Summary
Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.
Abstract
As células-tronco se dividem de forma assimétrica para gerar duas células de progênie com desigual potencial destino: uma célula-tronco auto-renovação e diferenciação de uma célula. Dada a sua relevância para o desenvolvimento e da doença, compreender os mecanismos que regem a divisão de células-tronco assimétrico tem sido uma área forte de estudo. Porque eles são geneticamente tratável e submetidos a ciclos sucessivos de divisão celular uma vez a cada hora, as células estaminais do sistema nervoso central, de Drosophila, ou neuroblastos, são modelos indispensáveis para o estudo da divisão de células estaminais. Cerca de 100 células estaminais neurais estão localizadas próximo da superfície de cada um dos dois lobos cerebrais larvais, tornando este sistema modelo particularmente útil para estudos de microscopia de imagens em tempo real. Neste trabalho, nós revisamos várias abordagens amplamente utilizado para visualizar as divisões de células-tronco, e abordar as vantagens e desvantagens relativas as técnicas que empregam dissociados contra tecidos cerebrais intactas. Nós também detalhar nossa simplifprotocolo IED usado explantar cérebros inteiros a partir de larvas de terceiro estádio de imagens de células vivas e aplicações de análise fixos.
Introduction
As células-tronco manter um equilíbrio de diferenciação e auto-renovação para gerar diversidade celular durante o desenvolvimento precoce e substituir as células danificadas em tecidos adultos. A regulação deste homeostase impede tanto a perda como sobre-expansão da população de células estaminais, o que pode resultar em degeneração de tecido nocivo ou tumorigénese.
Os neuroblastos (RN), são as células estaminais neurais amplamente estudadas do sistema nervoso central de Drosophila (Figura 1A), que durante a primeira forma estágios embrionários 1, 2. RN submetidos a repetidos ciclos de divisão celular assimétrica (ACD) para produzir duas células desigualmente predestinadas: uma célula-tronco auto-renovação e diferenciação celulares. ACD é guiado por centrossomas, as organelas não-membranosas que atuam como centros de microtúbulos-organização da maioria das células 3. Durante a mitose, centrossomas NB organizar e orientar o fuso mitótico bipolar ao longo do apical-basal polareixo dade. Após a clivagem da NB dividindo, determinantes destino apicais que especificam o destino de células-tronco, e determinantes destino basais que especificam diferenciação, são segregados em células filhas desiguais.
No cérebro central larvar, dois tipos de RNs podem ser distinguidas pelo seu número, posição, expressão do factor de transcrição, e da linhagem de células (Figura 1A) 4-6. Tipo I RN são os mais abundantes, e cerca de 90 deles preencher os anteriores e posteriores lados de cada lóbulo óptico do cérebro 7. Estes RN expressar o fator de transcrição Asense (ASE), e eles caracteristicamente se dividem em uma auto-renovação NB e um menor célula-mãe gânglio (GMC; Figura 1B). Cada GMC passa por uma única divisão terminal para gerar dois neurônios ou células gliais (Figura 1B). Em contraste, os RN oito do tipo II que povoam o lado posterior de cada lobo óptico falta Ase expressão 5. Eles sofrem ACDpara produzir um NB auto-renovação e um progenitor neural intermediária (INP).
O INP, por sua vez, divide assimetricamente três a cinco vezes. Cada uma dessas divisões conduz à regeneração do INP e a produção de um único GMC 4. Colectivamente, a identidade específica NB e a ordem temporal de GMC nascimento dá origem à diversidade surpreendente neuronal do sistema nervoso central adulto.
Compreender a biologia das células que subjaz NB ACD foi vastamente melhorada através do uso de técnicas de imagem de células vivas. Publicado protocolos utilizados pelos pesquisadores para a imagem RN ao vivo variam muito. Em geral, no entanto, estes métodos podem ser agrupados em duas categorias gerais que se distinguem pelo facto do cérebro larval é deixada intacta ou mecanicamente dissociadas. Ambas as técnicas apresentam vantagens e desvantagens distintas, dependendo da aplicação do pesquisador.
Os primeiros relatos revelam divi célula NB ao vivoes envolvem um certo grau de dissociação Manual do cérebro larval. Estes protocolos detalhes manchas 8 ou 9 provocando além do cérebro, a fim de crescer culturas primárias de curto prazo do RN em lamínulas. Para melhorar a imagem, os RN redondas são geralmente achatado nas lamelas em que suas lâminas de vidro 8 ou almofadas de agarose 9. Embora as células achatadas têm melhorado óptica, estas técnicas conduzem frequentemente a defeitos mitóticas RN, incluindo a regressão do sulco de clivagem e a incapacidade para se dividem mais do que uma vez. Por conseguinte, os protocolos que envolvem a dissociação manual e distorção física do tecido cerebral de larvas são geralmente apenas adequados para a muito curto prazo (isto é., Um ciclo de célula ou menos) aplicações. Da mesma forma, semi-esmagamento ou achatamento completamente cérebros intactos entre lâminas de vidro e lamelas limita o tempo pode-se passar a imagem de um dado espécime para um período de 10 minutos, aproximadamente, 30. Apesar desta limitação, this abordagem tem sido utilizada com sucesso 11-14.
Esforços recentes para a imagem ao vivo dissociada limite RN distorção física das células isoladas. Estas técnicas são particularmente úteis para aplicações em que é necessária para sustentar a culturas de células de múltiplos ciclos de divisão celular. Por exemplo, as células dispersas do cérebro dissociados manualmente pode ser parcialmente incorporado num coágulo feita a partir da mistura de fibrinogénio e trombina 15 para geração de imagens de longo prazo 16. Alternativamente, os cérebros explantados pode ser primeiro quimicamente dissociados com a enzima colagenase, próximo interrompido manualmente, por passagem repetida através de uma ponta de pipeta, e subsequentemente semeadas em poli-L-lisina-revestidas de vidro pratos de fundo 17, 18. Revestimento pratos de vidro com ou fibrinogênio ou poli-L-lisina promove o anexo e leve disseminação de células redondas, trazendo-o mais próximo da lamela quanto possível, sem grande distorção física. Em comum, alémem, estes métodos envolvem a cultura da RN em meio que pode ser facilmente trocado por experimentos de perturbação farmacológicas 18. No geral, chapeamento diretamente dispersa RN melhora óptica de imagem sem sacrificar a capacidade de imagem de longo prazo. Recentemente, um protocolo descrevendo a cultura de longo prazo de dissociada RN foi detalhado 19.
No entanto, esta abordagem não é sem as suas limitações. Existem várias ressalvas à imagem RN ao vivo dissociados. Num campo de células dispersas, por exemplo, é difícil identificar linhagens NB específicos que são espacialmente organizadas no cérebro intacto 1. Da mesma forma, distinguir o tipo I versus Tipo II RN no tecido dissociado é também um desafio, sem a expressão de marcadores de linhagem ou transgenes específicos do subtipo, como worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Embora esses transgenes são bastante úteis para algumas aplicações, eles não limitam aos investigadores transgenes expressionado sob o controlo do elemento intensificador UAS 21 e exigem sistemas genéticos mais complexos. Estudos que dizem respeito ao desenvolvimento espacial ou temporal de RN, portanto, exigem in vivo de imagens no contexto de um tecido intacto.
Além disso, estudos de RN embrionárias dissociadas indicam que o contacto físico das células adjacentes é crítica para a localização da interfase de polaridade chave determinantes 22, 23. Esses estudos mostram completamente isolado RN não mais manter o eixo do fuso mitótico invariante. Em vez disso, estas células apresentam um eixo de fuso mais aleatórios e largos ângulos de separação entre as sucessivas gomos GMC, talvez devido à perda de apicais posicionamento centrossoma 22. Embora a relação entre os RN de larvas e suas células vizinhas não tem sido extensivamente estudada, vale a pena considerar que o microambiente de células-tronco larval pode invadir a polaridade celular ou outrocomportamentos. Para manter o contexto fisiológico de larvas RN, que imagem a partir de cérebros inteiros de ACD.
Dadas as limitações inerentes a imagem dissociada RN, o nosso laboratório e outras estabeleceram protocolos de imagem sucessivas rondas de NB ACD de cérebros larvas inteiras. Técnicas para a imagem cérebros intactos, muitas vezes substituir a superfície rígida de vidro de um lado da câmara de cultura com uma membrana flexível, para evitar a distorção do tecido ou danos e para permitir a troca de gás. Alguns métodos envolvem a montagem cérebros explantados em uma mistura de meio de insecto de cultura, soro, e ácido ascórbico com os corpos gordos isolados a partir de dez larvas 24. Os corpos gordos isolados são adicionados porque eles secretam um mitógeno conhecido por estimular a divisão celular NB 25. Este protocolo preserva a integridade do tecido por mais de 3 horas e é, por isso, passíveis de imagens de longo prazo 24, 26-28. Recentemente, um protocolo descrevendo o lonimagiologia g prazo de cérebros larvais intactas na presença de ácido ascórbico, o soro, e corpos gordos foi detalhado 29. Importante, porque o tecido é exposto nem nem imobilizados, esta abordagem é menos útil para aplicações onde o meio de cultura é trocado (por exemplo, estudos de drogas, imunodepleção, etc.).
Nosso laboratório simplificou toda a preparação monte de cérebros de larvas vivas para imagens de longo prazo 30, 31. A principal vantagem para o nosso protocolo sobre os outros é a sua simplicidade: as nossas observações indicam nem soro, ácido ascórbico, a insulina, nem corpos gordos são aditivos necessários à Imagem sucessivas rondas de NB ACD. Apesar de aditivos, tais como insulina, têm sido úteis para a imagem prolongado de divisões de células-tronco 32 e migração celular colectivo em Drosophila ovários 33, eles parecem ser dispensável para NB ACD, como nosso meio de imagem consiste de uma mistura simples de standard meio de cultura de células de inseto suplementado com antibiótico-antimicótico para evitar a contaminação. Através do uso de placas de cultura de fundo gás-permeáveis ou de vidro reutilizáveis, temos sido capazes de sustentar várias rodadas de sucessivas NB DACs. As mesmas amostras de explante pode ser prontamente utilizado para imunofluorescência e outros procedimentos com tecido fixado. Neste protocolo, detalhamos a dissecação de cérebros de larvas intactas, bem como a preparação de cérebros para a análise tanto ao vivo e fixo.
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Protocol
1. Preparação de materiais necessários para Explante Brains terceiro instar larval
- Preparar as ferramentas necessárias para a microdissecção.
- Forjar duas ferramentas de dissecação (um bisturi e um gancho), colocando primeiro um único pino de dissecação em cada titular pino. Prenda os pinos firmemente com a mão ou com um alicate (Figura 1C).
- Use um par de pinças de idade para dobrar um pino de dissecação de um ângulo de aproximadamente 120 °. Faça isso sob um microscópio de dissecação para garantir que a metade superior do pino fica plana quando o titular do pino é segurado na mão. Esta ferramenta deverá ser utilizada como um bisturi para soltar ou cortar através do tecido.
- Utilizar um par de pinças de idade para dobrar o segundo pino para um gancho que vai ser utilizado para segurar e raspar o tecido.
- Cobrir cada uma das ferramentas de dissecação com uma ponta de pipeta para proteger as ferramentas de danos. Com cuidado, ferramentas bem formadas podem ser usados para dissecção indefinidamente. Substitua pinos danificados ou deformados, se necessário.
- Prepare dissecando médio.
- Em uma capa de cultura de tecidos, diluir o suplemento de antibiótico-antimicótico em meios de cultura da Schneider. Agitar os meios de incorporar o suplemento.
- Prepare várias alíquotas de 5 ml de meio suplementado. Guarde todos os meios a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
- Aquecer-se uma alíquota de 5 ml de meio de cultura suplementado para a temperatura ambiente. Desenhe o meio em um estéril seringa de 5 ml e parafuso em um filtro estéril seringa 0,2 m.
- Selecione larvas para dissecção. Use uma sonda dissecando para selecionar o rastreamento de larvas de terceiro estádio como o cérebro vai ser mais fácil de dissecar. Opcional: larvas de depósito em uma placa de ágar de uva.
Nota: Não use frascos excessivamente cheia ou as garrafas com "comida molhada", uma vez que estes tendem a forçar segundo ou primeiro larvas se arrastar para fora prematuramente.
Nota: Algumas origens genéticas exigirá usando larvas mais jovens. Isso não afeta o protocolo, mas faz a dissection mais difícil.
2. Dissecção do Sistema Nervoso Central
- Em uma única lâmina de vidro, criar duas piscinas de 50 ml de meio de dissecação quentes, separadas por cerca de 3 cm. Uma piscina será utilizada para dissecção e outros utilizados para dissecção fina (Figura 1C).
- Transferir várias larvas de uma das gotas de comunicação.
- Mova a lamela com larvas de um microscópio de dissecação. Zoom na piscina contendo as larvas de tal modo que as extremidades anterior e posterior das larvas são discerníveis.
- Use um pares de fórceps para apreender o meio-região de uma única larva. Tome um segundo par de pinças na outra mão e agarrar a larva perto da mesma região. Puxe os dois pares de fórceps para além de rasgar delicadamente a larva ao meio. Repita os dois passos acima para todas as larvas na lamela.
- Descarte as metades posterior do corpo larval, transferindo-os para um tecido.
- Zoom em uma larva de modo que poe mouthhooks anteriores são claramente visíveis. Usar dois pares de forceps para criar uma pequena incisão, ou entalhe, em lados opostos das mouthhooks larvais entre o terceiro torácica e bandas denticle primeiros anterior.
- Segure as mouthhooks com a pinça na mão não-dominante. Use a pinça na outra mão para descascar suavemente a cutícula em uma direção ântero-a-posterior. Continue a remover lentamente cutícula até que o sistema nervoso central está exposta.
- Isolar o sistema nervoso central, a partir do resto da larva por rasgar os tecidos com a pinça. Tenha cuidado para não perturbar o sistema nervoso central.
Passo crítico: Não puxe o sistema nervoso central! Descarte amostras danificadas com um cabo rompido ventral do nervo (Figura 2A) ou lóbulos ópticos distorcidas (Figuras 2B e 2B). - Repita os dois passos acima para todas as larvas na lamela. Transferir o tecido enxertado saudável para osegunda (limpo) piscina de meio na lamela para a fase de dissecação bem.
- Use as ferramentas de pinos de dissecação para limpar os tecidos periféricos (por exemplo, olhos, asas e pernas discos) do cérebro. Deslize o bisturi entre o queria (cérebro) eo tecido indesejado, prendendo o tecido conjuntivo para a lamela. Use o gancho para provocar suavemente o tecido indesejado enquanto pressiona simultaneamente o bisturi para a lamela em movimentos de serra-like.
- Passo crítico: Trabalhe lentamente e deliberadamente para remover todos os discos de cada cérebro. Tenha cuidado para não perturbar a morfologia do cérebro. Um cérebro saudável terá um cordão intacto ventral do nervo e simétrica, lobos ópticos redondos (Figura 2C).
3. Montagem Brains explantado for Imaging ao vivo
- Inverta a placa de cultura de 50 milímetros permeável ao gás com a película transparente virada para cima (Figura 2D). Pressione a seringa para depositar uma pequena queda (cerca de 30 mL) de meio em tele o centro do prato.
- Transferir os cérebros isolados, um de cada vez, para a gota do meio do prato. Use a ferramenta gancho para pegar um cérebro sob os lóbulos ópticos. Em alternativa, utilize uma pinça para agarrar axônios se projetam a partir do cordão nervoso ventral.
- Colete 5-10 cérebros na queda de meio. Submergir os cérebros usando as ferramentas de pinos de dissecação para empurrar cérebros individuais para a parte inferior da gota de meio como muitos deles serão presos no menisco (Figura 2E).
- Orientar os cérebros utilizando as ferramentas de pinos de dissecação para alinhar cérebros dependendo do RN a ser trabalhada (Figura 3A). Para a imagem do RN dorsal, coloque o cordão nervoso ventral virada para baixo (ao longo da membrana). Para os RN imagem Antério-ventral, coloque o cérebro com o cordão nervoso ventral voltada para cima (longe de membrana). Alinhar o cérebro de modo a que todos os cordões nervosos ventrais apontam na mesma direcção no plano xy.
- Use uma seringa ou de transferência de plástico pipette colocar 4 halocarboneto (HC) gotas de óleo (cerca de 30 mL cada) para a membrana permeável a gás. O volume de cada gota de óleo deve ser equivalente ao outro e para a gota de meio. Espaço as gotas de óleo correspondem aos quatro cantos de uma lamela centrado ao redor da gota de meio de cultura. Uma vez concluída, as cinco gotas (quatro gotas de óleo e uma gota de meio no centro) será semelhante as cinco facetas em estilo ocidental dados (Figura 3B).
- Diminuir a # 1,5 22 milímetros lamela sobre a montagem de tal forma que ela atinge todos os 5 gotas, ao mesmo tempo. A manutenção de uma pressão uniforme através das amostras reduz a probabilidade de que eles serão interrompidos. Espera cerca de 3 minutos, como o petróleo e meio dispersar sob o peso da lamela. A forma de cruz-como dos meios de comunicação formarão (Figuras 3C e 3D).
- Passo crítico: Abaixe a lamela sobre a superfície do cérebro, removendo o excesso de mídia usando um pavio de papel tissue (Figure 3C). Faça isso enquanto assistia a amostra sob o escopo de dissecação. Como a mídia é removido, a lamela vai diminuir. Pare de uma vez a lamela toca os cérebros. Não excesso de pavio, pois isso fará com que a distorção do tecido do cérebro ou explosões.
- Se imagem dorsal RN (Figura 3E), passar para o passo 3.9. Se imagem RN Antério-ventral, a lamela deve ser ligeiramente movido (por gentilmente empurrando-o com uma pinça) na direção das pontas do cordão nervoso ventral. Isso faz com que o cérebro a girar, que traz os lóbulos cerebrais em contato direto com a lamela para facilitar a imagem (Figura 3F).
- Selar a câmara cercando a lamela com pequenas quantidades de óleo de hidrocarbonetos halogenados (Figura 3D). O excesso de exsudação do óleo lamela deve ser minimizado e apagou afastado com um lenço de papel.
4. Imagens ao vivo da Central Neuroblastos cérebro
Nota: Para este trabalho, a fiação de disco Nikon Eclipse Timicroscópio confocal (microscópio invertido) foi usado para imagens em tempo real; detalhes de nossa configuração foi publicado anteriormente 31. Alternativamente, a amostra pode ser visualizada usando um sistema vertical.
- Adicionar uma gota de óleo de imersão para a lamela logo acima dos cérebros montados. Isso ajudará a centrar o objetivo diretamente acima da amostra.
- Passo crítico: Manter os cérebros a uma temperatura constante de 25 ° C, com uma fase de incubadora. Suavemente posicionar a amostra montada na incubadora fase e cobrir a câmara com a sua tampa.
- Localize RN cerebrais centrais usando luz transmitida, concentrando-se sobre as células grandes e redondas que residem nas áreas centrais e mediais dos lobos ópticos, não use epi-fluorescência. Isto torna-se mais fácil com a prática. É muito importante para expor a amostra para a menor quantidade de luz possível. Não perca tempo cérebros de imagem que estão danificados.
- Uma vez no local, tomar posições rápidas usando o confocal adeterminar a localização adequada e profundidade. Limitar a profundidade para o primeiro de 10-15 ^ m. Ajuste conforme o necessário, e ter outra imagem de teste.
- Etapa opcional: Colete um filme teste do cordão nervoso ventral para garantir que não haja desvio xy. Se deriva é detectado, esperar 15-30 min para a amostra para resolver. Se a deriva não resolve em 30 minutos, preparar uma nova amostra. Maior deriva geralmente pode ser rastreada até a adição de excesso de óleo, ou o tamanho desigual de gotas de óleo durante a montagem.
- Para eliminar desvio axial (z-drift) usar um dispositivo com foco automático contínuo que usa um LED infravermelho. Alternativamente, corrigir manualmente o plano focal.
- Uma vez que um NB de interesse é identificado, prossiga com regime de imagem. Tal como acontece com todas imagens de células vivas, a quantidade de luz laser, tempo de exposição, câmera binning, ampliação objetiva, tempo e / ou intervalo z-passo devem todos ser empiricamente otimizado para uma experiência particular para responder à pergunta em questão. O objetivo é minimizar barragem luzidade, enquanto ainda a coleta de dados úteis. Veja a discussão para orientação adicional.
- Imagem de todo o volume do RN através da recolha de 12-14 imagens espaçadas de 1 mícron no eixo z. Ajustar o tempo de resolução para captar os ciclos celulares simples ou múltiplos de um mesmo NB. Como orientação geral, use 10-30 intervalos seg para a imagem latente do ciclo celular única e 1-3 minutos de intervalo para vários ciclos celulares.
- Passo crítico: Confirme se a amostra é saudável, monitorando a duração da mitose. Se mitose leva mais de 15 minutos, passar para outro cérebro. Um cérebro saudável vai mostrar muitos RN dentro do mesmo campo de visão passando por várias rodadas de mitose. Note-se que cada ciclo celular é ligeiramente mais longo do que o anterior, devido a danos provocados pela luz.
- Depois de imagens estiver concluída, desmontar a câmara de incubação, e descartar tudo, mas os pratos de cultivo gás-permeáveis. Lavar superfície prato da cultura com 95% de etanol e limpar bem com um tecido. Repita mais duas vezes.
5. Preparação de cérebros para Imunofluorescência
- Colete 20 ou mais explantes cérebros em um tubo de 1,5 ml contendo aproximadamente 0,2 ml de meio suplementado.
- Remova o meio a partir do tubo e lavar uma vez com cérebros 0,5 ml PBSTx (Tampão fosfato salino, PBS, com 0,3% de Triton X-100). Vamos cérebros assentar no fundo do tubo de entre todas as trocas de líquido. O detergente Triton X-100 é usado para permeabilizar o tecido. A lavagem geralmente leva menos de 30 seg; simplesmente remover o PBSTx uma vez cérebros se instalaram para o fundo do tubo.
- Substitua a solução com 0,5 ml de 9% elétron paraformaldeído grau microscopia diluído em PBSTx. Incubar com nutação durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Descarte de fixador acordo com os regulamentos de resíduos perigosos.
- Lavar as amostras com 0,5 ml PBSTx durante 15 min. Repita o passo de lavagem com PBSTx fresco mais duas vezes.
- Substituir a solução com 0,5 ml de PBT (PBS, 1% Albumina de Soro Bovino (BSA), e 0,1% de Tween-20). Incubar com nutação durante 1 hora à temperatura ambiente. Bloqueia a ligação não específica de anticorpos para o tecido esta etapa.
- Substituir a solução com 0,5 ml de anticorpo primário diluído em PBT suplementado com 4% de soro de cabra normal (NGS). Incube com nutação durante a noite a 4 ° C.
- Descarte ou salvar o anticorpo primário diluído.
- Lavar as amostras com 0,5 ml de PBT durante 15 min. Repita o passo de lavagem com PBT fresco mais duas vezes.
- Substituir a solução com 0,5 ml de modificada PBT (PBS, BSA a 2%, 0,1% de Tween-20 e 4% de NGS). Incubar com nutação durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Substituir a solução com 0,5 ml de anticorpo secundário diluído em PBT modificado. Incubar com nutação durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Substituir a solução com 0,5 ml de PBST (PBS com 0,1% de Tween-20). Incubar com nutação durante 15 minutos à temperatura ambiente. Repita o passo de lavagem com PBST fresco mais duas vezes.
- Transferir cuidadosamente as amostras, tal como uma gota sobre uma lâmina de vidro, limitando a queda para o lado esquerdo do centro da lâmina.
- Adicionar uma grande gota (cerca de 2 cm de diâmetro) de meio de montagem (por exemplo, Aqua-Poly/Mount) para o centro da lâmina. Evite a piscina de PBST que é para a esquerda.
- Use uma pinça para transferir os cérebros a partir da piscina de PBST para o tanque de meio de montagem. A adição de meio de montagem directamente na parte superior do cérebro pode perturbar a sua orientação e deve ser evitada.
- Sob um microscópio de luz, providenciar as amostras no meio de montagem com o lado que vai ser trabalhada voltada para cima.
- Com a lâmina sob o microscópio de luz, abaixe lentamente uma lamela de vidro # 1.5 no topo das amostras. Etapa opcional: Desalojar bolhas de ar menores levemente empurrando a lamela.
- Permitir que o meio de montagem para polimerizar por várias horas, ou durante a noite, por mentir lâminas planas, de luzprotegida, à temperatura ambiente.
- As lâminas podem ser visualizados no dia seguinte, ou armazenados para imagem.
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Representative Results
Imagens ao vivo elucidou uma série de mecanismos que regulam NB ACD. Antes da aquisição da imagem, é necessário determinar as condições de imagem ideal. É necessário equilibrar a taxa de captura de quadro com a duração de imagens de células vivas. Para a análise celular fina, por exemplo, o aumento temporal e resolução óptica pode ser necessária. Ao visualizar um único ciclo celular NB (Figura 4A), a taxa na qual as imagens são captadas pode ser aumentada, sem a introdução de fotoenvelhecimento. Normalmente, os eventos únicos de divisão celular podem ser monitorados em intervalos de tempo de aproximadamente 10-30 seg. Uma forma de aumentar a resolução temporal, sem danificar o tecido é o de modular a velocidade de aquisição de imagem. Por exemplo, imagens de lapso de tempo pode ser iniciado com uma taxa de quadros mais baixa, o qual é acrescido na observação de uma característica interessante ou ponto de tempo (Filme 1).
Geração de imagens rodadas sucessivas de divisão celular (
Para a análise de grandes números de amostras, muitas vezes é necessário analisar RN fixos. Nosso protocolo fixação preserva a morfologia global da RN e é compatível com os ensaios de imunofluorescência (Figuras 4C-4E). Whole brai montagem fixans pode ser trabalhada em baixa ampliação (Figura 4C) para visualizar o tamanho total do cérebro e forma ou para detectar RN. Para visualizar RN ou seus GMCs progênie em mais detalhes, maior ampliação deve ser usado. Na ampliação moderada (Figura 4D), os clusters NB linhagem inteiras podem ser observados. Para a análise celular detalhada, maior ampliação é usado (Figura 4E).
Figura 1. Explante cérebros inteiros para imagens de células vivas de NB ACD. A) O sistema nervoso central larval consiste de dois lobos ópticos e um cordão nervoso ventral. Dois subtipos de RN preencher o lóbulo óptico em posições estereotipadas:. Tipo I (azul escuro) e Tipo II (azul claro) B) RN submetidos a ACD. Com cada divisão celular, oNB cliva para dar origem a uma GMC (ou INP, não mostrado) e se regenera a célula estaminal NB. As GMC vai dividir a dar origem a duas ou neurónios (células gliais, não mostrado). C) Duas ferramentas microdissection são montados através da inserção dos pinos de dissecação em suportes de pino. Dobrar os pinos de cria ferramentas exclusivas, um bisturi e um gancho, que são usados para cortar, perfurar e deslocar o tecido indesejado, sem danificar o cérebro subjacente. D) Os cérebros são explantado em um de dois conjuntos de meios de dissecação (círculos azuis). Um conjunto de suporte é utilizado para remover o sistema nervoso central, a partir das larvas (dissecção bruto), e o outro grupo é usado para microdissecção fina de tecidos periféricos dos cérebros explantadas (dissecção fina).
Figura 2. Preservção da morfologia do cérebro durante a microdissecção. dissecção cérebro Hasty pode induzir dano tecidual grave, que inclui (a) cordões nervosos ventrais rasgadas ou (B) distorcidas lobos ópticos. Ainda mais sutil dano tecidual (B ') deve ser evitado para imagens de células vivas. (C) Um exemplo de uma amostra de tecido saudável adequado para imagens em tempo real. D) Uma membrana opticamente clara, permeável ao gás. E) Um conjunto de vários cérebros saudáveis dispostos em cultura de meio em um prato de gás-permeáveis. Esses cérebros estão prontos para serem montados para microscopia. Barra de escala: (AC), 100 mm; (D), 25 mm; (E) de 1 mm.
Figura 3. Montagem cérebros para imagens de células vivas. A) Cérebros são alinhados em filas dentro de uma gota de meio de cultura depositado no centro do prato. B) A queda de meio é rodeado por gotas de óleo de HC de cerca de igual volume. Os quatro gotas de óleo de HC e da queda central do meio lembram as cinco facetas de jogar dados. Depois de uma lamela é baixada sobre as gotas de óleo, (C) um pavio é formado de tecido Kimwipe e utilizado para absorver o excesso de líquido. D) A borda exterior da lamela está rodeado por uma fina camada de óleo para impedir a evaporação do meio de cultura. Esses cérebros estão agora prontos para microscopia. E e F) A orientação da relação cérebro para a lamela determina que neuroblastos são acessíveis para imagens de células vivas. E) neuroblastos dorsais são gravadas, organizando os cérebros com o lado ventral tocar a membrana permeável a gás . F) neuroblastos ântero-ventral pode ser trabalhada por arranging os cérebros com o lado dorsal tocar a membrana permeável ao gás e, em seguida, empurrando a lamela, e o tecido subjacente, no sentido das pontas do cabo de nervo ventral. Este movimento ligeiramente inclina os lóbulos ópticos modo que a superfície contatos Antério-dorsal a lamela, trazendo o eixo de imagem desejados em perfeito alinhamento (linha verde).
Figura 4. Resultados representativos de imagens ao vivo de dividir neuroblastos. A e B) de imagem ao vivo de NB-tronco divisões celulares em preparações integrais de montagem usando um 40X, 1,3 NA objetiva de imersão em óleo. Tempo é apresentado como min: seg em relação ao início do time-lapse A) Stills do lapso de tempo de imagem de um ciclo de uma única célula de um NB expressando GFP-moesin.(GFP-MOE). A taxa de aquisição de imagem de um ciclo de célula única pode ser aumentada para melhorar a resolução temporal sem induzir photodamage. B) Stills do lapso de tempo de imagem de sucessivos ciclos de divisão celular de um NB expressar tanto GFP-Moe e um marcador centrosome marcado com GFP. O período prolongado associado a vários ciclos celulares exige reduzida resolução temporal para evitar photodamage. Note-se que o período de tempo entre cada divisão celular aumenta durante o curso de geração de imagens. CE) projeções confocal de células-tronco fixo de preparações integrais de montagem. C)) a imagem todos os RN localizados em ambos os lóbulos ópticos, ampliação 20X é usado. Esta análise é particularmente útil para analisar a morfologia do cérebro em geral e para quantificar o número NB (azul claro), etc. D) A maioria dos RN (rosa) a partir de um único lóbulo óptico pode ser visualizado com 40X de ampliação. Os microtúbulos, (verde). E)
Filme 1. Imagens ao vivo de um único ciclo celular NB. Imagens de lapso de tempo de uma única divisão celular NB de um cérebro expressando GFP-Moe para rotular o córtex celular. As imagens foram adquiridas a partir de um único plano óptico em 40X de ampliação. Neste filme, os quadros foram capturados a cada 15 seg. Depois de cerca de 7 min de aquisição, a taxa foi aumentada para um quadro a cada 5 segundos. Clique aqui para ver filme.
Filme 2. Imagens ao vivo sucessivas rondas of NB ACD. imagens de lapso de tempo de um NB submetidos a três ciclos de divisão celular em um cérebro expressando GFP-Moe e um marcador centrosome marcado com GFP. As imagens foram adquiridas em intervalos de 2 min de tempo em 60X de ampliação. Clique aqui para ver filme.
| Linha | Estrutura celular rotulada | Fluoróforo | Expressão / Promotor | Citação |
| YFP-Asterless | Centríolo | YFP | Ubiquitin | Rebollo, et al. (2007) Dev. Célula 12:. 467. |
| SAS6-mCherry | Centríolo | mCherry | Endógeno | Rusan e Peifer (2007) J. Cell Biol. 177 |
| GFP-SAS6 | Centríolo | GFP | Endógeno (BAC) | Lerit e Rusan (2013) J. Cell Biol 202: 1013.. |
| GFP-PACT | Centríolo | GFP | Ubiquitin | Martinez-Campos et al. J. Cell Biol 165:. 673. |
| GFP-SAS4 | Centrossoma | GFP | Ubiquitin | Dix e Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1.759. |
| GFP-Polo | Centrossoma | GFP | Endógeno | . Moutinho-Santos, et al (1999) Cell Biol 91:. 585. |
| GFP-γ-tubulina 23C | Centrossoma | GFP | Ubiquitin | Lerit e Rusan (2013) J. Cell Biol 202: 1013.. |
| GFP-Centrosomin | Centrossoma | GFP | UAS | Megraw, et al. (2002) J. Celular Sci 115: 4707.. |
| GFP-Spd-2 | Centrossoma | GFP | Ubiquitin | Dix e Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1.759. |
| mCherry α-tubulina | Os microtúbulos | mCherry | Ubiquitin | Rusan e Peifer (2007) J. Cell Biol 177: 13.. |
| GFP-α-tubulina | Os microtúbulos | GFP | Ubiquitin | . Rebollo, et al (2004) PLoS Biol 2:. E8. |
| Júpiter-GFP ("G147") | Os microtúbulos | GFP | Endógeno | Morin, et al (2001) PNAS 98:.. 15050. |
| mCherry-Júpiter | Microtubules | mCherry | UAS | Cabernard e Silva (2009) Dev. Célula 17: 134. |
| H2AvD-MRFP | DNA | MRFP | Endógeno | Pandey et al. (2005) J. Celular Sci 118: 733.. |
| H2AvD-GFP | DNA | GFP | Endógeno | Clarkson e São (1999) Cell Biol DNA 18: 457.. |
| Moesina-GFP | Actina cortical | GFP | Abóbora Spaghetti | Kiehart, et al. (2000) J. Cell Biol 149:. 471. |
Tabela 1. Uma selecção de linhas transgénicas úteis para o estudo de ACD. Estas construções de fusão são particularmente úteis para o estudo da divisão celular. Eles são rotineiramente utilizados em NB estudos de imagem ao vivo.
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Discussion
Imagens de células vivas é uma abordagem valiosa usada para estudar os mecanismos que regulam a ACD de células-tronco, a diferenciação de linhagens celulares, ea morfogênese de tecidos complexos. Embora os grupos de pesquisa têm historicamente utilizada uma variedade de técnicas para visualizar NB ACD, estas abordagens podem ser geralmente agrupadas em duas categorias que diferem principalmente no que diz respeito ao facto de o tecido cerebral é deixada intacta ou dissociada.
Imagem dissociada RN tem suas vantagens. Por um lado, dissociada RNs são mais fáceis de imagem, porque eles são especialmente fáceis de identificar como os maiores (cerca de 12 m de diâmetro), as células em um prato de cultura. Além disso, quase todas as células estaminais que são cultivadas sobre uma superfície de vidro vai ser igualmente perto da objectiva do microscópio durante todo o período de aquisição de imagem. A qualidade óptica das imagens de lapso de tempo é ainda melhorada com a utilização de um ou outro poli-L-lisina ou de vidro revestido de fibrinogénio para induzir o SEMi-achatamento da rodada RN 16, 17. Outra vantagem para imagiologia RN dissociadas cresceram em cultura é a facilidade com que o meio cultura pode ser trocado. Uma vez que as células adiram à superfície de vidro revestido, a cultura de meio contendo qualquer número de agonistas farmacológicos, antagonistas ou anticorpos immunoblocking, etc. pode ser adicionado ou removido. Finalmente, as abordagens recentes para visualizar RN dissociadas demonstraram que esta técnica é, de fato, passível de aquisição de imagem prolongada 18, 19.
No entanto, as desvantagens de imagem dissociada RN incluem a complexidade do protocolo. A maioria dos métodos de detalhe longa (30-60 min) de digestão química, seguido por um passo de incubação longos (60 min) para permitir que as células dispersas assentar e aderir ao prato de cultura 17, 19.
Em contraste, RN imagem de um cérebro intacto preserva tanto ocontexto fisiológico e morfologia do tecido. As vantagens dessa abordagem incluem a capacidade de identificar linhagens NB específicos que se desenvolvem em arranjos estereotipadas ou em momentos de desenvolvimento definidos 1. Portanto, o nosso protocolo simplificado tem utilidade, que se estende para além de estudos de ACD, como também permite a investigação ao vivo de eventos de diferenciação e morfogênese. Uma desvantagem deste método, no entanto, é a incapacidade de se trocar a cultura média. Portanto, os pesquisadores interessados em imagem a longo prazo de sucessivas divisões de células-tronco deve-se considerar a abordagem (cultura primária dissociada contra toda montagem) que melhor se adapte a sua aplicação. Da mesma forma, a necessidade de aditivos de cultura, tais como a insulina ou soro, deve ser determinada empiricamente com base nas condições de imagem (duração das imagens, a quantidade de luz que atinge a amostra, etc.) E configuração experimental.
Em geral, recomendamos a utilização de dissociarRN d para estudos em que é necessário para avaliar a resposta aguda do RN com a introdução de pequenas moléculas (por exemplo, inibidores, etc.), para aplicações de alto rendimento quando microdissection multa de cérebros pode ser muito complicado, e para estudos avançados de imagem que exigem que o NB de estar em contato físico com a lamela. Em contraste, recomendamos a utilização de cérebros intactos para aplicações onde é útil para a imagem de alguns RN a partir do mesmo cérebro, e, especialmente, para os estudos que as interações célula-célula preocupação, a autonomia, a análise clonal, alterações na forma celular, e outras investigações em que o nativo ambiente das células é importante.
Para garantir o êxito da preparação de cérebros intactos para imagens ao vivo, várias etapas críticas devem ser cuidadosamente executados. Acima de tudo, é imprescindível para evitar a exposição do tecido ao trauma desnecessário. Especificamente, o explante do cérebro e a remoção do tecido periférico deverão ser realizados com cuidado. Umdeve minimizar o contato direto entre as ferramentas de dissecação e do cérebro. Além disso, deve-se evitar puxar ou empurrar sobre o tecido ligado ao cérebro. Um manuseamento incorrecto do tecido pode facilmente resultar em cérebros rasgadas ou distorcidas. Em nossas mãos, RN de cérebros danificados raramente se dividem. Os indivíduos que são novos para dissecção cérebro larval geralmente se beneficiam de dominar a dissecção antes de tentar preparar amostras para imagens ao vivo.
Outro passo crítico no protocolo é a montagem dos cérebros antes de viver imagens de células. Os volumes corretos de ambos meio de cultura e óleo de HC são essenciais para completar uma preparação útil. Embora seja difícil medir com precisão o óleo HC viscoso com uma pipeta, pode-se aproximar o volume correto (cerca de 30 mL) por olho. Muito líquido impede a lamela de se estabelecer no lugar. Muitas vezes, isto resulta no cérebro que se deslocam sobre a superfície do prato de cultura. Durante a gravação ao vivo, uma lamela inquieto é evident quando os desvios de tecido ou o rolo de lobos óptica. As amostras que não se encontram posicionados no local deve ser evitada. Pelo contrário, a adição de meio de cultura muito pouco ou resultados de petróleo HC em danos nos tecidos catastrófica, incluindo os lóbulos explosão óptica. Há um equilíbrio cuidadoso entre o uso de meio líquido suficiente e óleo para lidar com o peso da lamela versus usando muito líquido, o que faz com que a lamela a deslizar. Este equilíbrio é melhor aprendida através da prática. Em geral, o melhor é apenas aqueles cérebros imagem que têm uma morfologia saudável, tal como um cordão nervoso ventral intacta e, lobos ópticos redondos simétricos.
Uma vez que a amostra é montada sem deriva detectável, mantendo a amostra viva se torna o próximo aspecto crítico do presente protocolo. Este é melhor conseguido mantendo a temperatura adequada e, mais importante ainda, minimizando a quantidade de luz que atinge a amostra. A configuração do microscópio ea amostra são as duas variáveis que governam o sucesso de live imagens de células. Objetivos de alta qualidade, filtros de transmissão (~ 98%) e câmeras (elétron back-diluído multiplicando e complementar metal-oxide semiconductor) do lado da emissão permitirá que se reduza a quantidade de luz que atinge a amostra do lado da excitação. É bem sabido que a luz azul (utilizados para a imagem GFP) é altamente tóxico para as células. É preciso determinar a quantidade total de luz (tempo total de exposição) uma determinada amostra pode tolerar e depois se espalhou que o tempo total ao longo do período de duração do experimento. Por exemplo, se uma amostra só pode tolerar 500 exposições de luz laser com base em uma configuração de microscópio especial, em seguida, pode-se coletar 50 pilhas x 10-slice. Essas pilhas podem ser espaçadas por 1 min para coletar um único ciclo celular NB, ou 2-3 min para coletar ~ 3 ciclos celulares. Além disso, otimizar as configurações para cada genótipo é fundamental para imagens ao vivo de sucesso. Durante o período de otimização, um bom ponto de partida para 488 nm potência do laser é de 25-50 μW que emana de um 100X, 1,4 NA &# 160; objetiva de imersão em óleo. Finalmente, deve-se determinar o que condição de imagem vai responder adequadamente a questão em apreço, já que não é sempre o caso que é necessário a imagem mais sofisticada.
Para as experiências com tecido vivo ou fixado, o cérebro pode ser montado de modo a NB linhagens específicas de imagem. Por exemplo, a fim de RN Tipo II da imagem, que estereotipado residem na região posterior-medial do lobo óptica 7, pode-se montar o cérebro, tal como ilustrado na figura 3E. Porque o padrão espacial e temporal da RN cerebrais centrais têm sido bem documentadas 1, pode-se usar o nosso protocolo para a imagem de uma variedade de grupos específicos NB ao utilizar qualquer número de construções transgênicas amplamente disponíveis, que são expressas sob onipresente, ou, idealmente, promotores endógenos (Tabela 1). No entanto, as tecnologias de linhagem específica de rotulagem 20 permanecem úteis para uma série de aplicações.Com a análise fixa, cérebros com danos menores são geralmente aceitáveis. Além disso, a remoção completa do tecido periférico pode ser adiada até imediatamente antes da incorporação do cérebro em meio de montagem. Estudos com tecido fixado são particularmente úteis quando um grande número de RN deve ser trabalhada.
Em conclusão, os estudos sobre NB ACD beneficiaram com o uso de ambos imagens de células vivas e análise detalhada fixo. O protocolo descrito aqui detalha uma abordagem para preparar larvas Drosophila para aplicações ao vivo ou fixos. Prevemos a investigação continuada de NB ACD através de estudos detalhados de imagem irá revelar novas e resultados interessantes que permitirão uma melhor compreensão das células-tronco no desenvolvimento e na doença. A aplicação de imagens ao vivo de longo prazo do cérebro de larvas intactas tem o potencial para descobrir novos insights sobre a seqüência temporal de diferenciação e morfogênese eventos que regem o desenvolvimento (e degeneraçãoção), do sistema nervoso central.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela divisão de pesquisa intramural no National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) e um Lenfant Biomédica bolsa pós concedidos a DAL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | A high viscosity inert oil that is clear and colorless. |
| Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissecting needle/probe with plastic handle | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Syringe filter, 0.22 μm pore size | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Syringe, 5 ml | BD Biosciences | 309646 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Paraformaldehyde, 32% EM-grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | A dye that labels DNA and is excited by UV light. |
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