Summary
Levure, Saccharomyces cerevisiae, a été un organisme modèle clé pour identifier et étudier les gènes qui régissent la biogenèse et les fonctions du système endosomal. Nous présentons ici un protocole détaillé pour le marquage spécifique des endosomes pour les études ultrastructurales.
Abstract
Endosomes sont l'un des principaux membrane tri des points de contrôle dans les cellules eucaryotes et ils régulent le recyclage ou la destruction des protéines principalement de la membrane plasmique et l'appareil de Golgi. En conséquence, le système de l'endosome joue un rôle central dans le maintien de l'homéostasie des cellules, et des mutations dans les gènes appartenant à ce réseau interconnectés par des organelles de transport vésiculaire, provoquent des pathologies graves telles que le cancer et les troubles neurobiologiques. Il est donc de l'intérêt premier de comprendre les mécanismes qui sous-tendent la biogenèse et l'organisation du système endosomal. La levure Saccharomyces cerevisiae a joué un rôle essentiel dans cette tâche. Pour étiqueter spécifiquement et analyser au niveau ultrastructural le système endosomal de cet organisme modèle, nous présentons ici un protocole détaillé pour l'absorption d'Nanogold chargé positivement par les sphéroplastes suivie par la visualisation de ces particules par une réaction d'amplification de l'argent. Cette méthode est également une valeur tropl pour l'examen morphologique des mutants avec des défauts dans le trafic endosomal. En outre, il n'est pas seulement applicable pour les examens ultrastructuraux mais il peut aussi être combiné avec des marquages immunomarquage investigations protéine de localisation.
Introduction
Le système de l'endosome est un appareil de tri de la membrane majeur qui joue plusieurs rôles cruciaux cellulaires y compris le trafic de l'enzyme lysosomale récepteurs de tri et le recyclage de la membrane plasmique (PM) 1,2 récepteurs. Les endosomes sont divisés en trois compartiments, à savoir différentes. les endosomes précoces (EE), les endosomes tardifs (LE) et les endosomes de recyclage. Cette classification est basée sur le temps nécessaire pour que la matière endocytose pour les atteindre, sur des protéines marqueurs spécifiques et de leur morphologie. Membranes, soit protéiques et lipidiques bicouches, intériorisées de la PM peuvent soit être livrés à lysosomes via les endosomes de dégradation ou être recyclés. Membranes sont également transportés vers les endosomes de l'appareil de Golgi et de même, soit continuer à les lysosomes ou être récupérées vers l'appareil de Golgi. En outre, les protéines peuvent être triés dans des vésicules luminales herbe vers l'intérieur à partir de la membrane de l'endosome limitatif, un processus qui conduit à la formation d'une sous-catégorie de LE, les corps multivésiculaires.
Le système de l'endosome de levure est relativement moins complexe que celle des cellules eucaryotes élevées. endosomes de levure sont divisés en EE et LE. Par contraste avec les cellules de mammifères ne contiennent pas les endosomes de recyclage, mais également des organites apparentés aux lysosomes spécifiques d'un tissu. Par conséquent, ils ont un réseau moins complexe de voies de trafic endosomes 3,4. Par conséquent levure a représenté et représente un système expérimental avantageux d'étudier quelques-uns des principes trafic membranaire sous-jacente dans le système endosomal encore. Cet avantage est renforcé par le fait que de nombreux gènes impliqués dans les voies de endosomes ont été initialement isolé avec des écrans génétiques dans la levure 5. Bien que le système endosomal de levure dans le type sauvage et des cellules mutantes a été étudiée en utilisant des approches de microscopie par fluorescence et biochimiques, son enquête au niveau ultrastructural a seulement étéminime. Analyses morphologiques sont particulièrement pertinentes dans la levure, car la plupart des organites endosomes sont détectés comme des structures ponctuées par microscopie à fluorescence, qui rendent difficile leur identification sans équivoque 6. Malheureusement, seul un nombre limité d'antisérums reconnaissant des marqueurs protéiques de levure endosomes travaille en immuno-microscopie électronique (IEM) Préparations 7-10. Pour certaines protéines, ce problème a été contourné par le marquage endogène du gène d'intérêt et l'utilisation d'un anticorps reconnaissant l'étiquette à détecter 7,11,12. Souvent, cependant, les protéines sont indétectables par IEM en raison de leurs faibles niveaux d'expression. Leur surexpression n'est pas une solution parce que cette approche peut induire mis-localisations et / ou des modifications dans les organites morphologie / fonctions. Ainsi, le marquage des compartiments endocytaires avec une sonde détectable par microscopie électronique EM est une option efficace. Il s'agit d'une solution optimale en particulier si le probe entre dans la voie d'endocytose de manière dépendante du temps, ce qui permet de savoir quand il va marquer un organite spécifique 6.
L'absorption de Nanogold chargé positivement par sphéroplastes de levure (c'est à dire. Levure où la paroi cellulaire a été éliminé par voie enzymatique) a été utilisée avec succès pour identifier le endosomes de levure compartiments 10. Ces particules se lient fortement aux lipides chargés négativement composant les membranes biologiques. Ainsi, les associés de Nanogold chargés positivement avec le PM, pénètre dans la cellule par endocytose et passe à travers la EE LE et avant d'atteindre la vacuole. Ces petites particules d'or, cependant, n'ont pas une taille appropriée pour être vu par EM. Pour les rendre visibles, leur taille peut être agrandie par des réactions chimiques qui conduisent à la déposition de l'argent ou de l'or de la sonde de l'or de 13 à 15. Nous avons mis au point et appliqué avec succès une approche IEM basé sur la méthode Tokuyasu pour effectuer subcellulaireétudie la localisation 8,16. Cette méthode permet d'effectuer l'étiquetage immunologique sur des préparations de levure avec une excellente résolution de la morphologie 8,17-24. Nous avons également mis en place une procédure combinant ce protocole IEM avec l'étiquetage de Nanogold du système levure endosomique compartiments 6. En utilisant cette approche, nous avons caractérisé morphologiquement différentes sous-classes de endosomes et ultrastructuralement examiné mutants avec un trafic endosomal défaut 6,25. De plus, nous avons démontré que cet étiquetage de Nanogold peut être combiné avec marquages immunomarquage offrant la possibilité d'explorer la distribution d'une protéine d'intérêt sur les différentes sous-populations de endosomes. Nous présentons ici les modalités d'étiquetage du système levure endosomique avec Nanogold chargé positivement est pratiquement réalisée.
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Protocol
Une. Préparation des sphéroplastes
- Incuber la levure pendant une nuit à 30 ° C dans 10 ml du milieu approprié, déterminé par la conception de l'expérience.
- Le lendemain, mesurer la densité optique de la culture à 600 nm (DO 600) à l'aide d'un photomètre, Diluer les cellules dans le même milieu de culture jusqu'à une DO 600 de 0,2 à 0,4 et de les cultiver à une phase de croissance exponentielle à moins que la conception de l' expérience nécessite une condition différente. Les cellules sont en phase exponentielle lorsque la culture présente une DO 600 de 1-2.
- Recueillir 10 OD 600 équivalents de cellules par centrifugation à 3500 g pendant 5 min dans un tube de 50 ml. Après centrifugation, éliminer le surnageant.
- Remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de 100 mM de PIPES (pH 9,6), dithiothréitol 10 mM et incubé à 30 ° C pendant 10 min.
- Recueillir à nouveau les cellules par centrifugation à 3500 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules in 5 ml de milieu (déterminées par la conception de l'expérience) contenant 1 M de sorbitol et de 5 mg d'enzyme lytique, et incuber le mélange à 30 ° C sous agitation douce pendant 30 min.
- Centrifuger la suspension de cellules à 300 xg pendant 5 min pour recueillir la fraction de culot, ce qui correspond à des sphéroplastes. Jeter le surnageant.
- Reprendre les sphéroplastes dans 960 pi de glace médias froid (moyen déterminé par la conception de l'expérience) contenant 1 M de sorbitol et transférer le mélange dans un froid de glace de 2 ml microtube.
2. Nanogold absorption
- Avec une pipette, mélanger délicatement la sphéroplaste avec 4 nmol de particules chargées positivement Nanogold remises en suspension dans 40 pi d'eau. Le volume final du mélange doit être de 1 ml.
- Placer la suspension cellulaire obtenue sur de la glace pendant 15 min.
- Transférer la suspension à la température ambiante et incuber pendant le temps nécessaire pour permettre Nanogold internalisation par endocytosis.
REMARQUE: Une absorption 5 min sera principalement conduire à l'étiquetage des vésicules d'endocytose et compartiments endosomes précoces, tandis que l'absorption de 15 min permettra de marquer le système endosomal ensemble (début et fin des endosomes). De plus longues durées d'incubation (plus de 30 min) permettront également d'étiqueter la vacuole.
REMARQUE: Des expériences de marquage pulse-chase ne peuvent pas être effectuées avec cette méthode. Par conséquent, lors de l'étiquetage pour l'analyse de LE, Nanogold sera également disponible sur le PM et l'INEE.
3. Fixation et de section
- Arrêter l'absorption d'Nanogold en ajoutant 1 ml de la double fixateur de force [paraformaldéhyde à 4% (PFA), 0,4% de glutaraldéhyde (GA) dans 0,1 M de tampon PHEM (20 mM de PIPES, 50 mM de HEPES, pH 6,9, mM EGTA 20, 4 mM de MgCl 2)], contenant 1 M de sorbitol à la suspension cellulaire. Gardé le tube à température ambiante.
- Retourner doucement manuellement les tubes de micocentrifuge plusieurs fois pendant 30 min (ce qui permettra de garder les sphéroplastes danssuspension) et puis centrifuger deux fois à 1700 g pendant 25 sec.
- Remplacer le fixateur en éliminant le surnageant et en ajoutant 1 ml de frais fixateur de force standard (2% PFA, 0,2% GA dans 0,1 M de tampon MEHP) contenant 1 M de sorbitol et incuber pendant 2 heures à température ambiante sur une roue tournant lentement.
- Traiter les cellules de cryo-découpe comme décrit précédemment 6. REMARQUE: Pour les procédures de mise en valeur d'absorption de Nanogold et d'argent, le traitement à l'acide périodique décrit dans le protocole indiqué n'a pas à être effectué. Le traitement à l'acide périodique est de mieux perméabiliser la paroi de la cellule 26, mais cette structure a été éliminée au cours de la génération de sphéroplastes.
- Couper 50 cryosections minces nm à -120 ° C avec un couteau de diamant à sec en utilisant un ultramicrotome UCT comme décrit précédemment 8 et placez-les sur le carbone revêtu Formvar 50 mailles des grilles de nickel.
4. Amélioration Argent pour Nanogold particules Visualisation
NOTE: La procédure pour préparer les mélanges de réaction est essentiellement celle indiquée par le fabricant. Adaptations pratiques utilisant ce protocole, rend la procédure de mise en valeur de l'argent efficace et fiable sur cryosections.
- Retirez le kit d'augmentation de l'argent du congélateur et décongeler dans un incubateur à 37 ° ou de bain d'eau. Lors de la décongélation, placer le kit dans un incubateur à 24 ° C placé dans une pièce sombre jusqu'à utilisation (voir 4.7).
- Placer la plaque de chauffage dans la chambre noire et le réchauffer jusqu'à la température finale de 24 ° C.
- Couvrez le dessus de la plaque chauffante avec le protecteur de surface, côté brillant vers le haut, et le fixer avec une bande.
- Placez le Parafilm sur le Benchkote et marquer les bords avec un marqueur noir pour être en mesure de voir les bords de Parafilm dans l'obscurité.
- Cassette d'un thermomètre à la partie supérieure de la Benchkote pour surveiller la température de la plaque chauffante. Ajuster progressivement la température si pas 24 ° C.
- PlaCE le tube de 50 ml avec de l'eau distillée deux fois et le kit d'augmentation de l'argent à l'intérieur.
- Remplir les petites boîtes de Pétri avec de l'eau distillée deux fois, préchauffé à 37 ° C. Placez les grilles dans l'eau, un spécimen de côté vers le bas, pendant 30 min.
- Répétez cette étape 4.7 une fois de plus.
- Transférer les grilles dans la zone de stockage et de les amener à la chambre noire.
- Rincer à nouveau les grilles en les faisant passer (avec le côté de l'échantillon vers le bas) sur plusieurs gouttes d'eau distillée deux fois à 24 ° C placés sur le Parafilm qui ont été fixés sur la plaque chauffante.
- Assurez-vous que neuf doubles gouttes d'eau distillée sont prêts supplémentaires sur le Parafilm, pour le rinçage après la réaction d'amplification de l'argent.
- Éteindre la lumière et assurez-vous que toutes les lumières sont éteintes. Allumer la lumière rouge sur.
- Sortez les solutions A et B de la trousse de mise en valeur de l'argent de l'incubateur à 24 ° C.
- Mettre six premières gouttes de la solution A puis 6 gouttes de la solution B dans un 1,5 ml microtube, et bien mélanger avec une pipette Pasteur en verre en évitant de faire des bulles. La solution est assez épaisse et il doit être mélangé manuellement avec une pipette avant de finalement vortex brièvement.
- Mettez les solutions A et B dans l'incubateur à 24 ° C et sortir la solution de C.
- Ajouter 6 gouttes de la solution de C au mélange A / B. Puis mélanger à nouveau d'abord avec une pipette Pasteur puis par vortex, éviter de faire des bulles.
- Utiliser immédiatement le mélange final en plaçant les gouttes (~ 20 ul / goutte) sur le Parafilm.
- Avec une pince à épiler, propres anti-magnétiques, placer les grilles sur le mélange (par ex., Argent améliorant la réaction) pendant 6 à 15 min en fonction de la mise en valeur (en taille des particules d'or ie.) Souhaité être obtenu.
- Retirez les grilles du mélange et de les transmettre sur le dessus de l'eau distillée deux gouttes à 24 ° C pour les lavages. Tout d'abord, utiliser successivement rapidement 6 gouttes puis 3 gouttes avec 7 min temps d'incubation par goutte, Avant d'allumer la lumière.
- Passez à l'étape suivante, soit l'étiquetage immuno-or ou membrane coloration 27 afin de visualiser le résultat d'une enquête de EM.
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Representative Results
Selon le protocole présenté, la morphologie du système de levure peut être endosome accès par transmission EM. Figure 1 montre différents types de compartiments endosomiques qui ont été atteints et, par conséquent marquées avec Nanogold. Le Nanogold d'argent améliorée peut être clairement vu que des particules denses d'électrons. Les paramètres optimaux établis pour la réaction d'amplification de l'argent permet d'avoir des particules d'or dans une gamme de taille homogène entre 5 et 15 nm, qui n'interfère pas avec l'ultrastructure de la cellule de levure. membrane plasmatique ainsi que les premiers compartiments endosomiques sont accessibles au Nanogold après une incubation de 5 min à 24 ° C (figure 1A), alors que LE, dans les corps multivésiculaires de cas présenté, sont accessibles par ces particules après au moins 30 min de l'absorption (figure 1B). Le pouvoir de résolution de combiner notre procédure IEM 8 avec le protocole d'amélioration Nanogold / argent décrit ici est nonderlined par la conservation et la qualité de la morphologie des organites représentés, en particulier les vésicules internes des corps multivésiculaires (Figure 1B).
Figure 1. L'analyse ultrastructurale de Nanogold marqué compartiments levure endosomes. Les sphéroplastes ont été obtenus à partir de la souche SEY6210 de type sauvage (MATalpha ura3-52 leu2-3, 112 his3-Δ200 trp1 lys2-Δ901-801 suc2-Δ9 mel GAL), comme décrit dans le protocole présenté. Les sphéroplastes sont ensuite incubées avec 4 nmoles de Nanogold chargé positivement à 4 ° C pendant 15 minutes avant d'être transféré à la température ambiante pendant 10 (panneau A) ou 30 min (panneau B). Les cellules ont été ensuite fixées, traitées pour cryosectioning 8 avant d'effectuer la réaction d'amplification de l'argent sur la préparation telle que décritedans le protocole présenté. A. Les premiers compartiments du système de levure endosomal. En plus de la membrane plasmique, une courte absorption de la Nanogold (5 min) permet l'étiquetage des vésicules uniques (têtes de flèche), des vésicules d'endocytose, et éventuellement des structures tubulaires (flèche), très probablement endosomes précoces. B. levure multivésiculaire ultrastructure du corps. A 30 minutes d'incubation conduit à l'étiquetage de LE / corps multivésiculaires (astérisques), mais aussi les endosomes précoces et en partie vacuoles (non représenté). M, les mitochondries; N, le noyau; PM, membrane de plasma; V, vacuole. Bar = 200 nm.
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Discussion
Immuno-microscopie électronique est une technique qui permet de combiner la localisation des protéines à la résolution ultrastructurale des transporteurs et des organites où ces protéines résident. Cela est particulièrement important lorsque l'on étudie le système levure endosomique parce que ses compartiments apparaissent comme des structures ponctuées en microscopie de fluorescence. Il est donc difficile de les distinguer. Pour cette raison, l'utilisation d'une sonde détectable par microscopie électronique et entrer dans la voie d'endocytose d'une manière dépendante du temps est cruciale pour marquer spécifiquement les différents endosomes. Ce type de sonde est utile pour évaluer la fonctionnalité de l'endocytose 6 et elle est une alternative à l'absence de détection d'antisérums marqueurs protéiques.
La procédure décrite ici exploit chargée positivement Nanogold comme une sonde pour étiqueter les endosomes. Alors que cryosectioning nécessite un équipement et des compétences particulières, le protocole présenté est techniquement facile et ne reQuire machines spéciales. Il est donc accessible à tout laboratoire qui souhaite l'utiliser pour ses recherches. Cependant, certaines précautions doivent être prises lors de l'étape critique de cette procédure, c'est à dire la réaction d'amplification de l'argent. Cette réaction est très sensible à la lumière et donc tous les feux (sauf le rouge) dans la salle doivent être éteints et / ou couvert. Comme toutes les réactions chimiques, la vitesse de la réaction d'amplification de l'argent est influencée par la température. Pour obtenir des résultats constants et reproductibles à l'aide des mêmes paramètres, les solutions et les outils doivent être soigneusement pré-incubé à 24 ° C. Il est essentiel de déterminer de manière précise le temps d'incubation pour la mise en valeur en argent dans la pièce dans laquelle cette réaction est effectuée de façon routinière. L'expansion de la Nanogold doit être suffisamment longue pour être en mesure de détecter visuellement la particule d'or par EM et doit être suffisamment court pour éviter la production de particules trop grosses, ce qui pourrait couvrir détails morphologiques. Pour cette raison, il est vivement recommandé d'effectuer une expérience pilote lors de la mise en place de cette technique dans le laboratoire. Au cours de ce test, les particules de Nanogold doivent être améliorées argent pendant des temps différents pour déterminer le moment optimal pour la réaction. Il faut noter que les dimensions des particules obtenues ne peuvent pas être d'une taille homogène; il y aura toujours une certaine hétérogénéité, mais cela doit être aussi minime que possible, dans une fourchette comprise entre 5 à 15 nm. Ceci est particulièrement important si la procédure Nanogold d'absorption sera combiné avec marquages immuno-or. Un autre aspect à garder à l'esprit lors de l'interprétation des résultats est que les expériences de marquage pulse-chase ne sont pas possibles avec cette méthode. En conséquence, le PM et EE seront également marqués dans une prise d'Nanogold visant à visualiser LE.
Il est également possible d'avoir des applications supplémentaires du protocole présenté ici. Une option pourrait être de corréler les données EM de Nanogold absorption avec microscop fluorescenty. FM4-64 est un marqueur fluorescent colorant lipophile qui associe à la PM et, sur son chemin vers la vacuole, traverse les endosomes d'une manière dépendante du temps. Les deux FM4-64 et Nanogold entrer dans la cellule en association avec des lipides et ils ont probablement cinétique d'internalisation très similaires 28,29. En conséquence les deux colorants peuvent être utilisés en même temps dans corrélative lumière EM approches à explorer simultanément la dynamique et l'ultrastructure de l'endocytose compartments.The présenté méthode peut également être utilisé pour le trafic médiée par le récepteur par le système d'endocytose 30. Les dérivés mono-et Monomaleido sulfo-N-hydroxy-succinimido du Nanogold peuvent être utilisés pour lier de manière covalente à des protéines à ces particules 6. Par exemple la reticulation avec la a-ou le α-facteur peut permettre à la suite de l'endocytose de ces deux phéromones par leurs récepteurs spécifiques.
Tous ensemble, le protocole décrit permet à specifically étiqueter les organites de la levure système endosomal en utilisant une sonde endocytose, ce qui peut être fait par EM détectable. Cet outil expérimental est une approche intéressante pour étudier la biogenèse et l'organisation des compartiments levure endosomales au niveau ultrastructural.
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Acknowledgments
Les auteurs remercient René Scriwanek pour l'aide à la préparation de la figure. FR est soutenu par ECHO (700.59.003), ALW Open Program (821.02.017 822.02.014 et), la coopération DFG-NWO (DN82-303) et ZonMw VICI (016.130.606) de subventions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
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