Summary
Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.
Abstract
Stamcellen verdelen asymmetrisch twee nakomelingen cellen met ongelijke lot potentieel te genereren: een zelfvernieuwende stamcel en een differentiërende cel. Gezien hun relevantie voor ontwikkeling en ziekte, het begrijpen van de mechanismen die bepalen asymmetrische stamcellen divisie heeft een robuust gebied van studie geweest. Omdat ze genetisch handelbaar ondergaan opeenvolgende ronden van celdeling ongeveer eenmaal per uur, de stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel of neuroblasts, onmisbaar modellen voor de studie van stamcellen celdeling. Ongeveer 100 neurale stamcellen zijn gelegen nabij het oppervlak van elk van de twee lobben larvale hersenen, waardoor dit modelsysteem bijzonder bruikbaar voor levende beeldvorming microscopie studies. In dit werk, bespreken we verschillende benaderingen op grote schaal gebruikt om stamcellen divisies visualiseren, en we pakken de relatieve voor-en nadelen van de technieken die in dienst gedistantieerd versus intacte hersenen weefsels. We hebben ook detail onze simplifIED protocol dat wordt gebruikt om hele hersenen explanteren uit derde instar larven voor live cell imaging en vaste analyse toepassingen.
Introduction
Stamcellen handhaven van een balans tussen differentiatie en zelfvernieuwing om cellulaire diversiteit te genereren tijdens de vroege ontwikkeling en beschadigde cellen in volwassen weefsels. Regulering van deze homeostase voorkomt zowel verlies en over-expansie van de stamcelpopulatie, wat kan leiden tot schadelijke weefsel degeneratie of tumorvorming.
Neuroblasts (NBs) zijn uitgebreid bestudeerd neurale stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel (figuur 1A) die eerste vorm tijdens embryonale stadia 1, 2. NBs ondergaan herhaalde rondes van asymmetrische celdeling (ACD) tot twee ongelijk gedoemd cellen produceren: een zelfvernieuwende stamcel en een differentiërende cel. ACD wordt geleid door centrosomes de niet-membraneuze organellen die fungeren als microtubuli-organiserende centra van de meeste cellen 3. Tijdens de mitose, NB centrosomes organiseren en oriënteren de bipolaire mitotische spoel langs de apicale-basale polaireteit as. Na splitsing van het verdelen van NB, apicale lot determinanten die de stamcellen lot specificeren, en basale lot determinanten die differentiatie opgeeft, worden gescheiden in de ongelijke dochtercellen.
In het larvale centrale hersenen, kan twee soorten AI's worden onderscheiden door hun aantal, plaats, transcriptiefactor expressie en cellijn (Figuur 1A) 4-6. Type I NBs zijn de meest voorkomende, en ongeveer 90 van hen bevolken de voorste en achterste zijden van elk optische kwab van de hersenen 7. Deze AI's drukken de transcriptiefactor Asense (Ase), en ze karakteristiek verdelen in een zelfvernieuwende NB en een kleinere ganglion moeder cel (GMC; Figuur 1B). Elke GMC ondergaat een enkele terminal divisie twee neuronen of glia (Figuur 1B) te genereren. Daarentegen acht Type II NBs dat de achterste zijde van elke optische kwab stijging gebrek Ase expressie 5. Ze ondergaan ACDeen zelfvernieuwende NB en een tussen neurale voorlopercellen (INP) produceren.
De INP beurt asymmetrisch drie tot vijf keer. Elk van deze afdelingen leidt regeneratie van de INP en de productie van een GMC 4. Gezamenlijk specifieke NB identiteit en de temporele volgorde GMC baart tot de verbazingwekkende neuronale diversiteit van de volwassen centrale zenuwstelsel.
Inzicht in de celbiologie dat NB ACD ten grondslag ligt is sterk verbeterd door het gebruik van live-cell imaging technieken. Gepubliceerde protocollen gebruikt door onderzoekers op de foto voor live AI's lopen sterk uiteen. Kortom, maar deze werkwijzen kunnen worden ingedeeld in twee algemene categorieën onderscheiden door of de larvale hersenen intact wordt gelaten of mechanisch gedissocieerd. Beide technieken hebben verschillende voor-en nadelen, afhankelijk van de toepassing van de onderzoeker.
Vroege rapporten een onthullende live NB cel divilingen tot op zekere mate van handmatige dissociatie van de larvale hersenen. Deze protocollen detail vegen 8 of plagen elkaar 9 van de hersenen om op korte termijn primaire culturen van de AI's op dekglaasjes groeien. Om beeldvorming te verbeteren, zijn de ronde NBs meestal afgeplat op de dekglaasjes met ofwel glasplaatjes 8 of agarose pads 9. Hoewel afgeplatte cellen optiek verbeterd, deze technieken leidt vaak tot NB mitotische afwijkingen, waaronder regressie van de splitsing groef en het onvermogen om meer dan een keer te verdelen. Daarom protocollen die zowel handmatig dissociatie en fysieke verstoring van de larvale hersenweefsel te betrekken zijn over het algemeen alleen geschikt voor zeer korte termijn (dat wil zeggen., Een celcyclus of minder) toepassingen. Ook semi-kneuzingen of volledig afvlakking intacte hersenen tussen glas dia's en dekglaasjes beperkt de tijd die men kan besteden beeldvorming van een bepaald monster aan een ongeveer 30 min. periode 10. Ondanks deze beperking, thiDe aanpak is succesvol 11-14 gebruikt.
Recente inspanningen om het leven los NBs limiet fysieke verstoring van de geïsoleerde cellen. Deze technieken zijn bijzonder nuttig voor toepassingen waarbij het nodig is celculturen ondersteunen voor meerdere celdeelcycli. Bijvoorbeeld kan gedispergeerde cellen van handmatig gescheiden hersenen gedeeltelijk ingebed in een stolsel gemaakt van het mengsel van fibrinogeen en thrombine 15 voor langdurige weergave 16. Alternatief kan geëxplanteerde hersenen eerst chemisch gedissocieerd met het enzym collagenase, naast handmatig verstoord door herhaalde passage door een pipetpunt en vervolgens uitgeplaat op poly-L-lysine beklede glazen bodem schotels 17, 18 zijn. Coating glazen schalen met ofwel fibrinogeen of poly-L-lysine bevordert de hechting en geringe verspreiding van ronde cellen, waardoor ze zo dicht mogelijk bij het dekglaasje mogelijk zonder grote fysieke vervorming. In additiop, deze methodes is het kweken van de AI's in medium dat gemakkelijk kunnen worden ingewisseld voor farmacologische verstoring experimenten 18. Over het algemeen, direct plating verspreid NBs verbetert beeldvorming optiek zonder in te boeten op lange termijn imaging-mogelijkheden. Onlangs heeft een protocol waarin de langdurige kweken van gedissocieerde NBs zijn uitgewerkt 19.
Deze benadering is niet zonder beperkingen. Er zijn verschillende kanttekeningen om live los NBs beeldvorming. Op een gebied van gedispergeerde cellen, bijvoorbeeld, is het moeilijk specifieke NB lijnen die ruimtelijk georganiseerd in de intacte hersenen 1 identificeren. Ook onderscheiden de Type I versus type II AI's binnen gedissocieerde weefsel is ook uitdagend, zonder de uitdrukking van lineage tracers of subtype-specifieke transgenen, zoals worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Hoewel deze transgenen zijn zeer nuttig voor sommige toepassingen, ze onderzoekers beperken tot die transgenen afgedrukt onder de controle van de UAS enhancer element 21 en vereisen meer complexe genetische systemen. Studies die betrekking hebben op de ruimtelijke of temporele ontwikkeling AI's vergen dus in vivo in het kader van een intact weefsel.
Daarnaast hebben studies gedissocieerde embryonale NBs blijkt dat het fysieke contact van aangrenzende cellen is cruciaal voor de interfase lokalisatie van belangrijke determinanten polariteit 22, 23. Deze studies tonen volledig geïsoleerd NBs de invariante mitotische spindel-as niet meer te handhaven. In plaats daarvan, deze cellen vertonen een gerandomiseerde spilas en brede hoeken scheiding tussen opeenvolgende GMC knoppen, misschien door het verlies van apicale centrosome positionering 22. Hoewel de relatie tussen de larvale AI's en hun naburige cellen is niet uitgebreid zijn onderzocht, is het gezien het feit dat de larvale stamcel micro-omgeving kan van invloed zijn op cel polariteit of andere waardgedrag. Om de fysiologische context van larvale NBs te behouden, we afbeelding ACD van hele hersenen.
Gezien de inherente beperkingen in verband met beeldvorming gedissocieerde AI's, hebben ons lab en anderen protocollen opgesteld om de afbeelding opeenvolgende ronden van NB ACD uit hele larvale hersenen. Technieken om het intacte hersenen vaak vervangen de starre oppervlaktelaag van het glas aan een zijde van de kweekkamer met een flexibel membraan om weefsel verstoring of schade te voorkomen en zorgen voor gasuitwisseling. Sommige werkwijzen omvatten montage geëxplanteerd hersenen in een mengsel van insecten kweekmedium, serum en ascorbinezuur met het vet organen geïsoleerd uit tien larven 24. De geïsoleerde vet lichamen worden toegevoegd omdat ze scheiden een mitogeen bekend aan NB celdeling 25 stimuleren. Dit protocol blijft de integriteit van het weefsel gedurende 3 uur en is derhalve vatbaar voor langdurige weergave 24, 26-28. Onlangs heeft een protocol waarin de lonG termijn beeldvorming van intacte larvale hersenen in aanwezigheid van ascorbinezuur, serum, en vet lichamen is uitgewerkt 29. Belangrijk, omdat het weefsel niet blootgesteld of geïmmobiliseerd is deze benadering minder geschikt voor toepassingen waarbij kweekmedium wordt uitgewisseld (bijvoorbeeld drugstudies, immunodepletie enz.).
Ons laboratorium heeft de ganse berg voorbereiding van levende larvale hersenen voor de lange termijn imaging 30, 31 vereenvoudigd. Het belangrijkste voordeel van ons protocol over anderen is zijn eenvoud: onze waarnemingen wijzen noch serum, ascorbinezuur, insuline, noch vet lichamen zijn nodig additieven op de foto opeenvolgende ronden van NB ACD. Hoewel toevoegsels, zoals insuline, zijn nuttig voor het aanhoudende beeldvorming van stamcellen celdelingen 32 en collectieve celmigratie in Drosophila eierstokken 33 zijn, lijken ze overbodig voor NB ACD te zijn, als onze beeldmedium bestaat uit een eenvoudig mengsel van standard insect celkweek medium aangevuld met antibiotica-antimycotische om besmetting te voorkomen. Door het gebruik van herbruikbare gas-permeabel of glazen bodem cultuur gerechten, hebben we in staat om een aantal rondes van opeenvolgende NB ACD's ondersteunen geweest. Dezelfde geëxplanteerde monsters kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor immunofluorescentie en andere procedures met vaste weefsel. In dit protocol gedetailleerde weergave van de ontleding van intacte larvale hersenen, evenals de bereiding van hersenen van zowel levende en vaste analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de Benodigde aan derde Instar Larvale Brains Explanteer
- Bereid je gereedschap nodig voor microdissection.
- Smeden twee ontleden gereedschap (een scalpel en een haak) door eerst een dissectie pin in elke pin houder. Beveilig de pennen stevig met de hand of met een tang (figuur 1C).
- Gebruik een paar oude tang om een ontleden pin buigen tot een ongeveer 120 ° hoek. Doe dit onder een dissectie microscoop om ervoor te zorgen dat de bovenste helft van de pen plat wanneer de pen houder wordt gehouden in de hand. Deze tool zal gebruikt worden als een scalpel ingedrukt te houden of snijden door weefsel.
- Gebruik een paar oude tang om de tweede pen te buigen in een hoek, dat zal worden gebruikt om vast te houden en weg te schrapen weefsel.
- Bedek elk ontleden tool met een pipet tip om de instrumenten te beschermen tegen schade. Met zorg, kan goed gevormde gereedschappen gebruikt worden voor dissectie voor onbepaalde tijd. Vervang beschadigde of vervormde pinnen als dat nodig is.
- Bereid ontleden medium.
- In een weefselkweek kap, verdunnen het antibioticum-antimycoticum supplement in de Schneider kweekmedium. Swirl de media om het supplement te nemen.
- Bereid een aantal 5 ml porties van het aangevulde media. Bewaar alle media bij 4 ° C tot klaar voor gebruik.
- Verwarm een 5 ml van medium aangevuld tot kamertemperatuur. Teken het medium in een steriele 5 ml spuit en schroef op een steriele 0,2 um spuitfilter.
- Selecteer larven voor dissectie. Gebruik een ontleden sonde naar larven kruipen derde instar selecteren als het brein makkelijkste zal zijn te ontleden. Optioneel: storting larven op een druif agar plaat.
Opmerking: Gebruik geen overdreven druk flesjes of flessen met "nat voer," omdat deze de neiging om larven eerste of tweede instar dwingen om voortijdig kruipen.
Opmerking: Sommige genetische achtergronden zal het nodig zijn het gebruik van jongere larven. Dit heeft geen invloed op het protocol, maar maakt de dissection moeilijker.
2. Ontrafeling van het centrale zenuwstelsel
- Op een glasplaatje, maakt u twee 50 ml zwembaden van warm ontleden media gescheiden door ongeveer 3 cm. Een zwembad zal worden gebruikt voor grove dissectie en andere gebruikt voor fijne dissectie (figuur 1C).
- Transfer verscheidene larven een van de media druppels.
- Verplaats de dekglaasje met larven tot een dissectie microscoop. Zoom in op het zwembad met de larven zodanig dat de voorste en achterste uiteinden van de larven zijn waarneembaar.
- Gebruik een paar tang om het midden-gebied van een enkele larve begrijpen. Neem een tweede pincet in de andere hand en pak de larve in de buurt van dezelfde regio. Trek de twee paar tang uit elkaar om voorzichtig scheuren de larve in de helft. Herhaal de bovenstaande twee stappen voor alle larven op het dekglaasje.
- Gooi de achterste helften van het larvale lichaam door ze op een tissue.
- Zoom in op een larve zo dat ee anterior mouthhooks zijn duidelijk zichtbaar. Gebruik beide paren tang om een kleine incisie, of inkeping, aan weerszijden van de larvale mouthhooks tussen de derde thoracale en eerste voorste denticle bands maken.
- Pak de mouthhooks met de tang in de niet-dominante hand. Gebruik de tang in de andere hand voorzichtig afpellen cuticula per anterior naar posterior richting. Blijf langzaam afpellen cuticula totdat het centrale zenuwstelsel wordt blootgesteld.
- Isoleer het centrale zenuwstelsel van de rest van de larven door scheuren weefsels met de tang. Wees voorzichtig met het centrale zenuwstelsel niet te verstoren.
Kritische stap: Trek niet op het centrale zenuwstelsel! Gooi beschadigde monsters met een gescheurde buikzenuwkoord (Figuur 2A) of vervormde optische kwabben (figuren 2B en 2B). - Herhaal de bovenstaande twee stappen voor alle larven op het dekglaasje. Breng de gezonde geëxplanteerde weefsel detweede (schoon) zwembad van medium op het dekglaasje voor de fijne dissectie podium.
- Gebruik het ontleden pin gereedschap op te ruimen de perifere weefsels (bijv. oog, vleugel, en been schijven) van de hersenen. Schuif de scalpel tussen de wilde (hersenen) en de ongewenste weefsel, pinning het bindweefsel aan de dekglaasje. Gebruik de haak om voorzichtig te plagen de ongewenste weefsel weg terwijl tegelijkertijd op de scalpel aan de dekglaasje in zaag-achtige bewegingen.
- Kritische stap: werken langzaam en bewust om alle schijven uit elk hersenen te verwijderen. Wees voorzichtig de hersenen morfologie niet te verstoren. Een gezonde hersenen zullen een intacte buikzenuwkoord en symmetrische, ronde optische kwabben (figuur 2C) hebben.
3. Montage Geëxplanteerde Brains voor Live Imaging
- Zwenken 50 mm gasdoorlaatbare cultuur schotel met de transparante folie naar boven (figuur 2D). Druk de spuit een kleine daling (ongeveer 30 pl) van medium op t stortenhij midden van de schaal.
- Breng de geïsoleerde hersenen, een voor een, de daling drager op de schotel. Gebruik de haak hulpmiddel opscheppen een brein onder de optische lobben. Of gebruik een tang om axonen projecteren van de buikzenuwkoord begrijpen.
- Verzamel 5-10 hersenen in de druppel medium. Dompel de hersenen door het ontleden pin tools waarmee individuele hersenen duwen naar de onderkant van de druppel drager veel daarvan wordt opgesloten in de meniscus (figuur 2E).
- Richt de hersenen met behulp van het ontleden pin hulpmiddelen om hersenen te lijnen, afhankelijk van de AI's af te beelden (figuur 3A). Om het imago van de dorsale AI's, plaatst de buikzenuwkoord naar beneden (langs het membraan). Om het beeld Voorwandinfarct-ventrale AI's, plaats de hersenen met de buikzenuwkoord naar boven (weg van membraan). Lijn de hersenen zodanig dat alle de ventrale zenuw snoeren wijzen in dezelfde richting binnen het xy-vlak.
- Gebruik een spuit of plastic overdracht pipette tot 4 halocarbon (HC) oliedruppels (ongeveer 30 pi elk) plaatsen op de gas-permeabel membraan. Het volume van elke druppel olie moet gelijk zijn aan elkaar en de drop drager zijn. Ruimte de druppels olie te corresponderen met de vier hoeken van een dekglaasje gecentreerd rond de druppel kweekmedium. Eenmaal voltooid, zal de vijf druppels (vier druppels olie en een druppel medium in het midden) lijken op de vijf facetten van de West-stijl dobbelstenen (Figuur 3B).
- Laat een # 1,5 22 mm dekglaasje op het samenstel zodanig dat raakt alle 5 druppels tegelijk. Het handhaven van een gelijkmatige druk over de monsters vermindert de kans dat ze zullen worden verstoord. Wacht ongeveer 3 minuten de olie en medium te dispergeren onder het gewicht van het dekglaasje. Een cross-achtige vorm van media zal vormen (figuren 3C en 3D).
- Kritische stap: Laat de dekglaasje op het oppervlak van de hersenen door het verwijderen van overtollige media met behulp van een tissue lont (Figure 3C). Doe dit tijdens het kijken naar het monster onder het ontleden scope. Zoals media wordt verwijderd, zal het dekglaasje verlagen. Stoppen zodra het dekglaasje raakt de hersenen. Niet over-lont als dit weefsel vervorming of hersenen explosies veroorzaken.
- Als beeldvorming dorsale AI's (figuur 3E), ga dan naar stap 3.9. Als beeldvorming Voorwandinfarct-ventrale NBS moet het dekglaasje enigszins verplaatst (door zachtjes duwen met tang) in de richting van de buikzenuwkoord tips. Hierdoor wordt de hersenen te draaien, waardoor de hersenen lobben in direct contact met het dekglaasje brengt beeldvorming (figuur 3F) vergemakkelijken.
- Dicht de kamer door rondom de dekglaasje met kleine hoeveelheden Halocarbonolie (Figuur 3D). Overtollige olie lekt uit het dekglaasje moet worden geminimaliseerd en weg gedept met een tissue.
4. Live-Imaging van Central Brain neuroblasts
Opmerking: Voor dit werk, een Nikon Eclipse Ti spinning-diskconfocale microscoop (omgekeerde microscoop) werd gebruikt voor live beeldvorming; details van onze setup zijn eerder gepubliceerd 31. Als alternatief kan het monster worden afgebeeld met een opstaande systeem.
- Voeg een druppel immersie olie op het dekglaasje geplaatst net boven de hersenen. Dit zal helpen centreren de doelstelling direct boven het monster.
- Kritische stappen: aanvullen hersenen bij een constante temperatuur van 25 ° C met een verdieping incubator. Zachtjes plaats de gemonteerde monster in het stadium incubator en bedek de kamer met het deksel.
- Zoek centrale hersenen AI's met doorvallend licht door te focussen op de grote, ronde cellen die in de centrale en mediale gebieden van de optische lobben verblijven; heb epi-fluorescentie niet gebruiken. Dit wordt gemakkelijker met de praktijk. Het is zeer belangrijk om het monster bloot te stellen aan het minste licht mogelijk. Verspil geen tijd imaging hersenen die beschadigd zijn.
- Eenmaal op zijn plaats, neem snel vorderingen met behulp van de confocale aanbepalen juiste locatie en diepte. Beperk diepte aan de eerste 10-15 micrometer. Passen indien nodig, en een ander beeld test.
- Optionele stap: Verzamel een test filmpje van de buikzenuwkoord te zorgen dat er geen xy drift. Als drift wordt gedetecteerd, wacht 15-30 minuten voor de steekproef om zich te vestigen. Als de drift niet vestigen in 30 min, bereiden een nieuw monster. Bekende drift kan meestal worden teruggevoerd naar de toevoeging van overmaat olie of ongelijke grootte van oliedruppels bij de montage.
- Axiale drift (z-drift) te elimineren gebruik van een continue automatische scherpstelling apparaat dat een infrarood-LED maakt gebruik. U kunt ook handmatig de focal plane corrigeren.
- Zodra een NB van belang is geïdentificeerd, gaan met beeldvorming regime. Zoals bij alle live cell imaging, de hoeveelheid laserlicht, belichtingstijd, camera binning, objectiefvergroting, tijd en / of z-stap interval moeten alle empirisch worden geoptimaliseerd voor een bepaald experiment om de vraag te beantwoorden bij de hand. Het doel is om licht dam minimaliserenleeftijd, terwijl nog steeds het verzamelen van bruikbare gegevens. Zie bespreking voor extra begeleiding.
- Beeld het gehele volume van het NB door het verzamelen 12-14 images gescheiden door 1 urn in de z-as. Pas de tijd resolutie naar een of meerdere celdelingen van dezelfde NB vangen. Als een algemene richtlijn, gebruik 10-30 sec intervallen voor enkele celcyclus beeldvorming en 1-3 min. intervallen voor meerdere celcycli.
- Kritische stap: Bevestig dat de steekproef gezond door het toezicht op de duur van de mitose. Als mitose neemt meer dan 15 min, verhuizen naar een andere hersenen. Een gezonde hersenen zullen vele AI's tonen binnen hetzelfde gezichtsveld ondergaan verschillende rondes van mitose. Merk op dat elke celcyclus is iets langer dan de vorige door lichte schade.
- Zodra beeldvorming is voltooid, demonteer het incubatiekamer, en gooi alles maar de gasdoorlaatbare kweken gerechten. Spoel de cultuur schotel oppervlak met 95% ethanol en veeg goed met een tissue. Herhaal dit nog twee keer.
5. Voorbereiding van Brains voor immunofluorescentie
- Verzamel 20 of meer geëxplanteerde hersenen in een 1,5 ml buis met ongeveer 0,2 ml aangevuld medium.
- Verwijder medium uit de buis en spoel hersenen eenmaal met 0,5 ml PBSTx (fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS, 0,3% Triton X-100). Laat hersenen naar de bodem van de buis tussen alle uitwisseling van vloeistof. De Triton X-100 detergens wordt gebruikt om het weefsel permeabilize. Spoelen meestal duurt minder dan 30 seconden; verwijder de PBSTx eenmaal hersenen hebben zich naar de bodem van de buis.
- Vervang de oplossing met 0,5 ml 9% elektronenmicroscopie rang paraformaldehyd verdund in PBSTx. Incubeer met nutatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi fixatief volgens afvalregelgeving gevaarlijk.
- Was de monsters met 0,5 ml PBSTx gedurende 15 minuten. Herhaal de wasstap met verse PBSTx twee keer.
- Vervang de oplossing met 0,5 ml PBT (PBS, 1% Runderserumalbumine (BSA) en 0,1% Tween-20). Incubeer met nutatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Deze stap blokkeert de specifieke binding van antilichaam aan het weefsel.
- Vervang de oplossing met 0,5 ml primair antilichaam verdund in PBT aangevuld met 4% normaal geit serum (NGS). Incubeer met nutation overnacht bij 4 ° C.
- Gooi of sla de verdunde primaire antilichaam.
- Was de monsters met 0,5 ml PBT gedurende 15 minuten. Herhaal de wasstap met verse PBT twee keer.
- Vervang de oplossing met 0,5 ml gemodificeerde PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20 en 4% NGS). Incubeer met nutatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Vervang de oplossing met 0,5 ml secundair antilichaam verdund in gewijzigde PBT. Incubeer met nutatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Vervang de oplossing met 0,5 ml PBST (PBS met 0,1% Tween-20). Incubeer met nutatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap met verse PBST twee keer.
- Breng zorgvuldig de monsters als een druppel op een glasplaatje, beperkt de daling naar links van het midden van de schuif.
- Voeg een grote druppel (ongeveer 2 cm diameter) van fixeermiddel (bijvoorbeeld Aqua-Poly/Mount) naar het midden van de dia. Vermijd het zwembad PBST dat is naar links.
- Gebruik een tang om de hersenen te brengen van het zwembad van PBST aan de pool van montage medium. Fixeermiddel direct toevoegen bovenop de hersenen kunnen hun oriëntatie verstoren en moet worden vermeden.
- Onder een lichtmicroscoop, regelen de monsters in de montage medium met de kant die zal worden afgebeeld naar boven.
- Met de schuif onder de lichtmicroscoop, langzaam lager een # 1,5 glazen dekglaasje bovenop de monsters. Optionele stap: Verjagen kleine luchtbellen door licht te drukken op het dekglaasje.
- Laat de montage medium polymeriseren voor enkele uren, of 's nachts, door te liegen dia's plat, licht-beschermd bij kamertemperatuur.
- Slides kunnen worden afgebeeld de volgende dag, of opgeslagen om beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-beeldvorming heeft een aantal mechanismen die NB ACD opgehelderd. Vóór beeldacquisitie, moet de optimale imaging omgevingsomstandigheden. Het is noodzakelijk om het frame opnamesnelheid afwegen tegen de duur van live cell imaging. Voor fijne cellulaire analyse, bijvoorbeeld, verhoogde tijdelijke en optische resolutie kan worden verlangd. Bij het visualiseren van een enkele NB celcyclus (Figuur 4A), kan de snelheid waarmee beelden worden vastgelegd worden verhoogd zonder de invoering van photodamage. Typisch kan enkel celdeling gebeurtenissen worden gecontroleerd op ongeveer 10-30 sec tijdsintervallen. Een manier om de temporele resolutie te verhogen zonder schade weefsel naar afbeelding verwervingssnelheid moduleren. Bijvoorbeeld, kan time-lapse imaging tegen een lagere framerate, die vervolgens wordt verhoogd na observatie van een interessante functie of tijdstip (Film 1) worden gestart.
Imaging opeenvolgende rondes van celdeling (
Voor de analyse van grote aantallen monsters, is het vaak noodzakelijk om vaste AI's te analyseren. De fixatie protocol blijft de algehele morfologie van NBS en is compatibel met immunofluorescentie assays (figuren 4C-4E). Whole mount vaste brains kan worden afgebeeld bij een lage vergroting (figuur 4C) om de totale omvang hersenen te visualiseren en vorm of op te sporen AI's. Om NBs of hun nageslacht GMCs in meer detail zichtbaar te maken, moet een hogere vergroting worden gebruikt. Bij matige vergroting (Figuur 4D), kan de gehele NB lineage clusters worden waargenomen. Voor gedetailleerde cellulaire analyse, wordt een hogere vergroting gebruikt (figuur 4E).
Figuur 1. Explanteren hele hersenen voor live cell imaging van NB ACD. A) De larven centrale zenuwstelsel bestaat uit twee optische lobben en een buikzenuwkoord. Twee subtypen AI's bevolken de optische kwab in stereotiepe posities:. Type I (donkerblauw) en Type II (lichtblauw) B) De AI ondergaan ACD. Bij elke celdeling, deNB splitst aanleiding geeft tot een GMC (of INP, niet getoond) en regenereert de NB stamcellen. GMC verdeelt aanleiding geeft tot twee neuronen (of glia, niet getoond) C.) Twee microdissectie gereedschap geassembleerd door het inbrengen te kunnen ontleden in pinhouders. Het buigen van de pennen leidt tot unieke tools, een scalpel en een haak, die worden gebruikt om verbreken, doorboren en verdringen ongewenste weefsel zonder de onderliggende hersenen. D) Hersenen worden geëxplanteerd in een van twee pools ontleden media (blauwe cirkels). Een pool drager wordt gebruikt om het centrale zenuwstelsel van de larven (bruto dissectie) verwijderen en de andere pool wordt gebruikt voor fijne microdissectie van perifere weefsels van het geëxplanteerde hersenen (fijn dissectie).
Figuur 2. Preservatie van de hersenen morfologie tijdens microdissection. Hasty hersenen dissectie kan ernstige weefselschade die (A) gescheurd ventrale zenuw snoeren of (B) vervormd optische kwabben omvat induceren. Nog subtieler weefselschade (B ') dient te worden vermeden voor live cell imaging. (C) Een voorbeeld van een gezond weefselmonster voor levende beeldvorming. D) Een optisch heldere, gasdoorlatend membraan. E) Een verzameling van verschillende gezonde hersenen gerangschikt in kweekmedium op een gasdoorlatende schotel. Deze hersenen zijn klaar voor microscopie worden gemonteerd. Schaalbalk: (AC), 100 micrometer; (D), 25 mm; (E) 1 mm.
Figuur 3. Montage hersenen voor live cell imaging. A) Brains uitgelijnd in rijen in een druppel kweekmedium afgezet in het midden van de schaal. B) De daling drager wordt omgeven druppels HC olie ongeveer gelijk volume. De vier druppels HC olie en de centrale druppel medium lijken op de vijf facetten van het spelen dobbelstenen. Na een dekglaasje wordt neergelaten op de druppels olie, is (C) een pit gevormd uit KimWipe weefsel en gebruikt om zoethoudertje overtollig vocht. D) De buitenkant rand van het dekglaasje wordt omringd door een dunne laag olie aan op de verdamping te stoppen van het kweekmedium. Deze hersenen zijn nu klaar voor microscopie. E en F) De oriëntatie van de hersenen ten opzichte van het dekglaasje bepaalt welke neuroblasts zijn toegankelijk voor live cell imaging. E) Dorsale neuroblasts worden afgebeeld door het organiseren van de hersenen met de buikzijde het aanraken van het gas permeabel membraan . F) Antero-ventrale neuroblasts kan worden afgebeeld door arranging de hersenen met de dorsale zijde raken de gasdoorlatende membraan en vervolgens aanstoten het dekglaasje en het onderliggende weefsel in de richting van de buikzenuwkoord tips. Deze motie enigszins kantelt de optische kwabben zodanig dat het oppervlak Voorwandinfarct-dorsale contacten het dekglaasje, waardoor de gewenste beeldvorming as in perfecte uitlijning (groene lijn).
Figuur 4. Representatieve resultaten live beeldvorming van het verdelen neuroblasts. A en B) Live-beeldvorming van NB stamcel divisies geheel mount preparaten met behulp van een 40X, 1.3 NA olie-immersie objectief. Tijd wordt weergegeven als min: sec ten opzichte van de start van de time-lapse-A) Stills uit time-lapse imaging van een enkele cel cyclus van een NB die GFP-Moesin.(GFP-Moe). Het beeld acquisitie tarief van een enkele cel cyclus kan worden verhoogd tot temporele resolutie te verbeteren zonder het induceren photodamage. B) Stills uit time-lapse imaging van opeenvolgende celdeelcycli van een NB die zowel GFP-Moe en een GFP-gelabelde centrosome marker. De verlengde periode in verband met meerdere celcycli noodzaakt verminderde temporele resolutie te photodamage voorkomen. Merk op dat de tijdsduur tussen elke celdeling toeneemt tijdens beeldvorming. CE) confocale projecties van vaste stamcellen uit ganse berg preparaten. C)) Aan image alle NBs aan beide optische kwabben, 20x vergroting wordt gebruikt. Deze analyse is bijzonder nuttig om de algehele morfologie hersenen te onderzoeken en NB cijfers (lichtblauw), enz. D) kwantificeren De meerderheid van de AI's (roze) van een enkel optisch kwab kan worden gevisualiseerd met 40x vergroting. Microtubuli, (groen). E)
Film 1. Live beeldvorming van een enkele NB celcyclus. Time-lapse beelden van een enkele NB celdeling van een brein die GFP-Moe naar de cel cortex label. Beelden werden verkregen van een enkele optische vliegtuig op 40x vergroting. In deze film, werden frames vastgelegd om de 15 sec. Na ongeveer 7 min van de overname, werd het tarief verhoogd tot een frame om de 5 sec. Klik hier om de film te bekijken.
Movie 2. Live imaging opeenvolgende ronden of NB ACD. Time-lapse beelden van een NB ondergaat drie rondes van celdeling in de hersenen die GFP-Moe en een GFP-gelabelde centrosome marker. Beelden werden verkregen op 2 min tijdsintervallen bij 60X vergroting. Klik hier om de film te bekijken.
| Lijn | Gelabeld Celstructuur | Fluorofoor | Expression / Promoter | Citaat |
| YFP-Asterless | Centriole | YFP | Ubiquitine | Rebollo, et al.. (2007) Dev. Cell 12:. 467. |
| SAS6-mCherry | Centriole | mCherry | Endogene | Rusan en Peifer (2007) J. Cell Biol. 177 |
| GFP-SAS6 | Centriole | GFP | Endogene (BAC) | Lerit en Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013. |
| GFP-PACT | Centriole | GFP | Ubiquitine | Martinez-Campos et al.. J. Cell Biol 165:. 673. |
| GFP-SAS4 | Centrosome | GFP | Ubiquitine | Dix en Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759. |
| GFP-Polo | Centrosome | GFP | Endogene | . Moutinho-Santos et al. (1999) Cell Biol 91:. 585. |
| GFP-γ-tubuline 23C | Centrosome | GFP | Ubiquitine | Lerit en Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013. |
| GFP-Centrosomin | Centrosome | GFP | UAS | Megraw, et al.. (2002) J. Cell Sci 115:. 4707. |
| GFP-SPD-2 | Centrosome | GFP | Ubiquitine | Dix en Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759. |
| mCherry-α-tubuline | Microtubuli | mCherry | Ubiquitine | Rusan en Peifer (2007) J. Cell Biol 177:. 13. |
| GFP-α-tubuline | Microtubuli | GFP | Ubiquitine | . Rebollo, et al. (2004) PLoS Biol 2:. E8. |
| Jupiter-GFP ("G147") | Microtubuli | GFP | Endogene | Morin et al. (2001) PNAS 98:.. 15.050. |
| mCherry-Jupiter | Microtubulis | mCherry | UAS | Cabernard en Doe (2009) Dev. Cell 17: 134. |
| H2AvD-mRFP | DNA | mRFP | Endogene | Pandey, et al.. (2005) J. Cell Sci 118:. 733. |
| H2AvD-GFP | DNA | GFP | Endogene | Clarkson en Sint (1999) DNA Cell Biol 18:. 457. |
| Moesin-GFP | Corticale actine | GFP | Spaghettipompoen | Kiehart, et al.. (2000) J. Cell Biol 149:. 471. |
Tabel 1. Enkele voorbeelden van bruikbare transgene lijnen voor de studie van ACD. Deze fusie constructen zijn bijzonder nuttig voor het bestuderen van celdeling. Ze worden gewoonlijk gebruikt in NB levende weergavestudies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Live cell imaging is een waardevolle benadering gebruikt om de mechanismen die ACD van stamcellen, de differentiatie van cellijnen reguleren te bestuderen, en de morfogenese van complexe weefsels. Hoewel onderzoeksgroepen verleden zijn gebruikt verschillende technieken om te visualiseren NB ACD, kunnen deze benaderingen algemeen worden ingedeeld in twee categorieën die vooral verschillen met betrekking tot de vraag of het hersenweefsel intact wordt gelaten of gescheiden.
Imaging los NBs heeft zo zijn voordelen. Voor een, gedissocieerd AI's zijn gemakkelijker te beeld omdat zij bijzonder gemakkelijk te identificeren als de grootste (ongeveer 12 urn in diameter) cellen in een kweek schotel. Bovendien zullen bijna alle stamcellen die gekweekt zijn op een glazen oppervlak even dicht bij de microscoop objectief te zijn gedurende de beeldopname periode. De optische kwaliteit van time-lapse beelden wordt verder verbeterd door het gebruik van hetzij poly-L-lysine of fibrinogeen bekleed glas sem inducereni-afvlakking van de ronde AI's 16, 17. Een ander voordeel van gedissocieerde De AI in kweek beeldvorming is het gemak waarmee kweekmedium kan worden uitgewisseld. Zodra cellen hechten aan het gecoate glas oppervlak, kweken medium dat een willekeurig aantal farmacologische agonisten, antagonisten of immunoblocking antilichamen, enz. kunnen worden toegevoegd of verwijderd. Tenslotte, zijn benaderingen gedissocieerde AI's visualiseren hebben aangetoond dat deze techniek inderdaad vatbaar voor langdurige beeldacquisitie 18, 19.
Niettemin, de nadelen aan beeldvorming los AI's zijn de complexiteit van het protocol. De meeste methoden detail lange (30-60 min) chemische digestie, gevolgd door een lange incubatiestap (60 min) om gedispergeerde cellen bezinken en zich aan de kweken schotel 17, 19.
In tegenstelling, beeldvorming De AI van een intact brein behoudt zowel defysiologische context en morfologie van het weefsel. De voordelen van deze benadering zijn de mogelijkheid om specifieke NB lijnen die zich in stereotiepe regelingen of op bepaalde tijden 1 ontwikkelingsstoornissen identificeren. Daarom is onze vereenvoudigde protocol heeft nut dat verder reikt dan studies van ACD, omdat het zorgt ook voor de live onderzoek naar differentiatie en morfogenese evenementen. Een nadeel van deze methode is echter het onvermogen te wisselen kweekmedium. Daarom moeten onderzoekers die geïnteresseerd zijn in lange termijn beeldvorming van opeenvolgende stamcel divisies beschouwen de aanpak (gedissocieerde primaire cultuur versus ganse berg) die het best past bij hun aanvraag. Ook de noodzaak kweken toevoegsels, zoals insuline of serum, moet empirisch bepaald op basis van het beeldelement (duur beeldvorming, hoeveelheid licht die het monster, enz.) En experimentele opstelling.
In het algemeen adviseren wij gebruik te maken van dissociaatd NBs te onderzoeken waar het noodzakelijk is om de acute respons AI's tot de introductie van kleine moleculen (bijv. remmers, enz.) te beoordelen, voor high-throughput toepassingen wanneer fijne microdissection van hersenen zou te omslachtig zijn, en voor geavanceerde imaging studies dat de NB eisen dat fysiek contact met het dekglaasje. In tegenstelling, adviseren wij gebruik te maken van intacte hersenen voor toepassingen waar het nuttig is om het een paar AI's uit dezelfde hersenen, en vooral voor studies die betrekking hebben op cel-cel interacties, autonomie, klonale analyse, veranderingen cel vorm, en andere onderzoeken waar de inheemse omgeving van de cellen van belang.
Om de succesvolle voorbereiding van intacte hersenen voor live-imaging te garanderen, moet een aantal cruciale stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Foremost, is het noodzakelijk om blootstelling van het weefsel aan onnodige trauma. Specifiek explanteren de hersenen en het verwijderen van perifere weefsel moet worden uitgevoerd met zorg. Eendient direct contact tussen het gereedschap en ontleden de hersenen te minimaliseren. Bovendien moet men vermijden trekken of trekken aan het weefsel aan de hersenen. Verkeerd gebruik van het weefsel kan gemakkelijk leiden tot gescheurde of vervormde hersenen. In onze handen, AI's van beschadigde hersenen zelden verdelen. Mensen die nieuw zijn larvale hersenen dissectie vaak baat bij het beheersen van de dissectie voordat u monsters te bereiden voor live-imaging.
Een andere belangrijke stap in het protocol is de montage van de hersenen voorafgaand aan cell imaging leven. De juiste hoeveelheden zowel kweekmedium en HC olie zijn essentieel voor een bruikbare bereiding voltooien. Hoewel het moeilijk is om de viskeuze olie HC nauwkeurig met een pipet, kan men de juiste hoeveelheid (ongeveer 30 pl) benaderen door oog. Teveel vloeistof voorkomt het dekglaasje van de afwikkeling op zijn plaats. Vaak resulteert dit in de hersenen bewegen op het oppervlak van het kweken schotel. Tijdens de live-imaging, een onrustige dekglaasje is evideuk wanneer het weefsel afwijkingen of de optische kwabben roll. Monsters die niet gepositioneerd plek te vermijden. Integendeel, het toevoegen van te weinig kweekmedium of HC olie met katastrofisch weefselbeschadiging, waaronder burst optische kwabben. Er is een zorgvuldige afweging met voldoende vloeibaar medium en olie aan het gewicht van het dekglaasje behandelen versus teveel vloeistof, waardoor het dekglaasje te glijden. Dit evenwicht wordt best geleerd door oefening. In het algemeen is het het beste om alleen de beelden die hersenen die een gezonde morfologie, zoals een intact buikzenuwkoord en symmetrisch rond optische lobben.
Zodra het monster met geen detecteerbare drift is gemonteerd, waardoor het monster in leven wordt dat de volgende essentiële punt van deze protocol. Dit wordt het best bereikt door het handhaven van de juiste temperatuur en, belangrijker nog, het minimaliseren van de hoeveelheid licht die het monster raakt. De microscoop installatie en het monster de twee variabelen die het succes van l zullen geldenive cell imaging. Hoge kwaliteit doelstellingen, filters (~ 98% transmissie), en camera's (back-uitgedund elektron te vermenigvuldigen en Complementary Metal-Oxide Semiconductor) over de uitstoot kant zal toelaten dat een aan de hoeveelheid licht die het monster op de excitatie kant raakt te verminderen. Het is bekend dat blauw licht (gebruikt om het GFP) is zeer giftig voor cellen. Men moet bepalen hoeveel totale licht (totale blootstelling keer) kan een gegeven monster tolereren en vervolgens verspreid dat de totale tijd langs de duur van het experiment. Bijvoorbeeld, indien een monster alleen tolereren 500 laserlicht vorderingen op basis van een bepaalde microscoop opstart, en hierbij kan verzamelen 50 x 10-slice stacks. Deze stacks zou kunnen worden gescheiden door 1 min tot een enkele NB celcyclus, of 2-3 min verzamelen om ~ 3 celcycli verzamelen. Bovendien optimaliseren instellingen voor elk genotype is essentieel voor een succesvolle levende beeldvorming. Tijdens de optimalisatie periode, een goed uitgangspunt voor 488 nm laservermogen is 25-50 μW afkomstig van een 100X, 1.4 NA &# 160; olie-immersie objectief. Tenslotte moet men bepalen welke beeldvorming staat goed beantwoordt de vraag bij de hand, omdat het niet altijd zo dat de meest geavanceerde imaging nodig.
Voor experimenten met live of vaste weefsel, kunnen de hersenen worden gemonteerd zodat het specifieke NB geslachten. Bijvoorbeeld, om het type II NBS die stereotiep bevinden in de posterieure middengebied van de optische kwab 7, zou men zet de hersenen, zie figuur 3E. Omdat de ruimtelijke en temporele patroon van de centrale hersenen AI's zijn goed gedocumenteerd 1, kan men ons protocol gebruiken om de afbeelding een verscheidenheid aan specifieke NB clusters terwijl gebruik te maken een aantal van de grote schaal beschikbaar transgene constructies die worden uitgedrukt onder alomtegenwoordige of, idealiter, endogene promotors (Tabel 1). Toch afstammings-specifieke labeling technieken 20 bruikbaar blijven voor een aantal toepassingen.Met vaste analyse, hersenen met lichte schade zijn over het algemeen aanvaardbaar. Bovendien kan de volledige verwijdering van perifere weefsel worden uitgesteld tot vlak voor het inbedden van de hersenen in montage medium. Onderzoeken met vast weefsel zijn bijzonder nuttig wanneer grote aantallen AI's worden afgebeeld.
Tot slot, hebben studies van NB ACD sterk geprofiteerd van het gebruik van zowel live cell imaging en gedetailleerde analyse vast. Het protocol hier beschreven Gegevens een benadering van Drosophila larven bereiden voor live of vaste toepassingen. We anticiperen op de voortdurende onderzoek van NB ACD via gedetailleerde imaging studies zullen nieuwe en spannende resultaten die ons begrip van stamcellen in ontwikkeling en ziekte zal vooraf onthullen. De toepassing van langdurige beeldvorming van levende intacte larvale hersenen heeft de potentie om nieuwe onverwachte inzichten in de chronologische volgorde van differentiatie en morfogenese gebeurtenissen die de ontwikkeling regelen (en degenking) van het centrale zenuwstelsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de verdeling van de intramurale onderzoek aan de National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) en een Lenfant Biomedische Postdoctoraal Fellowship toegekend aan DAL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | A high viscosity inert oil that is clear and colorless. |
| Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissecting needle/probe with plastic handle | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Syringe filter, 0.22 μm pore size | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Syringe, 5 ml | BD Biosciences | 309646 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Paraformaldehyde, 32% EM-grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | A dye that labels DNA and is excited by UV light. |
References
- Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
- Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
- Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
- Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
- Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
- Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
- Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
- Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
- Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
- Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
- Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
- Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
- Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
- Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
- Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
- Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).
