Summary
Дрожжи, Saccharomyces CEREVISIAE, является одним из ключевых модельный организм для выявления и изучения генов, регулирующих биогенез и функции системы эндосомный. Здесь мы представляем подробный протокол для конкретного маркировке эндосомных отсеков для ультраструктурных исследований.
Abstract
Эндосомы являются одним из основных мембраны сортировки контрольно-пропускные пункты в эукариотических клетках и регулируют утилизацию или уничтожение белков в основном из мембраны плазмы и Гольджи. В результате система эндосомный играет центральную роль в поддержании гомеостаза клетки, и мутации в генах, принадлежащих к этой сети органелл, соединенных между собой везикулярного транспорта, вызвать серьезные патологии, включая рак и нейробиологических расстройств. Поэтому первостепенное значение для понимания механизмов, лежащих в основе биогенеза и организацию системы эндосомный. Дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE уже сыграли ключевую роль в решении этой задачи. Чтобы специально маркировать и анализировать на ультраструктурном уровне в эндосом систему этого модельного организма, мы представляем здесь подробный протокол для положительно заряженной поглощения Нанозолото по сферопластов последующим визуализации этих частиц через реакции повышения серебра. Этот метод также является ценным слишкомл для морфологического исследования мутантов с дефектами торговли эндосомный. Кроме того, он применим не только для ультраструктурных экзаменов, но он также может быть объединена с immunogold маркировок для локализации белка исследований.
Introduction
Система эндосомный является одним из основных мембрана сортировка аппарат, который играет несколько важных клеточных функций, включая торговлю лизосомальных ферментов сортировки рецепторов и утилизации мембране (PM) рецепторов 1,2. Эндосомы делятся в трех различных отсеков, то есть. ранние эндосомы (EE), поздние эндосомы (LE) и эндосомы утилизации. Эта классификация основана на время, необходимое для эндоцитарных материала для их достижения, на конкретных маркерных белков и их морфологии. Мембраны, то есть белковые и липидные бислои, интернализованные от премьер-министра может быть либо доставлен лизосом через эндосомах деградации или быть возвращен. Мембраны также транспортируется в эндосомах от Гольджи и, аналогично, либо продолжать лизосом или быть получены обратно в Гольджи. Кроме того, белки можно разделить на просвета пузырьков начинающим внутрь от эндосомный ограничения мембраны, процесс, который приводит к образованиюподкатегория LE, то мультивезикулярные органы.
Система эндосом дрожжи относительно менее сложным, чем у высоких эукариотических клетках. Дрожжи эндосомы делятся на ЭО и LE. В отличие от клеток млекопитающих они не содержат переработки эндосомы, но и тканеспецифические лизосомы, связанных с органеллы. Следовательно, они имеют менее сложную сеть маршрутов эндосомных торговли людьми 3,4. Поэтому дрожжи представлял и до сих пор представляет собой выгодное экспериментальной системы для изучения некоторых из принципов, лежащих мембраны трафика в системе эндосомный. Это преимущество подчеркивается тем фактом, что многочисленные гены, участвующие в эндосомных путей были первоначально изолированных с генетическими экранах в дрожжах 5. В то время как система эндосомный дрожжи в дикого типа и мутантных клеток была тщательно изучена с помощью биохимических и флуоресцентных подходы микроскопии, ее исследование в ультраструктурном уровне только былминимальным. Морфологические анализы особенно актуальны в дрожжах, потому что большинство эндосомных органелл определяются как знаки препинания структур с помощью флуоресцентной микроскопии, которые делают трудным их Однозначная идентификация 6. К сожалению, только ограниченное число антисыворотками признавая белковых маркеров дрожжи эндосомные работает в иммуно-электронной микроскопии (IEM) препараты 7-10. Для некоторых белков, эта проблема была преодолена путем эндогенного мечения интересующего гена и использование антитела, распознающего тег, чтобы обнаружить его 7,11,12. Часто, однако, белки не обнаруживается IEM из-за их низкого уровня экспрессии. Их экспрессия не является решением, потому что такой подход может вызвать неправильное локализации и / или изменения в органелл морфологии / функций. Таким образом, маркировка из эндоцитотических отсеков с зондом обнаруживаемых с помощью электронной микроскопии EM является эффективным методом. Это оптимальное решение, особенно если пр.ОБЕ входит в эндоцитического маршрут в зависимости от времени, что позволяет узнать, когда это будет означать определенную органеллу 6.
Поглощение положительно заряженного нанозолотом дрожжевыми сферопластов (т.е.. Дрожжевых где клеточная стенка была ферментативно удалены) успешно используется для выявления дрожжи эндосомный отделений 10. Эти частицы сильно связываются с отрицательно заряженных липидов, составляющих биологические мембраны. Таким образом, положительно заряженные Нанозолото ассоциируется с ПМ, проникает в клетку путем эндоцитоза и проходит через ЭО и LE до достижения вакуоль. Эти мелкие частицы золота, однако, не имеют подходящий размер, чтобы быть замеченными EM. Чтобы сделать их видимыми, их размер может быть увеличен за счет химических реакций, которые приводят к отложению серебра или золота вокруг золотого зонда 13-15. Мы разработали и успешно применяется подход IEM на основе метода Tokuyasu выполнять субклеточнаялокализация изучает 8,16. Этот метод позволяет выполнять immunogold маркировку на дрожжевых препаратов с отличным разрешением морфологии 8,17-24. Мы также установил процедуру, сочетающий этот протокол IEM с Нанозолото маркировки системы дрожжи эндосомный отсеков 6. Используя этот подход, мы морфологически характеризуются различные подклассы эндосомах и ультраструктурному анализу мутантов с людьми эндосомный дефект 6,25. Более того, мы показали, что это Нанозолото маркировки могут быть объединены с immunogold маркировок обеспечивая возможность изучить распределение белка имеется заинтересованность, на различных субпопуляций эндосом. Здесь мы представляем, как маркировка системы дрожжи эндосомный с положительно заряженным нанозолотом практически выполнена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сферопластного Подготовка
- Инкубировать дрожжи в течение ночи при 30 ° С в 10 мл соответствующей среды определяется конструкцией эксперимента.
- На следующий день после измеряют оптическую плотность культуры при 600 нм (OD 600) с использованием фотометра, Развести клетки в той же культуральной среде до оптической плотности 0,2-0,4 600 и выращивают их в экспоненциальной фазе роста, если конструкции Эксперимент требует иного состояние. Клетки в экспоненциальной фазе, когда культура имеет OD 600 из 1-2.
- Сбор 10 OD 600 эквивалентов клеток путем центрифугирования при 3500 х г в течение 5 мин в 50 мл пробирку. После центрифугирования отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл 100 мМ трубы (рН 9,6), 10 мМ дитиотреитола и инкубируют при 30 ° С в течение 10 мин.
- Сбор снова клеток путем центрифугирования при 3500 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют клеток ян 5 мл среды (определяется конструкцией эксперимента), содержащего 1 М сорбит и 5 мг литического фермента, и инкубируют смесь при 30 ° С при осторожном встряхивании в течение 30 мин.
- Центрифуга клеточной суспензии при 300 х г в течение 5 мин, чтобы собрать фракцию гранул, что соответствует Сферопласты. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют сферопластов в 960 мкл охлажденного льдом среды (среда определяется конструкцией эксперимента), содержащего 1 М сорбит и передавать смесь в охлажденный льдом 2 мл микроцентрифужных трубки.
2. Нанозолото Поглощение
- С помощью пипетки, осторожно перемешать с сферопластного 4 нмоль положительно заряженных частиц нанозолота ресуспендировали в 40 мкл воды. Конечный объем смеси должна быть от 1 мл.
- Поместите полученную клеточную суспензию на льду в течение 15 мин.
- Передача суспензии при комнатной температуре и инкубировать его в течение необходимого времени, чтобы позволить Нанозолото интернализации по электроннойndocytosis.
ПРИМЕЧАНИЕ: поглощение 5 мин будет принципиально привести к маркировке эндоцитотических пузырьков и начале эндосомных отсеков, в то время как поглощение 15 мин позволит отмечать всю систему эндосом (ранние и поздние эндосомы). Более длительное время инкубации (более 30 мин) также позволит маркировать вакуоль.
Примечание: Пульс-чейз-эксперименты маркировки не может быть выполнена с помощью этого метода. Таким образом, при маркировке для анализа LE, Нанозолото также можно найти на PM и МСОЧС.
3. Фиксация и Секционирование
- Стоп поглощение Нанозолото добавлением 1 мл двойного фиксатора прочности [4% параформальдегид (PFA), 0,4% глутаральдегид (GA) в 0,1 М ФЭУ буфера (20 мМ ТРУБЫ, 50 мМ HEPES, рН 6,9, 20 мМ EGTA, 4 мМ MgCl 2)], содержащего 1 М сорбит к клеточной суспензии. Kept трубки при комнатной температуре.
- Аккуратно перевернуть вручную micocentrifuge трубок несколько раз в течение 30 мин (это позволит сохранить сферопластов вподвеска) и затем центрифуги его дважды в 1700 мкг в течение 25 сек.
- Заменить фиксатором путем отбрасывания супернатант и путем добавления 1 мл свежей стандартной прочности фиксатором (2% PFA, 0,2% GA в 0,1 М буфере ФЭУ), содержащего 1 М сорбит и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре на медленно вращающемся колесе.
- Процесс клетки для крио-срезов, как описано выше 6. Примечание: для процедур повышения поглощения Нанозолото и серебра, лечение периодический кислота описано в указанном протоколе не должны быть выполнены. Лечение периодический кислота является более проницаемыми клеточную стенку 26, но эта структура была ликвидирована при генерации сферопластов.
- Вырезать 50 нм тонкие криосрезы при -120 ° С с сухим алмазного ножа с помощью UCT ультрамикротоме, как описано выше 8 и разместить их на формвар углерода, покрытой 50 входит в зацепление никеля сетки.
4. Серебряный расширение для Нанозолото частиц видеотехникализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура подготовить реакционных смесей в основном тот, который указан заводом-изготовителем. Практические приспособления, использующие этот протокол, делает процедуру повышения серебро эффективным и надежным на криосрезов.
- Извлеките набор усиления серебра из морозильника и разморозить его в 37 ° С инкубатор или водяной бане. Когда оттаивают, разместить комплект в инкубаторе 24 ° C, помещены в темной комнате до использования (см. 4.7).
- Поместите плиту топления в темной комнате и прогрейте его до конечной температуры 24 ° C.
- Обложка начало нагревательной пластины с поверхностью протектора, блестящей стороной вверх, и закрепите его при помощи ленты.
- Поместите парафильмом на Benchkote и отметьте края с черным маркером, чтобы иметь возможность видеть края парафильмом в темноте.
- Лента термометр на верхней части Benchkote контролировать температуру нагревательного элемента. Постепенно регулировать температуру, если не 24 ° С.
- Пласе в 50 мл трубки с двойным дистиллированной воды и повышения серебро комплекта внутри.
- Заполните небольшие чашки Петри с дважды дистиллированной воде, предварительно нагретого до 37 ° С. Поместите сетки в воде, образец стороной вниз, в течение 30 мин.
- Повторите этот шаг 4.7 еще раз.
- Перенесите сетки в ящик для хранения и привести их в темную комнату.
- Промыть решетки снова, пропуская их (с образца стороной вниз) на нескольких капель дважды дистиллированной воде при 24 ° С, размещенных на Parafilm, что было зафиксировано на нагревательной пластине.
- Убедитесь, что 9 дополнительных двойных капли дистиллированной воды готовы на парафильмом, для ополаскивания после реакции повышения серебро.
- Выключи свет и убедиться, что все освещение выключено. Поверните красный свет.
- Выньте решения А и В из усиливающего серебро комплекта из инкубатора 24 ° C.
- Положите первые 6 капель раствора А, а затем 6 капель раствора В в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, и хорошо перемешать со стеклянной пипетки Пастера, избегая, чтобы сделать пузыри. Решение довольно толстый и он должен быть вручную смешивали с пипеткой пока, наконец, встряхивая его кратко.
- Положите решения А и В обратно в инкубатор 24 ° C и вынуть C решение.
- Добавить 6 капель С решения смеси A / B. Затем смешать снова сначала с помощью пипетки Пастера и затем на вортексе, избежать пузырьков.
- Используйте сразу готовой смеси путем размещения капли (~ 20 мкл / падение) на парафильмом.
- С чистой, анти-магнитных пинцетом, положите решетки на смеси (серебро повышения реакционной например.) В течение 6 до 15 мин в зависимости от повышения (то есть. Размер частиц золота) хотел получить.
- Удаление сетки из смеси и передавать их на верхней части бидистиллированной воды падает при 24 ° С в течение стирок. Во-первых, использовать в быстро подряд 6 капель, а затем 3 капли с 7 мин времени инкубации на падение, До поворота огни.
- Перейдите к следующему шагу, либо иммуно-золотой маркировки или мембранного окрашивания 27 для того, чтобы визуализировать результат для EM расследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Согласно представленной протокола, морфология системы дрожжи эндосом может быть доступ по EM передачи. Рисунок 1 показывает различные типы эндосомных отсеков, которые были достигнуты, и поэтому меченные нанозолотом. Серебро повышенной Нанозолото можно ясно увидеть, как электронно плотных частиц. Оптимальные параметры, установленные для реакции повышения серебра позволяет иметь частицы золота в однородной диапазоне размеров от 5 до 15 нм, что не мешает ультраструктуры дрожжевой клетки. Плазменные мембраны, а также ранние эндосомных отсеки доступны для нанозолотом после 5 мин инкубации при 24 ° С (рис. 1А), а LE, в обсуждаемом случае мультивезикулярных органов, можно добраться на этих частиц после по крайней мере 30 минут поглощения (рис. 1В). Разрешающая способность объединения нашего процедуру IEM 8 с протоколом повышения Нанозолото / серебра, описанный здесь, ипderlined по сохранению и качества морфологии показанных органелл, в частности внутренние пузырьки из самых мультивезикулярных органов (рис. 1б).
Рисунок 1. Ультраструктурный анализ нанозолота помечены дрожжи эндосом отсеков. Сферопласты были получены из SEY6210 штамма дикого типа (MATalpha ura3-52 leu2-3, 112 his3-Δ200 trp1-Δ901 lys2-801 SUC2-Δ9 мел GAL), как описано в представленном протоколе. Сферопласты затем инкубировали с 4 нмоль положительно заряженного нанозолотом при 4 ° С в течение 15 мин перед передачей комнатной температуре в течение 10 (панель А) или 30 мин (панель B). Клетки последующей фиксации, обрабатываются для cryosectioning 8 до проведения реакции усиления серебра на Получение, как описанов представленном протоколе. А. Ранние отсеки системы дрожжи эндосомный. В дополнение к плазматической мембране, короткий поглощение в нанозолотом (5 мин) позволяет маркировки отдельных пузырьков (стрелки), возможно эндоцитотических везикулы и трубчатых конструкций (стрелка), весьма вероятно ранних эндосом. Б. Дрожжи мультивезикулярных тело ультраструктура. 30 мин инкубации приводит к маркировке LE / мультивезикулярных органов (звездочки), но и ранних эндосом и отчасти вакуолей (не показано). М, митохондрии; N, ядро; PM, плазматическая мембрана; В, вакуоль. Бар = 200 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Иммуно-электронно-микроскопическое является метод, который позволяет объединить локализацию белков с ультраструктурном разрешением носителей и органелл, где эти белки проживают. Это особенно важно при изучении системы дрожжи эндосом, потому что ее отсеки выглядят как знаки препинания структуры в флуоресцентной микроскопии. Поэтому трудно различать их. По этой причине использование зонда, обнаруживаемого EM и ввода эндоцитического маршрут в течение времени зависимым образом имеет решающее значение в специально отметить различные эндосомы. Этот тип зонда ценно, чтобы оценить функциональность эндоцитоза 6 и это является альтернативой отсутствия антисыворотки обнаружения белковых маркеров.
Описанная здесь процедура эксплойт положительно заряженные Нанозолото в качестве зонда для обозначения эндосомные отсеков. В то время как cryosectioning требуется специальное оборудование и навыки представлены протокол, технически просто и не повторнодесть специальные машины. Поэтому она доступна для любой лаборатории, которые хотели бы использовать его для своих исследований. Тем не менее, некоторые меры предосторожности должны быть приняты в течение критического шаге этой процедуры, то есть реакции повышения серебро. Эта реакция является очень чувствительным к свету и, следовательно, все фонари (кроме красного) в комнате должны быть выключены и / или закрывать. Как и все химические реакции, скорость реакции повышения серебро зависит от температуры. Чтобы получить последовательные и воспроизводимые результаты с теми же параметрами, все решения и инструменты должны быть тщательно предварительно инкубировали при 24 ° С Крайне важно, чтобы точно установить время инкубации для повышения серебра в комнате, где будет выполняться регулярно эта реакция. Расширение нанозолотом должен быть достаточно длинным, чтобы иметь возможность визуально обнаружить частиц золота на ЭМ и должен быть достаточно коротким, чтобы избежать генерацию негабаритных частиц, которые могли бы охватывать морфологические данные. По этой причине, он тепло предлагается выполнить пилотный эксперимент при настройке этот метод в лаборатории. Во время этого испытания частицы Нанозолото должны быть серебро расширенные течение различного времени для определения оптимального времени для реакции. Следует отметить, что размеры полученных частиц не может быть однородной размера; будет всегда некоторые неоднородность, но это должно быть минимально возможным, в диапазоне между 5 - 15 нм. Это особенно важно, если процедура поглощения Нанозолото будет сочетаться с иммуно-золотых маркировок. Другой аспект, который необходимо иметь в виду при интерпретации результатов является то, что импульс-погони эксперименты маркировки не возможно с помощью этого метода. Следовательно, премьер-министр и EE будет также помечены в Нанозолото поглощения направленной на визуализировать LE.
Кроме того, можно видеть дополнительные приложения протокола, представленного здесь. Опцион может быть соотнести данные ЭМ поглощения Нанозолото с флуоресцентным микротрещину. FM4-64 является липофильным флуоресцентный маркер краситель, который сопоставляет ПМ и, на своем пути к вакуоли, проходит через эндосомных отсеков в зависимости от времени. Оба FM4-64 и Нанозолото проникают в клетку в сочетании с липидами и они, вероятно, очень похожие интернализации кинетики 28,29. В результате оба красители могут быть использованы одновременно в корреляционной световой EM подходы к одновременно исследовать динамические и ультраструктуры эндоцитотического compartments.The представлены способ также может быть использован для рецептор-опосредованного людьми с помощью системы 30 эндоцитоза. Производные Monomaleido и моно-сульфо-N-гидрокси-сукцинимидо о нанозолотом могут быть использованы для ковалентного связывания этих частиц к белкам 6. Например сшивки с A-или α-фактора может позволить после эндоцитоза этих двух феромонов своими специфическими рецепторами.
Все вместе, описанный протокол позволяет к спекуляцииifically маркировать органеллы системы дрожжи эндосом с использованием эндоцитарных зонд, который может быть сделан по обнаружению EM. Это экспериментальный инструмент является ценным подход к изучению биогенеза и организацию дрожжи эндосомных отсеков на ультраструктурном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Рене Scriwanek за помощь с подготовкой рисунке. FR поддерживается ECHO (700.59.003), ALW Открытая программа (821.02.017 и 822.02.014), сотрудничество DFG-НВО (DN82-303) и ZonMw VICI (016.130.606) гранты.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
