Summary
Gist, Saccharomyces cerevisiae, heeft een sleutelrol modelorganisme om genen die de biogenese en functies van het endosomale systeem te identificeren en te bestuderen geweest. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de specifieke kenmerken van de endosomale compartimenten voor ultrastructurele studies.
Abstract
Endosomen zijn een van de belangrijkste membraan sorteren controlestations in eukaryote cellen en ze reguleren recycling of vernietiging van eiwitten voornamelijk uit de celmembraan en het Golgi. Door het endosomale systeem speelt een centrale rol in het handhaven celhomeostase en mutaties in genen die tot dit netwerk van organellen verbonden door vesiculair transport, ernstige pathologieën waaronder kanker en neurobiologische aandoeningen. Het is daarom van het grootste belang om de mechanismen die ten grondslag liggen van de biogenese en de organisatie van het endosomale systeem te begrijpen. De gist Saccharomyces cerevisiae is cruciaal geweest bij deze taak. Om specifiek te etiketteren en te analyseren op het ultrastructurele niveau het endosomale systeem van dit model organisme, presenteren we hier een gedetailleerd protocol voor de positief geladen Nanogold opname door sferoplasten gevolgd door de visualisatie van deze deeltjes door middel van een versterking met zilver reactie. Deze methode is ook een waardevol tel voor de morfologische onderzoek van mutanten met defecten in endosomaal transport. Bovendien is niet alleen voor ultrastructurele onderzoek maar kan ook gecombineerd worden met immuno labelings voor eiwit lokalisatie onderzoeken.
Introduction
De endosomale systeem is een belangrijke membraan sorteerinrichting die meerdere cruciale cellulaire functies, waaronder handel in lysosomale enzym sorteren receptoren en de recycling van plasmamembraan (PM) speelt receptoren 1,2. Endosomen worden onderverdeeld in drie compartimenten, dwz. de vroege endosomen (EE), de late endosomen (LE) en de recycling endosomes. Deze indeling is gebaseerd op de tijd die het duurt voor endocytosed materiaal om hen te bereiken, op specifieke marker-eiwitten en op hun morfologie. Membranen, dwz eiwit en lipidendubbellagen geïnternaliseerd van de PM kan ofwel lysosomen worden geleverd via endosomes voor degradatie of worden teruggevoerd. Membranen zijn ook vervoerd endosomen naar het Golgi en evenzo hetzij verder lysosomen of teruggestuurd naar de Golgi opgehaald. Bovendien kunnen eiwitten worden gesorteerd in luminale vesicles binnenwaarts knopvorming aan het endosomale membraan beperken, een proces dat leidt tot de vorming vaneen subcategorie van LE, de multivesiculaire lichamen.
De gist endosomale systeem relatief minder complex dan die van hoge eukaryotische cellen. Gist endosomes zijn verdeeld in EE en LE. In tegenstelling tot zoogdiercellen en niet recycling endosomen maar ook weefselspecifieke-lysosoom gerelateerde organellen bevatten. Daarom hebben ze een minder complex netwerk van endosomaal smokkelroutes 3,4. Daarom gist heeft vertegenwoordigd en vormt nog steeds een voordelige experimenteel systeem om een aantal van de principes onderliggende membraan verkeer studeren in het endosomale systeem. Dit voordeel wordt benadrukt door het feit dat vele genen betrokken bij de endosomale paden zijn aanvankelijk geïsoleerd met genetische screens in gist 5. Terwijl de gist endosomale systeem in wild-type en mutante cellen is uitgebreid bestudeerd met behulp van biochemische en fluorescentie microscopie benaderingen, heeft haar onderzoek op het ultrastructurele niveau alleen geweestminimaal. Morfologische analyses zijn met name relevant in gist, omdat de meeste van de endosomal organellen worden gedetecteerd als puntlaesies structuren met behulp van fluorescentie microscopie, die moeilijk hun ondubbelzinnige identificatie 6 maken. Er is een beperkt aantal antisera herkennen gist endosomen markers werkt in immuno-elektronen-microscopie (IEM) preparaten 7-10. Voor sommige eiwitten, is dit probleem omzeild door de endogene tagging van het gen van belang en het gebruik van een antilichaam dat het label om het 7,11,12 detecteren. Vaak echter, eiwitten zijn niet op te sporen door IEM vanwege hun lage expressie niveaus. Hun overexpressie is geen oplossing, want deze aanpak mis-lokalisatie en / of wijzigingen kunnen veroorzaken in het organel morfologie / functies. Dus de etikettering van de endocytische compartimenten met een probe detecteerbaar door elektronenmicroscopie EM is een effectieve optie. Dit is een optimale oplossing vooral als de probe betreedt de endocytische route een tijdsafhankelijke wijze, waardoor weten wanneer het een bepaalde organel 6 zal markeren.
De opname van positief geladen Nanogold door gistsferoplasten (dwz. Gist waar de celwand is enzymatisch verwijderd) is met succes gebruikt voor identificatie van de gist endosomale compartimenten 10. Deze deeltjes sterk binden aan de negatief geladen lipiden waaruit de biologische membranen. Dus de positief geladen Nanogold associeert met de PM, dringt de cel door endocytose en loopt door het EE en LE alvorens de vacuole. Deze kleine gouddeeltjes hebben echter geen adequate afmetingen zichtbaar EM. Om ze zichtbaar te maken, kan de grootte worden vergroot door chemische reacties die leiden tot de afzetting van zilver of goud om de gouden sonde 13-15. We hebben ontwikkeld en met succes toegepast een IEM aanpak op basis van de Tokuyasu methode om subcellulaire voerenlokalisatie bestudeert 8,16. Deze methode maakt het uitvoeren immunogold etikettering op gist preparaten met een uitstekende resolutie van de morfologie 8,17-24. We hebben ook vastgesteld in een procedure te combineren IEM protocol met de Nanogold etikettering van de gist endosomal systeem compartimenten 6. Met deze aanpak hebben we morfologisch gekarakteriseerd verschillende subklassen van endosomes en ultrastructureel onderzocht mutanten met een endosomaal transport defect 6,25. Bovendien hebben we aangetoond dat deze Nanogold kenmerken te combineren met immunogoud labelings die de mogelijkheid om de verdeling van een eiwit van belang van de verschillende subpopulaties endosoom verkennen. Hier presenteren we hoe de etikettering van de gist endosomal systeem met positief geladen Nanogold praktisch wordt uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sferoplast Bereiding
- Incubeer de gist overnacht bij 30 ° C in 10 ml van het geschikte medium bepaald door het ontwerp van het experiment.
- De dag na, meet de optische dichtheid van de kweek bij 600 nm (OD600) met een fotometer, Verdun cellen in hetzelfde kweekmedium een OD600 van 0,2-0,4 en groeien ze tot een exponentiële groeifase indien het model van de experiment vereist een andere aandoening. Cellen zijn in de exponentiële fase waarin de cultuur heeft een OD 600 van 1-2.
- Verzamel 10 OD 600 equivalenten van cellen door centrifugeren bij 3500 xg gedurende 5 minuten in een 50 ml buisje. Na het centrifugeren, gooi het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml 100 mM PIPES (pH 9,6), 10 mM dithiothreitol en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 10 minuten.
- Verzamel opnieuw de cellen door centrifugeren bij 3500 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 5 ml medium (bepaald door het ontwerp van het experiment) bevattende 1 M sorbitol en 5 mg lytisch enzym en incubeer het mengsel bij 30 ° C onder zacht schudden gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten om de pellet-fractie, die overeenkomt met de sferoplasten verzamelen. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de sferoplasten in 960 pl ijskoud medium (gemiddeld bepaald door het ontwerp van het experiment) bevattende 1 M sorbitol en breng het mengsel aan een ijskoude 2 ml microcentrifugebuis.
2. Nanogold Opname
- Met behulp van een pipet, meng de sferoplast met 4 nmol van positief geladen Nanogold deeltjes geresuspendeerd in 40 pl water. Het uiteindelijke volume van het mengsel van 1 ml te zijn.
- Plaats de verkregen celsuspensie op ijs gedurende 15 minuten.
- Breng de suspensie bij kamertemperatuur en incubeer voor de vereiste tijd om Nanogold internalisatie mogelijk via endocytosis.
OPMERKING: Een 5 min opname zal voornamelijk leiden tot de etikettering van endocytische blaasjes en vroeg endosomale compartimenten, terwijl een 15 min opname zal toelaten om het hele endosomale systeem (vroege en late endosomen) te markeren. Langere incubatietijden (meer dan 30 minuten) zal toestaan de vacuole label.
OPMERKING: Pulse-chase labeling experimenten is niet mogelijk met deze methode. Daarom, wanneer de etikettering voor de analyse van LE, Nanogold zal ook te vinden op de PM en INEE.
3. Fixatie en Snijden
- Stop de Nanogold opname door toevoeging van 1 ml van dubbele sterkte fixeermiddel [4% paraformaldehyde (PFA), 0,4% glutaaraldehyd (GA) in 0,1 M PHEM-buffer (20 mM PIPES, 50 mM HEPES, pH 6,9, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl 2)] bevattende 1 M sorbitol aan de celsuspensie. Hield de buis bij kamertemperatuur.
- Zwenk handmatig de micocentrifuge buizen meerdere malen gedurende 30 min (dit zal toelaten om de sferoplasten in te houdenschorsing) en centrifugeer vervolgens twee keer in 1700 xg gedurende 25 sec.
- Vervang het fixeermiddel door weggooien het supernatant en door toevoeging van 1 ml vers standaard sterkte fixatief (2% PFA, 0,2% GA 0,1 M PHEM-buffer) bevattende 1 M sorbitol en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een langzaam roterend wiel.
- Verwerk de cellen voor cryo-snijden zoals eerder beschreven 6. OPMERKING: Bij de Nanogold opname en zilver verbetering procedures, perjoodzuur behandeling in de aangegeven protocol beschreven niet worden uitgevoerd. De periodieke zuurbehandeling is aan de celwand 26 beter doorlaatbaar maar deze structuur is geëlimineerd tijdens de vorming van sferoplasten.
- Snijd 50 nm dunne cryosecties bij -120 ° C met droge diamant mes met behulp van een UCT ultramicrotoom zoals eerder beschreven 8 en leg ze op Formvar koolstof beklede 50 mazen nikkel grids.
4. Silver Enhancement voor Nanogold Particle Visuabiliseren
OPMERKING: De procedure om de reactiemengsels te bereiden is in principe aangegeven door de fabrikant. Praktische aanpassingen met dit protocol, maakt de zilveren enhancement procedure effectief en betrouwbaar op vriescoupes.
- Verwijder de versterking met zilver kit van de vriezer en ontdooien in een 37 ° C incubator of waterbad. Wanneer ontdooid, plaats de kit in een 24 ° C incubator geplaatst in een donkere kamer tot gebruik (zie 4.7).
- Zet de verwarming plaat in de donkere kamer en warm het tot de uiteindelijke temperatuur van 24 ° C.
- Bedek de bovenkant van het verwarmen plaat met het oppervlak beschermer, glimmende kant naar boven, en zet deze vast met een tape.
- Plaats de Parafilm op de Benchkote en markeer de randen met een zwarte stift kunnen de Parafilm randen zien in het donker.
- Tape een thermometer bovenaan de Benchkote om de temperatuur van de verwarmingsplaat volgen. Geleidelijk de temperatuur aan te passen, zo niet 24 ° C.
- Place de 50 ml buis met dubbel gedestilleerd water en de versterking met zilver kit binnen.
- Vul het kleine petrischalen met dubbel gedestilleerd water, voorverwarmd bij 37 ° C. Plaats de roosters in het water, specimen naar beneden, gedurende 30 minuten.
- Herhaal deze stap 4.7 nog een keer.
- Breng de roosters in de opbergbox en breng ze naar de donkere kamer.
- Spoel de roosters weer door ze (het model naar beneden) op enkele druppels dubbel gedestilleerd water bij 24 ° C geplaatst op de Parafilm die is vastgesteld op de verwarmingsplaat.
- Zorg ervoor dat 9 extra dubbel gedestilleerd water druppels zijn klaar om op de Parafilm, voor het spoelen na de versterking met zilver reactie.
- Doe het licht uit en zorg ervoor dat alle lichten uit zijn. Draai het rode lampje op.
- Neem de A-en B-oplossingen van de zilveren enhancement kit van de 24 ° C incubator.
- Zet eerste 6 druppels Een oplossing en vervolgens 6 druppels B oplossing in een 1,5 ml microcentrifugebuis, en meng goed met een glas Pasteur pipet vermijden om zeepbellen te maken. De oplossing is vrij dik en het moet handmatig worden gemengd met een pipet voordat eindelijk vortexen het kort.
- Doe de A-en B-oplossingen terug in de 24 ° C incubator en verwijder de C-oplossing.
- 6 druppels van de C oplossing van het A / B mengsel. Meng dan weer eerst met een Pasteur pipet en vervolgens door vortexen, voorkomen dat bellen.
- Onmiddellijk het uiteindelijke mengsel door het plaatsen van druppels (~ 20 ul / druppel) op de Parafilm.
- Met een schone, anti-magnetisch pincet, plaatst u de roosters op het mengsel (bijv.., Zilver verbeteren reactie) voor 6 tot 15 minuten, afhankelijk van de versterking (dwz. Grootte van de gouddeeltjes) wenste te worden verkregen.
- Verwijder de roosters uit het mengsel en doorgeven aan de bovenkant van het dubbel gedestilleerd water druppels bij 24 ° C voor wassen. Gebruik eerst in snel achter elkaar 6 druppels en vervolgens 3 druppels met 7 min incubatietijd per druppel, Voordat u de lichten aan.
- Ga naar de volgende stap, of immuno-goud labeling of membraankleuring 27 teneinde het resultaat te visualiseren voor een EM onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de gepresenteerde protocol, kan de morfologie van de gist endosoom systeem toegang worden door transmissie EM Figuur 1. Toont verschillende soorten endosomal compartimenten die zijn bereikt en daarom gelabeld met Nanogold. De zilveren versterkte Nanogold duidelijk te zien als elektronendonor dichte deeltjes. De optimale instellingen vastgesteld voor de versterking met zilver reactiemengsel kan met gouddeeltjes in een homogene afmetingen tussen 5 en 15 nm, die niet interfereert met de ultrastructuur van de gistcel. Plasmamembraan evenals vroege endosomale compartimenten zijn toegankelijk voor de Nanogold na 5 min incubatie bij 24 ° C (Figuur 1A) terwijl LE, in het voorgelegde geval multivesiculaire lichaampjes, bereikbaar door deze deeltjes na ten minste 30 min opname (figuur 1B). Het oplossend vermogen van onze IEM procedure 8 combineren met de Nanogold / zilver enhancement protocol hier beschreven is underlined het behoud en kwaliteit van de morfologie gefotografeerde organellen, in het bijzonder de interne vesicles van de multivesiculaire lichaampjes (Figuur 1B).
Figuur 1. Ultrastructurele analyse van Nanogold gelabelde gist endosomale compartimenten. Sferoplasten werden verkregen uit de wild-type stam SEY6210 (MATalpha ura3-52 leu2-3, 112 his3-Δ200 trp 1-Δ901 LYS2-801 SUC2-Δ9 mel GAL) zoals beschreven in de gepresenteerde protocol. Sferoplasten werden vervolgens geïncubeerd met 4 nmol positief geladen Nanogold bij 4 ° C gedurende 15 minuten alvorens te worden overgebracht naar kamertemperatuur 10 (paneel A) of 30 minuten (kader B). Cellen werden vervolgens vastgesteld, verwerkt voor cryosectioning 8 voor het uitvoeren van de versterking met zilver reactie op de opstelling zoals beschrevenin de gepresenteerde protocol. A. Vroege compartimenten van de gist endosomale systeem. Naast de plasmamembraan, een korte opname van de Nanogold (5 min) kan de kenmerken van een enkele blaasjes (pijlpunten) eventueel endocytische blaasjes, en buisvormige structuren (pijl), waarschijnlijk vroege endosomen. B. Gist multivesiculaire lichaam ultrastructuur. Een 30 minuten incubatie tot de etikettering van LE / multivesiculaire lichaampjes (sterretjes), maar ook vroege endosomen en deels vacuolen (niet getoond). M, mitochondriën; N, kern; PM, plasmamembraan; V, vacuole. Bar = 200 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immuno-elektron-microscopie is een techniek waarmee combineren lokalisatie van eiwitten met de ultrastructurele resolutie van de dragers en organellen wanneer deze eiwitten bevinden. Dit is vooral van cruciaal belang bij het bestuderen van de gist endosomale systeem, omdat haar compartimenten verschijnen als puntlaesies structuren in fluorescentie microscopie. Het is derhalve moeilijk te onderscheiden. Daarom is het gebruik van een probe detecteerbaar door EM en het invoeren van de endocytische route op een tijdsafhankelijke wijze is cruciaal voor specifiek markeren de verschillende endosomen. Dit type sensor is waardevol om de functionaliteit van endocytose 6 beoordelen en is een alternatief voor het ontbreken van antisera detecteren van eiwit markers.
De hier beschreven werkwijze exploit positief geladen Nanogold als een probe voor het endosomale compartimenten label. Terwijl cryosectioning vereist speciale apparatuur en vaardigheden, de gepresenteerde protocol is technisch eenvoudig en niet opnieuwspeciale machines katern. Daarom is het toegankelijk voor elke laboratorium dat zou willen gebruiken voor zijn onderzoek. Sommige voorzorgsmaatregelen tijdens de kritieke stap van deze procedure, namelijk de versterking met zilver reactie worden genomen. Deze reactie is zeer gevoelig voor licht en hebben dus alle lichten (behalve de rode) in de ruimte moeten worden uitgeschakeld en / of afgedekt. Zoals alle chemische reacties, wordt de snelheid van de versterking met zilver reactie beïnvloed door de temperatuur. Om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen met dezelfde parameters, alle oplossingen en hulpmiddelen moeten zorgvuldig worden geïncubeerd bij 24 ° C. Het is cruciaal om nauwkeurig vast de incubatietijd voor de versterking met zilver in de kamer waar deze reactie routinematig worden uitgevoerd. Uitbreiding van de Nanogold is lang genoeg om te kunnen visueel de goud deeltjes te detecteren door EM zijn en moet kort genoeg om de vorming van grote deeltjes, die morfologische gegevens kan omvatten vermijden zijn. Daarom wordt warm voorgesteld een proefproject uitgevoerd bij het opzetten van deze techniek in het laboratorium. Tijdens deze test de Nanogold deeltjes zilver verbeterde voor verschillende tijdstippen kunnen zijn voor de optimale tijd van de reactie te bepalen. Van de nota, kunnen de afmetingen van de verkregen deeltjes niet van homogene grootte zijn; er altijd enige heterogeniteit maar dit heeft in een bereik tussen 5 zo klein mogelijk worden gehouden, - 15 nm. Dit is vooral belangrijk als de Nanogold opname procedure zal worden gecombineerd met immuno-goud labelings. Een ander aspect dat moet worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten is dat pulse-chase labeling experimenten zijn niet mogelijk met deze methode. Bijgevolg de PM en EE zal ook worden geëtiketteerd een Nanogold opname bedoeld om te visualiseren LE.
Het is ook mogelijk om extra toepassingen van het protocol hier gepresenteerde bekijken. Een optie zou kunnen zijn om de EM-gegevens van Nanogold opname correleren met fluorescente microscoopy. FM4-64 is een lipofiele fluorescente merker kleurstof die associeert met de PM en, op weg naar de vacuole wordt door het endosomale compartimenten een tijdsafhankelijke wijze. Beide FM4-64 en Nanogold voer de cel in samenwerking met lipiden en ze hebben waarschijnlijk zeer vergelijkbaar internalisatie kinetiek 28,29. Hierdoor beide kleurstoffen kunnen worden gebruikt op hetzelfde moment in correlatieve licht EM zal gelijktijdig onderzoeken de dynamiek en de ultrastructuur van de endocytische compartments.The gepresenteerde methode kan ook worden gebruikt om receptor-gemedieerde endocytotische de handel door systeem 30. Monomaleido en mono-sulfo-N-hydroxy-succinimido derivaten van de Nanogold kan worden gebruikt om deze deeltjes covalent binden aan eiwitten 6. Bijvoorbeeld verknoping met een-of α-factor kan toestaan na endocytose van deze twee feromonen hun specifieke receptoren.
Alles bij elkaar, de beschreven protocol maakt het mogelijk om specifically label de organellen van de gist endosomale systeem gebruikt een endocytose probe, die detecteerbaar zijn door EM. Deze experimentele tool is een waardevolle benadering van de biogenese en de organisatie van de gist endosomal compartimenten studeren aan het ultrastructurele niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs danken Rene Scriwanek voor de hulp bij de voorbereiding van de figuur. FR wordt ondersteund door ECHO (700.59.003), ALW Open Programma (821.02.017 en 822.02.014), DFG-NWO samenwerking (DN82-303) en ZonMW VICI (016.130.606) subsidies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
