Summary
La levadura, Saccharomyces cerevisiae, ha sido un modelo de organismo clave para identificar y estudiar los genes que regulan la biogénesis y funciones del sistema endosomal. Aquí se presenta un protocolo detallado para el etiquetado específico de los compartimentos endosomal para estudios ultraestructurales.
Abstract
Los endosomas son uno de los principales puntos de control de clasificación de membrana en células eucariotas y regulan el reciclado o la destrucción de la mayoría de las proteínas de la membrana plasmática y el aparato de Golgi. Como resultado, el sistema endosomal juega un papel central en el mantenimiento de la homeostasis celular, y las mutaciones en los genes que pertenecen a esta red de orgánulos interconectados por el transporte vesicular, causan patologías graves como el cáncer y trastornos neurobiológicos. Por lo tanto, de primordial importancia es entender los mecanismos subyacentes a la biogénesis y la organización del sistema endosomal. La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido fundamental en esta tarea. Para etiquetar y analizar a nivel ultraestructural el sistema endosomal de este organismo modelo en concreto, presentamos aquí un protocolo detallado para la captación nanogold cargado positivamente por esferoplastos seguido de la visualización de estas partículas a través de una reacción en la mejora de plata. Este método es también una valiosa demasiadol para el examen morfológico de mutantes con defectos en el tráfico endosomal. Por otra parte, no sólo es aplicable para los exámenes ultraestructurales pero también se puede combinar con marcajes de inmunomarcaje para investigaciones de localización de proteínas.
Introduction
El sistema endosomal es un aparato de clasificación de membrana importante que desempeña múltiples funciones celulares importantes, incluyendo el tráfico de la enzima lisosomal receptores de clasificación y el reciclaje de la membrana plasmática (PM), los receptores 1,2. Endosomes se dividen en tres compartimentos diferentes, es decir. los endosomas tempranos (EE), a finales de los endosomas (LE) y los endosomas de reciclaje. Esta clasificación se basa en el tiempo que toma para el material endocytosed para llegar a ellos, en las proteínas marcadoras específicas y en su morfología. Las membranas, es decir, proteínas y lípidos bicapa, interiorizadas del PM pueden o bien ser entregados a través de endosomas lisosomas para la degradación o se reciclan de nuevo. Las membranas también son transportados a los endosomas de el aparato de Golgi y de manera similar, ya sea seguir a los lisosomas o ser recuperada de nuevo a los de Golgi. Además, las proteínas se pueden clasificar en vesículas luminales en ciernes hacia el interior de la membrana endosomal limitación, un proceso que conduce a la formación deuna subcategoría de LE, los cuerpos multivesiculares.
El sistema endosomal levadura es relativamente menos compleja que la de las células eucariotas altos. Endosomas levadura se dividen en EE y LE. En contraste con las células de mamífero que no contienen los endosomas de reciclaje, sino también orgánulos relacionados con los lisosomas-específicos de tejido. En consecuencia, tienen una red de menor complejidad de las rutas de tráfico endosomal 3,4. Por lo tanto, la levadura ha representado y sigue representando un sistema experimental ventajosa para estudiar algunos de los principios del tráfico de membrana subyacente en el sistema endosomal. Esta ventaja se acentúa por el hecho de que numerosos genes implicados en las vías de endosomal se han aislado inicialmente con pantallas genéticas en la levadura 5. Mientras que el sistema endosomal levadura en las células de tipo salvaje y mutantes se ha estudiado ampliamente el uso de enfoques de microscopía de fluorescencia y bioquímicos, su investigación en el nivel ultraestructural sólo ha sidomínimo. Los análisis morfológicos son particularmente relevantes en la levadura porque la mayoría de los orgánulos endosomales son detectados como estructuras puntiformes por microscopía de fluorescencia, lo que hace difícil su identificación inequívoca 6. Desgraciadamente, sólo un número limitado de antisueros reconocimiento de los marcadores de proteínas endosomal levadura está trabajando en inmuno-microscopía electrónica (IEM) preparaciones 7-10. Para algunas proteínas, este problema se ha eludido por el etiquetado endógena del gen de interés y el uso de un anticuerpo que reconoce la etiqueta para detectar que 7,11,12. A menudo, sin embargo, las proteínas son indetectables por IEM debido a sus bajos niveles de expresión. Su sobreexpresión no es una solución, porque este enfoque puede inducir mis-localizaciones y / o alteraciones en los orgánulos morfología / funciones. Así, el etiquetado de los compartimentos endocítica con una sonda detectable por microscopía electrónica de EM es una opción efectiva. Esta es una solución óptima sobre todo si la PRobe está entrando en la ruta endocítica de una manera dependiente del tiempo, lo que permite saber cuándo va a marcar un orgánulo específico 6.
La captación de nanogold cargado positivamente por esferoplastos de levadura (es decir. De levadura donde la pared celular se ha eliminado enzimáticamente) con éxito ha sido utilizado para identificar el endosomal levadura compartimentos 10. Estas partículas se unen fuertemente a los lípidos cargados negativamente que componen las membranas biológicas. Por lo tanto los asociados Nanogold cargados positivamente con la PM, penetra en la célula por endocitosis y pasa a través de la EE y LE antes de llegar a la vacuola. Estas pequeñas partículas de oro, sin embargo, no tienen un tamaño adecuado para ser visto por EM. Para hacerlos visibles, su tamaño se puede ampliar por reacciones químicas que conducen a la deposición de plata o de oro alrededor de la sonda de oro 13-15. Hemos desarrollado y aplicado con éxito un enfoque IEM basado en el método Tokuyasu para realizar subcelularlocalización estudia 8,16. Este método permite realizar inmunomarcaje sobre los preparativos de la levadura con una excelente resolución de la morfología 8,17-24. También hemos establecido un procedimiento que combina este protocolo IEM con el etiquetado nanogold del sistema endosomal levadura compartimentos 6. Con este enfoque hemos caracterizado morfológicamente diferentes subclases de endosomas y ultraestructuralmente examinado mutantes con un tráfico endosomal defecto 6,25. Por otra parte, hemos demostrado que este etiquetado nanogold se puede combinar con marcajes de inmunomarcaje proporcionar la posibilidad de explorar la distribución de una proteína de interés en las diferentes subpoblaciones endosoma. Aquí presentamos cómo se realiza prácticamente el etiquetado del sistema endosomal levadura con nanogold cargado positivamente.
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Protocol
1. Preparación Esferoplasto
- Incubar la levadura durante la noche a 30 ° C en 10 ml del medio apropiado determinado por el diseño del experimento.
- El día después, medir la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD 600) usando un fotómetro, Diluir las células en el mismo medio de cultivo hasta una DO 600 de 0,2-0,4 y crecer a una fase de crecimiento exponencial a menos que el diseño de la experimento requiere una condición diferente. Las células se encuentran en la fase exponencial cuando la cultura tiene un OD 600 de 1-2.
- Recoger 10 OD 600 equivalentes de células por centrifugación a 3500 xg durante 5 min en un tubo de 50 ml. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento de células en 5 ml de tubos de 100 mM (pH 9,6), ditiotreitol 10 mM y se incubaron a 30 ° C durante 10 min.
- Recoger de nuevo las células por centrifugación a 3500 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las células in 5 ml de medio (determinado por el diseño del experimento) que contiene 1 M de sorbitol y 5 mg de enzima lítica, e incubar la mezcla a 30 ° C con agitación suave durante 30 min.
- Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min para recoger la fracción de sedimento, que se corresponde con los esferoplastos. Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender los esferoplastos en 960 l de hielo frío medios (medio determinado por el diseño del experimento) que contiene 1 M de sorbitol y transferir la mezcla en un frío de hielo 2 ml tubo de microcentrífuga.
2. Nanogold captación
- Con una pipeta, mezclar suavemente el esferoplasto con 4 nmol de partículas con carga positiva Nanogold resuspendieron en 40 l de agua. El volumen final de la mezcla tiene que ser de 1 ml.
- Coloque la suspensión celular obtenida en hielo durante 15 min.
- Transferir la suspensión a temperatura ambiente y se incuba durante el tiempo necesario para permitir la internalización nanogold por correondocytosis.
NOTA: A la recaptación de 5 min dirigirá principalmente al etiquetado de vesículas endocítica y endosomal compartimentos tempranos, mientras que la absorción de 15 minutos permitirá a marcar todo el sistema endosomal (a principios y finales de endosomes). Tiempos de incubación más largos (más de 30 min) también permitirá etiquetar la vacuola.
NOTA: los experimentos de pulso-caza de etiquetado no se pueden realizar con este método. Por lo tanto, cuando el etiquetado para el análisis de LE, nanogold también puede encontrar en el PM y el INEE.
3. La fijación y seccionamiento
- Detener la absorción nanogold mediante la adición de 1 ml de fijador doble fuerza [4% de paraformaldehído (PFA), 0,4% de glutaraldehído (GA) en tampón PHEM 0,1 M (TUBOS 20 mM, HEPES 50 mM, pH 6,9, 20 mM de EGTA, 4 mM de MgCl 2)] que contiene 1 M de sorbitol a la suspensión celular. Se mantuvo el tubo a temperatura ambiente.
- Invertir suavemente manualmente los tubos micocentrifuge varias veces durante 30 min (esto permitirá mantener los esferoplastos ensuspensión) y centrifugar dos veces a 1.700 xg durante 25 s.
- Reemplazar el fijador descartando el sobrenadante y mediante la adición de 1 ml de fijador estándar de la fuerza fresco (2% de PFA, 0.2% GA en tampón PHEM 0,1 M) que contiene 1 M de sorbitol y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente en una rueda que gira lentamente.
- Procesar las células para la crio-seccionamiento como se describe anteriormente 6. NOTA: Para los procedimientos de mejora de captación nanogold y plata, no tiene que realizarse el tratamiento con ácido periódico describe en el protocolo indicado. El tratamiento con ácido periódico es mejor para permeabilizar la pared de la célula 26, pero esta estructura ha sido eliminado durante la generación de esferoplastos.
- Cortar 50 cryosections delgadas nm a -120 ° C con un cuchillo de diamante en seco utilizando un ultramicrotomo UCT como se describió previamente 8 y colocarlos en carbono Formvar recubierto 50 mallas de rejillas de níquel.
4. Silver Enhancement para Nanogold partículas Visualización
NOTA: El procedimiento para preparar las mezclas de reacción es, básicamente, la indicada por el fabricante. Adaptaciones prácticas que utilizan este protocolo, hace que el procedimiento de mejora de la plata eficaz y fiable sobre cryosections.
- Retire el kit de mejora de la plata del congelador y descongele en un 37 ° C incubadora o baño de agua. Cuando descongelado, coloque el kit en una incubadora de 24 ° C se coloca en un cuarto oscuro hasta su uso (ver 4.7).
- Coloque la placa de calefacción en la habitación oscura y deje que se caliente a la temperatura final de 24 ° C.
- Cubra la parte superior de la placa de calentamiento con el protector de la superficie, el lado brillante hacia arriba, y seguro que con una cinta.
- Coloque el Parafilm sobre la Benchkote y marcar los bordes con un marcador negro para poder ver los bordes de Parafilm en la oscuridad.
- Cinta de un termómetro en la parte superior de la Benchkote para controlar la temperatura de la placa de calentamiento. Poco a poco ajustar la temperatura si no es 24 ° C.
- PlaCE El tubo de 50 ml con agua bidestilada y el kit de mejora de plata dentro.
- Llene las pequeñas cajas de Petri con agua doblemente destilada, previamente calentada a 37 ° C. Coloque las rejillas en el agua, espécimen lado de abajo, durante 30 minutos.
- Repita este paso 4.7 una vez más.
- Transfiera las rejillas en la caja de almacenamiento y llevarlos a la sala oscura.
- Enjuague las rejillas de nuevo pasándolos (con el lado de la muestra hacia abajo) en varias gotas de agua doble destilada a 24 ° C colocados en el Parafilm que se ha fijado en la placa de calentamiento.
- Asegúrese de que 9 gotas de agua destilada dobles adicionales están dispuestos en el Parafilm, para el enjuague después de la reacción mejora plata.
- Apaga la luz y asegúrese de que todas las luces están apagadas. Encienda la luz roja.
- Sacar las soluciones A y B del kit de mejora de la plata de la incubadora 24 ° C.
- Ponga primero 6 gotas de la solución A y luego 6 gotas de la solución B en un 1,5 mtubo de microcentrífuga de L, y mezclar bien con una pipeta Pasteur de vidrio evitando para hacer burbujas. La solución es bastante gruesa y tiene que ser mezclada manualmente con una pipeta antes de que finalmente vórtex brevemente.
- Poner las soluciones A y B de nuevo en la incubadora de 24 ° C y retirar la solución C.
- Añadir 6 gotas de la solución C a la mezcla A / B. A continuación, mezclar de nuevo en primer lugar con una pipeta Pasteur y luego por agitación, evite hacer burbujas.
- Utilizar inmediatamente la mezcla final mediante la colocación de gotas (~ 20 l / gota) en el Parafilm.
- Con unas pinzas limpias, anti-magnético, colocar las rejillas en la mezcla (por ejemplo., Reacción mejorar plata) para 6 a 15 min dependiendo de la mejora (es decir. Tamaño de las partículas de oro) deseado a obtener.
- Retire las rejillas de la mezcla y pasarlos en la parte superior del agua doblemente destilada cae a 24 ° C para el lavado. En primer lugar, el uso en la sucesión rápida 6 gotas y luego 3 gotas con 7 min tiempo de incubación por gota, Antes de encender las luces.
- Continúe con el siguiente paso, ya sea etiquetado inmuno-oro o tinción de la membrana 27 con el fin de visualizar el resultado de una investigación de EM.
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Representative Results
De acuerdo con el protocolo presentado, la morfología del sistema endosoma de la levadura puede ser el acceso por EM de transmisión. Figura 1 muestra diferentes tipos de compartimientos endosomal que han sido alcanzados y por lo tanto marcadas con nanogold. El nanogold mejorada de plata se puede ver claramente como partículas densas de electrones. Los ajustes óptimos establecidos para la reacción mejora la plata permite tener partículas de oro en un intervalo de tamaño homogéneo entre 5 y 15 nm, que no interfiera con la ultraestructura de la célula de levadura. La membrana plasmática, así como principios de endosomal compartimentos son accesibles al nanogold después de una incubación de 5 min a 24 ° C (Figura 1 A), mientras que LE, en los cuerpos multivesiculares de casos presentados, se puede llegar por estas partículas después de al menos 30 min de la captación (Figura 1B). El poder de resolución de la combinación de nuestro procedimiento IEM 8 con la mejora protocolo nanogold / plata descrito aquí es de la ONUderlined por la preservación y la calidad de la morfología de los orgánulos que se muestran, en particular, las vesículas internas de los cuerpos multivesiculares (Figura 1B).
Figura 1. Análisis ultraestructural de Nanogold etiquetada endosomal compartimentos levadura. Los esferoplastos se obtuvieron de la cepa SEY6210 de tipo salvaje (MATalfa ura3-52 leu2-3, 112 HIS3-Δ200-trp1 LYS2 Δ901-801 suc2-Δ9 Mel GAL) como se describe en el protocolo presentado. Los esferoplastos fueron incubadas con 4 nmol de nanogold cargado positivamente a 4 º C durante 15 min antes de ser transferido a temperatura ambiente durante 10 (panel A) o 30 min (panel B). Las células fueron posteriormente fijadas, procesadas para cryosectioning 8 antes de llevar a cabo la reacción de mejora de plata en la preparación como se describeen el protocolo presentado. A. Los primeros compartimentos del sistema endosomal levadura. Además de la membrana de plasma, un corto absorción de la Nanogold (5 min) permite el etiquetado de vesículas individuales (puntas de flecha), vesículas posiblemente endocítica, y de las estructuras tubulares (flecha), muy probables los endosomas tempranos. B. La levadura ultraestructura cuerpo multivesicular. Un 30 min de incubación conduce al etiquetado de los cuerpos LE / multivesiculares (asteriscos), sino también los endosomas tempranos y en parte vacuolas (no se muestra). M, mitocondrias; N, núcleo; PM, membrana plasmática; V, vacuola. Barra = 200 nm.
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Discussion
Inmuno-microscopía electrónica es una técnica que permite la combinación de localización de las proteínas con la resolución ultraestructural de los portadores y orgánulos donde residen estas proteínas. Esto es especialmente importante cuando se estudia el sistema endosomal levadura porque sus compartimentos aparecen como estructuras puntiformes en la microscopía de fluorescencia. Por lo tanto, es difícil distinguirlas. Por esta razón el uso de una sonda detectable por EM y de entrar en la ruta endocítica de una manera dependiente del tiempo es crucial para marcar específicamente los diferentes endosomas. Este tipo de sonda es valiosa para evaluar la funcionalidad de la endocitosis 6 y es una alternativa a la falta de antisueros detección de marcadores de proteínas.
El procedimiento descrito aquí exploit carga positiva nanogold como sonda para etiquetar los compartimentos endosomal. Mientras cryosectioning requiere equipo y habilidades especiales, el protocolo que se presenta es técnicamente fácil y no se vuelve aQuire máquinas especiales. Por lo tanto, es accesible a cualquier laboratorio que le gustaría utilizar para su investigación. Sin embargo, algunas precauciones deben ser tomadas durante la etapa crítica de este procedimiento, es decir, la reacción de la mejora de plata. Esta reacción es muy sensible a la luz y, por tanto, todas las luces (excepto la roja) en la habitación tiene que estar apagado y / o cubierto. Como todas las reacciones químicas, la velocidad de la reacción mejora la plata está influenciada por la temperatura. Para obtener resultados consistentes y reproducibles utilizando los mismos parámetros, todas las soluciones y herramientas tienen que ser cuidadosamente preincubado a 24 º C. Es crucial para establecer con precisión el tiempo de incubación para la mejora de la plata en la sala donde se llevará a cabo de forma rutinaria esta reacción. La expansión de la nanogold tiene que ser lo suficientemente largo con el fin de ser capaz de detectar visualmente la partícula de oro por EM y tiene que ser lo suficientemente corto para evitar la generación de partículas de gran tamaño, lo que podría cubrir detalles morfológicos. Por esta razón, se sugiere con gusto para llevar a cabo un experimento piloto cuando la creación de esta técnica en el laboratorio. Durante esta prueba las partículas Nanogold tienen que ser de plata mejorada para diferentes momentos para determinar el momento óptimo para la reacción. Es de destacar que las dimensiones de las partículas obtenidas no pueden ser de tamaño homogéneo; habrá siempre una cierta heterogeneidad pero esto tiene que ser lo mínimo posible, en un rango entre 5-15 nm. Esto es particularmente importante si el procedimiento de captación nanogold se combinará con marcajes inmuno-oro. Otro aspecto a tener en cuenta en la interpretación de los resultados es que los experimentos de marcado de pulso-caza no son posibles con este método. En consecuencia, el PM y EE también serán etiquetados de captación nanogold pretendía visualizar LE.
También es posible ver aplicaciones adicionales del protocolo presentado aquí. Una opción podría ser la de correlacionar los datos de EM de captación nanogold con microscópicas fluorescentesY. FM4-64 es un producto colorante fluorescente lipofílica que asocia a la PM y, en su camino hacia la vacuola, está pasando a través de los compartimentos endosomal de una manera dependiente del tiempo. Tanto FM4-64 y nanogold entrar en la célula, en asociación con los lípidos y tienen probablemente la cinética de internalización muy similares 28,29. Como resultado ambos colorantes podrían utilizarse al mismo tiempo en correlativa luz-EM se acerca a explorar simultáneamente la dinámica y la ultraestructura de la endocítica compartments.The presentó método también se puede utilizar para el tráfico del receptor mediada a través del sistema endocítica 30. Derivados Monomaleido y mono-sulfo-N-hidroxi-succinimido de la nanogold se pueden utilizar para enlazar covalentemente estas partículas a las proteínas 6. Por ejemplo la reticulación con la una o la α-factor puede permitir después de la endocitosis de estos dos feromonas por sus receptores específicos.
En conjunto, el protocolo descrito permite a las especificacionesifically etiquetar los orgánulos del sistema endosomal de levadura utilizando una sonda de endocitosis, que puede hacerse detectable por EM. Esta herramienta experimental es un enfoque valioso para estudiar la biogénesis y la organización de los compartimientos endosomal de levadura en el nivel ultraestructural.
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Acknowledgments
Los autores agradecen a René Scriwanek para la asistencia en la preparación de la figura. FR es apoyada por ECHO (700.59.003), Programa ALW abierta (821.02.017 y 822.02.014), la cooperación DFG-NWO (DN82-303) y ZonMW VICI (016.130.606) subvenciones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
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