Summary
Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l'imagerie des cellules vivantes dans le cadre d'un cerveau intact larvaire. Approches d'imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l'étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d'autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.
Abstract
Les cellules souches se divisent de façon asymétrique pour générer deux cellules filles ayant un potentiel de sort inégal: une cellule souche auto-renouvellement et de différenciation d'une cellule. Compte tenu de leur importance pour le développement et la maladie, la compréhension des mécanismes qui régissent la division des cellules souches asymétrique a été une zone robuste d'étude. Parce qu'ils sont génétiquement docile et soumis à des cycles successifs de la division cellulaire environ une fois toutes les heures, les cellules souches du système nerveux central chez la drosophile, ou neuroblastes, sont des modèles indispensables pour l'étude de la division des cellules souches. Environ 100 cellules souches neurales sont situés près de la surface de chacun des deux lobes du cerveau des larves, ce qui rend ce système modèle particulièrement utile pour des études de microscopie d'imagerie en temps réel. Dans ce travail, nous passons en revue plusieurs approches couramment utilisées pour visualiser les divisions de cellules souches, et nous abordons les avantages et les inconvénients de ces techniques qui emploient indissociables contre tissus cérébraux intacts. Nous avons également en détail notre simplified protocole utilisé pour explantation cerveaux entiers de troisième stade larvaire pour l'imagerie des cellules vivantes et des applications d'analyse fixes.
Introduction
Les cellules souches de maintenir un équilibre de la différenciation et de l'auto-renouvellement pour générer la diversité cellulaire au cours du développement précoce et remplacer les cellules endommagées dans les tissus adultes. Le règlement de cette homéostasie empêche à la fois la perte et la sur-expansion de la population de cellules souches, ce qui peut entraîner une dégénérescence tissulaire néfaste ou la tumorigenèse.
Neuroblastes (NBS) sont les cellules souches neurales largement étudiés du système nerveux central chez la drosophile (figure 1A) que première forme embryonnaire pendant 1, 2. NBs subissent des cycles répétés de la division cellulaire asymétrique (ACD) pour produire deux cellules inégalement malheureuse: une cellule souche auto-renouvellement et une cellule de différenciation. ACD est guidé par centrosomes, les organites non-membraneux qui agissent comme des centres microtubules organisation de la plupart des cellules 3. Au cours de la mitose, centrosomes NB organisent et orientent le fuseau mitotique bipolaire long de la polaire apicale-basaleaxe lité. Lors du clivage de la division NB, les déterminants du devenir apical qui spécifient le destin des cellules souches, et les déterminants du devenir basales qui spécifient la différenciation, sont séparés dans les cellules filles inégales.
Dans le cerveau des larves central, deux types de NBs peuvent être distingués par leur nombre, la position, l'expression du facteur de transcription, et la lignée cellulaire (figure 1A) 6.4. Type I ON sont les plus abondants, et environ 90 d'entre eux peuplent les côtés antérieur et postérieur de chaque lobe optique du cerveau 7. Ces organismes notifiés expriment le facteur de transcription Asense (Ase), et ils se divisent caractéristique dans un auto-renouvellement NB et un plus petit ganglion cellule mère (GMC, figure 1B). Chaque GMC subit une seule division borne à générer deux neurones ou des cellules gliales (figure 1B). En revanche, les organismes notifiés huit de type II qui peuplent la face postérieure de chaque lobe optique manquent Ase expression 5. Ils subissent ACDpour produire une auto-renouvellement NB et un progéniteur neural intermédiaire (INP).
Le INP, à son tour, se divise de manière asymétrique trois à cinq fois. Chacun de ces résultats des divisions dans la régénération de l'INP et la production d'un seul GMC 4. Collectivement, l'identité spécifique NB et l'ordre temporel de naissance GMC donne lieu à la diversité étonnante de neurones du système nerveux central adulte.
Compréhension de la biologie cellulaire qui sous-tend NB ACD a été grandement améliorée par l'utilisation de techniques d'imagerie des cellules. Protocoles publiés utilisées par les chercheurs à l'image NBs vivants varient considérablement. Dans l'ensemble, cependant, ces méthodes peuvent être regroupées en deux catégories générales se distinguent par le fait que le cerveau larvaire est laissé intact ou mécaniquement dissocié. Les deux techniques ont des avantages et des inconvénients distincts en fonction de la demande du chercheur.
Les premiers rapports révélant en direct division cellulaire NBsions impliquent un certain degré de dissociation manuel du cerveau larvaire. Ces protocoles détail bavures 8 ou 9 taquiner à part le cerveau afin de développer des cultures primaires à court terme de la BNS sur des lamelles de verre. Pour améliorer l'imagerie, les organismes notifiés rondes sont généralement aplatis sur les lamelles soit avec des lames de verre 8 ou 9 pads agarose. Bien que les cellules aplaties ont amélioré l'optique, ces techniques entraînent souvent des défauts NB mitotiques, y compris la régression du sillon de clivage et l'incapacité à diviser plus d'une fois. Par conséquent, les protocoles qui impliquent à la fois manuel et la distorsion dissociation physique du tissu cérébral larves ne sont généralement adaptés à court terme (c.-à-., Un cycle cellulaire ou moins) très applications. De même, semi-écrasement ou aplatissement complètement cerveaux intacts entre des lames de verre et des lamelles limite le temps on peut passer imagerie un échantillon donné, à une période d'environ 30 min 10. Malgré cette limitation, this approche a été utilisée avec succès 11-14.
Les efforts récents de l'image en direct dissociés limite NBs distorsion physique des cellules isolées. Ces techniques sont particulièrement utiles pour des applications où il est nécessaire de maintenir des cultures de cellules pour plusieurs cycles de division cellulaire. Par exemple, les cellules dispersées dans des cerveaux dissociées manuellement peuvent être partiellement noyés dans un caillot fabriqué à partir du mélange de fibrinogène et de la thrombine 15 pour l'imagerie à long terme 16. En variante, les cerveaux explantées peuvent être dissociées premier chimiquement avec l'enzyme collagénase, la prochaine perturbation manuellement par passage répété à travers un embout de pipette, et ensuite étalées sur des boîtes de poly-L-lysine à fond de verre 17, 18. Revêtement plats en verre avec soit fibrinogène ou poly-L-lysine favorise l'attachement et légère propagation des cellules rondes, leur apportant le plus près de la lamelle possible sans distorsion majeure physique. En additisur, ces méthodes impliquent la culture de la notifiés dans un milieu qui peut être facilement échangé des expériences de perturbation pharmacologiques 18. Dans l'ensemble, le placage directement dispersé NBs améliore optique d'imagerie sans sacrifier les capacités d'imagerie à long terme. Récemment, un protocole décrivant la culture à long terme des organismes notifiés dissocié a été détaillé 19.
Cependant, cette approche n'est pas sans limites. Il ya plusieurs mises en garde à l'imagerie NBs direct dissociées. Dans un champ de cellules dispersées, par exemple, il est difficile d'identifier des lignées de NB spécifiques qui sont organisées spatialement dans le cerveau intact 1. De même, la distinction du type I par rapport type II notifiés dans le tissu dissocié est également difficile sans l'expression de marqueurs de la lignée ou transgènes spécifiques des sous-types, tels que worniu-GAL4, GAL80 aSENSE-20. Bien que ces transgènes sont très utiles pour certaines applications, ils ne limitent les chercheurs à ceux transgènes expressé sous le contrôle de l'élément UAS d'activateur 21 et nécessitent des systèmes génétiques complexes. Les études qui concernent la mise au point spatial ou temporel du NB, par conséquent, nécessitent l'imagerie in vivo dans le cadre d'un tissu intact.
En outre, des études sur les ON embryonnaires dissociées indiquent que le contact physique de cellules adjacentes est critique pour la localisation d'interphase de polarité clé Déterminants 22, 23. Ces études montrent complètement isolé NBs plus maintenir l'axe de fuseau mitotique invariant. Au lieu de cela, ces cellules présentent un axe de broche plus aléatoires et de larges angles de séparation entre les bourgeons GMC successives, peut-être en raison de la perte de positionnement du centrosome apicale 22. Bien que la relation entre les organismes notifiés larves et leurs cellules voisines n'a pas été étudié, il est intéressant de considérer que le microenvironnement des cellules souches larvaire peut empiéter sur la polarité cellulaire ou autrecomportements. Pour maintenir le contexte physiologique des larves de NB, nous l'image ACD à partir de cerveaux entiers.
Compte tenu des limites inhérentes à l'imagerie dissocié NB, notre laboratoire et d'autres ont établi des protocoles à l'image des cycles successifs de NB ACD du cerveau larves entières. Les techniques à l'image cerveaux intacts remplacent souvent la surface de verre rigide d'un côté de la chambre de culture avec une membrane flexible pour empêcher la déformation ou endommagement des tissus et pour permettre l'échange de gaz. Certains procédés impliquent le montage cerveaux explantées dans un mélange de milieu de culture d'insecte, le sérum, et l'acide ascorbique avec les corps gras isolés à partir de dix larves 24. Les corps gras isolées sont ajoutés parce qu'ils sécrètent un mitogène connu pour stimuler la division cellulaire NB 25. Ce protocole préserve l'intégrité du tissu pendant plus de 3 heures et est, par conséquent, se prêtent à l'imagerie à long terme 24, 26-28. Récemment, un protocole décrivant la lonimagerie g terme de cerveaux larves intactes en présence de l'acide ascorbique, le sérum et corps gras a été détaillé 29. Il est important, parce que le tissu n'est ni exposé ni immobilisé, cette approche est moins utile pour des applications où milieu de culture est échangé (par exemple, des études de médicaments, immunodéplétion, etc.).
Notre laboratoire a simplifié l'ensemble de la préparation de montage de cerveaux de larves vivantes pour l'imagerie à long terme 30, 31. Le principal avantage de notre protocole sur les autres est sa simplicité: nos observations indiquent ni sérum, l'acide ascorbique, de l'insuline, ni corps gras sont les additifs nécessaires à l'image des cycles successifs de NB ACD. Bien que des additifs tels que l'insuline, ont été utiles pour l'imagerie prolongée de divisions de cellules souches 32 et migration collective de cellules dans les ovaires chez la drosophile 33, ils semblent être indispensables pour NB ACD, comme notre moyen d'imagerie consiste en un simple mélange de standard insecte milieu de culture cellulaire supplémenté avec l'antibiotique-antimycosique pour éviter la contamination. Grâce à l'utilisation de plats gaz-perméables ou en verre réutilisables culture sur le fond, nous avons été en mesure de soutenir plusieurs séries de successives NB ACD. Les mêmes échantillons expiantes peuvent facilement être utilisés pour l'immunofluorescence et d'autres procédures avec tissu fixé. Dans ce protocole, nous détaillons la dissection des cerveaux de larves intactes, ainsi que la préparation des cerveaux pour analyse à la fois en direct et fixe.
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Protocol
1. Préparation du matériel requis pour explant Brains troisième stade larvaire
- Préparer les outils nécessaires pour microdissection.
- Forge deux outils de dissection (un scalpel et un crochet) en plaçant d'abord un axe de dissection unique dans chaque support de broche. Garantir les broches étroitement main et l'aide de pinces (La figure 1C).
- Utilisez une paire de vieilles pinces à plier une broche de dissection à un angle d'environ 120 °. Pour ce faire, sous un microscope à dissection pour s'assurer que la moitié supérieure de la broche à plat lorsque le support de broche est tenu dans la main. Cet outil sera utilisé comme un scalpel de maintenir enfoncée ou couper à travers le tissu.
- Utilisez une paire de vieilles pinces à plier la seconde broche en forme de crochet qui sera utilisé pour contenir et gratter les tissus.
- Couvrir chaque outil de dissection avec une pointe de pipette pour protéger les outils de dommages. Avec des soins, des outils bien formés peuvent être utilisés pour la dissection indéfiniment. Remplacer les broches endommagées ou déformées si nécessaire.
- Préparer dissection moyen.
- Dans une hotte de culture tissulaire, diluer le supplément de l'antibiotique antifongique dans le milieu de culture de Schneider. Agiter les médias à intégrer le supplément.
- Préparer plusieurs aliquotes de 5 ml des milieux supplémentés. Conservez tous les médias à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Réchauffer une portion aliquote de 5 ml de milieu additionné à température ambiante. Tracer le milieu dans une seringue stérile de 5 ml et le visser sur un filtre à seringue de 0,2 um stérile.
- Sélectionnez larves pour la dissection. Utiliser une sonde de dissection pour sélectionner ramper troisième stade larvaire que le cerveau sera plus facile à disséquer. En option: le dépôt des larves sur une plaque de gélose de raisin.
Note: Ne pas utiliser les flacons ou bouteilles trop bondés avec "la nourriture humide», comme ils ont tendance à forcer deuxième ou larves de premier stade de ramper prématurément.
Remarque: Certains milieux génétiques nécessiteront l'aide de jeunes larves. Cela n'affecte pas le protocole, mais ne fait la dissection plus difficile.
2. Dissection du système nerveux central
- Sur une lame de verre unique, créer deux piscines de 50 ml de médias de dissection chaudes séparées d'environ 3 cm. Une piscine sera utilisé pour la dissection brut et autres utilisées pour dissection fine (figure 1C).
- Transférer plusieurs larves à l'une des gouttes de médias.
- Déplacer la lamelle couvre-objet avec des larves d'un microscope à dissection. Faire un zoom dans la piscine contenant des larves de telle sorte que les extrémités antérieure et postérieure des larves sont discernables.
- Utilisez une paires de pinces pour saisir la mi-région d'une seule larve. Prenez une seconde paire de pinces dans l'autre main et saisir la larve près de la même région. Tirez sur les deux paires de pinces à part pour le déchirer doucement la larve de moitié. Répétez les deux étapes précédentes pour toutes les larves sur la lamelle.
- Éliminer les moitiés postérieures du corps des larves en les transférant à un tissu.
- Zoomez sur une larve de sorte que ee antérieures mouthhooks sont clairement visibles. Utiliser les deux paires de pinces pour créer une petite incision ou encoche, sur des côtés opposés des larves mouthhooks entre la troisième et la première thoracique bandes de denticle antérieures.
- Saisissez les mouthhooks avec la pince dans la main non dominante. Utilisez la pince dans l'autre main pour éplucher doucement cuticule dans une direction antérieure à postérieure. Continuer à peler lentement cuticule jusqu'à ce que le système nerveux central est exposé.
- Isoler le système nerveux central du reste de la larve par déchirement des tissus avec la pince. Faites attention de ne pas perturber le système nerveux central.
Étape critique: Ne pas tirer sur le système nerveux central! Jeter échantillons endommagés par un cordon déchiré ventral de nerf (figure 2A) ou lobes optiques déformées (figures 2B et 2B). - Répétez les deux étapes précédentes pour toutes les larves sur la lamelle. Transférer le tissu sain explantée à ladeuxième (propre) Piscine de milieu sur la lamelle pour la phase de dissection amende.
- Utilisez les outils de broches de dissection pour déblayer les tissus périphériques (par exemple, les yeux, les ailes et les jambes disques) du cerveau. Faites glisser le scalpel entre le voulu (cerveau) et le tissu non désirée, épinglant le tissu conjonctif de la lamelle. Utilisez le crochet pour taquiner doucement le tissu indésirable tout en appuyant sur le scalpel à la lamelle dans les mouvements de scie, etc.
- Étape cruciale: Travaillez lentement et délibérément de supprimer tous les disques de chaque cerveau. Faites attention de ne pas perturber la morphologie du cerveau. Un cerveau sain aura un cordon intact ventrale de nerf et symétrique, lobes optiques rondes (figure 2C).
3. Montage Brains explantées pour l'imagerie en direct
- Inverser une boîte de culture de 50 mm perméable au gaz avec le film transparent vers le haut (figure 2D). Appuyer sur la seringue pour déposer une petite goutte (environ 30 pi) de support sur til centre de l'assiette.
- Transférer les cerveaux isolés, un à la fois, à la goutte de milieu sur le plat. Utilisez l'outil de crochet pour ramasser un cerveau sous les lobes optiques. Vous pouvez également utiliser une pince pour saisir axones de la corde nerveuse ventrale.
- Recueillir 5-10 cerveau dans la goutte de milieu. Immerger les cerveaux en utilisant les outils de broches de dissection pour pousser le cerveau des individus à la partie inférieure de la goutte de milieu en tant que nombre d'entre eux seront piégés au niveau du ménisque (figure 2E).
- Orientez le cerveau en utilisant les outils de broches de dissection d'aligner cerveau en fonction de la notifiés à imager (figure 3A). À l'image de la NBs dorsale, placez la corde nerveuse ventrale vers le bas (le long de la membrane). À l'image de la BNS de antéro-ventral, placent le cerveau avec la corde nerveuse ventrale vers le haut (loin de la membrane). Aligner les cerveaux de telle sorte que tous les cordons nerveux ventraux pointent dans la même direction dans le plan xy.
- Utiliser une seringue ou en plastique transfert pipette de placer 4 halocarbures (HC) des gouttes d'huile (environ 30 pi de chacun) sur la membrane perméable aux gaz. Le volume de chaque goutte d'huile doit être équivalente à l'autre et à la goutte de milieu. L'espace des gouttes d'huile de correspondent aux quatre coins d'une lamelle couvre-objet centré autour de la goutte de milieu de culture. Une fois terminé, les cinq gouttes (quatre gouttes d'huile et une goutte de milieu dans le centre) ressembleront les cinq facettes sur de style occidental dés (figure 3B).
- Abaisser une lamelle # 1,5 mm 22 sur l'assemblage de telle sorte qu'il frappe l'ensemble des cinq gouttes en même temps. Le maintien d'une pression, même à travers les échantillons réduit la probabilité qu'ils seront perturbés. Attendre environ 3 minutes, comme de l'huile et de milieu de dispersion sous le poids de la lamelle. Une forme de croix de médias se former (figures 3C et 3D).
- Étape cruciale: Abaisser la lamelle sur la surface du cerveau en enlevant l'excès médias utilisant une mèche de papier tissu (Figure 3C). Pour ce faire, tout en regardant l'échantillon sous le microscope à dissection. Comme les médias est enlevé, la lamelle sera inférieur. Arrêtez une fois la lamelle touche le cerveau. Ne pas trop mèche au risque de provoquer de distorsion du tissu ou du cerveau explosions.
- Si l'imagerie dorsale notifiés (figure 3F), passez à l'étape 3.9. Si imagerie NBs de antéro-ventrale, la lamelle doit être légèrement déplacé (en poussant doucement avec une pince) dans le sens des conseils nerf de la moelle ventrale. Cela provoque le cerveau à tourner, ce qui amène les lobes du cerveau en contact direct avec la lamelle couvre-objet pour faciliter la formation d'image (figure 3F).
- Sceller la chambre en entourant la lamelle couvre-objet avec de petites quantités d'huile d'hydrocarbure halogéné (Figure 3D). L'excès d'huile qui suinte de la lamelle doit être minimisée et effacé loin avec un tissu.
4. Imagerie en direct de Central Neuroblastes cerveau
Note: Pour ce travail, un disque tournant Nikon Eclipse TiMicroscope confocal (microscope inversé) a été utilisée pour l'imagerie en temps réel; détails de notre installation ont déjà été publiés 31. En variante, l'échantillon peut être imagé en utilisant un système à la verticale.
- Ajouter une goutte d'huile d'immersion à la lamelle juste au-dessus des cerveaux montés. Cela vous aidera à centrer l'objectif directement au-dessus de l'échantillon.
- Étape cruciale: Maintenir cerveau à une température constante de 25 ° C avec un incubateur d'étape. Positionnez délicatement l'échantillon monté dans l'incubateur de la scène et couvrir la chambre avec son couvercle.
- Localiser NBs centrales du cerveau en utilisant la lumière transmise en se concentrant sur les grandes cellules rondes qui résident dans les zones centrales et médiales des lobes optiques, ne pas utiliser épi-fluorescence. Cela devient plus facile avec la pratique. Il est très important d'exposer l'échantillon à la moindre quantité de lumière que possible. Ne perdez pas de cerveau d'imagerie de temps qui sont endommagés.
- Une fois en place, prendre des positions rapides utilisant le confocale àdéterminer l'emplacement et la profondeur adéquate. Limiter la profondeur à la première 10-15 um. Ajustez au besoin, et prendre une autre image de test.
- Étape facultative: Recueillir un film d'essai de la corde nerveuse ventrale pour s'assurer qu'il n'y a pas de dérive de xy. Si la dérive est détectée, attendre 15-30 minutes pour l'échantillon à régler. Si la dérive ne s'installe pas en 30 min, préparer un nouvel échantillon. Dérive majeure peut généralement être retracée à l'ajout de l'excès d'huile, ou la taille inégale des gouttes d'huile pendant le montage.
- Pour éliminer la dérive axiale (z-dérive) utiliser un dispositif de focalisation automatique en continu qui utilise une LED infrarouge. Sinon, corriger manuellement le plan focal.
- Une fois NB d'intérêt est identifiée, procéder à l'imagerie régime. Comme avec tous imagerie des cellules vivantes, la quantité de lumière laser, temps d'exposition, la caméra binning, grossissement de l'objectif, du temps et / ou l'intervalle z étapes doivent toutes être empiriquement optimisé pour une expérience particulière pour répondre à la question à portée de main. L'objectif est de minimiser barrage lumièretandis que de l'âge encore la collecte de données utiles. Voir la discussion pour des informations supplémentaires.
- L'image de la totalité du volume du NB 12-14 en recueillant des images espacées de 1 um dans l'axe z. Réglez la résolution de temps pour capturer cycles cellulaires simples ou multiples de la même NB. En règle générale, utiliser 10-30 seconde d'intervalle pour l'imagerie du cycle cellulaire unique et 1-3 minutes d'intervalle pour les cycles cellulaires multiples.
- Étape cruciale: Assurez-vous que l'échantillon est sain en contrôlant la durée de la mitose. Si la mitose prend plus de 15 minutes, passer à un autre cerveau. Un cerveau sain montrera de nombreux organismes notifiés dans le même champ de vue de subir plusieurs cycles de mitose. A noter que chaque cycle cellulaire est légèrement plus long que le précédent en raison de dommages de la lumière.
- Une fois l'imagerie terminée, démonter la chambre d'incubation, et jetez tout mais les plats de culture perméables aux gaz. Rincer la surface de la boîte de culture avec 95% d'éthanol et essuyez bien avec un tissu. Répéter deux autres fois.
5. Préparation de Brains pour immunofluorescence
- Recueillir 20 ou plus expiantes cerveau dans un tube de 1,5 ml, contenant environ 0,2 ml de milieu supplémenté.
- Éliminer le milieu du tube et rincer une fois avec de cerveaux 0,5 ml PBSTx (Phosphate Buffered Saline, PBS, avec 0,3% de Triton X-100). Laissez cerveaux se déposent au fond du tube entre tous les échanges de liquide. Le détergent Triton X-100 est utilisé pour perméabiliser les tissus. Rinçage prend généralement moins de 30 secondes; il suffit de retirer le PBSTx fois cerveaux se sont installés au fond du tube.
- Remplacer la solution avec 0,5 ml de paraformaldehyde à 9% d'électrons à niveau de la microscopie dilué dans PBSTx. Incuber avec nutation pendant 15 min à température ambiante.
- Disposer de fixateur conformément à la réglementation sur les déchets dangereux.
- Laver les échantillons par 0,5 ml PBSTx pendant 15 min. Répétez l'étape de lavage avec PBSTx frais deux fois de plus.
- Remplacer la solution avec 0,5 ml PBT (PBS, 1% Albumine de sérum bovin (BSA) et 0,1% de Tween-20). Incuber avec nutation pendant 1 heure à température ambiante. Cette blocs de l'étape de liaison non spécifique de l'anticorps au tissu.
- Remplacer la solution avec 0,5 ml anticorps primaire dilué dans PBT complété avec 4% de sérum de chèvre normal (NGS). Incuber avec nutation pendant une nuit à 4 ° C.
- Jeter ou mettre l'anticorps primaire dilué.
- Laver les échantillons par 0,5 ml PBT pendant 15 min. Répétez l'étape de lavage avec PBT frais deux fois de plus.
- Remplacer la solution avec 0,5 ml de modification PBT (PBS, BSA 2%, 0,1% de Tween-20, et 4% NGS). Incuber avec nutation pendant 1 heure à température ambiante.
- Remplacer la solution avec 0,5 ml anticorps secondaire dilué en PBT modifié. Incuber avec nutation pendant 2 h à température ambiante.
- Remplacer la solution avec 0,5 ml de PBST (PBS avec 0,1% de Tween-20). Incuber avec nutation pendant 15 min à température ambiante. Répétez l'étape de lavage au PBS frais deux fois de plus.
- Transférer soigneusement les échantillons comme une goutte sur une lame de verre, ce qui limite la chute vers la gauche du centre de la diapositive.
- Ajouter une baisse importante (environ 2 cm de diamètre) de milieu de montage (par exemple, Aqua-Poly/Mount) au centre de la diapositive. Évitez la piscine de PBST qui est vers la gauche.
- Utilisez une pince à transférer les cerveaux de la piscine de PBST à la piscine de milieu de montage. Ajout de milieu de montage directement sur le cerveau peut perturber leur orientation et doit être évitée.
- Sous un microscope optique, organiser les échantillons dans le milieu de montage avec le côté qui sera imagé vers le haut.
- Avec la lame sous le microscope optique, abaissez lentement une lamelle de verre # 1.5 sur le dessus des échantillons. Étape facultative: Déloger les bulles d'air mineures en poussant légèrement sur la lamelle.
- Laisser le milieu de montage à polymériser pendant plusieurs heures, ou toute la nuit, par le mensonge diapositives plat, la lumièreprotégé, à la température ambiante.
- Les lames peuvent être imagé le lendemain, ou stocké avant l'imagerie.
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Representative Results
Imagerie en temps réel a élucidé un certain nombre de mécanismes qui régulent NB ACD. Avant l'acquisition des images, il est nécessaire de déterminer les conditions optimales d'imagerie. Il est nécessaire d'équilibrer le taux de capture d'image avec la durée d'imagerie des cellules vivantes. Pour l'analyse cellulaire fine, par exemple, a augmenté temporelle et la résolution optique peut être nécessaire. Quand la visualisation d'un cycle cellulaire NB unique (figure 4A), la vitesse à laquelle les images sont capturées peut être augmentée sans introduire de photovieillissement. Typiquement, des événements uniques de la division cellulaire peuvent être surveillés à environ 10-30 intervalles de temps sec. Une façon d'augmenter la résolution temporelle sans endommager les tissus est de moduler le taux d'acquisition d'images. Par exemple, imagerie time-lapse peut être initié à une vitesse inférieure, qui est ensuite augmenté sur l'observation d'une caractéristique intéressante ou un point (Film 1) de temps.
Imagerie des cycles successifs de la division cellulaire (
Pour l'analyse de grands nombres d'échantillons, il est souvent nécessaire d'analyser les ON fixes. Notre protocole de fixation préserve la morphologie générale de la BNS et est compatible avec les techniques d'immunofluorescence (figures 4C-4E). Tout le brai montage fixens peuvent être visualisés à faible grossissement (figure 4C) pour visualiser la taille globale du cerveau et de la forme ou de détecter les organismes notifiés. Pour visualiser notifiés ou de leurs CMG de la descendance plus en détail, plus fort grossissement doit être utilisé. À un grossissement modéré (figure 4D), les clusters NB lignée entières peuvent être observées. Pour une analyse détaillée cellulaire, plus fort grossissement est utilisé (figure 4E).
Figure 1. Explantation cerveaux entiers pour l'imagerie des cellules vivantes de NB ACD. A) Le système nerveux central des larves est constituée de deux lobes optiques et une corde nerveuse ventrale. Deux sous-types de NBs peuplent le lobe optique dans des positions stéréotypées:. Type I (bleu foncé) et de type II (bleu clair) B) NBs subissent ACD. Avec chaque division cellulaire, laNB s'attache à donner lieu à un GMC (ou INP, non représentés) et régénère la cellule souche NB. CMG va diviser pour donner naissance à deux neurones (ou cellules gliales, non représenté) en C). Deux outils de microdissection sont assemblés par des goupilles de dissection en porte-broches. Plier les broches crée des outils uniques, un scalpel et un crochet, qui sont utilisés pour couper, percer, et déplacer les tissus indésirables sans endommager le cerveau sous-jacent. D) Les cerveaux sont explantées dans l'une des deux piscines de médias de dissection (cercles bleus). Une piscine de moyenne est utilisé pour supprimer le système nerveux central des larves (de dissection brut), et l'autre piscine est utilisée pour bien microdissection des tissus périphériques des cerveaux expiantes (amende de dissection).
Figure 2. Preservation de la morphologie du cerveau pendant microdissection. Hasty dissection du cerveau peut provoquer des lésions graves des tissus qui comprend (A) déchirés cordons nerveux ventral ou (B) déformées lobes optiques. Encore plus subtil des lésions tissulaires (B ') doit être évitée pour l'imagerie des cellules vivantes. (C) Un exemple d'un échantillon de tissu sain convenable pour l'imagerie en temps réel. D) An, de la membrane perméable aux gaz optiquement transparente. E) Une collection de plusieurs cerveaux sains disposé dans la mise en culture sur une boîte de milieu perméable au gaz. Ces cerveaux sont prêtes à être montées pour la microscopie. Barre d'échelle: (AC), 100 um; (D) 25 mm; (E) de 1 mm.
Figure 3. Cerveaux pour l'imagerie des cellules vivantes de montage. A) du cerveaus sont alignés en rangées à l'intérieur d'une goutte de milieu de culture déposé au centre de la boîte. B) La goutte de milieu est entourée par des gouttes d'huile HC de volume approximativement égal. Les quatre gouttes d'huile de HC et de la baisse de milieu central ressemblent les cinq facettes de jouer aux dés. Après une lamelle couvre-objet est abaissé sur les gouttes d'huile, (C) une mèche est façonnée à partir d'un tissu Kimwipe et utilisé pour éponger l'excès de liquide. D) Le bord extérieur de la lamelle est entourée par une mince couche d'huile pour arrêter l'évaporation du milieu de culture. Ces cerveaux sont maintenant prêts pour la microscopie. E et F) L'orientation du cerveau par rapport à la lamelle détermine les neuroblastes sont accessibles pour l'imagerie des cellules vivantes. E) neuroblastes dorsales sont imagés en disposant les cerveaux avec la face ventrale de toucher la membrane perméable au gaz . F) neuroblastes antéro-ventrale peuvent être imagées par arrAnging les cerveaux avec la face dorsale de toucher la membrane perméable aux gaz et poussant ensuite la lamelle couvre-objet, et les tissus sous-jacents, en direction de l'extrémité du nerf de la moelle ventrale. Cette motion s'incline légèrement les lobes optiques tels que les contacts de antéro-dorsal surface de la lamelle, ce qui porte l'axe d'imagerie souhaités dans un alignement parfait (ligne verte).
Figure 4. Des résultats représentatifs de l'imagerie en direct de neuroblastes division. A et B) imagerie en direct de NB souches divisions cellulaires dans des préparations entières de montage en utilisant un 40X, 1,3 NA objectif à immersion d'huile. L'heure est affichée comme min: sec par rapport au début de la time-lapse A) Stills de l'imagerie time-lapse d'un seul cycle cellulaire à partir d'un NB exprimant la GFP-Moesin.(GFP-Moe). Le taux d'un seul cycle cellulaire d'acquisition d'image peut être augmentée pour améliorer la résolution temporelle sans induire photovieillissement. B) Images de l'imagerie time-lapse de cycles successifs de la division cellulaire d'une NB exprimant à la fois la GFP-Moe et un marqueur centrosome GFP-étiquetée. La période prolongée associée à des cycles multiples de cellules nécessite la résolution temporelle réduite pour éviter le photovieillissement. Notez que la longueur de temps entre chaque division cellulaire augmente au cours de l'imagerie. CE) projections confocale de cellules souches fixes à partir de préparations de montage entières. C)) à l'image de tous les organismes notifiés situés sur les deux lobes optiques, un grossissement de 20x est utilisé. Cette analyse est particulièrement utile pour examiner la morphologie globale du cerveau et de quantifier le nombre NB (bleu clair), etc. D) La majorité des organismes notifiés (rose) d'un lobe optique unique peut être visualisé avec un grossissement de 40X. Microtubules (vert). E)
Film 1. D'imagerie en direct d'un seul cycle cellulaire NB. Images time-lapse d'une seule division cellulaire NB d'un cerveau exprimant la GFP-Moe pour marquer le cortex cellulaire. Les images ont été acquises à un plan optique unique à un grossissement de 40X. Dans ce film, les cadres ont été capturés toutes les 15 secondes. Après environ 7 min de l'acquisition, le taux a été porté à une image toutes les 5 sec. Cliquez ici pour voir le film.
Movie 2. Imagerie en direct de cycles successifs of NB ACD. images de time-lapse d'une NB subissant trois cycles de division cellulaire dans le cerveau exprimant la GFP-Moe et un marqueur GFP centrosome marqué. Les images ont été acquises à deux intervalles de temps min à 60x. Cliquez ici pour voir le film.
| Ligne | Structure cellulaire marqué | Fluorophore | Expression / Promoteur | Citation |
| YFP-Asterless | Centriole | YFP | Ubiquitine | Rebollo, et al. (2007) Dev. La cellule 12:. 467. |
| SAS6-mCherry | Centriole | mCherry | Endogène | Rusan et Peifer (2007) J. Cell Biol. 177 |
| GFP-SAS6 | Centriole | GFP | Endogène (BAC) | Lerit et Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013. |
| GFP-PACT | Centriole | GFP | Ubiquitine | Martinez-Campos, et al. J. Cell Biol 165:. 673. |
| GFP-SAS4 | Centrosome | GFP | Ubiquitine | Dix et Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1,759. |
| GFP-Polo | Centrosome | GFP | Endogène | . Moutinho-Santos, et al (1999) Cell Biol 91:. 585. |
| GFP-γ-tubuline 23C | Centrosome | GFP | Ubiquitine | Lerit et Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013. |
| GFP-Centrosomin | Centrosome | GFP | UAS | Megraw, et al. (2002) J. Cellule Science 115:. 4707. |
| GFP-Spd-2 | Centrosome | GFP | Ubiquitine | Dix et Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1,759. |
| mCherry-α-tubuline | Microtubules | mCherry | Ubiquitine | Rusan et Peifer (2007) J. Cell Biol 177:. 13. |
| GFP-α-tubuline | Microtubules | GFP | Ubiquitine | . Rebollo, et al (2004) PLoS Biol 2:. E8. |
| Jupiter-GFP («G147») | Microtubules | GFP | Endogène | Morin, et al (2001) PNAS 98:.. 15050. |
| mCherry-Jupiter | Microtubuless | mCherry | UAS | Cabernard et Doe (2009) Dev. Cellule 17: 134. |
| H2AvD-mRFP | ADN | mRFP | Endogène | Pandey, et al. (2005) J. Cellule Science 118:. 733. |
| H2AvD-GFP | ADN | GFP | Endogène | Clarkson et Saint (1999) ADN Cell Biol 18:. 457. |
| Moesin-GFP | Actine corticale | GFP | Courge spaghetti | Kiehart, et al. (2000) J. Cell Biol 149:. 471. |
Tableau 1. Une sélection de lignées transgéniques utiles pour l'étude de l'ACD. Ces constructions de fusion sont particulièrement utiles pour l'étude de la division cellulaire. Ils sont couramment utilisés dans NB études d'imagerie en temps réel.
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Discussion
Imagerie des cellules vivantes est une approche précieuse utilisée pour étudier les mécanismes qui régulent ACD de cellules souches, la différenciation des lignées cellulaires, et la morphogenèse des tissus complexes. Bien que les groupes de recherche ont toujours utilisé une variété de techniques pour visualiser NB ACD, ces approches peuvent généralement être regroupés en deux catégories qui diffèrent principalement quant à savoir si le tissu cérébral est laissé intact ou dissocié.
Imagerie dissocié NBs a ses avantages. Pour l'un, dissociés notifiés sont plus faciles à l'image, car ils sont particulièrement faciles à identifier que les grandes cellules (environ 12 m de diamètre) dans un récipient de culture. En outre, la quasi-totalité des cellules souches qui sont mises en culture sur une surface de verre seront tout aussi proche de l'objectif du microscope pendant toute la période d'acquisition d'image. La qualité optique des images par laps de temps est en outre améliorée par l'utilisation soit de la poly-L-lysine ou de fibrinogène verre revêtu d'induire la semi-aplatissement de la ronde NBs 16, 17. Un autre avantage de l'imagerie NBs dissociées en culture est la facilité avec laquelle la culture de milieu peut être échangé. Une fois que les cellules adhèrent à la surface de verre revêtu, en cultivant du milieu contenant n'importe quel nombre d'agonistes, des antagonistes pharmacologiques, ou des anticorps immunobloquant, etc. peuvent être ajoutés ou supprimés. Enfin, les approches récentes de visualiser NBs dissociées ont démontré que cette technique est, en effet, se prêtent à l'acquisition d'image prolongée 18, 19.
Néanmoins, les inconvénients de l'imagerie dissociés NBs comprennent la complexité du protocole. La plupart des méthodes détail longue (30 à 60 min), la digestion chimique, suivie d'une étape d'incubation (60 min) pour permettre aux cellules de se déposer dispersées et adhèrent à la boîte de culture 17, 19.
En revanche, les organismes notifiés d'imagerie à partir d'un cerveau intact préserve à la fois lacontexte physiologique et la morphologie du tissu. Les avantages de cette approche sont la capacité d'identifier des lignées de NB spécifiques qui se développent dans des arrangements stéréotypes ou à des moments définis du développement 1. Par conséquent, notre protocole simplifié a une utilité qui s'étend au-delà des études de ACD, car il permet également d'investigation en direct de la différenciation et de la morphogénèse des événements. Un inconvénient de cette méthode, cependant, est l'incapacité d'échanger la culture de milieu. Par conséquent, les chercheurs qui s'intéressent à l'imagerie à long terme des divisions de cellules souches successives doivent tenir compte de l'approche (de culture primaire dissocié par rapport à l'ensemble de montage) qui convient le mieux à leur application. De même, la nécessité d'additifs de mise en culture, telles que l'insuline ou de sérum, doit être déterminée de façon empirique sur la base des conditions de formation d'image (d'une durée de formation d'image, la quantité de lumière atteignant l'échantillon, etc.) Et montage expérimental.
En général, nous recommandons d'utiliser dissocientNBs d pour les études où il est nécessaire d'évaluer la réponse aiguë de NBs à l'introduction de petites molécules (par exemple, des inhibiteurs, etc.), pour les applications à haut débit quand bien microdissection des cerveaux pourraient être trop lourd, et pour les études d'imagerie de pointe qui nécessitent le NB à être en contact physique avec la lamelle. En revanche, nous recommandons d'utiliser cerveaux intacts pour les applications où il est utile à l'image de quelques organismes notifiés de la même cerveau, et en particulier pour les études que les interactions préoccupation cellule-cellule, autonomie, analyse clonale, les changements de forme de la cellule, et d'autres enquêtes où l'indigène milieu des cellules est importante.
Pour assurer la bonne préparation de cerveaux intacts pour l'imagerie en temps réel, plusieurs étapes critiques doivent être soigneusement exécutées. Tout d'abord, il est impératif d'éviter d'exposer le tissu à un traumatisme inutile. Plus précisément, l'explantation le cerveau et enlever les tissus périphériques doit être effectuée avec soin. Undevrait minimiser le contact direct entre les outils de dissection et le cerveau. En outre, il faut éviter tirant ou tirant sur le tissu attaché au cerveau. Une mauvaise manipulation du tissu peut facilement entraîner dans les cerveaux déchirés ou déformés. Dans nos mains, notifiés à partir de cerveaux endommagés diviser rarement. Les personnes qui sont nouvelles pour larvaire dissection du cerveau bénéficient souvent de la maîtrise de la dissection avant de tenter de préparer des échantillons pour l'imagerie en direct.
Une autre étape cruciale dans le protocole est le montage des cerveaux avant de vivre l'imagerie cellulaire. Les volumes corrects des deux milieu de culture et d'huile HC sont essentielles pour compléter une préparation utile. Bien qu'il soit difficile de mesurer avec précision l'huile de HC visqueux avec une pipette, on peut rapprochant le volume correct (environ 30 pi) par œil. Trop de liquide empêche la lamelle de s'installer en place. Souvent, cela se traduit dans le cerveau qui se déplacent sur la surface du récipient de culture. Au cours de l'imagerie en direct, une lamelle en suspens est evident lorsque les dérives de tissu ou le rouleau de lobes optiques. Les échantillons qui ne sont pas positionnés en place doivent être évités. Au contraire, en ajoutant trop peu milieu de culture ou les résultats de pétrole HC à des lésions tissulaires catastrophique, y compris lobes rafale optique. Il ya un juste équilibre entre l'utilisation assez milieu liquide et huile pour supporter le poids de la lamelle plutôt que d'utiliser trop de liquide, ce qui provoque la lamelle de glisser. Cet équilibre est meilleur appris par la pratique. En général, il est préférable de l'image seulement ces cerveaux qui ont une morphologie en bonne santé, par exemple un cordon nerveux ventral intact et symétriques, les lobes optiques rondes.
Une fois l'échantillon est monté sans dérive détectable, en gardant l'échantillon vivant devient le prochain aspect essentiel de ce protocole. Ceci se fait en maintenant la température convenable et, plus important, ce qui réduit la quantité de lumière qui frappe l'échantillon. La configuration du microscope et l'échantillon sont les deux variables qui régiront le succès de live imagerie cellulaire. Objectifs de qualité, les filtres (~ transmission de 98%), et des caméras (électronique dos aminci multipliant et semi-conducteur complémentaire à oxyde de métal) sur le côté d'émission permettront l'autre pour réduire la quantité de lumière qui frappe l'échantillon sur le côté d'excitation. Il est bien connu que la lumière bleue (utilisé pour l'image GFP) est très toxique pour les cellules. Il faut déterminer la quantité de lumière totale (total des temps d'exposition) un échantillon donné peut tolérer et s'est ensuite propagée que le temps total le long de la durée de l'expérience. Par exemple, si un échantillon ne peut tolérer 500 expositions de lumière laser en fonction d'une configuration de microscope particulier, on pourrait alors recueillir des piles 50 x 10 découpes. Ces piles peuvent être espacés de 1 min à recueillir un seul cycle cellulaire NB, ou 2-3 min à collecter ~ 3 cycles cellulaires. En outre, l'optimisation des paramètres pour chaque génotype est essentiel pour l'imagerie en temps réel succès. Pendant la période d'optimisation, un bon point de départ pour 488 nm Puissance du laser est de 25-50 mW émanant d'un 100X, 1,4 NA &# 160; objectif à immersion d'huile. Enfin, il faut déterminer dans quel état d'imagerie sera correctement répondu à la question à portée de main, que ce n'est pas toujours le cas que l'imagerie la plus sophistiquée est nécessaire.
Pour les expériences avec le tissu vivant ou fixe, le cerveau peuvent être montés de manière à NB lignées spécifiques de l'image. Par exemple, pour l'image de type II, qui résident NBs stéréotypie dans la région postérieure-médiane du lobe optique 7, que l'on peut monter le cerveau, comme cela est illustré sur la figure 3E. Parce que la répartition spatiale et temporelle des organismes notifiés centrales du cerveau ont été bien documentés 1, on peut utiliser notre protocole à l'image d'une variété de groupes NB spécifiques tout en utilisant un certain nombre de constructions transgéniques largement disponibles qui sont exprimés sous ubiquitaire ou, idéalement, des promoteurs endogènes (Tableau 1). Pourtant, les technologies d'étiquetage spécifique de la lignée 20 restent utiles pour un certain nombre d'applications.Avec l'analyse fixe, cerveaux avec des dommages mineurs sont généralement acceptables. En outre, l'élimination complète des tissus périphériques peut être reportée jusqu'à ce que juste avant de l'intégrer dans le cerveau milieu de montage. Des études avec des tissus fixés sont particulièrement utiles lorsque de nombreux organismes notifiés doivent être imagés.
En conclusion, les études du Nouveau-Brunswick ACD ont grandement bénéficié de l'utilisation des deux imagerie des cellules vivantes et l'analyse détaillée fixe. Le protocole décrit ici les détails d'une approche pour préparer larves de drosophile pour les applications en direct ou fixes. Nous prévoyons la poursuite des enquêtes NB ACD par des études d'imagerie détaillées révélera roman et résultats passionnants qui feront progresser notre compréhension des cellules souches dans le développement et la maladie. L'application de l'imagerie en direct à long terme des cerveaux larves intactes a le potentiel de découvrir de nouvelles idées dans la séquence temporelle de différenciation et la morphogenèse des événements qui régissent le développement (et dégénérescencetion) du système nerveux central.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la division de la recherche intra-muros au National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) et un Lenfant biomédicale postdoctorale attribués à DAL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | A high viscosity inert oil that is clear and colorless. |
| Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissecting needle/probe with plastic handle | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Syringe filter, 0.22 μm pore size | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Syringe, 5 ml | BD Biosciences | 309646 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Paraformaldehyde, 32% EM-grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | A dye that labels DNA and is excited by UV light. |
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