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Neuroscience

के रहते इमेजिंग Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51756
Automatic Translation
1, 1, 1
1National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

Summary

इस प्रोटोकॉल एक अक्षुण्ण लार्वा के मस्तिष्क के संदर्भ में लाइव सेल इमेजिंग का संचालन करने के लिए इस्तेमाल एक सुव्यवस्थित विधि विवरण. लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण लगातार पहले से अनदेखी कर रहे थे कि तंत्र को उजागर करने, असममित तंत्रिका स्टेम कोशिका विभाजन के अध्ययन के साथ ही अन्य तंत्रिकाजन्य और विकास की प्रक्रिया के लिए अमूल्य हैं.

Abstract

एक स्वयं renewing स्टेम सेल और एक फर्क सेल: स्टेम सेल असमान भाग्य क्षमता के साथ दो संतान कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए asymmetrically विभाजित करते हैं. असममित स्टेम कोशिका विभाजन के अध्ययन के लिए एक मजबूत क्षेत्र रहा है कि सरकार तंत्र को समझने, विकास और रोग के लिए उनकी प्रासंगिकता को देखते हुए. वे आनुवंशिक विनयशील हैं और के बारे में एक बार हर घंटे कोशिका विभाजन की लगातार राउंड से गुजरना क्योंकि, ड्रोसोफिला केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, या neuroblasts के स्टेम सेल, स्टेम कोशिका विभाजन के अध्ययन के लिए अपरिहार्य मॉडल हैं. के बारे में 100 तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं रहते इमेजिंग माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए इस मॉडल प्रणाली विशेष रूप से उपयोगी है, जिससे दो लार्वा के मस्तिष्क पालियों में से प्रत्येक की सतह के पास स्थित हैं. इस काम में, हम व्यापक रूप से स्टेम कोशिका विभाजन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया कई तरीकों की समीक्षा करें, और हम रिश्तेदार फायदे और बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में अलग है कि रोजगार उन तकनीकों के नुकसान का पता. हम भी विस्तार से हमारे simplifIED प्रोटोकॉल लाइव सेल इमेजिंग के लिए तीसरे instar लार्वा और तय विश्लेषण अनुप्रयोगों से पूरे दिमाग explant के लिए इस्तेमाल किया.

Introduction

स्टेम कोशिकाओं प्रारंभिक विकास के दौरान सेलुलर विविधता पैदा करते हैं और वयस्क ऊतकों में क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की जगह एक भेदभाव का संतुलन और आत्म नवीकरण बनाए रखें. इस homeostasis के विनियमन के झड़ने और हानिकारक ऊतक अध: पतन या tumorigenesis में परिणाम कर सकते हैं जो स्टेम सेल की आबादी का अधिक विस्तार, दोनों को रोकता है.

Neuroblasts (NBS) ड्रोसोफिला केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (चित्रा 1 ए) भ्रूण चरणों 1, 2 के दौरान कहा कि पहले फार्म की व्यापक रूप से अध्ययन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं रहे हैं. एक स्वयं renewing स्टेम सेल और एक फर्क सेल: NBs दो असमान नसीब कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए असममित कोशिका विभाजन (एसीडी) के दोहराया दौर से गुजरना. एसीडी centrosomes, सबसे कोशिकाओं 3 के microtubule का आयोजन केन्द्रों के रूप में कार्य है कि गैर झिल्लीदार organelles द्वारा निर्देशित है. पिंजरे का बँटवारा दौरान, नायब centrosomes व्यवस्थित और शिखर बेसल ध्रुवीय साथ द्विध्रुवी mitotic धुरा पूरबीअल्पसंख्यक अक्ष. विभाजित नायब की दरार पर, स्टेम सेल भाग्य निर्दिष्ट है कि शिखर भाग्य निर्धारकों, और भेदभाव निर्दिष्ट है कि बेसल भाग्य निर्धारकों, असमान बेटी कोशिकाओं में अलग कर रहे हैं.

लार्वा केंद्रीय मस्तिष्क, NBS के दो प्रकार उनकी संख्या, स्थिति, प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति, और सेल वंश (चित्रा 1 ए) 4-6 से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. मैं NBs सबसे प्रचुर मात्रा में हैं टाइप करें, और के बारे में 90 उनमें से मस्तिष्क 7 से प्रत्येक ऑप्टिक पालि के पूर्वकाल और कूल्हों पक्षों आबाद. ये NBs प्रतिलेखन कारक Asense (एएसई) व्यक्त, और वे विशेषता से एक स्वयं renewing नायब में विभाजित है और एक छोटे नाड़ीग्रन्थि मां सेल (जीएमसी, चित्रा 1 बी). प्रत्येक जीएमसी दो न्यूरॉन्स या glia (चित्रा 1 बी) उत्पन्न करने के लिए एक टर्मिनल डिवीजन आए. इसके विपरीत, प्रत्येक ऑप्टिक पालि के पीछे की ओर आबाद कि आठ प्रकार द्वितीय NBs Ase अभिव्यक्ति 5 की कमी है. वे एसीडी गुजरनाएक स्वयं renewing नायब और एक मध्यवर्ती तंत्रिका पूर्वज (INP) का उत्पादन.

INP, बारी में, asymmetrically तीन से पांच गुना बिताते हैं. INP के उत्थान और एक भी जीएमसी 4 के उत्पादन में इन डिवीजनों परिणामों के प्रत्येक. सामूहिक रूप से, विशिष्ट नायब पहचान और जीएमसी जन्म के अस्थायी आदेश वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की अद्भुत neuronal विविधता को जन्म देता है.

नायब एसीडी underlies कि कोशिका जीव विज्ञान बेहद जीना सेल इमेजिंग तकनीक के उपयोग के माध्यम से सुधार किया गया है समझना. छवि लाइव NBS के शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल प्रकाशित प्रोटोकॉल व्यापक रूप से बदलती हैं. कुल मिलाकर, हालांकि, इन तरीकों लार्वा के मस्तिष्क बरकरार रह या यंत्रवत् अलग है कि क्या द्वारा प्रतिष्ठित दो सामान्य श्रेणियों में बांटा जा सकता है. दोनों तकनीकों शोधकर्ता के आवेदन के आधार पर अलग फायदे और नुकसान है.

लाइव नायब सेल प्रखंड खुलासा प्रारंभिक रिपोर्टवजहें लार्वा के मस्तिष्क का मार्गदर्शन हदबंदी के कुछ डिग्री शामिल है. इन प्रोटोकॉल विस्तार 8 smearing या कांच coverslips पर NBs की अल्पकालिक प्राथमिक संस्कृतियों बढ़ने के क्रम में अलग 9 मस्तिष्क चिढ़ा. इमेजिंग में सुधार, दौर NBs आमतौर पर कांच स्लाइड 8 या agarose पैड 9 के साथ या तो coverslips पर चपटा कर रहे हैं. चपटा कोशिकाओं प्रकाशिकी में सुधार हुआ है हालांकि, इन तकनीकों अक्सर दरार कुंड की प्रतिगमन और अधिक से अधिक एक समय विभाजित करने में असमर्थता सहित, नायब mitotic दोषों को जन्म दे. इसलिए, पुस्तिका हदबंदी और लार्वा के मस्तिष्क के ऊतकों की शारीरिक विकृति दोनों शामिल प्रोटोकॉल है कि आम तौर पर बहुत ही कम अवधि (यानी., एक सेल चक्र या कम) अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल हैं. इसी तरह, अर्द्ध squashing या पूरी तरह से कांच स्लाइड और coverslips के बीच बरकरार दिमाग सपाट एक एक लगभग 30 मिनट की अवधि 10 के लिए दिए गए नमूना इमेजिंग खर्च कर सकते हैं समय सीमा. इस सीमा, थी बावजूददृष्टिकोण सफलतापूर्वक 11-14 इस्तेमाल किया गया है.

छवि लाइव करने के लिए हाल के प्रयासों NBs सीमा अलग कक्षों की शारीरिक विकृति अलग. इन तकनीकों में यह कई कोशिका विभाजन चक्र के लिए सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, जहां अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं. उदाहरण के लिए, मैन्युअल रूप से अलग दिमाग से छितरी हुई कोशिकाओं को आंशिक रूप से लंबे समय तक इमेजिंग 16 के लिए फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन 15 के मिश्रण से बनाया गया एक थक्का में एम्बेड किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, explanted दिमाग रासायनिक एंजाइम अगले स्वयं एक pipet टिप के माध्यम से दोहराया पारित होने से बाधित collagenase,, और बाद में पाली एल lysine लेपित गिलास नीचे व्यंजन 17, 18 पर चढ़ाया साथ अलग पहले हो सकता है. फाइब्रिनोजेन या पाली एल lysine के साथ या तो कांच के बर्तन कोटिंग प्रमुख शारीरिक विकृति के बिना संभव के रूप में coverslip करने के लिए उन्हें करीब लाने, गोल कोशिकाओं के प्रसार लगाव और मामूली बढ़ावा देता है. Additi में, पर इन तरीकों आसानी से औषधीय गड़बड़ी प्रयोगों 18 के लिए विमर्श किया जा सकता है कि मध्यम में NBs संवर्धन शामिल है. कुल मिलाकर, सीधे चढ़ाना NBs लंबी अवधि इमेजिंग क्षमताओं का त्याग किए बिना इमेजिंग प्रकाशिकी को बेहतर बनाता है छितरी हुई है. हाल ही में, अलग NBs की लंबी अवधि के संवर्धन का वर्णन एक प्रोटोकॉल 19 विस्तृत किया गया है.

हालांकि, इस दृष्टिकोण अपनी सीमाओं के बिना नहीं है. लाइव अलग NBs इमेजिंग के लिए कई निरंतर कर रहे हैं. छितरी कोशिकाओं के एक क्षेत्र में, उदाहरण के लिए, यह स्थानिक बरकरार मस्तिष्क 1 में आयोजित कर रहे हैं कि विशिष्ट नायब प्रजातियों की पहचान करने के लिए मुश्किल है. इसी तरह, प्रकार अलग ऊतक के भीतर द्वितीय NBs बनाम प्रकार मैं भेद ऐसे worniu-GAL4, asense-GAL80 20 के रूप में वंश tracers या subtype विशेष transgenes, की अभिव्यक्ति के बिना भी चुनौती दे रहा है. इन transgenes कुछ अनुप्रयोगों के लिए काफी उपयोगी हैं, वे उन transgenes पूर्व करने के लिए शोधकर्ताओं को सीमित करते हैंयूएएस बढ़ाने तत्व 21 के नियंत्रण में दबाया और अधिक जटिल आनुवंशिक योजनाओं की आवश्यकता होती है. NBs के स्थानिक या अस्थायी विकास को चिंता है कि अध्ययन, इसलिए, एक अक्षुण्ण ऊतक के संदर्भ में vivo इमेजिंग में आवश्यकता होती है.

इसके अलावा, अलग भ्रूण NBs की पढ़ाई कुंजी polarity के अंतरावस्था स्थानीयकरण 22, 23 निर्धारकों के लिए आसन्न कोशिकाओं के शारीरिक संपर्क के लिए महत्वपूर्ण है कि संकेत मिलता है. इन अध्ययनों से पूरी तरह से अलग NBs अब कोई अपरिवर्तनीय mitotic धुरा धुरी बनाए रखने दिखा. इसके बजाय, इन कोशिकाओं को शायद कारण शिखर तारककाय स्थिति 22 के नुकसान के लिए एक अधिक यादृच्छिक धुरी धुरी और लगातार जीएमसी कलियों के बीच अलगाव की व्यापक कोण प्रदर्शित करते हैं. लार्वा NBs और उनके पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच के रिश्ते बड़े पैमाने पर अध्ययन नहीं किया गया है, यह लार्वा स्टेम सेल microenvironment सेल polarity या अन्य पर टकराना सकता है कि विचार के लायक हैव्यवहार. लार्वा NBs के शारीरिक संदर्भ बनाए रखने के लिए, पूरे दिमाग से हम छवि एसीडी.

इमेजिंग अलग NBs के साथ जुड़े निहित सीमाओं को देखते हुए, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों को पूरी लार्वा दिमाग से नायब एसीडी की छवि लगातार राउंड के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की है. छवि बरकरार दिमाग के लिए तकनीकों अक्सर ऊतक विकृति या नुकसान को रोकने और गैस आदान प्रदान के लिए अनुमति देने के लिए एक लचीला झिल्ली के साथ संस्कृति कक्ष के एक तरफ कांच की कठोर सतह जगह. कुछ तरीकों कीट संवर्धन मध्यम, सीरम, और दस लार्वा 24 से पृथक वसा शरीर के साथ एस्कॉर्बिक एसिड का एक मिश्रण में explanted दिमाग बढ़ते शामिल है. वे नायब कोशिका विभाजन 25 को प्रोत्साहित करने के लिए जाना जाता माइटोजन छिपाना क्योंकि पृथक वसा शरीर से जोड़ रहे हैं. इस प्रोटोकॉल पर 3 घंटे के लिए ऊतक की अखंडता को बरकरार रखता है और लंबे समय तक इमेजिंग 24, 26-28 के लिए उत्तरदायी है, इसलिए. हाल ही में, लंदन का वर्णन एक प्रोटोकॉलएस्कॉर्बिक एसिड, सीरम, और वसा शरीर की उपस्थिति में बरकरार लार्वा दिमाग की जी अवधि इमेजिंग 29 विस्तृत किया गया है. ऊतक उजागर न ही स्थिर है क्योंकि न तो महत्वपूर्ण बात है,, इस दृष्टिकोण संवर्धन मध्यम विमर्श किया है जहां अनुप्रयोगों के लिए कम उपयोगी है (आदि जैसे, दवा पढ़ाई, immunodepletion,.).

हमारी प्रयोगशाला लंबी अवधि इमेजिंग 30, 31 के लिए लाइव लार्वा दिमाग के पूरे माउंट तैयारी सरल बनाया गया है. दूसरों पर हमारे प्रोटोकॉल के मुख्य लाभ अपनी सादगी है: हमारी टिप्पणियों नायब एसीडी की छवि लगातार राउंड के लिए आवश्यक additives हैं न तो सीरम, एस्कॉर्बिक एसिड, इंसुलिन, और न ही वसा शरीर से संकेत मिलता है. ऐसे इंसुलिन के रूप में additives, स्टेम सेल डिवीजनों में 32 और ड्रोसोफिला अंडाशय 33 में सामूहिक सेल प्रवास के लंबे समय तक इमेजिंग के लिए उपयोगी किया गया है हालांकि हमारे इमेजिंग के माध्यम स्टेशन के एक साधारण मिश्रण के होते हैं, के रूप में वे, नायब एसीडी के लिए नगण्य होना दिखाई देते हैंndard कीट कोशिका संवर्धन मध्यम प्रदूषण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक कवकनाशी के साथ पूरक. पुन: प्रयोज्य गैस पारगम्य या गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन के उपयोग के माध्यम से, हम लगातार नायब सेना दंत चिकित्सा महाविद्यालय के कई दौर को बनाए रखने में सक्षम है. एक ही explanted नमूने आसानी immunofluorescence और तय ऊतक के साथ अन्य प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार बरकरार लार्वा दिमाग का विच्छेदन, साथ ही रहते हैं और तय दोनों के विश्लेषण के लिए दिमाग की तैयारी.

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Protocol

1. आवश्यक सामग्री की तैयारी तीसरे instar लार्वा दिमाग explant को

  1. Microdissection के लिए आवश्यक उपकरण तैयार.
    1. पहले एक पिन धारक में एक भी विदारक पिन रखकर दो विदारक उपकरण (एक छुरी और एक हुक) बना. हाथ से या सरौता (चित्रा 1C) के साथ मजबूती से पिंस सुरक्षित.
    2. एक लगभग 120 डिग्री कोण के लिए एक विदारक पिन मोड़ करने के लिए पुराने संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें. पिन धारक हाथ में आयोजित किया जाता है जब पिन के शीर्ष आधा फ्लैट निहित है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत यह मत करो. इस उपकरण को दबाए रखें या ऊतक के माध्यम से टुकड़ा करने के लिए एक स्केलपेल के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
    3. पकड़ और ऊतक दूर परिमार्जन करने के लिए उपयोग किया जाएगा जो एक हुक में दूसरे पिन मोड़ करने के लिए पुराने संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें.
    4. नुकसान से उपकरणों की रक्षा के लिए एक विंदुक टिप के साथ प्रत्येक विदारक उपकरण को कवर किया. देखभाल के साथ, अच्छी तरह से बनाई उपकरणों को अनिश्चित काल के विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आवश्यक रूप से क्षतिग्रस्त या विकृत पिन बदलें.
    </ ली>
  2. मध्यम विदारक तैयार करें.
    1. एक टिशू कल्चर हुड में, श्नाइडर संवर्धन माध्यम में एंटीबायोटिक कवकनाशी पूरक पतला. पूरक को शामिल करने के लिए मीडिया भंवर.
    2. पूरक मीडिया के कई 5 एमएल aliquots तैयार करें. उपयोग के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सब मीडिया की दुकान.
    3. कमरे के तापमान को पूरक मध्यम से 5 एमएल विभाज्य गर्म. एक बाँझ 5 एमएल सिरिंज में मध्यम ड्रा और एक बाँझ 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर पर पेंच.
  3. विच्छेदन के लिए लार्वा का चयन करें. मस्तिष्क काटना आसान हो जाएगा के रूप में रेंगने तीसरे instar लार्वा का चयन करने के लिए एक विदारक जांच का प्रयोग करें. वैकल्पिक: एक अंगूर अगर प्लेट पर जमा लार्वा.
    नोट: ये समय से पहले ही बाहर क्रॉल करने के लिए दूसरी या पहली instar लार्वा के लिए मजबूर करते हैं "गीले भोजन," साथ पीढ़ी भीड़ शीशियों या बोतलों का प्रयोग न करें.
    नोट: कुछ आनुवंशिक पृष्ठभूमि युवा लार्वा का उपयोग की जरूरत होगी. इस प्रोटोकॉल को प्रभावित नहीं करता, लेकिन डी पड़ता हैissection अधिक कठिन.

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के 2. विच्छेदन

  1. एक गिलास स्लाइड पर, के बारे में 3 सेमी द्वारा अलग गर्म विदारक मीडिया के दो 50 मिलीलीटर पूल बना. एक पूल ठीक विच्छेदन (चित्रा 1C) के लिए इस्तेमाल सकल विच्छेदन और अन्य के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  2. मीडिया की बूंदों में से एक के लिए कई लार्वा स्थानांतरण.
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप के लिए लार्वा के साथ coverslip ले जाएँ. लार्वा के पूर्वकाल और कूल्हों समाप्त होता है प्रत्यक्ष कर रहे हैं कि इस तरह के लार्वा युक्त पूल में ज़ूम.
  4. एक एकल लार्वा के मध्य क्षेत्र काबू करने के लिए संदंश के एक जोड़े का प्रयोग करें. दूसरे हाथ में संदंश की एक दूसरी जोड़ी ले लो और एक ही क्षेत्र के करीब लार्वा समझ. धीरे छमाही में लार्वा फाड़ करने के लिए अलग संदंश के दो जोड़े खींचो. Coverslip पर सभी लार्वा के लिए ऊपर दो चरणों को दोहराएँ.
  5. एक ऊतक के लिए उन्हें स्थानांतरित करने से लार्वा शरीर के पीछे हिस्सों के निपटान के.
  6. एक लार्वा में ज़ूम वें इतना है किई पूर्वकाल mouthhooks स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. तीसरे वक्ष और पहली पूर्वकाल दंतिका बैंड के बीच लार्वा mouthhooks के विपरीत दिशा में एक छोटा सा चीरा, या निशान बनाने के लिए संदंश के दोनों जोड़े का प्रयोग करें.
  7. गैर प्रमुख हाथ में संदंश के साथ mouthhooks समझ. धीरे एक पूर्वकाल से पीछे दिशा में छल्ली दूर छील करने के लिए दूसरे हाथ में संदंश का प्रयोग करें. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र सामने आ रहा है जब तक धीरे धीरे छल्ली दूर छील करने के लिए आगे बढ़ें.
  8. संदंश के साथ ऊतकों फाड़ से लार्वा के बाकी हिस्सों से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र अलग. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को परेशान करने की नहीं सावधानी बरतें.
    महत्वपूर्ण कदम: केंद्रीय तंत्रिका तंत्र पर tug मत करो! एक फटे उदर तंत्रिका कॉर्ड (2A चित्रा) या विकृत ऑप्टिक पालियों (आंकड़े 2 बी और 2 बी ') के साथ क्षतिग्रस्त नमूने त्यागें.
  9. Coverslip पर सभी लार्वा के लिए ऊपर दो चरणों को दोहराएँ. स्वस्थ explanted ऊतक स्थानांतरणठीक विच्छेदन चरण के लिए coverslip पर मध्यम से दूसरे (स्वच्छ) पूल.
  10. मस्तिष्क से परिधि के ऊतकों (जैसे, आंख, पंख, और पैर डिस्क) दूर खाली करने के लिए विदारक पिन उपकरणों का उपयोग करें. Coverglass के लिए संयोजी ऊतक लगाए, चाहता था (मस्तिष्क) और अवांछित ऊतकों के बीच स्केलपेल स्लाइड. एक साथ देखा जैसे आंदोलनों में coverslip करने के लिए स्केलपेल दबाने जबकि धीरे अवांछित ऊतक दूर तंग करने के लिए हुक का प्रयोग करें.
  11. महत्वपूर्ण कदम: प्रत्येक मस्तिष्क से सभी डिस्क निकालने के लिए धीरे धीरे और जानबूझकर काम करें. मस्तिष्क आकारिकी को परेशान करने की नहीं सावधानी बरतें. एक स्वस्थ मस्तिष्क एक अक्षुण्ण उदर तंत्रिका कॉर्ड और सुडौल, गोल ऑप्टिक पालियों (चित्रा -2) होगा.

3. रहते इमेजिंग के लिए दिमाग explanted बढ़ते

  1. (चित्रा 2 डी) का सामना करना पड़ स्पष्ट फिल्म के साथ एक 50 मिमी गैस पारगम्य संस्कृति पकवान उलटें. टी पर माध्यम की एक छोटी सी बूंद (लगभग 30 μl) जमा करने के लिए सिरिंज दबानापकवान का वह केंद्र.
  2. पकवान पर मध्यम से ड्रॉप करने के लिए अलग - अलग दिमाग, एक समय में एक, स्थानांतरण. ऑप्टिक पालियों नीचे एक मस्तिष्क स्कूप करने के लिए हुक उपकरण का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, उदर तंत्रिका कॉर्ड से पेश axons काबू करने के लिए संदंश का उपयोग करें.
  3. मध्यम के ड्रॉप में 5-10 दिमाग लीजिए. उनमें से कई के रूप में मध्यम से ड्रॉप की तह तक व्यक्ति के दिमाग को पुश करने विदारक पिन उपकरणों का उपयोग करके दिमाग डूब meniscus (चित्रा 2 ई) में फंस जाएगा.
  4. Imaged किया जा NBs (चित्रा 3) के आधार पर दिमाग के लिए पंक्ति में विदारक पिन उपकरण का उपयोग कर दिमाग पूरबी. छवि के लिए पृष्ठीय NBs, (झिल्ली साथ) नीचे का सामना करना पड़ उदर तंत्रिका कॉर्ड जगह है. छवि के लिए anterio-उदर NBs, (झिल्ली से दूर) ऊपर की ओर का सामना करना पड़ उदर तंत्रिका कॉर्ड के साथ दिमाग जगह है. सभी उदर तंत्रिका डोरियों xy विमान के भीतर एक ही दिशा में बात ऐसी है कि दिमाग संरेखित करें.
  5. एक सिरिंज या प्लास्टिक हस्तांतरण P उपयोगipette गैस पारगम्य झिल्ली पर 4 हेलोकार्बन (एचसी) के तेल की बूँदें (लगभग 30 μl प्रत्येक) के लिए जगह. तेल की एक बूंद की मात्रा एक दूसरे के लिए और मध्यम की बूंद के बराबर होना चाहिए. अंतरिक्ष तेल की बूंदों संवर्धन माध्यम की बूंद के आसपास केंद्रित एक coverslip के चारों कोनों के अनुरूप करने के लिए. एक बार जब पूरा, पाँच बूँदें (तेल की चार बूंदें और केंद्र में मध्यम से एक बूंद) पश्चिमी शैली पासा (3B चित्रा) पर पांच पहलुओं के समान होगा.
  6. यह एक ही समय में सभी 5 बूँदें हिट ऐसी है कि विधानसभा पर एक # 1.5 22 मिमी coverslip कम करें. नमूने भर में एक भी दबाव बनाए रखने वे बाधित हो जाएगा संभावना है कि कम कर देता है. तेल और मध्यम coverslip के वजन के तहत फैलाने के रूप में के बारे में 3 मिनट रुको. मीडिया के एक क्रॉस की तरह आकार (आंकड़े -3 सी और 3 डी) के रूप में होगा.
  7. महत्वपूर्ण कदम: एक टिशू पेपर बाती (figu का उपयोग अतिरिक्त मीडिया को हटाने के द्वारा दिमाग की सतह पर coverslip लोअर) -3 सी कर रहे हैं. विदारक गुंजाइश के तहत नमूना देखते हुए यह मत करो. मीडिया को हटा दिया जाता है, coverslip कम होगी. Coverslip दिमाग से छू एक बार बंद करो. नहीं अति बाती इस ऊतक विकृति या मस्तिष्क विस्फोट का कारण होगा.
  8. इमेजिंग पृष्ठीय NBs (चित्रा 3E), 3.9 कदम के लिए ले जाते हैं. इमेजिंग anterio-उदर NBs हैं, coverslip थोड़ा उदर तंत्रिका कॉर्ड सुझावों की दिशा में (धीरे ​​संदंश के साथ यह परोक्ष दबाव डाल द्वारा) ले जाया जाना चाहिए. यह इमेजिंग (चित्रा 3F) की सुविधा के लिए coverslip के साथ सीधे संपर्क में मस्तिष्क पालियों लाता है, जो बारी बारी से करने के लिए मस्तिष्क का कारण बनता है.
  9. हेलोकार्बन तेल (चित्रा 3 डी) की थोड़ी मात्रा के साथ coverslip encircling द्वारा चैम्बर सील. Coverslip से बह अतिरिक्त तेल को कम से कम और एक ऊतक के साथ दूर मिट जाना चाहिए.

केंद्रीय मस्तिष्क neuroblasts के 4. लाइव इमेजिंग

नोट: इस काम के लिए, एक Nikon ग्रहण तिवारी कताई डिस्कconfocal खुर्दबीन (उलटा माइक्रोस्कोप) लाइव इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था; हमारे सेटअप का ब्यौरा पहले से 31 प्रकाशित किया गया है. वैकल्पिक रूप से, नमूना एक ईमानदार प्रणाली का उपयोग imaged किया जा सकता है.

  1. बस घुड़सवार दिमाग ऊपर coverslip करने के लिए विसर्जन के तेल की एक बूंद जोड़ें. यह सीधे नमूना ऊपर उद्देश्य केंद्र में मदद मिलेगी.
  2. महत्वपूर्ण कदम: एक मंच इनक्यूबेटर के साथ 25 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान पर दिमाग बनाए रखें. धीरे चरण इनक्यूबेटर में घुड़सवार नमूना स्थिति और उसके ढक्कन के साथ चैम्बर को कवर किया.
  3. ऑप्टिक पालियों की केंद्रीय और औसत दर्जे के क्षेत्रों में रहते हैं कि बड़े, गोल कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करके प्रेषित प्रकाश का उपयोग केंद्रीय मस्तिष्क NBs लगाएँ, महामारी प्रतिदीप्ति का उपयोग नहीं करते. इस अभ्यास के साथ आसान हो जाता है. यह संभव के रूप में प्रकाश की कम से कम राशि के लिए नमूना बेनकाब करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. क्षतिग्रस्त कर रहे हैं कि समय इमेजिंग दिमाग बर्बाद मत करो.
  4. जगह में एक बार, confocal करने का उपयोग कर त्वरित जोखिम लेनाउचित स्थान और गहराई का निर्धारण. पहले 10-15 मीटर तक गहराई को सीमित करें. जरूरत के रूप में समायोजित करें, और एक और परीक्षण छवि ले.
    1. वैकल्पिक कदम: कोई XY बहाव है यह सुनिश्चित करने के लिए उदर तंत्रिका कॉर्ड के एक परीक्षण फिल्म लीजिए. बहाव का पता चला है, तो व्यवस्थित करने के लिए नमूने के लिए 15-30 मिनट इंतज़ार करो. बहाव 30 मिनट में तय नहीं करता है, तो एक नया नमूना तैयार करते हैं. मेजर बहाव आमतौर पर अतिरिक्त तेल के अलावा करने के लिए वापस पता लगाया जा सकता है, या तेल का असमान आकार बढ़ते दौरान चला जाता है.
  5. अक्षीय बहाव (z-बहाव) को खत्म करने के लिए एक अवरक्त एलईडी का उपयोग करता है कि एक निरंतर स्वत: ध्यान केंद्रित डिवाइस का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल फोकल हवाई जहाज़ को सही.
  6. ब्याज की एक नायब पहचान की है, इमेजिंग आहार के साथ आगे बढ़ना. सभी जीना सेल इमेजिंग, लेज़र प्रकाश की राशि, जोखिम समय, कैमरा binning, उद्देश्य बढ़ाई, समय और / या z कदम अंतराल के साथ के रूप में सभी अनुभव से हाथ पर सवाल का जवाब देने के लिए एक विशेष प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. लक्ष्य प्रकाश बांध को कम करने के लिए हैउम्र है जबकि अभी भी उपयोगी डाटा एकत्रित. अतिरिक्त मार्गदर्शन के लिए चर्चा देखें.
    1. छवि Z-अक्ष में 1 माइक्रोन के अंतराल पर 12-14 छवियों को इकट्ठा करके नायब की पूरी मात्रा. एक ही नायब की एक या कई सेल चक्र पर कब्जा करने के लिए समय संकल्प को समायोजित करें. एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में, एकल कोशिका चक्र इमेजिंग और कई सेल चक्र के लिए 1-3 मिनट के अंतराल के लिए 10-30 सेकंड के अंतराल का उपयोग करें.
  7. महत्वपूर्ण कदम: नमूना पिंजरे का बँटवारा की अवधि की निगरानी के द्वारा स्वस्थ है कि पुष्टि करें. पिंजरे का बँटवारा अधिक से अधिक 15 मिनट लगते हैं, तो एक और मस्तिष्क पर चलते हैं. एक स्वस्थ मस्तिष्क पिंजरे का बँटवारा के कई दौर से गुजरने के देखने का एक ही क्षेत्र के भीतर कई NBs दिखाएगा. प्रत्येक कोशिका चक्र के कारण प्रकाश क्षति के लिए अब थोड़ा पिछले एक से है कि ध्यान दें.
  8. इमेजिंग पूरा हो जाए, ऊष्मायन चैम्बर अलग करना, और गैस पारगम्य संवर्धन व्यंजन लेकिन सब कुछ त्यागने. 95% इथेनॉल के साथ संस्कृति डिश सतह कुल्ला और एक ऊतक के साथ अच्छी तरह से साफ कर लें. दो बार दोहराएँ.

    Immunofluorescence के लिए दिमाग की 5. तैयारी

    1. पूरक मध्यम से लगभग 0.2 मिलीग्राम से युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 20 या अधिक explanted दिमाग लीजिए.
    2. ट्यूब से मध्यम निकालें और (0.3% ट्राइटन X-100 के साथ फॉस्फेट बफर खारा, पीबीएस) 0.5 मिलीलीटर PBSTx साथ एक बार दिमाग कुल्ला. दिमाग तरल के सभी एक्सचेंजों के बीच ट्यूब के नीचे के लिए व्यवस्थित करते हैं. ट्राइटन X-100 डिटर्जेंट ऊतक permeabilize करने के लिए प्रयोग किया जाता है. आम तौर पर Rinsing कम से कम 30 सेकंड लेता है; दिमाग ट्यूब के नीचे करने के लिए तय हो चुका है एक बार बस PBSTx हटा दें.
    3. PBSTx में पतला 9% इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड paraformaldehyde के 0.5 मिलीलीटर के साथ समाधान बदलें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सिर का इशारा के साथ सेते हैं.
    4. खतरनाक कचरे के नियमों के अनुसार लगानेवाला के निपटान के.
    5. 15 मिनट के लिए 0.5 मिलीलीटर PBSTx साथ नमूने धो लें. ताजा PBSTx दो बार के साथ धोने कदम दोहराएँ.
    6. 0.5 मिलीलीटर पीबीटी (पीबीएस, 1 के साथ समाधान बदलें% गोजातीय सीरम albumin (BSA), और 0.1% बीच 20). कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सिर का इशारा के साथ सेते हैं. यह कदम ब्लॉक ऊतक के लिए एंटीबॉडी का अविशिष्ट बाइंडिंग.
    7. 4% सामान्य बकरी सीरम (NGS) के साथ पूरक पीबीटी में पतला 0.5 मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ समाधान बदलें. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात शिखावर्तन साथ सेते
    8. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी त्यागें या बचाने के लिए.
    9. 15 मिनट के लिए 0.5 मिलीलीटर पीबीटी के साथ नमूने धो लें. ताजा पीबीटी दो बार के साथ धोने कदम दोहराएँ.
    10. 0.5 संशोधित पीबीटी की मिलीलीटर (पीबीएस, 2% बीएसए, 0.1% बीच 20, और 4% NGS) के साथ समाधान बदलें. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सिर का इशारा के साथ सेते हैं.
    11. संशोधित पीबीटी में पतला 0.5 मिलीलीटर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ समाधान बदलें. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सिर का इशारा के साथ सेते हैं.
    12. (0.1% बीच 20 के साथ पीबीएस) 0.5 मिलीलीटर PBST के साथ समाधान बदलें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सिर का इशारा के साथ सेते हैं. ताजा PBST दो बार के साथ धोने कदम दोहराएँ.

    1. ध्यान से स्लाइड के केंद्र के बाईं ओर ड्रॉप सीमित, एक गिलास स्लाइड पर एक बूंद के रूप में नमूने का स्थानांतरण.
    2. स्लाइड के केंद्र के बढ़ते मध्यम की एक बड़ी गिरावट (व्यास में लगभग 2 सेमी) (उदाहरण के लिए, Aqua-Poly/Mount) जोड़ें. बाईं ओर है कि PBST के पूल से बचें.
    3. बढ़ते मध्यम के पूल के लिए PBST के पूल से दिमाग हस्तांतरण संदंश का प्रयोग करें. दिमाग के शीर्ष पर सीधे बढ़ते मध्यम जोड़ना उनके उन्मुखीकरण को बाधित कर सकते हैं और बचा जाना चाहिए.
    4. एक रोशनी खुर्दबीन के तहत, ऊपर का सामना करना पड़ imaged किया जाएगा कि पक्ष के साथ बढ़ते मध्यम में नमूनों की व्यवस्था.
    5. प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड के साथ, धीरे से नमूने के शीर्ष पर एक # 1.5 गिलास coverslip कम है. वैकल्पिक कदम: हल्के से coverslip पर धकेलने के द्वारा नाबालिग हवाई बुलबुले हटाना.
    6. बढ़ते मध्यम स्लाइड झूठ बोल कर, रात भर में कई घंटे, या के लिए भाजन के लिए फ्लैट, प्रकाश की अनुमति देंकमरे के तापमान पर संरक्षित.
    7. स्लाइड्स अगले दिन imaged, या इमेजिंग के लिए पहले से संग्रहित किया जा सकता है.

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Representative Results

लाइव इमेजिंग नायब एसीडी कि विनियमित तंत्र के एक नंबर elucidated किया गया है. पिछले छवि अधिग्रहण करने के लिए, यह इष्टतम इमेजिंग की स्थिति निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. यह लाइव सेल इमेजिंग की अवधि के साथ फ्रेम पर कब्जा दर संतुलन के लिए आवश्यक है. ठीक सेलुलर विश्लेषण के लिए, उदाहरण के लिए, अस्थायी वृद्धि हुई है और ऑप्टिकल संकल्प की आवश्यकता हो सकती है. एक भी नो बॉल सेल चक्र (चित्रा -4 ए) visualizing जब, छवियों पर कब्जा कर रहे हैं, जिस पर दर photodamage शुरू करने के बिना बढ़ाया जा सकता है. आमतौर पर, एकल कोशिका विभाजन की घटनाओं में लगभग 10-30 सेकंड का समय अंतराल पर नजर रखी जा सकती है. ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना अस्थायी समाधान को बढ़ाने के लिए एक तरह से छवि अधिग्रहण दर को व्यवस्थित करना है. उदाहरण के लिए, समय चूक इमेजिंग तो एक दिलचस्प सुविधा या समय बिंदु (मूवी 1) के अवलोकन पर बढ़ जाती है जो एक कम फ्रेम दर, पर शुरू किया जा सकता है.

कोशिका विभाजन की इमेजिंग लगातार राउंड ( (चित्रा 4 बी) में किया जाता है. हम आम तौर पर छवि एकाधिक 2-3 घंटे की अवधि में 1-3 मिनट का समय अंतराल पर पूरे नायब सेल की मात्रा के माध्यम से एसीडी के (दो या अधिक) दौर. अस्थायी समाधान और इमेजिंग अधिग्रहण अवधि दोनों नमूना हिट कि प्रकाश की मात्रा को सीमित करके सुधार किया जा सकता है. केवल एक ऑप्टिकल विमान imaged है अगर उदाहरण के लिए, लगातार नायब डिवीजनों के समय चूक इमेजिंग 8 घंटा से अधिक बढ़ाया जा सकता है. नायब एसीडी के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी ट्रांसजेनिक लाइनों का (तालिका 1) 16, 31, 34-38 में सूचीबद्ध है.

नमूनों की बड़ी संख्या के विश्लेषण के लिए, यह निश्चित NBs का विश्लेषण करने के लिए अक्सर आवश्यक है. हमारी निर्धारण प्रोटोकॉल NBs के समग्र आकारिकी को बरकरार रखता है और immunofluorescence assays (आंकड़े 4C-4E) के साथ संगत है. पूरे माउंट तय बीआरएआईएनएस समग्र मस्तिष्क के आकार और कल्पना को आकार या NBs का पता लगाने के लिए कम बढ़ाई (चित्रा 4C) में imaged किया जा सकता है. और अधिक विस्तार में NBs या उनके वंशज GMCs कल्पना, उच्च बढ़ाई इस्तेमाल किया जाना चाहिए. मध्यम बढ़ाई (चित्रा 4D) में, पूरे नायब वंश समूहों मनाया जा सकता है. विस्तृत सेलुलर विश्लेषण के लिए, उच्च आवर्धन (चित्रा 4E) का उपयोग किया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. नायब एसीडी का जीना सेल इमेजिंग के लिए पूरे दिमाग Explanting. ए) लार्वा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र दो ऑप्टिक lobes और एक उदर तंत्रिका कॉर्ड के होते हैं. NBs के दो subtypes टकसाली पदों में ऑप्टिक पालि आबाद:. प्रकार मैं (गहरे नीले रंग) और प्रकार द्वितीय (हल्का नीला) बी) NBS एसीडी से गुजरना. प्रत्येक कोशिका विभाजन के साथ,एक जीएमसी को जन्म देने के लिए नायब cleaves (या INP,) नहीं दिखाया और नायब स्टेम सेल पुन: बनाता है. GMCs (नहीं दिखाया गया है, या glia) दो न्यूरॉन्स को जन्म देने के लिए बांट देंगे. सी) दो microdissection उपकरण पिन धारकों में विदारक पिन डालने से इकट्ठा कर रहे हैं. पिंस झुकने अद्वितीय उपकरण, एक छुरी और, पियर्स तोड़, और अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए बिना अवांछित ऊतक विस्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है जो एक हुक, बनाता है. डी) दिमाग विदारक मीडिया (नीले हलकों) के दो पूल में से एक में explanted रहे हैं. मध्यम से एक पूल लार्वा (सकल विच्छेदन) से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और अन्य पूल explanted दिमाग (ठीक विच्छेदन) से परिधि के ऊतकों के ठीक microdissection के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Preservmicrodissection दौरान मस्तिष्क आकृति विज्ञान के व्यावहारिक. जल्दबाजी मस्तिष्क विच्छेदन (ए) फाड़ा उदर तंत्रिका डोरियों या (बी) ऑप्टिक पालियों विकृत भी शामिल है कि गंभीर ऊतकों को नुकसान पैदा कर सकते हैं. इससे भी अधिक सूक्ष्म ऊतकों को नुकसान (बी ') लाइव सेल इमेजिंग के लिए नहीं होना चाहिए. (सी) लाइव इमेजिंग. डी) एक ऑप्टिकली स्पष्ट, गैस पारगम्य झिल्ली. ई) एक गैस पारगम्य पकवान पर मध्यम संवर्धन की व्यवस्था में कई स्वस्थ दिमाग का एक संग्रह के लिए उपयुक्त एक स्वस्थ ऊतक के नमूने का एक उदाहरण है. ये दिमाग माइक्रोस्कोपी के लिए मुहिम शुरू करने के लिए तैयार हैं. स्केल बार: (एसी), 100 मीटर; (डी), 25 मिमी; (ई) 1 मिमी.

चित्रा 3
चित्रा 3. लाइव सेल इमेजिंग के लिए दिमाग बढ़ते. ए) मस्तिष्कएस माध्यम की बूंद लगभग बराबर मात्रा की कोर्ट तेल की बूंदों से घिरा हुआ है पकवान. बी) के केंद्र में जमा संवर्धन माध्यम की एक बूंद के भीतर पंक्तियों में जुड़ रहे हैं. कोर्ट तेल और मध्यम के केंद्रीय बूंद की चार बूंदें पासा खेलने के पांच पहलुओं के समान है. एक coverslip तेल की बूंदों पर उतारा है, के बाद (सी) एक बाती Kimwipe ऊतक के बाहर फैशन और वाष्पीकरण को रोकने के लिए अधिक तरल पदार्थ. डी) coverslip के बाहरी किनारे तेल की एक पतली परत से घेर लिया है ऊपर शराबी प्रयोग किया जाता है संवर्धन माध्यम की. ये दिमाग). अब ई और एफ माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार हैं coverslip करने के लिए मस्तिष्क रिश्तेदार के उन्मुखीकरण. ई) पृष्ठीय neuroblasts गैस पारगम्य झिल्ली को छू उदर पक्ष के साथ दिमाग की व्यवस्था ने उतारी रहे neuroblasts लाइव सेल इमेजिंग के लिए पहुंच रहे हैं, जो निर्धारित करता है . एफ) पूर्वकाल उदर neuroblasts आगमन ने उतारी जा सकती हैपृष्ठीय पक्ष उदर तंत्रिका कॉर्ड सुझावों की दिशा में, गैस पारगम्य झिल्ली को छूने और फिर coverslip परोक्ष दबाव डाल, और अंतर्निहित ऊतक के साथ दिमाग anging. इस प्रस्ताव से थोड़ा ऐसे परिपूर्ण संरेखण (ग्रीन लाइन) में वांछित इमेजिंग अक्ष लाने anterio-पृष्ठीय सतह संपर्क coverslip, कि ऑप्टिक पालियों झुक जाता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. विभाजित neuroblasts नायब की. ए और बी) लाइव इमेजिंग एक 40x, 1.3 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग पूरे माउंट तैयारी में कोशिका विभाजन स्टेम की लाइव इमेजिंग से प्रतिनिधि परिणाम है. . GFP-Moesin व्यक्त एक नायब से एक एकल कोशिका चक्र के समय चूक इमेजिंग से समय चूक ए) चित्र की शुरुआत करने के लिए सेकंड रिश्तेदार: समय मिनट के रूप में प्रदर्शित किया जाता है(GFP-मो). एक एकल कोशिका चक्र की छवि अधिग्रहण दर GFP-मो और एक GFP लेबल तारककाय मार्कर दोनों व्यक्त एक नो बॉल से लगातार कोशिका विभाजन चक्र के समय चूक इमेजिंग से). बी photodamage उत्प्रेरण बिना अस्थायी समाधान को बढ़ाने के लिए चित्र वृद्धि हो सकती है. कई सेल चक्र के साथ जुड़े लम्बी अवधि photodamage से बचने के लिए कम अस्थायी समाधान जरूरी है. इमेजिंग. सीई) के दौरान प्रत्येक कोशिका विभाजन वृद्धि के बीच समय की लंबाई दोनों ऑप्टिक पालियों पर स्थित छवि सभी NBS के पूरे माउंट तैयारी. सी)) से तय की स्टेम कोशिकाओं के Confocal अनुमानों, 20x बढ़ाई प्रयोग किया जाता है कि ध्यान दें. इस विश्लेषण एक ही ऑप्टिक पालि से NBs (गुलाबी) के बहुमत 40X आवर्धन के साथ देखे जा सकते हैं समग्र मस्तिष्क आकारिकी की जांच करने के लिए और नायब संख्या (हल्का नीला), आदि. डी) यों तो विशेष रूप से उपयोगी है. सूक्ष्मनलिकाएं (हरा). ई)

मूवी 1. एक भी नो बॉल सेल चक्र का लाइव इमेजिंग. सेल प्रांतस्था लेबल करने के लिए GFP-मो व्यक्त एक मस्तिष्क से एक भी नो बॉल कोशिका विभाजन के समय चूक छवियों. छवियाँ 40X बढ़ाई एक ऑप्टिकल विमान से हासिल किया गया. इस फिल्म में, फ्रेम हर 15 सेकंड पर कब्जा कर लिया गया. अधिग्रहण के बारे में 7 मिनट के बाद यह दर एक फ्रेम हर 5 सेकंड के लिए बढ़ा दिया गया था. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

मूवी 2. लाइव इमेजिंग लगातार राउंड ओच नायब एसीडी. GFP-मो और एक GFP लेबल तारककाय मार्कर व्यक्त मस्तिष्क में कोशिकाओं के विभाजन के तीन दौर के दौर से गुजर एक नो बॉल के समय चूक छवियों. छवियाँ 60x बढ़ाई पर 2 मिनट के समय के अंतराल पर हासिल किया गया. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें.

लाइन लेबल्ड सेलुलर संरचना Fluorophore अभिव्यक्ति / प्रोमोटर उद्धरण
YFP-Asterless तारककेंद्रक YFP Ubiquitin Rebollo, एट अल. (2007) देव. सेल 12:. 467.
SAS6-mCherry तारककेंद्रक mCherry अन्तःविकसित Rusan और Peifer (2007) जे सेल बॉय. 177
GFP-SAS6 तारककेंद्रक GFP अंतर्जात (बीएसी) Lerit और Rusan (2013) जे सेल बॉय ​​202:. 1013.
GFP-संधि तारककेंद्रक GFP Ubiquitin मार्टिनेज-Campos, एट अल. जे सेल बॉय ​​165:. 673.
GFP-SAS4 तारककाय GFP Ubiquitin डिक्स और बदचलन (2007) मुद्रा. बॉय 17:. 1759.
GFP-पोलो तारककाय GFP अन्तःविकसित . Moutinho-सैंटोस, एट अल (1999) बॉय सेल 91:. 585.
GFP-γ ट्यूबिलिन 23C तारककाय GFP Ubiquitin Lerit और Rusan (2013) जे सेल बॉय ​​202:. 1013.
GFP-Centrosoमिनट तारककाय GFP यूएएस Megraw, एट अल. (2002) जे विज्ञान सेल 115:. 4707.
GFP-एसपीडी 2 तारककाय GFP Ubiquitin डिक्स और बदचलन (2007) मुद्रा. बॉय 17:. 1759.
mCherry-α-ट्यूबिलिन सूक्ष्मनलिकाएं mCherry Ubiquitin Rusan और Peifer (2007) जे सेल बॉय ​​177:. 13.
GFP-α-ट्यूबिलिन सूक्ष्मनलिकाएं GFP Ubiquitin . Rebollo, एट अल (2004) PLoS बॉय 2:. E8.
बृहस्पति GFP ("G147") सूक्ष्मनलिकाएं GFP अन्तःविकसित मोरिन, एट अल (2001) PNAS 98:.. 15050.
mCherry-बृहस्पति Microtubuleएस mCherry यूएएस Cabernard और डो (2009) देव. सेल 17: 134.
H2AvD-mRFP डीएनए mRFP अन्तःविकसित पांडे, एट अल. (2005) जे विज्ञान सेल 118:. 733.
H2AvD-GFP डीएनए GFP अन्तःविकसित क्लार्कसन और सेंट (1999) डीएनए सेल बॉय ​​18:. 457.
Moesin-GFP Cortical actin GFP स्पेगेटी स्क्वैश Kiehart, एट अल. (2000) जे सेल बॉय ​​149:. 471.

तालिका 1. एसीडी के अध्ययन के लिए उपयोगी ट्रांसजेनिक लाइनों की एक चयन. ये फ्यूजन निर्माणों कोशिका विभाजन के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं. वे नियमित तौर पर नायब लाइव इमेजिंग अध्ययन में इस्तेमाल किया जाता है.

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Discussion

लाइव सेल इमेजिंग स्टेम कोशिकाओं की एसीडी, सेल प्रजातियों के भेदभाव को विनियमित कि तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक अमूल्य दृष्टिकोण, और जटिल ऊतकों के morphogenesis है. अनुसंधान समूहों ऐतिहासिक नायब एसीडी कल्पना करने के लिए विभिन्न तकनीकों कार्यरत है हालांकि, इन तरीकों आम तौर पर मुख्य रूप से मस्तिष्क के ऊतकों बरकरार छोड़ दिया है या अलग है कि क्या करने के लिए सम्मान के साथ अलग है कि दो श्रेणियों में बांटा जा सकता है.

इमेजिंग NBs अपने फायदे हैं अलग. एक के लिए, वे एक संवर्धन पकवान में सबसे बड़ा (व्यास में लगभग 12 माइक्रोन) कोशिकाओं के रूप में पहचान करने के लिए विशेष रूप से आसान कर रहे हैं क्योंकि NBs छवि के लिए आसान कर रहे हैं अलग. इसके अलावा, एक कांच की सतह पर संवर्धित कर रहे हैं कि लगभग सभी स्टेम कोशिकाओं छवि अधिग्रहण की अवधि भर खुर्दबीन उद्देश्य के लिए समान रूप से बंद हो जाएगा. समय चूक छवियों के ऑप्टिकल गुणवत्ता आगे SEM प्रेरित करने के लिए पाली एल lysine या फाइब्रिनोजेन लेपित गिलास या तो के उपयोग के साथ सुधार हुआ हैदौर NBs 16, 17 का मैं सपाट. संस्कृति में विकसित अलग NBs इमेजिंग के लिए एक और लाभ संवर्धन मध्यम विमर्श किया जा सकता है जिसके साथ आसानी है. कोशिकाओं आदि औषधीय एगोनिस्ट, गरम, या immunoblocking एंटीबॉडी, के किसी भी नंबर से युक्त मध्यम संवर्धन, लेपित गिलास सतह का पालन एक बार. जोड़ा या हटाया जा सकता है. अंत में, अलग NBs कल्पना करने के लिए हाल के दृष्टिकोण इस तकनीक, वास्तव में, लंबे समय तक छवि अधिग्रहण 18, 19 के लिए उत्तरदायी है कि प्रदर्शन किया है.

बहरहाल, इमेजिंग के लिए नुकसान NBs प्रोटोकॉल की जटिलता शामिल अलग. अधिकांश तरीकों विस्तार लंबा (30-60 मिनट) छितरी कोशिकाओं बसने और संवर्धन पकवान 17, 19 का पालन करने की अनुमति देने के लिए एक लंबी ऊष्मायन कदम (60 मिनट) के बाद रासायनिक पाचन,.

इसके विपरीत, एक अक्षुण्ण मस्तिष्क से इमेजिंग NBs दोनों को बरकरार रखता हैशारीरिक संदर्भ और ऊतकों की आकारिकी. इस दृष्टिकोण के फायदे टकसाली व्यवस्था में या परिभाषित विकासात्मक बार 1 में विकसित है कि विशिष्ट नायब प्रजातियों की पहचान करने की क्षमता शामिल है. इसलिए, हमारे सरलीकृत प्रोटोकॉल यह भी भेदभाव और morphogenesis घटनाओं का जीना जांच के लिए अनुमति देता है, के रूप में एसीडी की पढ़ाई से परे फैली हुई है कि उपयोगिता है. इस विधि के लिए एक नुकसान यह है, हालांकि, मध्यम संवर्धन का आदान प्रदान करने में असमर्थता है. इसलिए, लगातार स्टेम कोशिका विभाजन की लंबी अवधि इमेजिंग में रुचि शोधकर्ताओं सबसे अच्छा उनके आवेदन है कि सूट दृष्टिकोण (पूरे माउंट बनाम अलग प्राथमिक संस्कृति) पर विचार करना चाहिए. इसी तरह, जैसे कि इंसुलिन या सीरम के रूप में संवर्धन additives, के लिए आवश्यकता, इमेजिंग शर्तों (आदि इमेजिंग की अवधि, नमूना मार प्रकाश की राशि,.) और प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए.

सामान्य में, हम अलग कर देना का उपयोग करने की अनुशंसायह छोटे अणुओं (जैसे, निरोधक, आदि.) की शुरुआत करने के लिए NBs की तीव्र प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए आवश्यक है, जहां पढ़ाई के लिए डी NBs, उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए दिमाग के ठीक microdissection भी बोझिल हो सकता है जब, और उन्नत इमेजिंग अध्ययन के लिए coverslip के साथ शारीरिक संपर्क में होने की नो बॉल की आवश्यकता होती है. इसके विपरीत, हम यह छवि के लिए उपयोगी है जहां अनुप्रयोगों के लिए बरकरार दिमाग का उपयोग करने की सलाह देते ही मस्तिष्क, और विशेष रूप से पढ़ाई के लिए से कुछ NBs चिंता सेल सेल बातचीत, स्वायत्तता, प्रतिरूप विश्लेषण, सेल आकार में परिवर्तन, और अन्य जांच जहां देशी कि कोशिकाओं का माहौल महत्वपूर्ण है.

लाइव इमेजिंग के लिए बरकरार दिमाग की सफल तैयारी सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम सावधानी से निष्पादित किया जाना चाहिए. सबसे पहले, यह अनावश्यक मानसिक आघात के ऊतकों को प्रकाश में लाने से बचने के लिए जरूरी है. विशेष रूप से, मस्तिष्क explanting और परिधीय ऊतकों को हटाने की देखभाल के साथ किया जाना चाहिए. एकविदारक उपकरण और मस्तिष्क के बीच सीधे संपर्क को कम करना चाहिए. इसके अलावा, एक tugging या मस्तिष्क से जुड़ी ऊतक पर खींच से बचना चाहिए. ऊतक छेड़छाड़ आसानी से फटे या विकृत दिमाग में परिणाम कर सकते हैं. हमारे हाथ में, क्षतिग्रस्त दिमाग से NBs शायद ही कभी विभाजित करते हैं. लार्वा के मस्तिष्क विच्छेदन के लिए नए हैं, जो अक्सर रहते इमेजिंग के लिए नमूने तैयार करने के लिए प्रयास करने से पहले विच्छेदन माहिर से लाभ.

प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम सेल इमेजिंग रहने के लिए पूर्व दिमाग के बढ़ते है. संवर्धन मध्यम और कोर्ट तेल दोनों की सही मात्रा में एक उपयोगी तैयारी पूरी करने के लिए आवश्यक हैं. यह सही एक pipet साथ चिपचिपा कोर्ट तेल मापने के लिए मुश्किल है, एक आंख से सही मात्रा (लगभग 30 μl) लगभग हो सकती है. बहुत अधिक तरल जगह में बसने से coverslip रोकता है. अक्सर, इस संवर्धन पकवान की सतह पर चलती दिमाग में यह परिणाम है. लाइव इमेजिंग के दौरान, एक अस्थिर coverslip सबूत हैसेंध जब ऊतक drifts या ऑप्टिक पालियों रोल. जगह में तैनात नहीं कर रहे हैं कि नमूनों से बचा जाना चाहिए. इसके विपरीत, बहुत कम संवर्धन मध्यम या फट ऑप्टिक पालियों सहित भयावह ऊतकों को नुकसान, में कोर्ट तेल परिणामों जोड़ने. Coverslip स्लाइड करने का कारण बनता है जो बहुत अधिक तरल, का उपयोग कर बनाम coverslip के वजन को संभालने के लिए पर्याप्त तरल मध्यम और तेल का उपयोग कर के बीच एक सावधान संतुलन है. यह संतुलन सबसे अच्छा अभ्यास के माध्यम से सीखा है. सामान्य में, यह केवल छवि एक ऐसे बरकरार उदर तंत्रिका कॉर्ड और सुडौल, गोल ऑप्टिक पालियों के रूप में एक स्वस्थ आकारिकी, उन है कि दिमाग के लिए सबसे अच्छा है.

नमूना नहीं detectable बहाव के साथ मुहिम शुरू की है एक बार, जिंदा नमूना रखते हुए इस प्रोटोकॉल के अगले महत्वपूर्ण पहलू बन जाता है. यह सबसे अच्छा उचित तापमान बनाए रखने और, सबसे महत्वपूर्ण बात, नमूना हिट कि प्रकाश की मात्रा को कम करके हासिल की है. माइक्रोस्कोप सेटअप और नमूना एल की सफलता को नियंत्रित करेंगे कि दो चर रहे हैंसेल इमेजिंग ive. उच्च गुणवत्ता के उद्देश्यों, फिल्टर (~ 98% प्रसारण), और कैमरे (बैक पतला इलेक्ट्रॉन गुणा और पूरक धातु ऑक्साइड सेमीकंडक्टर) उत्सर्जन पक्ष पर एक उत्तेजना तरफ नमूना हिट कि प्रकाश की मात्रा को कम करने की अनुमति देगा. यह अच्छी तरह से (छवि GFP के लिए प्रयोग किया जाता) नीली बत्ती कोशिकाओं को बेहद जहरीला है कि जाना जाता है. एक कुल प्रकाश (कुल जोखिम बार) किसी नमूने बर्दाश्त कर सकते हैं निर्धारित कितना और फिर फैल चाहिए कि प्रयोग की अवधि के साथ कुल समय. एक नमूना केवल एक विशेष माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर 500 लेजर प्रकाश जोखिम बर्दाश्त कर सकते हैं उदाहरण के लिए, तो एक 50 x 10 टुकड़ा ढेर जमा सकता है. ये ढेर ~ 3 सेल चक्र इकट्ठा करने के लिए एक भी नो बॉल सेल चक्र, या 2-3 मिनट एकत्र करने के लिए 1 मिनट से बाहर स्थान दिया जा सकता है. इसके अलावा, प्रत्येक जीनोटाइप के लिए सेटिंग्स को अनुकूलित सफल रहते इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है. अनुकूलन अवधि के दौरान, 488 एनएम लेजर शक्ति के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु एक 100X, 1.4 एनए और से चलाई 25-50 μW है# 160; उद्देश्य तेल विसर्जन. अंत में, एक यह हमेशा सबसे परिष्कृत इमेजिंग की जरूरत है कि ऐसा नहीं है के रूप में इमेजिंग हालत ठीक से, हाथ पर सवाल का जवाब देना होगा कि क्या यह निर्धारित करना चाहिए.

लाइव या फिक्स्ड या तो ऊतक के साथ प्रयोग के लिए, दिमाग मुहिम शुरू की जा सकती छवि विशिष्ट नायब प्रजातियों की जा सके. चित्रा 3E में सचित्र के रूप में उदाहरण के लिए, stereotypically ऑप्टिक पालि 7 के पीछे औसत दर्जे क्षेत्र में रहते हैं, जो छवि प्रकार द्वितीय NBs, क्रम में, एक, दिमाग माउंट होगा. केंद्रीय मस्तिष्क NBs के स्थानिक और लौकिक पैटर्न अच्छी तरह से 1 प्रलेखित किया गया है क्योंकि आदर्श रूप में, सर्वव्यापक तहत व्यक्त कर रहे हैं या कि व्यापक रूप से उपलब्ध ट्रांसजेनिक निर्माणों, अंतर्जात प्रमोटरों के किसी भी संख्या का उपयोग करते हुए, एक छवि के लिए विशिष्ट नायब समूहों की एक किस्म हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं (1 टेबल). बहरहाल, वंश विशेष लेबलिंग टेक्नोलॉजीज 20 आवेदनों की एक संख्या के लिए उपयोगी रहते हैं.तय विश्लेषण के साथ, मामूली नुकसान के साथ दिमाग आम तौर पर स्वीकार्य हैं. इसके अलावा, परिधीय ऊतकों का पूरी तरह हटाने सिर्फ मध्यम बढ़ते में दिमाग एम्बेड करने से पहले तक के लिए स्थगित किया जा सकता है. तय ऊतक के साथ अध्ययन NBs की बड़ी संख्या imaged किया जाना चाहिए जब विशेष रूप से उपयोगी हैं.

अंत में, नायब एसीडी का अध्ययन बहुत जीना सेल इमेजिंग और विस्तृत तय विश्लेषण दोनों के उपयोग से लाभ हुआ है. यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल रहते हैं या तय की या तो अनुप्रयोगों के लिए ड्रोसोफिला लार्वा तैयार करने के लिए एक दृष्टिकोण का विवरण. हम विस्तृत इमेजिंग अध्ययन के माध्यम से नायब एसीडी की निरंतर जांच उपन्यास और विकास और बीमारी में स्टेम सेल के बारे में हमारी समझ अग्रिम होगा कि रोमांचक परिणाम खोलेगा आशा. बरकरार लार्वा दिमाग की लंबी अवधि के रहते इमेजिंग के आवेदन भेदभाव और morphogenesis विकास को नियंत्रित करने वाले घटनाक्रम (और DEGEN की अस्थायी अनुक्रम में उपन्यास अंतर्दृष्टि को उजागर करने की क्षमता हैकेंद्रीय तंत्रिका तंत्र की eration).

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के दल को सम्मानित किया स्वास्थ्य / NHLBI (1ZIAHL006126) और एक LENFANT बायोमेडिकल Postdoctoral फैलोशिप के राष्ट्रीय संस्थानों पर अंदर का रिसर्च के डिवीजन द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm Sarstedt 94.6077.410 A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium Invitrogen 21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) Invitrogen 15240-062 A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. 
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long Fine Science Tools 26018-17
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle Fisher Scientific 08-965-A
Syringe filter, 0.22 μm pore size Fisher Scientific 09-719A
Syringe, 5 ml BD Biosciences 309646
Plastic transfer pipette Fisher Scientific S30467-1
Paraformaldehyde, 32% EM-grade Electron Microscopy Sciences 15714 CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Invitrogen D1306 A dye that labels DNA and is excited by UV light.

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References

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Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).

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