Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Samtidige Langsiktige Recordings på To Neuronal Processing Stages i oppfører Honeybees

doi: 10.3791/51750 Published: July 21, 2014

Summary

Samtidige ekstracellulære langsiktige opptak fra to ulike hjerne neuropiles eller to forskjellige anatomiske traktater ble etablert i honningbier. Disse opptakene tillate etterforskningen av timelige aspekter av nevronale behandling på tvers av ulike hjerneområder på enkelt nervecelle samt på ensemble nivå i en oppfører dyret.

Abstract

I begge pattedyr og insekter neuronal informasjon bearbeides i forskjellige høyere og lavere orden hjerne sentre. Disse sentrene er koblet via konvergent og avvikende anatomiske tilkoblinger inkludert fôr fram og tilbakemeldinger ledningsnett. Videre blir informasjonen fra den samme opprinnelsen delvis sendt via parallelle veier til forskjellige, og noen ganger i de samme hjerneområdene. For å forstå de evolusjonære fordeler så vel som de beregnings fordelene ved disse ledninger strategier og spesielt deres tidsmessige avhengigheter på hverandre, er det nødvendig å ha samtidig tilgang til enkelt nevroner i forskjellige trakter eller neuropiles i det samme preparatet med høy tidsoppløsning. Her konsentrerer vi oss om honningbier ved å demonstrere en unik ekstracellulære langsiktig tilgang til å spille inn flere enhet aktivitet ved to påfølgende neuropiles 1, antennal lapp (AL), den første lukteprosesstrinn og sjampinjong kroppen (MB), en høyere orden integrering sentrum involved i læring og hukommelse formasjon, eller to parallelle nevrale traktater to forbinder AL med MB. Sistnevnte ble valgt som et eksempel og vil bli beskrevet i sin helhet. I bære video konstruksjonen og permanent innsetting av fleksible flerkanaltrådelektroder er demonstrert. Parvise differensialforsterkning av de mikrotrådelektrode kanaler drastisk reduserer støyen og verifiserer at kilden til signalet er nært knyttet til posisjonen til elektrodespissen. Den mekaniske fleksibiliteten av de brukte trådelektroder gir stabile invasive langtidsopptak i løpet av mange timer til dager, noe som er en klar fordel sammenlignet med konvensjonelle ekstra-og intracellulære in vivo opptaksteknikker.

Introduction

Honeybees så vel som de fleste andre insekter sterkt avhengige av luktesans. Blant annet de bruker lukte stikkord for orientering, parring, kommunikasjon med conspecifics, og beite. Deres godt utdypet luktsystemet bidrar til et rikt repertoar av lærings atferd knyttet til blomsterluktstimuli. Disse atferd kan lett studert under kontrollerte laboratorieforhold (for gjennomgang se 3 - 5). Deres "mini hjerner" (cp. 6) med sine relativt lite antall nerveceller gjør honningbie en velegnet modellorganisme for å studere lukte koding og læring under overvåking av nevral aktivitet.

Den luktsystemet hos insekter så vel som i pattedyr viser analogt organisasjon i stor grad (for gjennomgang se 7,8). I honningbier ca 80000 reseptor nevroner 9 ligger i sensillae langs antennene 10,11 sette miljø lukt stimulans til en neuronal signal. Axoner fra olfactory reseptor neuroner innerverer antennal lobe (AL), som har en glomerulær organisasjon kan sammenlignes med den hos virveldyr luktelappen. Den AL består av ca 164 glomeruli koblet sammen med hverandre etter ca 4000 lokale interneurons (LN) (for gjennomgang se 12). Spesielt i honningbien har det blitt vist nylig at LNS gir flekkvis lateral tilkobling og at ulike subpopulasjoner besitter elementær og configural lukte koding egenskaper 13,14. Den AL ble vist å være inndelt i en ventral og en dorsal hemi lobe som gir opphav til den mediale og laterale antennal lobe kanalen (m-, og l-ALT, tidligere betegnet m-og l-APT for medial-lateral og antennal lobe protocerebral proselyttering 15 - 17). Her en ny kanalen terminologi innført av en nylig innsats for en enhetlig nomenklatur av insekt hjernen vil bli brukt 18. Begge alts (l-og m-ALT) kombinere enten 410 (l-ALAT) eller 510 (m-ALT) uniglomerular projeDette skjer nevroner (PN), henholdsvis 15,16,19. PNS av begge traktater har nylig vist seg å kode lukt i parallell 2 (for gjennomgang se 17,20), og begge traktater postsynaptisk danne avvikende forbindelser med Kenyon Cells (KC), sopp kroppen (MB) viktigste nevroner. Hver MB inneholder ca 172 000 KCs 21-23. MBS er kjent for å være involvert i stimulans integrering, læring og hukommelse formasjon. De AXO dendritter av KCs danne peduncle (sopp er stammen), som har to hovedutganger regioner: den Vertica eller alpha-lapp og den horisontale eller beta-lapp 22,24. Utgangen av MB konvergerer mot bare ca 400 ytre nevroner (EN) 24. ENS er ansvarlig for olfactory informasjonsbehandling for det meste innerverer den ventrale del av den vertikale lobe 22.. Nylig har det blitt vist at ENS registrert på dette området kode lukt belønning foreningen 25.

Temporal somutsikter i luktesystemet av insekter samt virveldyr har blitt en viktig og vesentlig aspekt som en potensiell koding prinsipp 26 - 29. For å være i stand til å samtidig ta opp flere nevroner fra ulike områder med høy tidsoppløsning, etablerte vi doble multi enhet opptaksteknikker ved hjelp av tilpassede multikanals trådelektroder introdusert til ulike målgrupper regioner i bee luktesystem. Denne tilnærmingen gjør oss i stand til å analysere og sammenligne tidsmessig behandling i honningbien luktsystemet på nivået av enkeltnerveceller og populasjoner av nerveceller enten mellom parallelle lukte trasé, dual lukte pathway to eller mellom ulike påfølgende neuropils en. Nylig med en lignende eksperimentell tilnærming i locust luktsystemet 30 ved hjelp av en annen konfigurasjon av elektroder var i stand til å analysere tid og rom kodemekanisme for bakgrunn-lukt invariant gjenkjennelse 31.. Thoss, de etablerte dual opptak aktiverer samle romlig informasjon om samtidige nevronale aktivitetsprofiler.

Sammenlignet med den bredere romlig sampling hentet fra kalsium bildebehandling denne metoden gjør opptak fra to stedene bare. Imidlertid er fordelen i forhold til kalsiumavbildningsteknikker er den høye time presisjon på aksjonspotensial-opptak, som ikke kan leveres av enten konvensjonell CCD eller to-foton avbildning anskaffelse. De ekstracellulære elektroder som er beskrevet her er permanent implantert og festet i forhold til hjernen og hodekapsel unngå elektrodedrift. Dette er en klar fordel i forhold til bruken av skarpe intracellulære elektroder. En annen fordel i forhold til intracellulære opptak og kalsium bildebehandling er den utvidede nevrale observasjonstid alt fra mange timer opp til dager. Dette er en viktig forutsetning for å undersøke nevrale korrelater for læring og hukommelse formasjon. Ytterligere fordeler av multienhets innspillinger er videre beskrevet i diskusjonskapittelet.

I denne metodeoversikten produksjon prosedyren for tilpasset design trådelektroder vil bli vist, tilpasset fra 32,33 og egnet for langsiktig multi unit opptak i honningbien hjernen. I tillegg er et eksempel på hvordan slike elektroder er fast implantert på to forskjellige steder innenfor opptaks honningbie olfaktoriske system for å registrere samtidig, l-og m-ALT over lange tidsperioder for å tillate mange stimuleringsregimer er vist to. For verifisering av de mottatte posisjoner et eksempel og protokoll for farging og etter opptak visualisering av opptakssider er gitt.

Protocol

En. Elektrode Building (Figur 1)

  1. Produksjon av en elektrode adapter som passer elektroden grensesnittet styret i kommersielle flerkanals forsterker systemer 1,2,25.
    1. Bruk en liten pleksiglass plate limt til en 18-pinners kontakt basen.
    2. Koble basen med tre korte stykker av isolert ledning til tre separate lödlänkar skrudd på pleksiglass plate (figur 1 A1-A3).
    3. Sett et spor inn i pleksiglassplate hvor en glass kapillær lett kan bevege seg og bli holdt på plass av en skrue (fig. 1 B1).
    4. Forlenge glass kapillær om 5 mm ved hjelp av en minutien pin.
    5. Fest mikroelektrodetråder langs minutien pin og glass capillary å garantere stabilisering og støtte.
  2. Multi-kanals micro wire produksjon (adoptert fra Ryuichy Okada 32,33)
    1. Span 3 mikro ledninger (polyuretan belagt kobbertråd, 15mikrometer diameter) på en slik måte at de er plassert ved siden av hverandre (figur 1 B2).
    2. Bruk av en 12 V lodding nål til å spre en tynn film av lavtsmeltende voks tann (50 ° C) delvis langs ledningene for å lime dem sammen, (elektrodespissen) (figur 1 B3). La noen få centimeter i limingen (elektrode end) som denne delen vil bli brukt senere for å koble mikro ledninger med elektrodeadapteren.
  3. Koble multikanal mikro ledning til elektroden adapter
    1. Fjern glass capillary fra holderen og fest den med minutien pin til elektrodetuppen. Bringe den til en stilling parallell med mikro-elektrode (figur 1 B3).
    2. Lim elektroden spissen til minutien pin hjelp lavt smelte dental voks og kutte mikro elektrode på spissen, utstående 2-3 cm fra minutien pin og ved elektroden slutten (små piler Figur 1 B3).
    3. Slip kapillær slforsiktig skrå tilbake inn i elektrode adapter. Bruk skruen til å fikse det (Figur 1 B4).
    4. Lodd de løse ender av de tre ledningene til loddeørene ved hjelp av en loddepistol med en temperatur på rundt 360 ° C for å sikre smelting av isolasjonen (figur 1 B4). Etter lodding, sikre at det er tilstrekkelig elektrisk kontakt (~ 300 kOhm).
    5. Monter en av elektrodene (master) til elektroden grensesnittet styret i heads og fikse den andre multi-kanal elektrode (slave) på en egen adapter. Forbind-kanaler for slave til master-elektroden (figur 1 C1). I tillegg lodde referanse, så vel som muskel elektroder til hovedelektrodebasen (figur 1 C2).

2. Bee Forberedelse (figur 2)

I disse eksperimentene er beskrevet, honningbie (Apis mellifera), som er en virvelløse dyrog derfor ikke krever spesifikke etiske tillatelser til bruk, blir brukt.

  1. Catch honningbie nitter (A. mellifera) ved bikuben inngangen i morgen som vist av andre 34,35.
  2. Chill biene på knust is til immobilisering (5 til 10 minutter) og rette en i en standard pleksiglass holder eller metallrøret på en slik måte at hodet er eksponert (figur 2 A). For å minimalisere hodebevegelser bruke lav-smeltende voks tann (~ 50 ° C) og feste hode nøye til holderen rundt basis av de sammensatte øynene og halsen.
  3. Bruk lavt smeltevoks til fiksere scapi av antennene på hodet kapsel (figur 2 B) uten å berøre flagellen. Flagellen av antennen må være spiss fremover. Kontroller at bee kan fritt flytte sine snabel.
  4. Barber hodet kapselen å sørge for en uforstyrret visning og tilgang til toppen av hodet.
  5. Strøm bee med en 30% sukrose løsning inntil saturatifor å sikre en tilstrekkelig fukting av hjernevev og god levedyktighet av dyret (figur 2 C).
  6. Gjør forsiktig snitt vertikalt langs grensene til de sammensatte øyne og horisontalt over antennal baser samt under Ocelli og fjern løsnet stykke skjellaget (Figur 2 D).
  7. Nøye sette av hypopharyngeal kjertler og fjerne luftrøret for å sikre et klart syn og tilgang til hjernen før elektroden innsetting (Tall 2E, 2F).

Tre. Elektrode Insertion

I eksemplet tilfellet vist i figur 2, er en elektrode plassert med sikte på å l-ALT, den andre tar sikte på m-ALT 2. Ved hjelp av spesielle landemerker, øvrige satsingsområdene er mulig også, for eksempel Al-og MB utgang regioner en.

  1. Plasser elektrodene hjelp micromanipulators på region av interesse ( 3A). For å målrette m-ALT sted elektroden mellom AL og medialt fra den vertikale flik av MB. Sørg innstikkstedet er over forgreningspunktet av de mediolateral ALT PNS. Stikker elektroden inn i hjernen med en dybde på omtrent 180 um (figur 2E). For l-ALT PN opptak elektroden under den laterale protocerebrum (LH) i midten av en tenkt linje mellom den laterale side av vertikal flik og på midten av AL. Sett i elektroden med en dybde på omtrent 300 um (figur 2E)
  2. Sett referansen (sølv wire, omtrent 25 mikrometer i diameter) i ipsilaterale sammensatt øye gjennom et lite snitt i skjellaget. Sett en annen sølv wire inn i muskelen projeksjon regionen under den laterale Ocelli. MERK: Hvis det er nødvendig for å lære oppførsel av bee kan overvåkes med høy tidsmessig presisjon ved å registrere muskelen M17, som er involvert in snabel forlengelse respons (PER) av bee 36 som beskrevet i 25 år.
  3. For å solid feste elektrodene i hjernen og hodet kapsel, dekke hele rommet over hjernen med to-komponent silikon (figur 2H), noe som vil hindre hjernen fra å tørke ut. MERK: opptakene kan vare i timer opp til dager, og biene kan for eksempel bli registrert i løpet av et klassisk betinging prosedyre (figur 2H) eller stimulert med et stort panel av forskjellige lukter.

4. Datainnsamling og forhåndsbehandling

  1. Bruk riktig oppkjøp programvare som oppfyller følgende krav: samplingsfrekvens på min 25 kHz; 1,25 analog eller digital to tverr differensiering mellom elektrode kanaler; Bandet pass filter fra 300 Hz til 8000 Hz for å trekke pigg hendelser.
  2. Bruk tilgjengelig pigg sortering programvare for å trekke ut én enhet aktivitet, for eksempel templspiste matchende teknikker som inngår i Spike2 programvare (figur 3).
  3. For ytterligere analyse bruke tidsangivelser for de utpakkede enheter for å beregne enkelt enhet i gjennomsnitt lukt svar (figur 4), eller å beregne befolknings vektorer for Principal Component Analysis (PCA) (figur 5) ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare. For ytterligere å analysere enkelt enhet og befolkningen respons latency kan du sammenligne nyere publikasjoner 1,2,25.

5. Visualisering av Relativ elektrode Position (figur 4)

  1. Dypp elektroder spissene ned i en oppløsning av enten 5% Alexa hydrazid 568 eller 5% Alexa hydrazid 488 som er oppløst i 0,5 M kaliumklorid-løsning forut for opptakseksperimenter.
  2. Fjern elektrodene og dekker silisium nøye etter forsøkene, skyll hjernen med bee Ringer løsning, fjerne kjertler og luftrøret og sett små krystaller av tetramethylrhodamin dekstran eller sette inn en 5% løsning løst i 1,0 M kalium acetat inn i AL å merke alts anterogradely. Utfør følgende trinn i mørket.
  3. Tillat fargestoffet tas opp og transporteres med projeksjon nevroner sammen sine aksonale traktater (30-45 min) (Figur 4A), før du vasker hjernen med bee Ringer løsning tre ganger for en annen 30-45 min.
  4. Chill bee på is inntil immobilisering og forsiktig fjerne hjernen fra hodet kapsel. Fiksere hjernen ved å skylle den i en 0,1 M PBS-løsning inneholdende 4% formaldehyd og holde den natten over ved 4 ° C.
  5. Vent i minst 12 timer før vasking hjernen to ganger i 0,1 M PBS (10 min hver).
  6. Vask hjernen 3 x i 20 min i 0.2% Triton X-100 fortynnet i 0,1 M PBS før dehydratisering den i en stigende alkoholserie (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3 x 100% etanol, 20 minst hvert trinn).
  7. Bygg inn dehydrert hjernen i Methylsalicylate på et objektglass og seal det med en cover lysbilde.
  8. Bruk et konfokal laser scanning mikroskop og skanne hjernen som optiske seksjoner hver 2-5 mikrometer ved hjelp av en Harmonic Compound Plan Apochromat objektiv (10X 0,4 NA nedsenking). Eksitere vev ved hjelp av 568 nm bølgelengde for tetramethylrhodamin dekstran og en bølgelengde på 488 nm for elektrodeposisjon.
  9. Rekonstruere farget strukturer i hjernen og elektroder stiene fra de bildestakker i 3D med rekonstruksjon programvare (f.eks. AMIRA eller Fiji) (figur 4).

Representative Results

"Den nåværende protokollen tillater samtidige opptak på to forskjellige prosesstrinn innenfor enkelte honningbier og i tillegg gjør det mulig å teste underliggende mekanismene for læring og hukommelse via f.eks., PER condition innen behersket honningbier." Dette er en forutsetning for analyse av temporale aspekter av neuronal behandling. Metoden er lett å tilpasse for ulike vitenskapelige tilnærminger til å løse den nevronale nettverk av bienes luktesans. For eksempel er denne metoden benyttes (i) å analysere tidsmessig behandling av PNS innen den doble olfactory vei av honningbie, l-og m-ALT PNS (figur 5). I figur 5A ett eksempel på en l-ALT PN samtidig registreres med en PN av m-ALT er gitt som ti prøve gjennomsnitt og illustrerer deres respons styrke og latens med hensyn til fem forskjellige luktkonsentrasjon som fargekodet varmeflekk. I et gjennomsnitt på sju bier med 11 l-og 13 mALT PNS (figurene 5B, 5C) illustrerer at både svar styrke så vel som respons ventetid, i en viss grad, reflekterer odorant konsentrasjon. Dermed er till i dette eksempelet øke sin respons styrke mens med økende odorant konsentrasjon deres respons latency avvist (figur 5B, 5C). Dette resultatet er ganske begrenset og gjelder kun for den analyserte odorant, men er likevel i tråd med nyere beregningsmodeller av AL 37. Enten lukt konsentrasjon koding i biens AL ligger til grunn for ikke-lineære beregninger eller ligger under andre koding eiendommer fortsatt må analyseres i fremtiden. Videre kan metoden brukes (ii) å sammenligne tidsmessige aspekter i populasjonen aktivitet ved to etterfølgende bearbeidelsestrinn, Al-og MB-produksjon (figur 6). Prinsipal komponent analyse (PCA) illustrerer at lukt beregning er forlenget og overleve hele lukt presentasjon på PN nivå mens i ENs bare lukt og på sett var representert i populasjonen aktivitet (figur 6). Dermed EN befolkning nådde sin maksimale aktivitet allerede på et tidspunkt når PN aktiviteten er fortsatt utvikling (cp. Movie 1).

Figur 1
.. Figur 1 Industri tre-kanals mikrotrådelektroder A1) avslutninger av tre ledninger er loddet til en IC-pinners kontakt i posisjoner 11, 13 og 16 A2) Fire lödöron skrues fast på en pleksiglass plast bunnplate.; en minutien pinne settes inn i spissen av et glasskapillær som så blir festet til plastplaten. A3) Plastplaten er festet på toppen av en IC-polet kontakt, og den frie ende av hver ledning er loddet til en av de øverste lodding kabelsko. <sterke> B1) Å utstyre elektrodeholderen med de fine kobbertråder, har kapillær skal tas ut igjen. B2) Bunnen av holderen er deretter festet i en spesiallaget innrette enheten. Tre kopper mikro ledninger er justert langs sporet og festes med teip i hver ende B3) De parallelle mikro ledninger er limt sammen med dental voks og kapillær er satt tilbake på plass (lange piler).; de limte mikro ledninger er deretter festet til kapillær med tann voks og dens ender er avskåret (korte piler). B4) De tre løse ender av kobberledninger er loddet til de tre loddeører således bringe dem i elektrisk kontakt med den IC-pin-kontakt. C1) To ferdigmonterte elektroder kan kobles til hverandre for bruk med en enkelt heads. C2) For dette formål pinnene i en elektrode (venstre, slave) er forbundet via isolerte ledninger til den andre elektrode (høyre, master), som er koblet til hovedtrinn; den heads koblet elektroden kan også samle innspill fra en muskel (M17) og referanseelektrode (Ref).

Fig. 2
Figur 2. Fremstilling og permanent elektrode innsetting i bie hjernen. A) En bie settes inn i en pleksiglass holderen etter immobilisering på is. Antenner med Flagellum (FL) og Scapus (SC) er indikert. B) Hodet og antenner er løst ved hjelp av dental voks. C) Hodet kapsel er barbert og bee mates med sukkervann. D) Hodet kapsel åpnes. E) etter fjerning kjertler og trachea fra toppen av hjernen, kan de forskjellige neuropiles og større landemerker lett skilles. De baner av Alts angis sammen medet merke, hvor elektrodene er satt inn. (MB: Mushroom body, AL: antennal lapp, OL: Optisk lapp, α: Alpha lapp eller vertikal lapp, ALT: antennal lobe kanalen, E1: elektrode innsetting side for m-ALAT innspillinger, E2: elektrode innsetting side for l-ALT opptak). F) Referanse (Ref) og muskel elektroder (M17) er satt inn i hodet kapselen gjennom små hull i hårstråene eller forbindelsen øyet. G) De trådelektroder er satt inn i hjernen på de riktige steder. H) Etter feste elektrodene på plass ved hjelp av to-komponent silisium, biene fortsatt viser PER og kan være betinget (f.eks., ved hjelp av sukkervann).

Figur 3
Figur 3. Ekstracellulær opptak på to nevrale traktater og enkelt enhet utvinning (pigg sortering). A B) Samtidige opptak fra l-og m-ALT PNS (grønn og lilla spor) viser eksitatoriske svar på begge traktater til en 500 msek lukt stimulering av honning i vann løsning med en konsentrasjon 1:100 ved 33 ° C. Hver plottet linje representerer de differensierte kanaler som etiketten fargekodet fra elektrode lödlänkar i A. Bar:. 50 μV C) Etter pigg sortering prosedyrer enkeltaksjonspotensialer er sortert og fargekodet. Overlapping av de sorterte enheter illustrerer separeringen av bølgeformene. D) Spike intervall histogram viser separasjonskvaliteten av de sorterte enheter som bevis for tilstrekkelig pigg sortering. Merk at det er ingen pigg innenfor enhetens refraktærperiode. E) To visninger (E1, E2) fraen 3D gruppering av den sorterte enhet med prinsipalkomponentanalyse som indikerer avstanden til de sorterte enhetene til hverandre. Sirkler indikerer 2,5 fold Mahalanobis avstand som ligner på SD i verdensrommet, og indikerer en betydelig differensiering av klyngene i den viktigste komponenten plass F) Fargekodede enheter skildrer aksjonspotensialer synlige i en forstørrelse på tre kanaler fra én kanalen opptak. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Post-innspilling visualisering og 3D-rekonstruksjon av opptak. A) Projection visning av orto-skiver langs z-aksen med maksimal intensitet justering av en anteroog retrograd tilbakefylling av de uniglomerular projeksjon nevroner utstikk fra AL til MB og LH. Den intracellulære tracer Microruby (tetramethylrhodamin dekstran) ble satt inn i AL etter opptakseksperimenter. Stained glomeruli inne i AL bevis riktig PN farging. B) Projection visning av orto skiver langs z-aksen med maksimal intensitet justering fra en farging av de to elektroder med Alexa hydrazid 488 indikerer elektrodeplasseringen for m-ALAT (E1, pil ) og l-ALAT (E2, pil). Den tracer Alexa Hydrazid 488 vandrer til elektroden omkringliggende vev og flekker elektroden innstikkstedet. Merk, den fremtredende flekker i AL er en overfladisk artefakt. C) 3D rekonstruksjoner av de fargede målcellene (PNS) og elektrodeinnstikkstedet fra A, B (høyre side) sammen med en skjematisk oversikt over honningbie luktsystemet (venstre side) med angivelse av l-m-og ALAT-baner. Obs, bare uniglomerular PN traktene vises. AN: antennal nerve, AL: antennal lapp, LH: lateral horn, MB: sopp kroppen, E1, E2: elektrodeinnstikk, m-ALT: medial antennal lobe kanalen, l-ALT: lateral antennal lobe-tarmkanalen, c: Caudal, r: rostral, m: medial, l:. lateral Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Eksempel luktkonsentrasjon koding innenfor den doble olfactory pathway. A) Varme plott illustrerer responsen av en enkelt l-ALT (grønn) og enkelt m-ALT PN (purpur) anskaffet samtidig fra en enkelt honningbie som reaksjon på odorant hexanal ved økende luktkonsentrasjon (fra 1: 10 til 1:100 -6). Hver linje er et gjennomsnitt av ti prøve Stimbefolkningens. Forbrenningsintensiteten er vist som relativ intensitetsendring som er avfyringshastighet i forhold til det subtraheres spontan aktivitet. B) Folke respons ventetid på 11 l, og 13 m-ALT PNS fra 7 innspilte bier. I hvert bee PNS fra begge traktater ble spilt inn samtidig. Responsen befolkningen ventetid viser en avtagende latency med økende lukt konsentrasjon i till fra begge traktater. Lukten respons utbruddet på antennene på 99 ms ble registrert via electroantennograms og trekkes fra PN responsventetider. Legg merke til at på de laveste konsentrasjonene svarene er for svake for latency målinger, og derfor ble ekskludert. C) Befolknings respons avfyring sats fra samme PNS som i B. Med økende lukt konsentrasjon responsstyrken øker. Den l-ALT viser en sterkere respons styrke. I B, er C gjennomsnitt og SD gitt.

Figur 6 Figur 6. Sammenligning aktivitet befolkning på to påfølgende behandlingen etapper langs honningbie lukte pathway. Data ble registrert i 20 dyr som ble stimulert med en-heksanol og 2-octanone. A) Hver linje representerer den falske fargekodet gjennomsnittlig avfyring hastighet på en projeksjon nevron (PN) beregnet over 10 lukt repetisjoner av en-heksanol. Lukt presentasjon starter på tid 0 og varte i tre sekunder. B) viser det samme som i A), men for sopp kroppens ytre nevroner (EN). Matrisen vist i A) kan ses på som en PN befolkning vektor under lukt stimulering med 1-heksanol. Vi har beregnet den samme type populasjon vektor under lukt stimulering med 2-octanone og brukes begge vektorer i en hovedkomponentanalyse (PCA) å holde tidsdimensjonen. C) De første tre hovedkomponenter (PC1, 2 og 3) varplottes mot hverandre for å illustrere den lukt separasjon i PN-ensemble aktivitet på antennal lobe utgang. Tiden før lukt utbruddet er markert med svart. Aktivitet i løpet av tre sekunder av stimulering med 1-heksanol er vist i blått. Aktiviteten under stimulering med 2-oktanol er vist i rødt. Videre viser vi 1,5 sekunder (legg) av aktivitet etter lukt av settet av 1-heksanol (lys blå) og 2-octanonen (rosa). Merk at ved PN ensemble nivå, både lukt fremkaller svært forskjellige baner bosette seg i et "fast punkt" som outlasts hele lukt stimulering periode. Først etter lukt oppveie baner flytte tilbake til baseline aktivitet uten lukt stimulering. D) Den samme analysen ble gjort på EN ensemble nivå som representerer aktiviteten på sopp kroppen utgang. Sammenlignet med PN aktivitet lukt fremkalle en mindre distinkt bane. Videre et "fast punkt" ikke er observerbare. Den noe lukt induserte baner intermingle med baseline aktivitet selv om lukt er fortsatt til stede. Bare lukt offset fremkalt en ekstra bane.

. Movie 1 Tid løst evaluering av en lukt indusert banen etter principal komponent analyse av en PN-befolkningen vektor (til venstre) og en EN befolkning vektor. (høyre;. cp Figur 6) De øvre delene omfatter de første tre hovedkomponenter (PC1, 2 og 3) er plottet mot hverandre. De nedre paneler illustrerer evaluering av PC1, 2 og 3 over tid. Lukt stimulering er preget av det grå feltet. Alle panelene ble synkronisert. Merk at EN befolkningen aktiviteten starter litt før PN befolkningen aktivitet, kan et fenomen som synes å være contraintuitive men forklares ved tilkobling og egenskapene til de involverte lagene, noe som er diskutert tidligere en.

Discussion

Denne artikkelen viser fremstilling og bruk av spesialdesignet multikanalmikrotrådelektroder. De beskrevne elektroder er egnet for opptak både enkelt enhet og befolkningen aktivitet som er spesielt nyttig for latency målinger og andre timelige respons egenskapene til ulike nerveceller og ulike neuropils innenfor et enkelt eksemplar (for detaljer se 1,2,25). I tillegg har vi vist hvordan du permanent implementere mikrotrådelektroder å tillate stabile langsiktige opptak i oppfører honningbier som varer i timer opp til dager.

Ekstracellulære multi-unit opptakene ble et gunstig verktøy for å oppnå høy tidsoppløsning kombinert med romlig informasjon. I vårt tilfelle, disse er enten parallelle nevrale traktater to eller to forskjellige neuropils en. Flere neuroner kan bli registrert og analysert på enkelt neuron nivået i parallell og ved høy tidsmessig oppløsning. Multi-unit rekordninger ble først brukt i pattedyr 38 og senere også i insekter 39-41. Betydelig fremgang ble oppnådd med utvikling og forbedring av ekstracellulære flerkanals opptak teknikker 42,43. Dette, for eksempel, omfatter utvikling av nye elektroder 44 eller romanen spike sorterings-og clustering algoritmer 45. Generelle metoder for ekstracellulære multi-enhets opptak teknikker er godt beskrevet 46 - 48. De selv bygget elektrodene som vises i denne videoen i tillegg kan tilpasses ved å legge til flere microwires pr elektrode eller mikro ledninger kan vris til å få målbare konstant avstand mellom spissene. Begge fremgangsmåter vil imidlertid føre til avtagende fleksibilitet og øke tykkelsen av elektroden.

Sammenlignet med silisium sonder som vanligvis brukes for ekstracellulære opptak i mye større insekter som hauken møll, gresshoppe og kakerlakk 40,49 - 51 de beskrevne mikrotrådelektroder er mindre fleksibelt og kan tåle lett med potensielle hjerne bevegelser, og dermed kan bli pålitelig brukes i små sosiale insekter som bier og maur som viser en mye bredere atferdsmessige repertoar. De silikon-sonder har skarpe skaftlignende strukturer skjære axoner og neural vev langs deres innføringskanalen, mens de beskrevne mikro ledninger er runde, fleksibel og mindre, og er derfor mindre skadelige for omgivende vev, som er en klar fordel dersom målet er å studere lang -begrepet plastisitet i en intakt og oppfører dyret. En annen fordel med mikrotrådelektroder er deres lave produksjonskostnader og enkel håndtering. I stedet for å nøye rengjøring en dyr silikon sonde elektrodetråder er nyklipt før hjernen innsetting og derfor mangel problemer med lunger. Videre er det mulig å bruke mer enn ett mikrotrådelektroder i samme preparat, enten satt inn i forskjellige neuropiles 1 or traktene to som vi viser her. Denne tilnærmingen er spesielt gunstig å analysere og sammenligne timelige aspekter som respons ventetider og samhandling på ulike nevrale prosesseringsnivåer.

Vi er klar over det faktum at en ekstracellulær innspilte signal ikke reflekterer enkeltcelle-aktivitet per se. Det er alltid en forbindelse av spenningsaktiviteten rundt elektrodespissen. For å lokalisere kilden for signalet differansen av to nabomikrotråd kanaler innenfor en elektrode er alltid beregnet. Således kilde for pigg-signaler som benyttes til å trekke ut én enhet aktivitet var alltid meget nær den ene eller den andre elektroden kanalen resulterer i lett skjelnes pigg bølgeformer. Signaler fra lenger borte, slik som muskel-aktivitet eller aktivitet av nabo neuropils, når begge elektrodene samtidig fremkaller sammenlignbare former og amplituder og vil bli forkastet av denne fremgangsmåten. Bruke malen matchingsteknikk for Spike2,Vi er svært sikre å oppnå enkelt enhet aktivitet, som ikke er den samme, men svært nær én nervecelle-aktivitet. Men, kunne spørsmålet om spike sortering unngås ved hjelp av intracellulære opptak teknikker.

Encellete innspillinger med enten skarpe elektroder eller patch pipetter tillate inngående kunnskap om fysiologiske egenskapene til en enkelt nervecelle. Men på grunn av den lille størrelsen på insekt nevroner og deres neurites (f.eks., Mindre enn 1 mikrometer for honningbie PNS 52) bare kortsiktige innspillinger er håndterbare. Videre kan intracellulært opptak være invasiv og kan skade cellen som er muligens en annen grunn for de timelige begrensninger. In vivo intracellulære opptak i insekter sjelden overleve én time. En tidsvindu som var tilstrekkelig for det banebrytende arbeidet til Martin Hammer 53 som spilte intracellulær fra en enkelt identifisert nevron, ventral uparede maxilar nevron nr. 1 (VUMmx1). Han kunne link dens aktivitet direkte til belønning pathway. Juliane Mauelshagen 54 registrerte intracellulært aktiviteten til en identifisert sopp kroppen ytre nervecellen, den pedunculus ytre nevron nr. 1 (PE1) under klassisk betinging. Det samme nevron var i fokus for Menzel og Manz 55 da de fant LTP etter elektrisk stimulering av Kenyon Cells. Men Okada og kolleger 56 kunne bruke intracellulært godt karakterisert spiking mønster (doble og triple pigger) for identifisering av PE1 under ekstracellulære opptak. Tross alt en kombinasjon av begge metodene, kan intracellulære opptak fra identifiserte nevroner og ekstracellulære langsiktige opptak være et kraftig verktøy for fremtidige undersøkelser.

Men ved å bruke skarpe elektroder for å spille inn flere celler (enheter) samtidig på forskjellige nivåer gjennom mange timer opp til dager til å analysere sine time respons-forhold og / eller plast endringer ier nesten umulig.

Med den første kalsium bildebehandling tilnærminger i honningbien 57,58 hjelp kalsiumfølsomme fargestoffer analyse av romlige mønstre av lukt svar var tilgjengelig 59-62. Men i mange tilfeller kalsiumfølsomme fargestoffer har til å bli innført i hjernevevet via invasive manipulasjoner som igjen begrenser bie levetid og iboende egenskaper av de analyserte celler. Dette problemet er overvunnet i andre modellorganismer som banan bruker genetisk innført kalsium sensorer 63,64. Men generelt kan kalsium sensorer innføre andre begrensninger som de kan opptre som kalsiumbuffere som trolig påvirke tidsmessige egenskaper av lukt responser. Samtidige intracellulære innspillinger kombinert med kalsium bildebehandling eller beregnings tilnærminger kan bevise riktig tidsmessig oppløsning på bildeprosesser 65,66. Men tidsmessig oppløsning på bildeprosessen er Rather begrenset. Optiske oppkjøp systemer vanligvis bruker CCD-bildebehandling med en tidsmessig oppløsning på 5-20 Hz 67, selv om to-foton-Imaging kan være i stand til å tilegne seg raskere sekvenser 68. Imidlertid øker samplingsfrekvensen alltid går sammen med et tap i romlig oppløsning. Videre kalsiumfølsomme fargestoffer som brukes i honningen gjennomgå bleking, noe som også reduserer oppkjøps tid 69.

Sammenlignet med andre fysiologiske opptaksteknikker i insekter våre fleksible multikanals mikro-trådelektroder sikre lang tid tilgang til én enhet og befolkning neuronal aktivitet i oppfører bier.

Vi demonstrerte å bruke to av disse elektroder ved forskjellige behandlingstrinn i det samme dyr, som muliggjør analyse av temporale koding forhold mellom de forskjellige opptakssteder. Avhengig av den problemstilling og modellen insekt den grunnleggende metode for elektrode bygningen vist her er enkelt utvidestand og / eller kan tilpasses. For eksempel er det mulig å anvende flere enn de tre enkelttråder for å produsere flerkanals elektroder. I tillegg kan antall registrerings områder bli utvidet og observere tidsmessige aspekter ved flere enn to trakter eller neuropils er gjennomførbart. Vårt håp er at denne metoden vil inspirere mange forskere og vil bidra positivt til forståelsen av sofistikerte nevronale behandling i små hjerner.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraffin oil Fluka 76235
Odors Sigma Aldrich 
PBS pH 7.2
4% Formaldehyde ThermoScientific 28908 Methanol free
Triton X BioChemica A1388
Methylsalicylate Roth 4529.1
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) Invitrogen D7162 keep dark
Alexa 488 hydrazide Invitrogen A-10436 keep dark
Alexa 568 hydrazide Invitrogen A-10437 keep dark
Bee Ringer Solution see Brill et al.2
Polyurethane-coated copper wire Elektrisola 15 µm diameter & P155 insulation
Dental Wax  Densply Detrey 64103015S1 moderate melting point
Dental Wax Flexaponal  124-202-00 low melting Wax
KWIK SIl WPI 03L
18 Pin Socket Conrad Electronic 189634-62
Hot melting glue Conrad Electronic 827673
Soldering needle Conrad Electronics 830283 12 V
Soldering terminal lug  Conrad Electronic 531901
Glaselectrodes WPI 1B100F-3
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 V2A 0.2 x 12 mm
Switchable headstage Tucer Davis Technologies SH16
Headstage connection module NPI INT-03M
Amplifier Module NPI PDA-2F
Data Acquisition boards National Instruments NI-6123, Ni-6143
Acquisition Software National Instruments Lab View 8.2 custom design
Spike-Sorting  CED  Spike 2 v7.11
Matlab Mathworks R2008B
Micromanipulator Leitz manual
AG-wires WPI AGT05100
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP2 AOBS
AMIRA Mercury Computer Systems  2/5/2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strube-Bloss, M. F., Herrera-Valdez, M. a, Smith, B. H. Ensemble response in mushroom body output neurons of the honey bee outpaces spatiotemporal odor processing two synapses earlier in the antennal lobe. PLoS ONE. 7, (11), (2012).
  2. Brill, M. F., Rosenbaum, T., Reus, I., Kleineidam, C. J., Nawrot, M. P., Rössler, W. Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33, (6), 2443-2456 (2013).
  3. Menzel, R. The honeybee as a model for understanding the basis of cognition. Nature Reviews Neuroscience. 13, (11), 758-768 (2012).
  4. Sandoz, J. Behavioral and neurophysiological study of olfactory perception and learning in honeybees. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, (2011).
  5. Giurfa, M. Cognition with few neurons: higher-order learning in insects. Trends in Neurosciences. 36, (5), 1-10 (2013).
  6. Menzel, R., Giurfa, M. Cognitive architecture of a mini-brain: the honeybee. Trends in cognitive sciences. 5, (2), 62-71 (2001).
  7. Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory discrimination: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
  8. Wilson, R. I., Mainen, Z. F. Early events in olfactory processing. Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).
  9. Streinzer, M., Kelber, C., Pfabigan, S., Kleineidam, C. J., Spaethe, J. Sexual dimorphism in the olfactory system of a solitary and a eusocial bee species. The Journal of comparative neurology. 521, (12), (2013).
  10. Nishino, H., Nishikawa, M., Mizunami, M., Yokohari, F. Functional and topographic segregation of glomeruli revealed by local staining of antennal sensory neurons in the honeybee Apis mellifera. The Journal of comparative neurology. 515, (2), 161-180 (2009).
  11. Schneider, D. Elektrophysiologische Untersuchungen von Chemo- und Mechanorezeptoren der Antenne des Seidenspinners Bombyx mori L. Zeitschrift für Vergleichende Physiologie. 40, (1), 8-41 (1957).
  12. Menzel, R., Rybak, J. Antennal lobe of the honeybee. Handbook of brain microcircuits. 427-432 (2011).
  13. Girardin, C. C., Kreissl, S., Galizia, C. G. Inhibitory connections in the honeybee antennal lobe are spatially patchy. Journal of neurophysiology. 109, (2), 332-343 (2013).
  14. Meyer, A., Galizia, C. G. Elemental and configural olfactory coding by antennal lobe neurons of the honeybee (Apis mellifera). Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral. 198, (2), 159-171 (2012).
  15. Abel, R., Rybak, J., Menzel, R. Structure and response patterns of olfactory interneurons in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of comparative neurology. 437, (3), 363-383 (2001).
  16. Kirschner, S., Kleineidam, C. J., Zube, C., Rybak, J., Grünewald, B., Rössler, W. Dual olfactory pathway in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of comparative neurology. 499, (6), 933-952 (2006).
  17. Galizia, C. G., Rössler, W. Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function. Annual review of entomology. 55, (August), 399-420 Forthcoming.
  18. Ito, K., Shinomiya, K., et al. A coordinated nomenclature system for the insect brain. Neuron. 81, (4), 755-765 (2014).
  19. Rybak, J. The digital honey bee brain atlas. Honeybee Neurobiology and Behavior. 125-140 (2012).
  20. Rössler, W., Brill, M. F. Parallel processing in the honeybee olfactory pathway: structure, function, and evolution. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral. 199, (11), (2013).
  21. Mobbs, P. The brain of the honeybee Apis mellifera. I. The connections and spatial organization of the mushroom bodies. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 298, (1091), 309-354 (1982).
  22. Strausfeld, N. J. Organization of the honey bee mushroom body: representation of the calyx within the vertical and gamma lobes. The Journal of comparative neurology. 450, (1), 4-33 (2002).
  23. Witthöft, W. Absolute Anzahl und Verteilung der Zellen im Hirn der Honigbiene. Zeitschrift für Morphologie der Tiere. 61, (1), 160-184 (1967).
  24. Rybak, J., Menzel, R. Anatomy of the mushroom bodies in the honey bee brain: the neuronal connections of the alpha-lobe. The Journal of Comparative Neurology. 465, 444-465 (1993).
  25. Strube-Bloss, M. F., Nawrot, M. P., Menzel, R. Mushroom body output neurons encode odor-reward associations. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. (8), 3129-3140 (2011).
  26. Haddad, R., Lanjuin, A., Madisen, L., Zeng, H., Murthy, V. N., Uchida, N. Olfactory cortical neurons read out a relative time code in the olfactory bulb. Nature neuroscience. (May), 1-11 (2013).
  27. Martin, J. P., Beyerlein, A., et al. The neurobiology of insect olfaction: Sensory processing in a comparative context. Progress in neurobiology. 95, (3), 427-447 (2011).
  28. Nawrot, M. P. Dynamics of sensory processing in the dual olfactory pathway of the honeybee. Apidologie. 43, (3), 269-291 (2012).
  29. Farkhooi, F., Froese, A., Muller, E., Menzel, R., Nawrot, M. P. Cellular adaptation facilitates sparse and reliable coding in sensory pathways. PLoS computational biology. 9, (10), e1003251 (2013).
  30. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca americana) olfactory circuits. Journal of visualized experiments JoVE. (71), (2013).
  31. Saha, D., Leong, K., Li, C., Peterson, S., Siegel, G., Raman, B. A spatiotemporal coding mechanism for background-invariant odor recognition. Nature neuroscience. 16, (12), 1-13 (2013).
  32. Mizunami, M., Okada, R., Li, Y., Strausfeld, N. J. Mushroom Bodies of the Cockroach Activity and Identities of Neurons. Journal of Comparative Neurology. 519, (July), 501-519 (1998).
  33. Okada, R., Ikeda, J., Mizunami, M. Sensory responses and movement-related activities in extrinsic neurons of the cockroach mushroom bodies. Journal of Comparative Physiology A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 185, (2), 115-129 (1999).
  34. Haehnel, M., Froese, A., Menzel, R. In vivo Ca2+ imaging of mushroom body neurons during olfactory learning in the honey bee. Journal of visualized experiments JoVE. (30), (2009).
  35. Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). Journal of visualized experiments JoVE. (47), (2011).
  36. Rehder, V. Quantification of the honeybee’s proboscis reflex by electromyographic recordings. Journal of Insect Physiology. 33, (7), 501-507 (1987).
  37. Serrano, E., Nowotny, T., Levi, R., Smith, B. H., Huerta, R. Gain control network conditions in early sensory coding. PLoS computational biology. 9, (7), e1003133 (2013).
  38. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Receptive fields and functional architecture of monkey striate cortex. The Journal of physiology. 195, (1), 215-243 (1968).
  39. Christensen, T. A., Pawlowski, V. M., Lei, H., Hildebrand, J. G. Multi-unit recordings reveal context-dependent modulation of synchrony in odor-specific neural ensembles. Nature neuroscience. 3, (9), 927-931 (2000).
  40. Byers, K. J. R. P., Sanders, E., Riffell, J. A. Identification of olfactory volatiles using gas chromatography-multi-unit recordings (GCMR) in the insect antennal lobe. Journal of visualized experiments JoVE. (72), e4381 (2013).
  41. Perez-Orive, J., Mazor, O., Turner, G. C., Cassenaer, S., Wilson, R. I., Laurent, G. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, (5580), 359-365 (2002).
  42. Stevenson, I. H., Kording, K. P. How advances in neural recording affect data analysis. Nature. 14, (2), 139-142 (2011).
  43. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature neuroscience. 7, (5), 446-451 (2004).
  44. Viventi, J., Kim, D. -H., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nature neuroscience. 14, (12), 1599-1605 (2011).
  45. Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. Journal of neuroscience methods. 122, (1), 43-57 (2002).
  46. Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9, (4), R53-R78 (1998).
  47. Quian Quiroga, R., Panzeri, S. Extracting information from neuronal populations: information theory and decoding approaches). Nature reviews. Neuroscience. 10, (3), 173-185 (2009).
  48. Einevoll, G. T., Franke, F., Hagen, E., Pouzat, C., Harris, K. D. Towards reliable spike-train recordings from thousands of neurons with multielectrodes. Current opinion in neurobiology. 22, (1), 11-17 (2012).
  49. Riffell, J. a, Lei, H., Abrell, L., Hildebrand, J. G. Neural basis of a pollinator’s buffet: olfactory specialization and learning in Manduca sexta. Science. 164, (6), 877-892 (2013).
  50. Bender, J. a, Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes. Current biology : CB. 20, (10), 921-926 (2010).
  51. Perez-Orive, J., Bazhenov, M., Laurent, G. Intrinsic and circuit properties favor coincidence detection for decoding oscillatory input. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, (26), 6037-6047 (2004).
  52. Rybak, J. Die strukturelle Organisation der Pilzkörper und synaptische Konnektivität protocerebraler Interneuronen im Gehrin der Honigbiene, Apis mellifera.: eine licht- und elektronenmikroskopische Studie. (1994).
  53. Hammer, M. An identified neuron mediates the unconditioned stimulus in associative olfactory learning in honeybees. Nature. 366, 59-63 (1993).
  54. Mauelshagen, J. Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain. Journal of neurophysiology. 69, 609-625 (1993).
  55. Menzel, R., Manz, G. Neural plasticity of mushroom body-extrinsic neurons in the honeybee brain. The Journal of experimental biology. 208, (22), 4317-4332 (2005).
  56. Okada, R., Rybak, J., Manz, G., Menzel, R. Learning-related plasticity in PE1 and other mushroom body-extrinsic neurons in the honeybee brain). The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, (43), 11736-11747 (2007).
  57. Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. Representation of odours and odour mixtures visualized in the honeybee brain. Nature. 387, 285-288 (1997).
  58. Galizia, C. G., Joerges, J., Küttner, A., Faber, T., Menzel, R. A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain. Journal of neuroscience. 76, (1), 61-69 (1997).
  59. Galizia, C. G., Sachse, S., Rappert, A., Menzel, R. The glomerular code for odor representation is species specific in the honeybee Apis mellifera. Nature. 2, (5), 473-478 (1999).
  60. Sandoz, J. -C. Odour-evoked responses to queen pheromone components and to plant odours using optical imaging in the antennal lobe of the honey bee drone Apis mellifera L. The Journal of experimental biology. 209, (18), 3587-3598 (2006).
  61. Fernandez, P. C., Locatelli, F. F., Person-Rennell, N., Deleo, G., Smith, B. H. Associative conditioning tunes transient dynamics of early olfactory processing. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29, (33), 10191-10202 (2009).
  62. Locatelli, F. F., Fernandez, P. C., et al. Nonassociative plasticity alters competitive interactions among mixture components in early olfactory processing. European Journal of Neuroscience. 37, (1), (2013).
  63. Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. Calcium imaging of odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe. Journal of visualized experiments JoVE. (61), 1-7 (2012).
  64. Strutz, A., Völler, T., Riemensperger, T., Fiala, A., Sachse, S. Calcium imaging of neural activity in the olfactory system of Drosophila. Genetically Encoded Functional Indicators. 72, 43-70 (2012).
  65. Galizia, C. G., Kimmerle, B. Physiological and morphological characterization of honeybee olfactory neurons combining electrophysiology, calcium imaging and confocal microscopy. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 190, (1), 21-38 (2004).
  66. Helmchen, F., Waters, J. Ca2+ imaging in the mammalian brain in vivo. European journal of pharmacology. 447, (2-3), 119-129 (2002).
  67. Stierle, J. S., Galizia, C. G., Szyszka, P. Millisecond stimulus onset-asynchrony enhances information about components in an odor mixture. Journal of Neuroscience. 33, (14), 6060-6069 (2013).
  68. Haase, A., Rigosi, E., et al. In-vivo two-photon imaging of the honey bee antennal lobe. Biomedical optics express. 2, (1), 131-138 (2010).
  69. Becker, P. L., Fay, F. S. Photobleaching of fura-2 and its effect on determination of calcium concentrations. The American journal of physiology. 253, (4 pt 1), C613-C618 (1987).
Samtidige Langsiktige Recordings på To Neuronal Processing Stages i oppfører Honeybees
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brill, M. F., Reuter, M., Rössler, W., Strube-Bloss, M. F. Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees. J. Vis. Exp. (89), e51750, doi:10.3791/51750 (2014).More

Brill, M. F., Reuter, M., Rössler, W., Strube-Bloss, M. F. Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees. J. Vis. Exp. (89), e51750, doi:10.3791/51750 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter