Summary
酵母、 サッカロマイセス·セレビシエは 、エンドソーム系の生合成と機能を調節する遺伝子を同定し、研究するための重要なモデル生物となっている。ここでは、超微細構造の研究のためのエンドソーム区画の特異的標識のための詳細なプロトコルを提示する。
Abstract
エンドソームは、真核細胞の主要な膜ソートのチェックポイントの一つであり、彼らは主に、細胞膜やゴルジ体からのタンパク質のリサイクルや破壊を調節する。その結果、エンドソーム系は、細胞の恒常性を維持する上で中心的な役割を果たしており、小胞輸送によって相互接続オルガネラのこのネットワークに属する遺伝子の変異は、がんや神経生物学的障害を含む深刻な病状を引き起こす。これは、エンドソーム系の生物発生と組織のメカニズムを理解することは、プライム関連性のある。酵母Saccharomyces cerevisiaeが 、この作業において極めて重要となっている。特にこのモデル生物のエンドソームシステムにラベルを付け、超微細構造レベルで解析するために、我々はここで銀増強反応によりこれらの粒子の可視化に続いてスフェロによって正に帯電したナノ金の取り込みのための詳細なプロトコルを提示する。この方法はあまりにも貴重なものですエンドソーム輸送における欠陥を有する突然変異体の形態学的検査のためのL。また、それのみならず、超微細構造検査のために適用可能であるが、それはまた、タンパク質の局在の調査のための免疫金ラベル付けと組み合わせることができる。
Introduction
エンドソーム系は、1,2受容体リソソーム酵素ソーティング受容体のトラフィッキング及び原形質膜（PM）のリサイクルを含む複数の重要な細胞の役割を果たしている主要な膜選別装置である。エンドソームは、3つの異なるコンパートメント、 すなわち分割されている。初期エンドソーム（EE）、後期エンドソーム（LE）と、リサイクルエンドソーム。この分類は、特定のマーカータンパク質に及び、それらの形態で、それらに到達するためにエンドサイトーシスされた物質のにかかる時間に基づいている。膜は、午後から内部化すなわちタンパク質と脂質二重層は、分解のためにエンドソームを経由してリソソームに送達するか、または再循環する。膜はまた、ゴルジ体からエンドソームに輸送し、同様に、いずれのリソソームに継続するか、戻ってゴルジに検索することがされています。さらに、タンパク質は、エンドソーム境界膜の形成に至る過程から内方出芽管腔小胞に分類することができLEのサブカテゴリ、多胞体。
酵母エンドソーム系は、高い真核細胞のものよりも比較的複雑である。酵母エンドソームは、EEとLEに分かれています。哺乳動物細胞とは対照的に、それらはリサイクルエンドソームでなく、組織特異的なリソソーム関連オルガネラを含まない。そのため彼らは、エンドソーム人身売買ルート3,4の少ない複雑なネットワークを持っている。そのため酵母が表現され、今でもエンドソーム系に膜輸送の基礎となる原則のいくつかを研究するための有利な実験系を表しています。この利点は、エンドソーム経路に関与する多数の遺伝子が最初に酵母5での遺伝子スクリーニングで単離されているという事実によって強調される。 野生型および変異細胞における酵母エンドソーム系は広く生化学的および蛍光顕微鏡法アプローチを用いて研究してきたが、超微細構造レベルでの調査のみであった最小限。エンドソーム小器官のほとんどは彼らの明確な同定6困難に蛍光顕微鏡で断続構造として検出されるため、形態学的分析は、酵母において特に関連する。残念ながら、酵母エンドソームタンパク質マーカーを認識し、抗血清の限られた数は、（IEM）準備7月10日免疫電子顕微鏡で働いている。いくつかのタンパク質については、この問題は、目的の遺伝子の内因性のタグ付けとそれ7,11,12を検出するためのタグを認識する抗体を使用することによって回避されている。多くの場合、しかし、タンパク質が低いため発現レベルのIEMによって検出されない。この方法は細胞小器官の形態/機能にミス局在および/または変更を誘導することができるので、その過剰発現は、解決策ではありません。このように、電子顕微鏡EMによって検出可能なプローブを用いたエンドサイトーシス区画のラベルは、効果的なオプションです。これは、特にPR場合に最適なソリューションです。OBEは、特定の細胞小器官6を迎えます時に知ることができ、時間依存的にエンドサイトーシス経路を、入力している。
酵母スフェロプラスト（細胞壁が酵素的に除去されている、すなわち酵母）によって正に帯電したナノ金の取り込みに成功した酵母エンドソーム区画10は識別するのに使用されている。これらの粒子は強く、生体膜を構成する負に帯電した脂質に結合する。このようにPMと正に帯電したナノゴールドアソシエイツは、エンドサイトーシスによって細胞に浸透し、空胞に到達する前に、EEとLEを通過する。これらの小さな金粒子は、しかしながら、EMによって見られるように適切なサイズを有していない。彼らは目に見えるレンダリングするには、その大きさは、金型プローブ13〜15の周囲に銀や金の析出につながる化学反応によって拡大することができる。我々が開発され、首尾よく実行するために細胞内徳安法に基づくIEMアプローチを適用しているローカリゼーションは、8,16を研究。この方法では、形態学8,17-24の優れた分解能で酵母の準備に免疫金標識化を行うことができます。我々はまた、酵母エンドソーム系コンパートメント6のナノゴールドラベルとこのIEMプロトコルを組み合わせた手順を確立しています。我々は、形態学的に欠陥6,25エンドソーム輸送で変異体をエンドソームの異なるサブクラスを特徴とする超微細構造を調べてきたこのアプローチを使用する。また、我々は、このナノゴールド標識は異なるエンドソーム小集団に、目的のタンパク質の分布を探索する可能性を提供免疫金ラベル付けと組み合わせることができることを実証した。ここでは、正に帯電したナノゴールドと酵母エンドソームシステムの標識は、実質的にどのように実行されるか提示します。
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Protocol
1。スフェロプラストの準備
- 実験の設計によって決定された適切な培地10ml中で30℃で一晩酵母をインキュベートする。
- 翌日、設計しない限り、光度計を用いて600nmで（OD 600）での培養物の光学密度を測定する0.2〜0.4のOD 600に同じ培養培地中で細胞を希釈し、指数増殖期にそれらを成長させる実験は、異なる条件を必要とします。培養がOD 1-2の600を持っている時に細胞が指数増殖期にある。
- 50mlチューブ中で5分間、3,500×gで遠心分離することによって細胞の10 OD 600当量を収集する。遠心分離の後、上清を捨てる。
- 100mMのPIPES（pH9.6）中の5mlの10mMジチオスレイトール、10分間30℃でインキュベートして細胞ペレットを再懸濁。
- 5分間3500×gで再び遠心分離して細胞を回収します。上清を捨てる。
- 細胞を再懸濁Inは1 Mソルビトールおよび溶菌酵素5mgを含有する（実験の設計によって決定される）、そして穏やかに30分間振とうしながら30℃で混合物をインキュベートする培地5ml。
- スフェロプラストに対応するペレット分画を回収し、5分間300×gで細胞懸濁液を遠心分離する。上清を捨てる。
- 氷冷たいメディアの960μlのフェロプラストを再懸濁し、1Mのソルビトールを含む（メディア実験の設計によって決定される）、アイス冷2 mlマイクロチューブに混合物を移す。
2。ナノ金取り込み
- ピペットを使用して、静かに水40μlに再懸濁させ、正に帯電しナノゴールド粒子の4ナノモルでフェロプラストをミックス。混合物の最終容量を1mlとする必要がある。
- 15分間氷上で得られた細胞懸濁液を置きます。
- 室温でサスペンションを転送し、Eによりナノゴールド内在化を可能にするために必要な時間のためにそれをインキュベートndocytosis。
注：15分の取り込みが全体エンドソームシステム（初期および後期エンドソーム）をマークすることを許可する一方、5分間の取り込みは、主に、細胞内小胞と早期エンドソーム区画のラベル付けにつながる。長いインキュベーション時間（30分以上）も、空胞を標識することを許可します。
NOTE：パルスチェイス標識実験は、この方法を行うことができない。 LEの分析のためにラベル付けする際にそのため、ナノゴールドもPMおよびinEEにあります。
3。固定と分割
- 2倍濃度の固定液を1ml添加することにより、ナノゴールド取り込みを停止する[4％パラホルムアルデヒド（PFA）、0.1 M PHEM緩衝液中の0.4％グルタルアルデヒド（GA）（20mMのPIPES、50mMのHEPES、pH6.9の、20mMのEGTA、4のMgCl 2）]を細胞懸濁液に1Mソルビトールを含有する。室温でチューブを保った。
- 優しく（これがフェロプラストを維持するために可能にする30分の間にmicocentrifugeチューブを手動で数回転倒懸濁液）してから25秒間1700×gで二度遠心する。
- 1Mソルビトールを含有し、ゆっくりと回転するホイール上で室温で2時間インキュベート上澄みを捨てたと（0.1M PHEM緩衝液中の2％のPFA、0.2％GA）の新鮮な標準強度固定液1ミリリットルを追加することにより、固定液を交換してください。
- 以前に説明したように6クライオ切片化のための細胞を処理する。 NOTE：ナノゴールド取り込みおよび銀増強する手順については、指定されたプロトコルに記載の周期的な酸処理を行うことがないようにしている。過ヨウ素酸処理は、より良いセル壁26を透過することであるが、この構造は、スフェロプラストの生成中に除去されている。
- 以前8に記載されているようUCTウルトラを用いたドライダイアモンドナイフで-120℃で50 nmの薄凍結切片を切り取り、50はニッケルグリッドメッシュコーティングされたホルムバール炭素上に置きます。
ナノ金粒子映像設備のための4。銀強化lization
注：反応混合物を製造するための手順は、基本的には、製造業者が示す1です。このプロトコルを使用して実用的な適応は、凍結切片上で効果的かつ信頼性の高い銀増強手順を行う。
- 冷凍庫から銀増強キットを削除し、37℃インキュベーターまたは水浴中で解凍。解凍した場合には、使用するまで、暗い部屋の中に置かれ24℃のインキュベーター（4.7参照）でキットを配置。
- 暗い部屋で熱板を置き、24℃の最終温度まで温める
- 表面保護、光沢のある面を上にして加熱プレートの上部を覆い、テープで固定します。
- Benchkoteにパラフィルムを配置し、暗所にパラフィルムの端を見ることができるようにするために黒のマーカーでエッジをマーク。
- 熱板の温度を監視するBenchkoteの上に温度計をテープで固定します。徐々に温度を調整しない場合は、24℃
- ナンプラー蒸留水や内部の銀増強キットで50ミリリットルチューブをCE。
- 再蒸留水を用いて小型のペトリ皿を埋め、37℃で予め温め試料は30分間、上下左右、水にグリッドを配置します。
- この4.7ステップ1より多くの時間を繰り返します。
- 収納ボックスにグリッドを転送し、暗い部屋にそれらをもたらす。
- 加熱プレート上に固定されているパラフィルム上に置かれ24℃の蒸留水を数滴に（下に試料側に）、それらを渡すことによって、再びグリッドを洗浄します。
- 9追加の蒸留水の水滴が銀増強反応後の洗浄に、パラフィルム上で準備ができていることを確認してください。
- 光をオフにして、すべてのライトが消えていることを確認してください。赤色光をオンにします。
- 24℃のインキュベーターから銀増強キットのAとBのソリューションを取り出します。
- 最初のA液6滴と1.5メートルのB液を6滴入れLマイクロチューブ、気泡を作るために避けてガラスパスツールピペットでよく混ぜる。溶液は非常に厚く、それが最終的に手動で簡単にそれをボルテックスする前にピペットで混合しなければならない。
- 24℃のインキュベーター中でAとBのソリューションを戻し、C溶液を取り出します。
- A / BミックスにC溶液6滴を追加します。その後、パスツールピペットで最初再び混合し、次いでボルテックスにより、気泡を作ることは避けてください。
- パラフィルム上（〜20μL/ドロップ）滴を配置することで、すぐに最終的な混合物を使用してください。
- クリーン、耐磁ピンセットで、得られることを望んだ機能拡張（金粒子のつまり 。サイズ）によっては6〜15分間混合物（ 例えば 、銀強化反応）にグリッドを配置します。
- 混合物からグリッドを取り外し、洗浄液を24℃で低下し、二重蒸留水の上に渡します。まず、急速に連続して6滴での使用、ドロップあたりの7分のインキュベーション時間で3滴、ライトをオンにする前に。
- 次のステップは、EM調査のために、結果を可視化するために免疫金標識または膜染色27のいずれかに進みます。
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Representative Results
提示されたプロトコールに従って、酵母エンドソーム系の形態は、送信EMによってアクセスすることができる。 図1に達し、したがって、ナノゴールドで標識されているエンドソーム区画の異なるタイプを示している。銀増強ナノ金は明らかに電子密度の高い粒子として見ることができます。銀増強反応のために確立された最適な設定は、酵母細胞の超微細構造を妨害しない5〜15 nmの均質なサイズ範囲内の金粒子を有することができる。原形質膜だけでなく、LEは、提示された場合多胞体で、取り込みの少なくとも30分（ 図の後に、これらの粒子によって到達可能であるが、早期エンドソーム区画は、24℃で5分間のインキュベーション（ 図1A）の後にナノ金にアクセス可能である1B）。ナノ金/銀増強プロトコルで我々のIEM手順8を組み合わせる分解能はここで説明され、未多胞体（ 図1B）の内部小胞、特に示さ小器官の形態の保存と品質によってderlined。
図1。ナノゴールドラベル酵母エンドソーム区画の超微細構造解析 。提示されたプロトコルで説明されているようフェロプラストは、野生型SEY6210株（MATalpha URA3-52 LEU2-3、112 HIS3-Δ200のTRP1-Δ901LYS2-801 SUC2-Δ9MEL GAL）から得た。スフェロプラストを、次いで、10（パネルA）、30分（パネルB）を、室温に転送される前に、15分間、4℃で正に荷電したナノ金の4ナノモルと共にインキュベートした。その後、細胞を記載のように調製上の銀増強反応を実施する前に、固定された8を凍結切片用に処理した提示されたプロトコルである。酵母エンドソームシステムのA.初期のコンパートメント。細胞質膜に加えて、ナノゴールド（5分）の短い取り込みは、単一小胞（矢印）、おそらくエンドサイトーシス小胞、および管状構造（矢印）の、可能性が非常に高い初期エンドソームを標識することができます。 B.酵母多胞体ボディ超微細構造。 30分のインキュベーションは、LE /多胞体（アスタリスク）のラベルにつながるだけでなく、初期エンドソームと部分的には空胞（図示せず）。男、ミトコンドリア; N、核; PM、原形質膜; V、液胞。バー= 200nmである。
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Discussion
免疫電子顕微鏡は、これらのタンパク質が存在するキャリアや細胞小器官の超微細構造の分解能でタンパク質の局在を組み合わせることが可能な技術である。酵母エンドソームシステムを研究する際に、その区画は蛍光顕微鏡のように断続構造が表示されますので、これは特に重大である。これは、それらを区別することは困難である。このような理由から、EMによって検出可能と時間依存的にエンドサイトーシス経路に入るプローブの使用は、異なるエンドソームを明確にマークすることが重要です。プローブのこのタイプは、エンドサイトーシス6の機能性を評価することは価値がある、それはタンパク質マーカーを検出する抗血清の不足に代わるものです。
ここで説明する手順では、積極的にエンドソーム区画を標識するプローブとしてナノ金を請求利用する。凍結切片は、特別な装置や技術を必要としながら、提示されたプロトコルは、技術的に容易であり、再ません特殊な機械を帖。そのためには、研究のためにそれを使用したい任意の研究室にアクセスできます。しかし、いくつかの注意事項が銀増強反応すなわち、この手順の重要なステップの間に入れなければならない。この反応は、光に非常に敏感であるため、部屋の中で（赤1を除く）は、すべてのライトがオフになって、および/またはカバーされなければならない。全ての化学反応のように、銀増強反応の速度は温度によって影響される。同じパラメータを使用して、一貫性のある再現性のある結果を得るためには、すべてのソリューションやツールを慎重に24℃でプレインキュベートされなければならないこれは、正確にこの反応は日常的に行われる室内の銀増強のためのインキュベーション時間を確立することが重要である。ナノゴールドの膨張を目視EMによって金粒子を検出できるようにするために十分に長くなければならず、形態学的な細部を覆う可能性がある、大きすぎる粒子の発生を回避するのに十分に短くなければならない。このため、実験室でこのテクニックを設定するときに温かくパイロット実験を実行することを示唆している。この試験中にナノ金粒子は、銀反応のための最適な時間を決定するために、異なる時間増強しなければならない。注目すべきは、得られた粒子の寸法は、均質なサイズのものにすることはできません。そこには常にいくらかの不均一性であるが、これは5の間の範囲内で、可能な限り最小限に保たれなければならないであろう - は15nm。ナノゴールド取り込み手順が免疫金ラベリングと組み合わされる場合、これは特に重要である。結果を解釈する際に留意すべき別の態様は、パルスチェイス標識実験は、この方法では不可能なことである。その結果、PMおよびEEもLEを視覚化することを目的としたナノ金の取り込みにラベルが付けられます。
それは、ここで紹介するプロトコルの追加アプリケーションを参照することも可能です。オプションでは、蛍光microscopとナノゴールド取り込みのEMデータを相関させることができたY。 FM4-64は、PMと、液胞への途中での会合は、時間依存的にエンドソーム区画を通過する親油性の蛍光マーカー色素である。 FM4-64とナノ金の両方が、脂質に関連して、細胞に入り、彼らはおそらく非常によく似た内部移行動態28,29を持っている。その結果、両方の色素が光相関-EMで同時に使用することができるが同時に動的に探索するために接近し、エンドサイトーシスcompartments.Theの超微細構造は、方法は、エンドサイトーシスシステム30を介して受容体媒介売買するために使用することができる示した。ナノ金のMonomaleidoおよびモノ- スルホ -N-ヒドロキシ-スクシンイミド誘導体は、共有結合タンパク質6にこれらの粒子を結合するために使用することができる。例えばA-またはα因子による架橋は、お客様の特定の受容体によるこれら2フェロモンのエンドサイトーシスを次許可することができます。
すべて一緒に、記載されているプロトコルが仕様することができますifically EMによって検出することができ、エンドサイトーシスプローブを用いて、酵母エンドソーム系の細胞小器官にラベルを付ける。この実験的なツールは、超微細構造レベルでの酵母エンドソーム区画の生合成と組織を研究する貴重なアプローチです。
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Acknowledgments
著者らは、図の作成の支援のためにルネScriwanekに感謝します。 FRがエコー（700.59.003）、ALWオープンプログラム（821.02.017や822.02.014）、DFG-NWO協力（DN82-303）とZonMW VICI（016.130.606）の補助金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
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