Summary
Mammaliehud innehåller en mångfald av strukturer - t.ex. hårsäckar och nervändar - som uppvisar distinkta mönster av rumslig organisation. Analysera hud som en platt fäste drar nytta av den 2-dimensionella geometrin hos denna vävnad för att producera full tjocklek högupplösta bilder av hud strukturer.
Abstract
Huden är en mycket heterogen vävnad. Intra-dermal strukturer inkluderar hårsäckar, arrector pili muskler, epidermal inriktningar (t.ex. Merkel cell kluster), talgkörtlar, nerver och nervändar, och kapillärer. Det rumsliga arrangemanget av dessa strukturer är tätt styrd i mikroskopisk skala - såsom ses, till exempel, i ett ordnat arrangemang av celltyper inom en enskild hårsäck - och i makroskopisk skala - såsom framgår av den nästan identiska orienteringar av tusentals av hår folliklar inom ett lokalt område av huden. Visualisering dessa strukturer utan att fysiskt sektione huden är möjligt på grund av två-dimensionell geometri av detta organ. I detta protokoll, visar vi att musen hud kan dissekeras, fast, permeabilized, färgas, och klar som en intakt tvådimensionella objekt, en platt fäste. Protokollet möjliggör enkel visualisering av hud strukturer i sin helhet genom hela tjockleken av stora hudområden genom optical sektione och återuppbyggnad. Bilder av dessa strukturer kan också integreras med information om position och orientering i förhållande till kroppen axlarna.
Introduction
Huden är ett av de största organ i kroppen, med viktiga funktioner i somato-sensation, isolering / värmereglering, och immunförsvaret 1. Att förstå den molekylära och cellulära grunden för hudens utveckling och funktion har varit för långvarigt intresse på grund av den grundläggande betydelsen av huden som ett biologiskt system och dess relevans för dermatologi. Mammaliehud innehåller en mängd flercelliga strukturer, inklusive skiktade lager av keratinocyter, dermal bindväv, flera typer av hårsäckar, talgkörtlar, arrector pili muskler, blodkärl, och minst ett dussin olika typer av afferenta (sensoriska) och efferenta nerv fibrer (figur 1). Olika regioner av kroppen är associerade med karakteristiskt olika typer av hud. I de flesta däggdjur, är nästan hela kroppsytan täckt med hud som tätt är packad med hårsäckar. [Människor och nakna mole råttor utgör undantag till thär mönstret.] Hår saknas Palmar ytorna i händer och fötter, som också förknippas med specialiserade epidermala mönster (dermatoglyphs), exokrina körtlar och sensoriska nervändar. De cellulära och molekylära händelser som styr tillväxt, differentiering och rumsliga arrangemanget av celler i hårsäcken är av speciellt intresse eftersom varje follikel utställningar, i miniatyr, många av de centrala dragen i organogenesen 2. Dessa funktioner inkluderar att det finns stamceller och stamcellsnischen, exakt koreograferade cellmigrationer, och montering av flercelliga strukturer från embryologiskt skilda komponenter.
I artikeln beskrivs metoder för att dissekera, fixering, märkning och bildhantering mus hud som ett intakt tvådimensionellt ark, kallad "hela berget" eller "flat montera" förberedelse. Sedan mushud är relativt tunn, är det möjligt att bilden genom hela tjockleken av tillplattad skidan med användning av konventionell konfokalmikroskopi. Den platta monterings metod för avbildning däggdjurshud är tekniskt fördelaktigt eftersom det kringgår behovet av fysiska sektione därigenom medge strukturer som skall rekonstrueras uteslutande genom optisk sektionering. Eftersom nästan hela huden behandlas som ett enda objekt, den platta montera tillvägagångssätt underlättar också avbildning av multipla regioner av kroppsytan och samtidigt bevara information om position och orientering i förhållande till kroppens axel. Slutligen strukturer inom huden är typiskt i mönster som upprepas med jämna mellanrum, vilket underlättar insamlingen av bilder från flera representanter för en given struktur. Dessa egenskaper är bekanta för neurobiologists som arbetar på näthinnan, en tvådimensionell del av det centrala nervsystemet som har liknande fördelar för studier av neuronal morfologi 3.
Den platta montera metod som beskrivs här är av särskild Utility för att studera strukturer som uppvisar rumslig organisation i relativt stor skala i det tvådimensionella planet i huden. Ett exempel på storskaliga rumsliga organisation är den samordnade polaritet hårsäckar och hårsäcken-associerade strukturer - Merkel cellkluster, arrector pili muskler, talgkörtlar och nervändar 4. Hårsäckar är orienterade i en vinkel i förhållande till planet för huden, och komponenten av follikel vektor som ligger inom det 2-dimensionella planet av huden i allmänhet uppvisar en orientering med avseende på kroppens axlar som är exakt bestämd för varje läge på kroppen. Till exempel, för att hårsäckarna på baksidan punkten från rostral kaudala och hår på den övre delen av fötterna pekar från proximalt distalt. Hårsäcken orientering styrs av plana cellpolaritet signalering (PCP, även kallad vävnads polaritet 5). Detta signaleringssystem upptäcktes i Drosophila där en litenuppsättning centrala PCP gener befanns styra inriktningen av cuticular hår och borst. Tre mammaliska ortologer av kärn PCP gener - frizzled homologa 6 (Fzd6, även hänvisad till som FZ6) cadherin EGF LAG sju-pass av G-typ-receptor 1 (Celsr1) och vang-like 2 (Vangl2) - spela analoga roller i däggdjurs- hud, samordna riktlinjerna i hårsäckarna med kroppsaxlarna. Studier av Fz6 knockoutmöss (Fzd6 tm1Nat, nedan kallat FZ6 - / -) visar att den primära defekten i frånvaro av PCP signalering är en initial randomisering eller desorganisation av hårsäcken läggning, utan någon effekt på den inneboende strukturen hos folliklarna 6-8. En andra icke-PCP systemet agerar senare för att främja lokal inriktning av närliggande folliklar, vilket leder till produktion av storskaliga hår mönster såsom virvlar och tofsar.
Ett andra exempel på storskaligarumslig organisation i huden ses i morfologier av sensoriska axon hållare. Sensoriska nervceller som innerverar huden har sina cellkroppar i dorsala och trigeminala ganglier. Dessa neuroner detektera temperatur, smärta, klåda, och olika typer av mekaniska deformationer som träffar huden och håret 9. De kan delas in i undertyper baserade på axon diameter och ledningshastighet, terminal nervänden struktur, och de mönster av uttryck av receptorer, kanaler och andra molekyler. På grund av den höga tätheten av innervation i huden, analyser som involverar visualisera alla axoner (t.ex. anti-neurofilament immunofärgning) eller till och med alla axoner av en enda klass (som kan ses när en enda celltyp är märkt genom uttryck av en fluorescerande reporter) allmänhet avslöjar en tät lagring av axoner som gör det omöjligt att definiera morfologi av en enskild berså. För att kringgå detta problem har vi använt mycket gles genetiskt riktad lAbeling att producera dorsala hudprov där enskilda välisolerade axon arbors visualiseras genom expression av en histokemisk reporter, humant placentalt alkaliskt fosfatas 10. Detta tillvägagångssätt gör det entydiga visualisering av enskilda axon arbor morfologier och en definition av somatosensoriska neuron typer baserat på morfologiska kriterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie utfördes i strikt enlighet med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur av National Institutes of Health. Alla djuren hanterades enligt godkänd Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) protokoll MO11M29 av Johns Hopkins Medical Institutions. Rådgör med din lokala Institutional Animal Care och användning kommittén riktlinjer för godkända metoder för dödshjälp. Använd handskar, skyddsrock och skyddsglasögon vid hantering av aldehyd fixativ eller organiska lösningsmedel.
1. Beredning av material
- Hälla Sylgard Plates
- Följ tillverkarens instruktioner, blanda härdaren med basen, och rör om med en plaststav.
- Pipett ~ 35 ml flytande Sylgard per 10 cm diameter vävnadsodlingsskål. Vävnads kultur rätter är djupare än de vanliga bakterie rätter; detta ger fri höjd för insekt stift.
- Placera dishes på en horisontell yta vid rumstemperatur över natten. Bubblor som bildas under blandningen försvinner.
- Efter polymerisering, lagra Sylgard plattorna vid rumstemperatur.
Anmärkning Sylgard plattorna kan förvaras vid rumstemperatur i flera år och återanvändas flera gånger ända tills Sylgard lossnar från plattan.
- Lösningar
- Bensylbensoat och bensylalkohol (BBBA). Blanda 2 volymer bensylbensoat och 1 volym bensylalkohol. Förvaras mörkt i en glasflaska med en glaspropp eller Teflon toppen.
VARNING: Används BBBA bör på lämpligt sätt hanteras som organiskt lösningsmedel avfall. Låt inte BBBA att kontakta plast. - Fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Lägg 4 g PFA till 80 ml vatten, tillsätt 0,1 ml 1 N NaOH, rör på en värmeplatta vid ~ 70 ° C i ~ 5 min tills PFA är helt löst, och lägg sedan till 10 ml 10x PBS och justera volymen till 100 ml med vatten.
VARNING: Inandning av formaldehyd / PFA och BBBA ångor bör varaminimeras genom att hålla dessa lösningar i täckta behållare. Formaldehyd / PFA är cancerframkallande. - Oil Red O. Förbered en 0,5% lager i isopropanol. Omedelbart före användning späds med vatten till en slutlig koncentration av 0,3% Oil Red O, och filtreras därefter genom ett 0,2 pm filter.
- Bensylbensoat och bensylalkohol (BBBA). Blanda 2 volymer bensylbensoat och 1 volym bensylalkohol. Förvaras mörkt i en glasflaska med en glaspropp eller Teflon toppen.
2. Hud Dissection, Fixering, och Clearing
- Rygghuden för immunfärgning och melanin Imaging
- För mycket unga möss (t.ex. foster och postnatal dag (P) 0-P3 PUP), avliva möss med isofluran inandning. Euthanize äldre möss med isofluran inandning eller med ketamin / xylazin injektion följt av halsdislokation.
- Ta bort hår med en elektrisk rakapparat och hårborttagning gel. För möss yngre än P8, kan du hoppa över steget.
- Använda ett rakblad för att göra ett horisontellt snitt från basen av svansen längs varje flank, som passerar på den dorsala sidan av basen på varje lem, skrider lateralt om öronen och sluteting vid näsan.
- Försiktigt skal huden från underliggande vävnad förfarande från bakre till främre genom att hålla huden mellan handskar på, så att den inte kläms av pincett. När skalar huden i höjd med öronen, skär först bort öronen med en sax och fortsätt särskilt långsamt eftersom huden kan riva på den här platsen.
- Från denna punkt framåt, orientera huden med insidan uppåt. Klämma huden att Sylgard med ~ 20 insekter stift jämnt fördelade runt periferin; inte över-sträcka huden (Figur 2B). Täck huden med 10 till 20 ml PBS.
- Dissekera bort huden associerade fett och bindväv med hjälp av vinklade eller böjda pincett med den spetsiga änden av tången vända horisontellt för att minimera risken för att tången kommer att tränga in i huden. Extrudera eventuella luftbubblor som har fastnat under huden genom att försiktigt rulla en bomullspinne över hudytan.
OBS: Om huden gårsom skall användas för platt fäste immunofärgning eller histokemi, ta bort så mycket av den bindväv som möjligt; om huden kommer att användas för att visualisera hårsäckar baserat på melaninpigmentering, är mindre fullständigt avlägsnande av bindväv tillfredsställande. Prenatal hud kräver minimal "städning" av vidhäftande bindväv. - Fäst nålas huden genom tillsats av 20 ml av nyberedd 4% PFA / PBS eller 10% buffrad formalin per 10 cm Sylgard plattan (om huden kommer att användas för melanin avbildning eller alkaliskt fosfatas (AP)-histokemi) eller 20 ml nyberedd 2% PFA / PBS (om huden kommer att användas för immunfärgning eller visualisera transgen Keratin (KRT) 17-GFP 11), och försiktigt rotera över natten i ett kallt rum. Nästa dag, tvättar i PBS under> 10 min.
OBS: Standard formalin är 37% formaldehyd; Därför är "10% formalin" 3,7% formaldehyd. - För AP-färgning och immunfärgning, fortsätter i avsnitt 3. För melanin imaghelst, torka ut huden genom en graderad etanolserie (70%, 95%, 100%), en dag för varje steg, med försiktig horisontell rotation vid rumstemperatur. Avlägsna kvarvarande bindväv.
- Med huden i 100% etanol, avlägsna insekter stift och, om så önskas, trim huden med en sax för att avlägsna de mest perifera 1-2 mm av huden med stifthålen.
- Överför huden till en 10 cm glas diameter skål, placera två objektglas på huden för att förhindra den från curling, och tillsätt 20 ml BBBA. BBBA härdar snabbt vävnad så det är viktigt för huden att tillplattas under vikten av glasskivorna före tillsats av BBBA.
- Över de nästa flera timmar, lyfter bilderna från huden i några sekunder så att BBBA att tvätta över huden.
OBS: Använd handskar när du arbetar med BBBA. Beroende på ålder och plats på huden kan det vara så mycket som 30% krympning i BBBA.
- Fot Hud för Analys av Hårsäck Patterning
OBS: Utbudet av åldrar vanligtvis undersökts är P1-P8.- Efter dödshjälp, skära av fötterna ovanför fotleden och göra ett enda rakt snitt längs den ventrala ytan genom fotsulorna.
- Försiktigt skal huden från den underliggande vävnaden, fortsätter i en proximal till distal riktning.
- Skär siffrorna att frigöra huden och stift den till Sylgard med insidan uppåt (figur 2C). Det är minimal bindväv på foten huden.
- Transgenic Krt17-GFP hud är nu redo för avbildning. För melanin avbildning fortsätta med fixering, dehydrering och BBBA clearing som beskrivs i avsnitt 2.1.
- Fot Skin för visualisering talgkörtlar
- Efter dödshjälp, ta bort hår genom att gnugga håret remover gel över hudytan med en handske finger och tumme; vänta 10 min.
OBS: Använd inte en elektrisk rakapparat, vilket kommer att skada den känsliga fot hud. - Waska hudytan med kranvatten, dissekera och nåla huden till Sylgard som beskrivs i avsnitt 2.2.
- Fäst med en% PFA / PBS under 30 min vid rumstemperatur och sedan tvätta i PBS.
OBS: För att visualisera talgkörtlar på fötterna, som utvecklas efter den första födseln veckan, är den optimala åldern för analys med Oil Red O P21, eftersom det markerar nadir av hår pigmentering under det första håret cykeln 12, och därför talgkörtlar kan ses lättare. Med albino möss denna analys kunde utföras i alla åldrar. För att få albino avkomma kors pigmenterad muterade möss till en tyrosinas mutant linje såsom C57BL/6J-Tyr c-2J.
- Efter dödshjälp, ta bort hår genom att gnugga håret remover gel över hudytan med en handske finger och tumme; vänta 10 min.
- Tail Skin Förberedelser för analys av melanin Distribution, Hårsäck Orientering och Sebaceous körtel Visualisering
- Efter dödshjälp, gör en cirkulär snitt runt svansroten, och sedan en längsgående slits som löper längs svansen längs dess ventrala yta. <li> Dra av den bakre täck början vid spetsen av stadigt greppa svansspets-ben och / eller bindväv med en pincett och huden med ett andra par av pincett. Sätta svansen huden till Sylgard.
- För analys av distributions melanin och hårsäckar orientering, fixa och behandla huden som beskrivs i avsnitt 2.1. För analys av talgkörtlar, skär svansen huden in i en serie av segment ~ 0,5-1 cm i längd före fixering och inkubera bitarna hud i PBS / 5 mM EDTA över natten vid 37 ° C för att försvaga den dermis-epidermis vidhäftning 13.
- Dra försiktigt epidermis från dermis, nåla epidermis till Sylgard (innersidan upp), och fixa det i 4% PFA / PBS under 1 timme i rumstemperatur. Tvätta med PBS och färgas med Oil Red O som beskrivs nedan.
OBS: En elektrisk rakapparat och / eller hårborttagning gel kan användas före dissekera äldre svans hud (t ex P21), men denna behandling är frivillig eftersom håret på svansen är inteså tät som på andra ställen på kroppen.
3. Färgreaktioner
- Humant placentalt alkaliskt fosfatas (AP) Histochemistry att visualisera Genetiskt märkta Axon Arbors 10,14,15 (fig. 3A, B)
- Efter PFA fixering på Sylgard, placera fasta skinn i en 10 cm glasskål och dränka i PBS / 1 mM MgCl2. Rotera försiktigt skålen i ett vattenbad vid 70 ° C under 90 min för att förstöra endogena fosfataser.
- Visualisera AP reporter aktivitet histokemiskt med en 4 till 48 timmars inkubering vid rumstemperatur i 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 0,34 | ig / ml NBT och 0,175 ug / ml BCIP, typiskt med användning av 10 till 15 ml av färglösningen per P21 rygghuden. Övervaka reaktionen under dissekera mikroskop, se till att inte låta det gå längre än den optimala tiden, att döma av visuell inspektion av Axon färgningsintensitet i förhållande till icke-specifik NBT nedfall. Stoppa reaktionen genom att tvätta med tre byten av PBS/0.1% Tween-20 under loppet av 1 timme, re-pin skinn till Sylgard, torka skinn genom en etanol-serien, och sedan överföra skinn till en 10 cm skål med BBBA.
Anmärkning BBBA långsamt upplöses NBT fällning. Under de första timmarna i BBBA, kommer en fin bakgrund av utfälld NBT upplösas; som en följd av detta kommer BBBA lösningen mörknar och huden ljusare. Byt till färsk BBBA efter några timmar. - Efter avbildning av AP-färgade hud, överför den till etanol under> 1 timme vid rumstemperatur och därefter lagra den i färsk etanol vid -20 ° C. AP-färgade skinn kan lagras på detta sätt i flera månader utan signalförlust.
- Oil Red O-färgning för att visualisera talgkörtlar 4 (figurerna 3C-F)
- Ta bort insekter stift och överför lätt fast fot eller svans skinn från Sylgard plattan till brunnarna i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta, medupp till två hudprover per brunn. Tvätta med 60:40 isopropanol: vatten under 5 min vid rumstemperatur.
- Fläck i 2 ml 0,3% Olja Red O i 60:40 isopropanol: vatten (se avsnitt 1.2) vid rumstemperatur i 2 timmar.
- Tvätta med 60:40 isopropanol: vatten under 5 min vid rumstemperatur, följt av en vattentvätt. Trimma försiktigt bort kanterna på huden, inklusive stifthålen, med fina saxar, så att ytan av huden kan göras så platt som möjligt.
- Placera huden på en bild med den yttre ytan uppåt, tillsätt några droppar vatten eller vattenmonteringsmedium, täcka huden med ett täckglas, och sedan försiktigt tejpa täckglas på bilden för att ytterligare platta huden.
- Flat Mount Immunfärgning 4,16,17 (figur 3G, H)
- Skär en rektangel av PFA fast hud (t.ex. 1 cm x 0,5 cm), markera sin orientering med en asymmetrisk snitt (t.ex. klippa den främre högra hörnet). Utför inkubation ochtvätta steg med varsam rotation på en roterande horisontell plattform. I brunnarna i en 6 - eller 12-brunnars vävnadsodlingsplatta, tvätta flera gånger med PBS för att avlägsna kvarvarande PFA, tvätta med ~ 10 byten av PBS med 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) under 5-8 h vid rumstemperatur för att permeabilisera huden.
- Inkubera med den primära antikroppen i 0,3% PBST med 5% getserum och 20% DMSO under fem dagar vid rumstemperatur. Täck brunnarna i plattan med genomskinlig tejp eller självhäftande plast för att eliminera avdunstningsförluster.
- Tvätta med 10-15 byten av 0,3% PBST över 5-8 h och inkuberas med sekundär antikropp i 0,3% PBST med 5% getserum och 20% DMSO under 3 dagar vid rumstemperatur.
- Tvätta med 10-15 byten av 0,3% PBST över 5-8 timmar.
- Torka i 25%, 50% och 75% metanol under 5 minuter vardera och sedan 3x i 100% metanol under 20 min vardera.
- Rensa i BBBA över natten vid rumstemperatur.
OBS: Flat montera immunfärgning av huden yngre än~ P1 kan utföras såsom beskrivits ovan, men med kortare inkubationstid och tvätta gånger. Till exempel kan P1 hud vara immunfärgades med en inkubering över natten i primär antikropp och en flera timmars inkubation i sekundär antikropp, och med mellanliggande tvättningar av endast 2-3 h i 0,3% PBST. Såsom noterats ovan yngre skinn är även tillräckligt tunna att de kan avbildas utan BBBA clearing.
- Visualisera Merkel cell kluster med fluorescerande Nerve Terminal Dye Upptag (figurerna 3I-L)
AMI-43 (grön) och AM4-65 (röd) är fastställbara fluorescerande färger som kommer in celler via icke-selektiva ning kanal 18. I den levande huden dessa färgämnen selektivt tas upp och koncentreras i Merkel celler.- Upplös 1 mg AM1-43 eller AM4-65 i 2 ml PBS och förvara i alikvoter vid -80 ° C.
- Injicera nyfödda valpar subkutant med 2-10 mikrogram färgämne per gram kroppsvikt med hjälp av en 29 G nål.
- En dag senare, avliva möss och DisseCT dorsala skinn.
- Fäst skinn i 4% PFA / PBS vid 4 ° C över natten, tvätta med PBS, och montera huden så som beskrivs i avsnitt 3.2.
4. Avbildning och bildanalys
- Imaging Hårsäck Orientering (Figur 4)
- Använd en dissekera mikroskop till bild rygg, fot, eller svans skinn som är nedsänkta i BBBA, tillplattad under en glasskiva, och fortfarande i glasskål - detta tillvägagångssätt minimerar BBBA förorening av mikroskop.
- Belysa skålen underifrån. För att minimera variationen i ljusintensitet över synfältet, elevate glasskål till en höjd ~ 10 cm över den normala arbetstiden ytan av dissektionsmikroskop och placera en diffunderande plast eller glasplatta över ljuskällan.
- Återgå huden att 100% etanol under långtidslagring vid -20 ° C.
OBSERVERA: lämnar huden i BBBA för mer än en dag bringar melaningranulat för att bryta endelen. När huden har BBBA behandlat det kommer att hårdna och förblir platt från den punkten och framåt. Olika skinn kan kodas med en serie hack på deras främre och / eller bakre ändar, så att de kan spara ihop, för att spara utrymme i frysen.
- Imaging och Spåra Axon Arbors (fig. 3A, B)
- Placera AP färgade huden (avsnitt 3.1.3) mellan två glasskivor av den typ som används för små protein geler. Undvik att införa luftbubblor mellan plattorna och huden, och sedan försiktigt transportera bort överflödigt BBBA med en pappershandduk. Placera sandwich av plåt-hud-platta på ett mikroskop scenen (figur 2D).
- Använd ljusfält eller DIC belysning med en 10X objektiv och 2 ìm eller 5 ìm Z-steg. Använd en mekaniserad XY skede för att fånga ett montage av XY bilder som fogas samman för att skapa en enda tredimensionell gråskala datamängd.
OBS: För en enda stor axonet berså, kan detta datauppsättning vara ens stor som 5 Gb. - Utför manuell, automatiserad eller delvis automatiserad spårning av axon hållare med någon av en mängd olika programpaket.
OBS: Program som Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) är ett gratis neuronal rekonstruktion verktyg som körs i en PC-miljö och är relativt lätt att bemästra 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brightfield avbildning av hud flatmounts kan användas till bild kutana sensoriska afferenter (Figur 3A 10) och hårsäcken mönster som bygger på melaninpigmentering (Figur 4). Konfokal avbildning av hud flatmounts kan användas för att definiera geometri (1) Merkel cellkluster, visualiseras med anti-cytokeratin-6 eller med AM färgupptagning (figurerna 3I-L), (2) arrector pili muskler, visualiserades med anti- glattmuskelaktin (fig. 3G, H), (3) talgkörtlar, visualiserade med Oil Red O (figurerna 3C-F) och (4) hårsäckar, visualiserade med en Krt17-GFP-transgen eller genom färgning med anti-Krt17 antikroppar 4 (figurerna 3E-G, K, L). Det är enkelt att manuellt göra mål de riktlinjer och rumsliga arrangemang av strukturer i sådana bilder genom att placera vektorerna kända orientering på de strukturer med hjälp av Adobe Photoshop eller Illustrator och sedan quantifying de resulterande vektorpopulationer. Även om detta tillvägagångssätt är tillräckligt för en skala av flera hundra vektorerna, skulle det vara oöverkomligt omständlig på en 10 - eller 100-faldigt större skala.
Figur 1. Schematisk av däggdjur hårig hud visar de stora strukturerna. (Copyright, Terese Winslow.)
Figur 2. Hud dissekering och provhantering. A) Dissection verktyg. B) En P5 rygghuden fast till en Sylgard platta. C) En P5 rygg bakfoten huden fast till en Sylgard platta. D) En rygghuden monterad mellan två glas gelplattor för avbildning wed en 10X objektiv och DIC eller ljusfältsbelysning.
Figur 3. Hud strukturer i platta montera åsikter. A, B) En enda kutan sensorisk berså (vänster) och dess spårat bilden (till höger) från en P21 rygghuden av en Brn3a CKOAP / +;. NFL-CreER / + mus utsätts för låg dos tamoxifen vid graviditets dag 17 Detta protokoll resultat i Cre-förmedlad rekombination av reportern i en mycket liten fraktion av dorsal root ganglion neurons, och därför kan en liten fraktion av kutana sensoriska arbors märks med humant placenta alkaliskt fosfatas (AP) rapportör. De märkta axoner visualiseras med NBT / BCIP-histokemi. Brn3a är ekvivalent kallad Pou4f1. C, D) Tail skin färgades med Oil Red O för att visualisera talgkörtlar frånWT (vänster) och FZ6 - / - (höger) möss vid P21. Den FZ6 - / - strukturer är oorganiserad. P, proximal; . D, distal E, F) Dorsal fot hud från WT (vänster) och FZ6 - / - (höger) möss som bär Krt17-GFP. Huden skördades vid P21 och färgades med Oil Red O. FZ6 - / - hud har ett hår krans i dess centrum. P, proximal; . D, distal G, H) Dorsal hud från en WT mus vid P21 visar hårsäckar (visualiseras med en Krt17-GFP transgenen och anti-GFP immunfärgning, panel G) och arrector pili muskler [visualiseras med anti-glattmuskelaktin (SMA ) immunfärgning; panel H]. Djup inom den konfokala Z-stack bilden är färgkodade. A, anterior; P, bakre. IL) En Merkel cell kluster (visualiseras med cytokeratin8 immunfärgning eller AM11-43 färgämne upptag) och dess centrala hårsäcken (visualiseras i paneler K och L med Krt17-GFP). Bilder erhölls från P1 dorsala huden från de indikerade genotyper. Den FZ6 - / - Merkel cell kluster bildar en sluten cirkel, medan WT Merkel cellklump är öppen mot den främre. A, anterior; P, posterior. Skala barer: A och B, 300 nm; C och D, 500 ^ m; E och F, 500 ^ m; G och H, 200 ^ m; IL, 50 | im. (Paneler A och B återges från eLife och Proc. Natl Acad Sci. USA.., Med tillstånd 4,10) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Hår och hårsäckar i rygghuden på P1 och P7 visualiseras med melanin pigmentering. A, B) P1 hud från WT och FZ6 - / -. möss C, D) P7 hud från Fz6 - / - möss. Skala barer: A och B, 500 nm; C och D, 1 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behärskning av dissektion metoder som beskrivs ovan kräver bara tålamod, en stadig hand, och några bra dissektion verktyg. Rygghuden dissektion är relativt lätt, men de svans och fötter hud dissektioner - särskilt vid tidig postnatal åldrar - är mer utmanande. Vid tidig prenatal åldrar (t.ex. före E15), är svårt att ta bort utan att riva sönder det i huden. Bekvämt, för många studier av tillväxt och mönstring av hud strukturer i möss, de händelser av intresse inträffar postnatalt, som sett till exempel i studier av tillväxten av arrector pili muskler 19.
Imaging djupt in i huden på ett platt fäste konfiguration är en utmaning eftersom huden är ett relativt brytande vävnad. Denna utmaning blir större eftersom huden mognar på grund av differentiering och ökad tjocklek på de ingående lagren. En partiell lösning på detta problem är att separera dermis och epidermis och analysera EpiDermär som en separat struktur ("epidermal hela monteringar"). Detta tillvägagångssätt är användbart för att visualisera hårsäckar och tillhörande strukturer, speciellt för mus svans hud. Emellertid erhålla högkvalitativa epidermala hela monteringar från mus dorsala huden är svårt, förmodligen på grund av (1) den höga densiteten av hårsäckar som sträcker sig djupt in i dermis och (2) den tunna de interfollikulära epidermis 13.
Enligt vår erfarenhet är BBBA behandling en mycket effektiv metod för att göra huden optiskt transparent samtidigt immunofluorescerande signaler utan att behöva separera epidermala och dermala skikt. Bensyl-bensoat har använts för att rensa vävnader i årtionden 20 och det är allmänt används för att rensa groda och fiskembryon. Emellertid har BBBA den nackdelen att det denaturerar GFP och andra fluorescerande proteiner, löser det Oil Red O, och det kan förorena utrustning (till exempel, mikroskop). Det skulle vara av intrest för att systematiskt jämföra BBBA behandling av hud med andra förtydligande metoder såsom SeeDB 21, ClearT 22, Skala 23, 3DISCO 24, och klarheten 25, av vilka några är kompatibla med fluorescerande proteiner. Om BBBA behandlade prover ska avbildas med en dissekera mikroskop, en vanlig ljus / fluorescerande mikroskop, eller en konfokalmikroskop, ska proverna placeras i en glasskål eller mellan två stora glasskivor för att minimera BBBA föroreningar.
Vi har inte diskuterat dataanalys i detalj, eftersom det är mer idiosynkratiska den biologiska frågan under utredning. Men som noterades i inledningen, har förekomsten av många nästan identiska strukturer såsom hårsäckar, Merkel cell kluster, och nervändar, och fullständighet med vilken dessa strukturer kan avbildas i platta fästen en möjlighet att mäta strukturella eller morfologiska parametrar i en statistiskt noggrann manner, som sett till exempel i nya studier av kutana sensoriska axon morfologier 10 och hårsäckar och follikelstimulerande associerade strukturer i vildtyp och FZ6 muterade möss 4,8. Med utvecklingen av mer sofistikerade bildanalys verktyg kan det vara möjligt att automatisera eller halv automatisera en del av de analyser som för närvarande utförs manuellt och därigenom underlätta mer omfattande användning av hud platt montera avbildning som en metod för undersökning av de principer som ligger multicellulär organisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
