меланина пигментации (рис. 4). Конфокальной визуализации flatmounts кожи могут быть использованы для определения геометрии (1) кластеров Меркель клеток, визуализированных с анти-цитокератина-6 или с поглощением AM красителя (рис. 3i-L), (2) arrector Пили мышц, визуализируется с анти- гладкой мышцы актина (рис. 3G, Н), (3) сальных желез, визуализированные с масляным красным O (Фигуры 3C-F), и (4) волосяных фолликулов, визуализированных с Krt17-GFP трансгена или путем окрашивания анти-антител Krt17 4 (рис. 3E-G, K, L). Это просто вручную набрать ориентации и пространственного расположения структур в таких изображений путем размещения векторов известной ориентации на структурах с использованием Adobe Photoshop или Illustrator, а затем quantifyinг результирующего вектора населения. Хотя этот подход достаточно для шкале от нескольких сотен векторов, было бы чрезмерно утомительным на 10 - или 100-кратный большего масштаба.
Рисунок 1. Схема млекопитающих волосатой кожи, показывая основные структуры. (Copyright, Тереза Уинслоу.)
Рисунок 2. Рассечение кожи и обработки проб.) Препарирование инструменты. Б) P5 спинной кожи прижат к пластине Sylgard. C) P5 спинной задние кожи ног прижат к Sylgard пластины. D) спинной кожи установлен между 2 стекла гелевых пластин для визуализации весIth цель 10X и ДВС или светлое освещение.
Рисунок 3. Кожные структуры в квартиру монтировать взгляды. А, В) Один кожный сенсорная беседка (слева) и его проследить изображение (справа) от P21 спинной коже Brn3a CKOAP / +;. Результатов настоящего Протокола НФЛ-Creer / + мышь подвергается низкой дозы тамоксифена на сроке день 17 в Cre-опосредованной рекомбинации репортера в очень небольшой части спинных нейронов ганглиев и поэтому небольшая часть кожных сенсорных беседок помечены плаценты человека щелочной фосфатазы (AP) репортера. Меченые аксоны визуализированы с NBT / BCIP гистохимии. Brn3a будет эквивалентно называют Pou4f1. С, D) кожи хвоста окрашивали Oil Red О визуализировать сальных желез отWT (слева) и FZ6 - / - (справа) мышей на P21. FZ6 - / - структуры дезорганизованы. P, проксимального; . D, дистального E, F) Спинной ноги кожи от БТ (слева) и FZ6 - / - (справа) мыши, несущие Krt17-GFP. Кожа была собрана на P21 и окрашивали Oil Red О. FZ6 - / - кожа имеет волос виток в ее центре. P, проксимального; . D, дистального G, H) Спинной кожи от WT мыши на P21 показывая волосяных фолликулов (визуализированных с Krt17-GFP трансгена и анти-GFP иммуноокрашивания; панели G) и arrector Пили мышц [визуализированных с анти-гладких мышц актина (SMA ) иммуноокрашивание; Панель Н]. Глубина в конфокальной Z-Stack изображения цветовую маркировку. , Передний; Р, задняя. Иллинойс) клеток Меркеля кластера (визуализированы с cytokeratin8 иммуноокрашивания или АМ11-43 поглощения красителя) и его центральная волосяной фолликул (визуализированы в панели K и L с Krt17-GFP). Изображения были получены из P1 спинной кожи от указанных генотипов. FZ6 - / - клетки кластера Меркель образует замкнутый круг, в то время как клетки кластера WT Меркель открыт к передней. , Передний; Р, задняя. Масштабные бары: А и В, 300 мкм; C и D, 500 мкм; Е и F, 500 мкм; G и Н, 200 мкм; Ил, 50 мкм. (Панели А и В, воспроизводятся с eLife и Proc. Natl. Акад. Научно. США, с разрешения 4,10) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Волос и волосяные фолликулы в спинной кожи в P1 и P7 визуализированы с меланина пигментации. А, В) P1 кожи от БТ и FZ6 - / -. мышей С, D) P7 кожу от FZ6 - / - мышей. Масштабные бары: А и В, 500 мкм; C и D, 1 мм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Овладение методами рассечение описанных выше требуется только терпение, твердая рука, и несколько хороших инструментов рассечение. Рассечение кожу спины сравнительно легко, но хвост и кожи ног вскрытия - особенно на ранних послеродовых возрастов - являются более сложными. На ранних пренатальной возрастов (например, до E15), кожа трудно удалить, не разрывая ее. Удобно, для многих исследований роста и формирования паттерна структур кожи у мышей, события интерес произойти после рождения, как видно, например, в исследованиях роста arrector Пили мышц 19.
Изображений глубоко в кожу в плоской конфигурации горе является сложной задачей, потому что кожа является относительно рефрактильные ткани. Эта задача становится больше, как кожа созревает благодаря дифференциации и увеличения толщины составляющих ее слоев. Один частичное решение этой проблемы заключается в разделении дерму и эпидермис и анализировать EpiDermкак отдельное структуры ("эпидермиса тотальных"). Этот подход полезен для визуализации волосяных фолликулов и связанные с ними структуры, особенно для хвоста мыши кожи. Однако получение высококачественных эпидермиса тотальных от мыши спинной кожи трудно, по-видимому из-за (1) высокой плотности волосяных фолликулов, которые простираются глубоко в дерму и (2) тонкость межфолликулярного эпидермиса 13.
По нашему опыту, лечение BBBA является высокоэффективным методом для оказания кожу оптически прозрачный, сохраняя иммунофлуоресцентный сигналы без необходимости разделения эпидермиса и кожные слои. Бензил-бензоат был использован для очистки ткани в течение многих десятилетий 20 и он широко используется для очистки лягушачьи и рыбные эмбрионов. Тем не менее, BBBA имеет тот недостаток, что он денатурирует GFP и другие флуоресцентные белки, она растворяет масла Red O, и это может загрязнить оборудование (например, микроскопы). Было бы Интерест систематически сравнивать BBBA лечение кожи с другими методами разъяснения таких как SeeDB 21 ClearT 22 Scale 23 3DISCO 24 и ясность 25, некоторые из которых совместимы с флуоресцентных белков. Если BBBA лечить образцы для включения в образ с помощью рассекает микроскопом, обычный свет / флуоресцентный микроскоп, или конфокальной микроскопии, образцы должны быть помещены в стеклянную посуду или между двумя большими стеклянными пластинами, чтобы свести к минимуму загрязнение BBBA.
Мы не обсуждали анализа данных во всех подробностях, так как это более особенным к биологическому вопросу ведется расследование. Однако, как отмечалось во введении, наличие многих почти идентичных структур, таких как волосяных фолликулов, кластеров клеток Меркеля и нервных окончаний, и полноты, с которой эти структуры могут быть отображены в плоских опорах обеспечивает возможность измерить структурные или морфологические параметры в статистически строгой маnner, как видно, например, в недавних исследованиях кожных сенсорных аксонов морфологии 10 и волосяных фолликулов и фолликулостимулирующего связано структур в дикого типа и FZ6 мутантных мышей 4,8. С развитием более сложных инструментов анализа изображений, это может быть возможным, чтобы автоматизировать или полуавтомат некоторые из анализов, которые в настоящее время выполняются вручную, тем самым способствуя более широкому использованию кожи плоским смонтировать изображений в качестве метода исследования принципы, лежащие многоклеточные организация.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
