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Neuroscience

Live-Imaging von doi: 10.3791/51756 Published: July 7, 2014

Summary

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Abstract

Stammzellen teilen sich asymmetrisch zu zwei Nachkommen Zellen mit ungleichen Schicksal Potenzial generieren: eine sich selbst erneuernde Stammzellen und differenzier Zelle. Angesichts ihrer Bedeutung für die Entwicklung und Krankheit, das Verständnis der Mechanismen, die regeln, asymmetrische Zellteilung Stamm hat eine robuste Bereich der Studie. Weil sie genetisch manipulierbaren und laufen aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung etwa einmal pro Stunde, die Stammzellen des Drosophila zentralen Nervensystems, Neuroblasten oder unverzichtbar sind Modelle für die Untersuchung von Stammzellteilung. 100 neurale Stammzellen sind in der Nähe der Oberfläche jedes der beiden Larvenhirnlappen angeordnet, so dass diese Modellsystem insbesondere für die Bildgebung mikroskopische Untersuchungen. In dieser Arbeit untersuchen wir einige Ansätze weit verbreitet, um Stammzell Divisionen zu visualisieren, und wir richten die relativen Vor-und Nachteile dieser Techniken, die im Vergleich zu intakten Hirngewebe dissoziiert beschäftigen. Wir haben auch unsere Detail simplifIED-Protokoll verwendet, um ganze Gehirn aus Drittlarvenstadium für Live-Cell-Imaging-und Festanalyseanwendungen Explantation.

Introduction

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Stammzellen ein Gleichgewicht der Differenzierung und Selbsterneuerung an zelluläre Vielfalt während der frühen Entwicklung zu generieren und ersetzen beschädigte Zellen in adulten Geweben. Verordnung dieser Homöostase verhindert sowohl den Verlust und die Überdehnung der Stammzellpopulation, die in schädlichen Gewebedegeneration oder Tumorentstehung führen kann.

Neuroblasten (NBS) sind die häufigsten untersuchten neuralen Stammzellen des zentralen Nervensystems von Drosophila (1A), die erste Form während der embryonalen Stufen 1, 2. NBs unterziehen wiederholte Runden der asymmetrischen Zellteilung (ACD), um zwei ungleich seligen Zellen produzieren: eine sich selbst erneuernde Stammzelle und eine differenzierende Zelle. ACD wird von Zentrosomen, die nicht-membranöse Organellen, die als Mikrotubuli-organisierende Zentren der meisten Zellen 3 handeln geführt. Während der Mitose, NB Zentrosomen zu organisieren und orientieren den bipolaren mitotischen Spindel entlang der apikal-basalen Polarkeit Achse. Nach der Spaltung des Teilungs NB, apikal Schicksal Determinanten, die die Stammzell Schicksal angeben und basalen Schicksal Determinanten, die eine Differenzierung angeben, werden in die ungleiche Tochterzellen getrennt.

Im Larven zentrale Gehirn, können zwei Arten von NBs durch deren Anzahl, Lage, Transkriptionsfaktor-Expression und Zelllinie (Fig. 1A) 4-6 unterscheiden. Typ-I-BS sind die häufigsten, und etwa 90 von ihnen bevölkern die vorderen und hinteren Seiten jeder Optik Lappen des Gehirns 7. Diese NBs Ausdruck der Transkriptionsfaktor ASENSE (Ase), und sie charakteristisch in eine sich selbst erneuernde NB teilen und eine kleinere Ganglienmutterzelle (GMC; Abbildung 1B). Jeder GMC erfährt ein einziges Terminal Division zu zwei Neuronen oder Gliazellen (Abbildung 1B) zu generieren. Im Gegensatz dazu sind die acht Typ II NBs, die die hintere Seite jeder optischen Loben bevöl fehlt Ase Ausdruck 5. Sie durchlaufen ACDauf eine sich selbst erneuernde NB und eine Zwischen neuralen Vorläufer (INP) zu produzieren.

Die INP wiederum teilt asymmetrisch drei-bis fünfmal. Jeder dieser Bereiche ergibt Regeneration des INP und der Herstellung eines einzigen GMC 4. Zusammen die spezifische NB Identität und die zeitliche Reihenfolge der GMC Geburt führt zur neuronalen erstaunliche Vielfalt der erwachsenen ZNS.

Das Verständnis der Zellbiologie, die NB ACD zugrunde liegt, wurde erheblich durch den Einsatz von Live-Cell-Imaging-Techniken verbessert. Veröffentlicht Protokolle, die von Forschern, Live-Bild verwendet NBs sind sehr unterschiedlich. Insgesamt aber diese Verfahren können in zwei allgemeine Kategorien von, ob die Larven Gehirn intakt gelassen oder mechanisch dissoziiert unterschieden gruppiert werden. Beide Techniken haben unterschiedliche Vor-und Nachteile je nach Anwendung des Forschers.

Frühe Berichte enthüllt Live-NB Zellteilunggen beinhalten ein gewisses Maß an Hand Dissoziation des Larven Gehirn. Diese Protokolle Detail Verschmieren 8 oder 9 Hänseleien abgesehen, das Gehirn, um kurzfristige Primärkulturen von der NBS auf Deckgläsern wachsen. Um Bildgebung zu verbessern, werden die runden NBs der Regel auf die Deckgläser entweder mit Glasobjektträger 8 oder 9 Agarose-Pads abgeflacht. Obwohl abgeflachten Zellen Optik verbessert, diese Techniken oft NB mitotischen Defekten führen, einschließlich Regression der Teilungsfurche und die Unfähigkeit, mehr als einmal zu teilen. Daher sind Protokolle, die sowohl manuelle Dissoziation und physische Verzerrung des Larvenhirngewebe beinhalten in der Regel nur geeignet, um sehr kurzfristige (dh., Ein Zellzyklus oder weniger) Anwendungen. Ebenso semi-Quetschen oder vollständig intakten Gehirn Abflachung zwischen Glasobjektträger und Deckgläser begrenzt die Zeit, ein verbringen Abbildung einer gegebenen Probe zu einer etwa 30-minütigen Zeitraum 10. Trotz dieser Einschränkung thiAnsatz erfolgreich 11-14 verwendet.

Die jüngsten Bemühungen um Live-Bild dissoziiert NBs Grenze physischen Verzerrung der isolierten Zellen. Diese Techniken sind besonders nützlich für Anwendungen, bei denen es notwendig ist, um die Zellkulturen für mehrere Zellteilungszyklen aufrecht zu erhalten. Beispielsweise kann manuell aus dispergierten Zellen dissoziiert Gehirn teilweise in ein Gerinnsel aus dem Gemisch von Fibrinogen und Thrombin, 15 für die Langzeitabbildungs ​​16 eingebettet werden. Alternativ kann explantierten Gehirne zunächst mit dem Enzym Collagenase, neben manuell durch wiederholte Passage durch eine Pipettenspitze aufgebrochen und anschließend auf Poly-L-Lysin beschichteten Glasbodenschalen 17, 18 plattiert chemisch getrennt werden. Die Beschichtung Glasschalen entweder mit Fibrinogen oder Poly-L-Lysin fördert die Bindung und leichten Verbreitung von Rundzellen, bringen sie so nah an der Deck wie möglich, ohne große körperliche Verzerrung. In additiauf beinhalten diese Verfahren das Kultivieren der NBS in Medium, das leicht für pharmakologische Experimente Störungs 18 ausgetauscht werden können. Insgesamt Plattierung direkt verteilt NBs verbessert Abbildungsoptik, ohne dabei langfristigen Imaging-Funktionen. Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die langfristige Kultivierung von dissoziierten NBs wurde 19 beschrieben.

Jedoch ist dieser Ansatz nicht ohne Einschränkungen. Es gibt mehrere Einschränkungen live dissoziiert NBs Bildgebung. In einem Feld von dispergierten Zellen, beispielsweise ist es schwierig, bestimmte NB Linien, die räumlich in der intakten 1 organisiert sind, zu identifizieren. Ebenso die Unterscheidung der Typ I gegen Typ-II-NBs in dissoziierten Gewebe ist auch ohne den Ausdruck der Abstammung oder Tracer-Subtyp-spezifischen Transgene, wie worniu-GAL4, asense-GAL80 20 herausfordernde. Obwohl diese Transgene sind sehr nützlich für einige Anwendungen, sie begrenzen Forscher diejenigen Transgene exunter der Kontrolle von UAS-Enhancer-Element 21 gedrückt und erfordern komplexe genetische Systeme. Studien, die die räumliche und zeitliche Entwicklung des NBs betreffen, erfordern daher in vivo-Bildgebung im Kontext eines intakten Gewebes.

Außerdem haben Studien dissoziierter embryonaler NBs anzuzeigen, dass der physische Kontakt benachbarter Zellen ist für die Zwischen Lokalisierung von Schlüsselfaktoren Polarität 22, 23. Diese Studien zeigen, völlig isoliert NBs die invariante mitotischen Spindelachse nicht mehr aufrecht zu erhalten. Stattdessen werden diese Zellen zeigen eine weitere randomisierte Spindelachse und großen Winkeln der Trennung zwischen aufeinander GMC Knospen, vielleicht aufgrund des Verlustes der apikalen Zentrosom Positionierungs 22. Obwohl die Beziehung zwischen den Larven NBs und ihre Nachbarzellen nicht ausführlich untersucht worden, ist es eine Überlegung wert, dass die Larvenstammzellmikroumgebung kann von Zellpolarität oder andere treffenVerhaltensweisen. Um die physiologischen Kontext der Larven NBs halten wir Bild ACD aus ganzen Gehirne.

Angesichts der inhärenten Einschränkungen mit bildgebenden dissoziiert NBs verbunden sind, haben unser Labor und andere Protokolle für Bild in aufeinanderfolgenden Runden der NB ACD aus ganzen Larven Gehirn etabliert. Techniken zur Bild intakten Gehirn ersetzen häufig die starre Oberfläche aus Glas auf der einen Seite der Kulturkammer mit einer flexiblen Membran, um Gewebe Verformung oder Beschädigung zu verhindern und eine für den Gasaustausch. Einige Verfahren beinhalten Montage explantierten Gehirne in einem Gemisch von Insektenkulturmedium, Serum und Ascorbinsäure mit den Fettkörpern von zehn Larven 24 isoliert. Die isolierten Fettkörper hinzugefügt werden, weil sie eine Mitogen bekannt, NB Zellteilung stimulieren 25 absondern. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität des Gewebes über 3 Stunden und ist daher offen für Langzeitabbildungs ​​24, 26-28. Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die long fristigen Abbildung des Larven intakten Gehirn in Gegenwart von Ascorbinsäure, Serum und Fettkörper wurde 29 detailliert. Wichtig ist, da das Gewebe nicht ausgesetzt oder immobilisiert ist dieser Ansatz weniger nützlich für Anwendungen, in denen Kulturmedium ausgetauscht wird (z. B. Arzneimittelstudien Immunodepletion usw.).

Unser Labor hat die ganze Vorbereitung der Live-Halterung Larven Gehirne für langfristige Bildgebung 30, 31 vereinfacht. Der Hauptvorteil unseres Protokolls über andere ist seine Einfachheit: Unsere Beobachtungen zeigen, weder Serum, Ascorbinsäure, Insulin, noch Fettkörper sind notwendig, Zusatzstoffe Bild aufeinanderfolgende Runden NB ACD. Obwohl Additive, wie Insulin, wurden für die verlängerte Bildgebungs der Stammzellen Abteilungen 32 und kollektive Zellmigration in Drosophila Ovarien 33 nützlich erscheinen sie entbehrlich für NB ACD sein, wie unsere Abbildungsmedium besteht aus einer einfachen Mischung von STAndard Insektenzellkulturmedium mit Antibiotika-Antimykotikum ergänzt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Durch die Verwendung von wiederverwendbaren gasdurchlässige oder Glasboden Kulturschalen, haben wir in der Lage, mehrere Runden von aufeinanderfolgenden NB ACD zu erhalten. Die gleichen explantiert Proben können leicht für Immunfluoreszenz-und andere Verfahren mit festen Gewebe verwendet werden. In diesem Protokoll, die wir ausführlich die Präparation von intakten Larven Gehirn, sowie die Vorbereitung der Gehirne sowohl für Live-und Festanalyse.

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Protocol

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1. Herstellung von Materialien Erforderlich zum dritten Larven Larven Brains Explantation

  1. Bereiten Sie Werkzeuge für die Mikrodissektion erforderlich.
    1. Forge sezieren zwei Werkzeuge (ein Skalpell und ein Haken), indem zunächst eine einzelne Sektions Stift in jeder Stifthalter. Sichern Sie sich die Stifte fest mit der Hand oder mit einer Zange (Abbildung 1C).
    2. Verwenden Sie ein Paar alte Pinzette, um ein Seziersaal Pin auf einem etwa 120 ° Winkel biegen. Tun Sie dies unter einem Binokular, um sicherzustellen, dass die obere Hälfte des Stiftes liegt flach, wenn der Stift Halter in der Hand hielt. Dieses Tool wird wie ein Skalpell in der Hand nach unten oder in Scheiben schneiden durch das Gewebe verwendet werden.
    3. Verwenden Sie ein Paar alte Pinzette, um den zweiten Stift in einen Haken, die verwendet werden, um zu halten und abkratzen Gewebe wird zu biegen.
    4. Cover jede Sezieren Werkzeug mit einer Pipettenspitze, die Werkzeuge vor Beschädigungen zu schützen. Mit Sorgfalt können gut ausgebildete Werkzeuge für die Präparation auf unbestimmte Zeit verwendet werden. Beschädigte oder verformte Pins Bedarf ersetzen.
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  2. Bereiten Sie sezieren Medium.
    1. In einer Gewebekultur Kapuze, verdünnen das Antibiotikum-Antimykotikum in Ergänzung des Schneiders Kulturmedium. Schwenken Sie die Medien, um den Zuschlag zu integrieren.
    2. Bereiten mehrere 5 ml Aliquots der ergänzten Medium. Speichern Sie alle Medien bei 4 ° C bis zur Verwendung.
    3. Warm eine 5 ml-Aliquot ergänzt Medium auf Raumtemperatur. Zeichnen Sie das Medium in einer sterilen 5 ml Spritze und Schrauben auf einer sterilen 0,2 um Spritzenfilter.
  3. Wählen Larven für die Präparation. Verwenden Sie ein Sezieren Sonde auf Crawling dritten Larvenstadium auswählen, wie das Gehirn wird am einfachsten sein, sezieren. Optional: Kaution Larven auf einem Wein Agar-Platte.
    Hinweis: Verwenden Sie keine überfüllten Ampullen oder Flaschen mit "Nassfutter", wie diese dazu neigen, zweiten oder ersten Larvenstadium zu zwingen, vorzeitig kriechen.
    Hinweis: Einige genetischen Hintergründen erfordern wird mit jüngeren Larven. Dies betrifft nicht das Protokoll, aber machen die dissection schwieriger.

2. Dissection des Zentralnervensystems

  1. An einem einzigen Objektträger aus Glas, erstellen Sie zwei Pools von 50 ml warmem Seziersaal Medien von etwa 3 cm getrennt. Ein Pool wird für grobe Zerlegung und andere für die Fein Dissektion (Abbildung 1C) verwendet werden.
  2. Transfer mehrere Larven einem der Medientropfen.
  3. Bewegen Sie das Deckglas mit Larven auf einem Binokular. Zoom in den Pool mit den Larven, so dass die vorderen und hinteren Enden der Larven sind erkennbar.
  4. Verwenden Sie ein Paar Zangen, um den mittleren Bereich einer einzigen Larve erfassen. Nehmen Sie eine zweite Zange in der anderen Hand und fassen die Larve in der Nähe der gleichen Region. Ziehen Sie die beiden Pinzetten auseinander reißen, um sanft die Larve in der Hälfte. Wiederholen Sie die obigen beiden Schritte für alle Larven auf dem Deckglas.
  5. Entsorgen der hinteren Hälften der Larvenkörper durch Übertragung auf ein Gewebe.
  6. Zoom in eine Larve, so dass the vorderen mouthhooks sind deutlich sichtbar. Mit beiden Zangenpaaren, um einen kleinen Einschnitt oder eine Kerbe, die auf gegenüberliegenden Seiten der Larven mouthhooks zwischen dem dritten und ersten vorderen Brust denticle Bands zu schaffen.
  7. Fassen Sie die mouthhooks mit der Zange in der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die Zange in der anderen Hand, um vorsichtig abziehen Nagelhaut in einer anterior-to-posterior-Richtung. Fahren Sie langsam abziehen Nagelhaut, bis das zentrale Nervensystem ausgesetzt ist.
  8. Isolieren des zentralen Nervensystems von dem Rest der Larve durch Reißen Gewebe mit der Zange. Seien Sie vorsichtig, nicht auf das zentrale Nervensystem stören.
    Critical Schritt: auf das zentrale Nervensystem zu zerren Sie nicht! Entsorgen Sie beschädigte Proben mit einem zerrissenen Bauchmark (2A) oder verzerrten optischen Loben (2B und 2B ').
  9. Wiederholen Sie die obigen beiden Schritte für alle Larven auf dem Deckglas. Übertragen Sie das gesunde Gewebe explantiert, um dieSekunden (clean) Pool von Medium auf dem Deckglas für die Fein Dissektion der Bühne.
  10. Verwenden Sie die Werkzeuge, um Sezieren Stift aus dem Gehirn beseitigen die peripheren Gewebe (z. B. Augen-, Flügel-und Beinscheiben). Schieben Sie das Skalpell zwischen der wollte (Gehirn) und dem unerwünschtes Gewebe, Pinning das Bindegewebe auf die Deckgläser. Verwenden Sie den Haken, um sanft zu necken entfernt die unerwünschte Gewebe, während Sie gleichzeitig die Tasten Skalpell, um das Deckglas in Säge-ähnlichen Bewegungen.
  11. Critical Schritt: Arbeiten Sie langsam und bewusst, um alle Scheiben von jedem Gehirn zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, nicht die Morphologie des Gehirns stören. Ein gesundes Gehirn haben eine intakte Bauchmark und symmetrisch, rund optischen Loben (Abbildung 2C).

3. Montage Explantierte Gehirne für Live-Imaging

  1. Kehren Sie ein 50 mm gasdurchlässigen Kulturschale mit der Klarsichtfolie nach oben (2D). Drücken Sie die Spritze, um einen kleinen Tropfen (etwa 30 ul) Medium auf t einzahlener Mitte der Schale.
  2. Übertragen der isolierten Hirn, eine zu einem Zeitpunkt, zu dem Mediumtropfen auf dem Teller. Verwenden Sie den Haken Werkzeug aufnehmen ein Gehirn unter den optischen Loben. Alternativ können Sie Pinzette Axone aus dem Bauchmark vorstehenden erfassen.
  3. Sammeln 5-10 Gehirne in der Dropdown Medium. Tauchen Sie die Gehirne mit den Seziersaal Stift Tools, um einzelne Gehirne, um den Boden der Tropfen Medium, wie viele von ihnen vorantreiben wird am Meniskus (2E) gefangen werden.
  4. Richten Sie die Gehirne mit den Seziersaal Stift Werkzeuge, um Gehirn abhängig von der NBS, die abgebildet werden (Abbildung 3A) auszurichten. Um das Bild der dorsale BS, legen Sie das Bauchmark nach unten (entlang der Membran). Um die Bild die anterio-ventralen NBs, legen die Gehirne mit dem Bauchmark nach oben (weg von Membran). Richten Sie die Köpfe, so dass alle die ventralen Nervenstränge in die gleiche Richtung in der xy-Ebene.
  5. Verwenden Sie eine Spritze oder Kunststoffübertragung pipette bis 4 Halogenkohlenwasserstoff (HC) Öltropfen (30 &mgr; l jeweils) auf der gasdurchlässigen Membran zu platzieren. Das Volumen jeder Tropfen Öl sollte äquivalent zueinander und zu dem Mediumtropfen sein. Raum die Tropfen Öl in den vier Ecken eines Deckglases um den Tropfen Kulturmedium zentriert entsprechen. Wenn Sie fertig sind, werden die fünf Tropfen (vier Tropfen Öl und ein Tropfen des Mediums in der Mitte) die fünf Facetten auf westlichen Stil Würfel (3B) ähneln.
  6. Senken Sie # 1.5 22 mm Deckglas auf der Versammlung, dass er trifft alle 5 Tropfen in der gleichen Zeit. Aufrechterhaltung eines gleichmäßigen Druck über die Proben reduziert die Wahrscheinlichkeit, dass sie gestört werden. Warten Sie ca. 3 Minuten, da das Öl-und Mittel unter dem Gewicht des Deckglases zu zerstreuen. Eine kreuzförmige Gestalt Medien bilden (Fig. 3C und 3D).
  7. Critical Schritt: Senken Sie die Deckglas auf der Oberfläche des Gehirns, indem überschüssiges Medien mit einem Seidenpapier Docht (Figure 3C). Tun Sie dies, während Sie die Probe unter dem Binokular. Als Medium wird entfernt, wird das Deckglas zu senken. Stoppen Sie, wenn die Deck berührt die Gehirne. Nicht über-Docht da diese Gewebe Verzerrung oder Gehirn Explosionen verursachen.
  8. Wenn Bildgebung Rücken NBs (3E), gehen Sie zu Schritt 3.9. Wenn Abbildungs ​​anterio-ventralen NBs, muss die Deck leicht (durch leichtes Antippen mit Zange) in Richtung der Bauchmark Spitzen verschoben werden. Dies bewirkt, dass das Gehirn zu drehen, die die Hirnlappen bringt in direktem Kontakt mit dem Deckglas zu Bildgebung (Fig. 3F) zu erleichtern.
  9. Verschließen Sie die Kammer, die durch umlauf das Deckglas mit geringen Mengen an Halogenkohlenwasserstofföl (3D). Überschüssiges Öl sickert aus dem Deckglas sollte minimiert und mit einem Papiertuch abgetupft werden entfernt.

4. Live-Imaging von Central Brain Neuroblasten

Hinweis: Für diese Arbeit, eine Nikon Eclipse-Ti Spinnplattenkonfokalen Mikroskop (inverses Mikroskop) wurde für die Bildgebung verwendet werden; Details unserer Einrichtung haben bisher veröffentlichten 31 wurde. Alternativ kann die Probe unter Verwendung eines aufrechten System abgebildet werden.

  1. Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas montiert, direkt über den Gehirnen. Dies wird Ihnen helfen zu zentrieren das Ziel direkt über der Probe.
  2. Kritischer Schritt: Halten Gehirn bei einer konstanten Temperatur von 25 ° C Inkubator mit einer Stufe. Sanft in die Bühne positionieren Sie den Inkubator Probe montiert und decken die Kammer mit dem Deckel.
  3. Suchen zentrale Gehirn NBs Durchlicht durch die Konzentration auf den großen, runden Zellen, die in den zentralen und medialen Bereiche der optischen Loben befinden, nicht verwenden Auflicht-Fluoreszenz. Dies wird leichter mit der Praxis. Es ist sehr wichtig, um die Probe zu der geringsten Menge an Licht wie möglich freizulegen. Verschwenden Sie keine Zeit Bildgebung Gehirn, die beschädigt sind.
  4. Einmal im Ort, um schnelle Aufnahmen mit dem konfokalen zuBestimmung der richtigen Lage und Tiefe. Grenztiefe auf den ersten 10-15 um. Passen Sie bei Bedarf, und einen weiteren Testbild.
    1. Optionaler Schritt: Sammeln Sie eine Test-Film mit dem Bauchmark, um sicherzustellen, gibt es keine xy Drift. Wenn Drift erkannt wird, warten Sie 15-30 Minuten für die Probe zu begleichen. Wenn die Drift nicht in 30 min absetzen, bereiten eine neue Probe. Wichtige Drift kann in der Regel wieder auf die Zugabe von überschüssigem Öl zurückgeführt werden, oder die ungleiche Größe der Öltropfen während der Montage.
  5. Um eine axiale Drift (z-Drift) zu beseitigen verwenden eine kontinuierliche automatische Fokussierung Gerät, eine Infrarot-LED verwendet. Alternativ manuell die Brennebene zu korrigieren.
  6. Sobald ein NB von Interesse identifiziert wird, gehen Sie mit bildgebenden Regime. Wie bei allen Live-Cell-Imaging, die Menge von Laserlicht, Belichtungszeit, Kamera Binning, Objektivvergrößerung, Zeit-und / oder z-Intervall Schritt müssen alle empirisch für einen bestimmten Versuch, die Frage zu beantworten, bei der Hand optimiert werden. Das Ziel ist es, Licht Damm minimierenAlter, während immer noch nützliche Daten sammeln. Siehe Diskussion für zusätzliche Hinweise.
    1. Bild das gesamte Volumen des NB durch Sammeln von 12-14 Bildern 1 um die z-Achse angeordnet sind. Stellen Sie die Zeitauflösung, einzelne oder mehrere Zellzyklen der gleichen NB zu erfassen. Als allgemeine Richtlinie, verwenden Sie 10-30 Sekunden-Intervallen für Einzelzellzyklus-Bildgebung und 1-3 Minuten-Intervallen für mehrere Zellzyklen.
  7. Critical Schritt: Bestätigen Sie, dass die Probe durch die Überwachung der gesunden Dauer der Mitose ist. Wenn Mitose dauert mehr als 15 Minuten, gehen Sie zu einem anderen Gehirn. Ein gesundes Gehirn viele NBs im gleichen Sichtfeld zeigen läuft mehrere Runden von Mitose. Beachten Sie, dass jede Zelle Zyklus ist etwas länger als der vorherige aufgrund von Lichtschäden.
  8. Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Inkubation Kammer, und entsorgen Sie alles, aber die gasdurchlässige Kultivierung Gerichte. Mit 95% Ethanol spülen Kulturschale Oberfläche und gut wischen mit einem Tuch. Vorgang zweimal wiederholen.

    5. Vorbereitung der Gehirne für Immunfluoreszenz

    1. Sammeln 20 oder mehr explantierten Gehirn in ein 1,5 ml Röhrchen, enthaltend etwa 0,2 ml Medium, ergänzt.
    2. Entfernen Medium aus dem Rohr und spülen Gehirne einmal mit 0,5 ml PBSTx (Phosphate Buffered Saline, PBS mit 0,3% Triton X-100). Lassen Gehirn setzen sich auf dem Boden der Röhre zwischen allen Austausch von Flüssigkeit. Der Triton X-100-Detergens verwendet wird, um das Gewebe zu permeabilisieren. Spülen typischerweise in weniger als 30 sec; entfernen Sie einfach den PBSTx einmal Gehirne wurden dem Boden der Röhre angesiedelt.
    3. Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml 9% Elektronenmikroskopie Grad Para in PBSTx verdünnt. Inkubieren mit Nutation für 15 min bei Raumtemperatur.
    4. Entsorgen Fixiermittel nach gefährlichen Abfällen Vorschriften.
    5. Mit 0,5 ml PBSTx 15 min Waschen der Proben. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischen PBSTx zwei weitere Male.
    6. Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml PBT (PBS, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Tween-20). Inkubieren mit Nutation für 1 h bei Raumtemperatur. Dieser Schritt Blöcke die unspezifische Bindung des Antikörpers an das Gewebe.
    7. Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml primären Antikörper in PBT mit 4% normalem Ziegenserum (NGS) ergänzt verdünnt. Inkubieren mit Nutation über Nacht bei 4 ° C.
    8. Verwerfen oder speichern Sie die verdünnten primären Antikörpers.
    9. Mit 0,5 ml PBT 15 min Waschen der Proben. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischen PBT zwei weitere Male.
    10. Ersetzen der Lösung mit 0,5 ml des modifizierten PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20 und 4% NGS). Inkubieren mit Nutation für 1 h bei Raumtemperatur.
    11. Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml sekundären Antikörper in modifizierte PBT verdünnt. Inkubieren mit Nutation für 2 h bei Raumtemperatur.
    12. Ersetzen Sie die Lösung mit 0,5 ml PBST (PBS mit 0,1% Tween-20). Inkubieren mit Nutation für 15 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischen PBST zwei weitere Male.

    1. Die Proben vorsichtig wie ein Tropfen auf einen Objektträger übertragen, die Einschränkung der Drop nach links von der Mitte der Folie.
    2. Hinzufügen eines großen Tropfen (etwa 2 cm im Durchmesser) des Befestigungsträgers (z. B. Aqua-Poly/Mount) zu der Mitte der Folie. Vermeiden Sie den Pool der PBST, die in Richtung der linken Seite ist.
    3. Verwenden einer Pinzette, um die Gehirne aus dem Pool der PBST in den Pool der Montagemedium zu übertragen. Hinzufügen Montagemedium direkt auf die Gehirne können ihre Orientierung zu stören und sollten vermieden werden.
    4. Unter einem Lichtmikroskop, ordnen Sie die Proben in der Montage Medium mit der Seite, die abgebildet wird nach oben werden.
    5. Mit dem Objektträger unter dem Lichtmikroskop, langsam senken # 1.5 ein Deckglas auf der Oberseite der Proben. Optionaler Schritt: müssen entfernt werden kleinere Luftblasen durch leichtes Drücken auf dem Deckglas.
    6. Lassen Sie die Montagemedium für mehrere Stunden oder über Nacht polymerisieren, durch Lügen Folien flach, leicht-geschützt, bei Raumtemperatur.
    7. Die Objektträger können abgebildet werden, am nächsten Tag, oder vor der Bildgebung gespeichert.

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Representative Results

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Live-Bildgebung hat eine Reihe von Mechanismen, die NB ACD regeln aufgeklärt. Vor der Bildaufnahme ist es erforderlich, die optimalen Bilderzeugungsbedingungen zu bestimmen. Es ist notwendig, um den Rahmen Erfassungsrate mit der Dauer der Live Cell Imaging auszugleichen. Für feine Zellanalyse, zum Beispiel erhöhte zeitliche und optische Auflösung kann erforderlich sein. Bei der Visualisierung einer einzelnen NB Zellzyklus (Fig. 4A) kann die Geschwindigkeit, mit der Bilder aufgenommen werden, ohne dabei Lichtschäden erhöht. Typischerweise kann einzigen Zellteilung Ereignisse bei ca. 10-30 Sek. Zeitabständen überwacht werden. Eine Möglichkeit, die zeitliche Auflösung ohne Beschädigung Gewebe zu erhöhen ist es, die Bildaufnahmerate zu modulieren. Zum Beispiel kann Zeitraffer-Bildgebung mit einer niedrigeren Bildrate, die dann auf Beobachtung eines interessanten Feature oder Zeitpunkt (Movie 1) erhöht eingeleitet werden.

Imaging aufeinanderfolgenden Runden der Zellteilung ( (4B) durchgeführt. Wir in der Regel Bild mehrere (zwei oder mehr) Runden der ACD durch das gesamte NB Zellvolumen bei 1-3 min Zeitabständen über einen Zeitraum von 2-3 Stunden. Sowohl die zeitliche Auflösung und die Bilderfassungszeitraum kann durch Begrenzung der Menge an Licht, das die Probe trifft verbessert werden. Zum Beispiel kann Zeitraffer-Bildgebung von aufeinander NB Divisionen über 8 h verlängert, wenn nur eine einzige optische Ebene abgebildet werden. Als Auswahl besonders nützliche transgene Linien für die Untersuchung von NB ACD aufgeführt (Tabelle 1) 16, 31, 34-38.

Für die Analyse einer großen Anzahl von Proben ist es oftmals notwendig, feste NBs analysieren. Unsere Fixierung Protokoll erhält die Gesamtmorphologie des NBs und ist mit Immunfluoreszenztests (4C-4E) kompatibel. Ganze Berge festen brains kann bei geringer Vergrößerung (4C) abgebildet werden, um die gesamte Größe des Gehirns sichtbar zu machen und zu gestalten oder zu NBs zu erkennen. NBS oder deren Nachkommen GMCs im Detail sichtbar zu machen, müssen höhere Vergrößerung verwendet werden. Bei moderaten Vergrößerung (4D), können ganze NB-Linie Cluster beobachtet werden. Für detaillierte Zellanalyse wird eine höhere Vergrößerung verwendet (4E).

Figur 1
Abbildung 1. Explantation ganze Gehirne für Live-Cell-Imaging von NB ACD. A) Die Larven zentrale Nervensystem besteht aus zwei optischen Loben und ein Bauchmark. Zwei Subtypen von NBs bevöl die Optik Keule in stereotype Positionen:. Typ I (dunkelblau) und Typ II (hellblau) B) NBs ACD unterziehen. Mit jeder Zellteilung, dieNB spaltet, um die zu einem GMC geben (oder InP, nicht gezeigt) und regeneriert die NB Stammzellen. GMCs wird dividieren, um die zu zwei Neuronen geben (oder Gliazellen, nicht gezeigt). C) zwei Mikrodissektion Werkzeuge werden durch Einsetzen Sezieren Stifte in die Stifthalter zusammengebaut. Verbiegen der Pins schafft einzigartige Werkzeuge, ein Skalpell und einen Haken, die verwendet werden, um zu trennen, durchbohren, und verdrängen unerwünschtes Gewebe, ohne die zugrunde liegende Gehirn. D) Gehirne werden in einem der beiden Pools zu sezieren Medien (blaue Kreise) explantiert. Ein Pool von Medium wird verwendet, um das zentrale Nervensystem der Larven (brutto Dissektion) zu entfernen, und der andere Pool ist für Fein Mikrodissektion von peripheren Geweben aus den Gehirnen explantiert (Fein Dissektion) verwendet.

Figur 2
2. Preservation der Hirnmorphologie während Mikrodissektion. Hasty Gehirnsezierung können schwere Gewebeschäden, die (A) gerissen ventralen Nervenstränge oder (B) verzerrt optischen Loben umfasst induzieren. Noch subtiler Gewebeschäden (B ') sollte für Live Cell Imaging vermieden werden. (C) Ein Beispiel für eine gesunde Gewebeprobe für die Live-Darstellung. D) Eine optisch klare, gasdurchlässige Membran. E) Eine Sammlung von mehreren gesunden Gehirn in Kulturmedium auf eine gasdurchlässige Schale angeordnet. Diese Köpfe sind bereit, für die Mikroskopie montiert werden. Maßstab: (AC), 100 um; (D), 25 mm; (E) 1 mm.

Fig. 3
Abbildung 3. Montage Gehirne für Live Cell Imaging. A) Brains in Reihen in einem Tropfen Kulturmedium in der Mitte der Schale. B) abgeschieden Die Mediumtropfen durch Tropfen HC Öl aus etwa gleichen Volumen umgeben ausgerichtet. Die vier Tropfen Öl HC und dem zentralen Mediumtropfen ähneln die fünf Facetten der würfeln. Nachdem ein Deckglas wird auf den Tropfen Öl gesenkt wird, wird (C) ein Docht aus Kimwipe Gewebe gestaltet und verwendet werden, um überschüssige Flüssigkeit sop. D) Die Außenkante des Deckglases wird durch eine dünne Ölschicht umgeben, die Verdunstung zu stoppen der Kultivierungsmedium. Diese Köpfe sind jetzt bereit für die Mikroskopie. E und F) Die Orientierung des Gehirns in Bezug auf das Deckglas bestimmt, welche Neuroblasten für Live Cell Imaging zugänglich sind. E) Rückenneuroblasten sind durch die Anordnung der Gehirne mit der Bauchseite berühren die gasdurchlässige Membran abgebildet . F) Anterior-ventralen Neuroblasten können durch arr abgebildet werdenanging das Gehirn mit dem Rückenseite berühren die gasdurchlässige Membran und dann stieß das Deckglas, und das darunter liegende Gewebe, in Richtung der Bauchmark-Tipps. Diese Bewegung leicht kippt die optischen Loben, so dass die anterio-Rückenfläche die Deckglas, womit sich die gewünschte Bildachse in perfekter Ausrichtung (grüne Linie).

Fig. 4
Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse aus Live-Aufnahmen der Division Neuroblasten. A und B) Live-Bildgebung von NB Stammzellen Divisionen ganze Berg Vorbereitungen mit einem 40-fach, 1,3 NA Öl-Immersionsobjektiv. Sec relativ zu Beginn der Zeitraffer-A) Stills von Zeitraffer-Bildgebung aus einer einzigen Zellzyklus von einem NB, die GFP-Moesin:. Zeit auf min angezeigt(GFP-Moe). Die Aufnahmerate einer einzelnen Zellzyklus kann von Zeitraffer-Bildgebung von aufeinanderfolgenden Zellteilungszyklen von einem NB sowohl GFP-exprimierenden Moe und ein GFP-markierten Zentrosom Marker erhöht werden, um zeitliche Auflösung ohne eine Lichtschäden. B zu erhöhen) Stills. Die längeren Zeitraum mit mehreren Zellzyklen verbunden erfordert reduzierter zeitlicher Auflösung zu Lichtschäden zu vermeiden. Man beachte, dass die Zeitdauer zwischen jeder Zellteilung erhöht sich im Laufe der Abbildungs. CE) Konfokale Vorsprünge der festen Stammzellen aus whole mount Zubereitungen. C)) in allen Bild NBs auf beiden optischen Loben befindet, ist 20-facher Vergrößerung verwendet. Diese Analyse ist besonders nützlich, um die Gesamt Morphologie des Gehirns zu untersuchen und NB Zahlen (hellblau), usw. D) quantifizieren Die Mehrheit der NBs (pink) von einer einzigen optischen Loben kann mit 40-facher Vergrößerung dargestellt werden. Mikrotubuli (grün). E)

Film 1. Live-Darstellung von einem einzigen NB Zellzyklus. Zeitraffer-Bilder von einem einzigen NB Zellteilung von einem Gehirn, die GFP-Moe, um die Zelle Kortex zu beschriften. Die Bilder wurden von einer einzigen optischen Ebene bei 40-facher Vergrößerung erworben. In diesem Film wurden Bilder alle 15 Sekunden erfasst. Nach ca. 7 min der Übernahme wurde die Rate um einen Frame alle 5 Sekunden erhöht. Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

Movie 2. Live-Imaging aufeinanderfolgenden Runden of NB ACD. Zeitraffer-Bilder von einem NB läuft drei Runden der Zellteilung in einem Gehirn, die GFP-Moe und ein GFP-markierten Zentrosom-Marker. Die Bilder wurden bei 2 min Zeitabständen 60X Vergrößerung erworben. Klicken Sie hier, um Film anzusehen.

Linie Markierten Zellstruktur Fluorophor Expression / Promoter Zitat
YFP-Asterless Centriole YFP Ubiquitin Rebollo, et al. (2007) Dev. Zelle 12:. 467.
SAS6-mCherry Centriole mCherry Endogene Rusan und Peifer (2007) J. Cell Biol. 177
GFP-SAS6 Centriole GFP Endogene (BAC) Lerit und Rusan (2013) J. Cell Biol. 202:. 1013.
GFP-PACT Centriole GFP Ubiquitin Martinez-Campos et al. J. Cell Biol. 165:. 673.
GFP-SAS4 Zentrosom GFP Ubiquitin Dix und Raff (2007) Curr. Biol. 17:. 1759.
GFP-Polo Zentrosom GFP Endogene . Moutinho-Santos et al (1999) Biol. Zelle 91:. 585.
GFP-γ-Tubulin 23C Zentrosom GFP Ubiquitin Lerit und Rusan (2013) J. Cell Biol. 202:. 1013.
GFP-CENTROmin Zentrosom GFP UAS Megraw, et al. (2002) J. Sci Zelle 115:. 4707.
GFP-Spd-2 Zentrosom GFP Ubiquitin Dix und Raff (2007) Curr. Biol. 17:. 1759.
mCherry-α-Tubulin Mikrotubuli mCherry Ubiquitin Rusan und Peifer (2007) J. Cell Biol. 177:. 13.
GFP-α-Tubulin Mikrotubuli GFP Ubiquitin . Rebollo, et al (2004) PLoS Biol 2:. E8.
Jupiter-GFP ("G147") Mikrotubuli GFP Endogene Morin et al (2001) PNAS 98:.. 15050.
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H2AvD-mRFP DNA mRFP Endogene Pandey et al. (2005) J. Sci Zelle 118:. 733.
H2AvD-GFP DNA GFP Endogene Clarkson und St. (1999) DNA-Cell Biol. 18:. 457.
Moesin-GFP Kortikalen Aktin GFP Spaghettikürbis Kiehart, et al. (2000) J. Cell Biol. 149:. 471.

Tabelle 1. Eine Auswahl von nützlichen transgenen Linien für die Untersuchung von ACD. Diese Fusionskonstrukte sind besonders nützlich für die Untersuchung der Zellteilung. Sie werden routinemäßig in der NB Live-Imaging-Studien verwendet.

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Discussion

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Live-Cell-Imaging ist eine unschätzbare Ansatz verwendet werden, um die Mechanismen, die ACD von Stammzellen, die Differenzierung von Zelllinien regulieren zu studieren, und die Morphogenese von komplexen Geweben. Obwohl Forschergruppen haben in der Vergangenheit verwendet eine Vielzahl von Techniken, um NB ACD visualisieren können diese Ansätze im Allgemeinen in zwei Kategorien, die in erster Linie mit Bezug darauf, ob das Hirngewebe intakt gelassen oder dissoziiert unterschiedlich gruppiert werden.

Imaging dissoziiert NBs hat seine Vorteile. Zum einen dissoziiert NBs sind leichter zu Bild, weil sie besonders leicht zu, wie die größte (etwa 12 um Durchmesser) Zellen in einer Kulturschale zu identifizieren. Darüber hinaus wird fast alle Stammzellen, die auf einer Glasoberfläche gezüchtet werden ebenso in der Nähe des Mikroskopobjektivs in der gesamten Bildaufnahmeperiode ist. Die optische Qualität der Zeitrafferbilder wird mit der Verwendung von entweder Poly-L-Lysin oder Fibrinogen beschichtete Glas die sem induzieren verbessertei-Abflachung der Runde BS 16, 17. Ein weiterer Vorteil der dissoziierten NBs in Kultur gezüchtet Bildgebung ist die Leichtigkeit, mit Kulturmedium ausgetauscht werden kann. Sobald Zellen haften auf der beschichteten Glasoberfläche Kulturmedium mit einer beliebigen Anzahl von pharmakologischen Agonisten, Antagonisten oder immunoblockierende Antikörper usw.. hinzugefügt oder entfernt werden. Schließlich bisherigen Ansätze zur dissoziierten NBs visualisieren haben gezeigt, dass diese Technik tatsächlich zugänglich längerer Bildaufnahme 18, 19.

Dennoch sind die Nachteile Abbildungs ​​dissoziiert NBs gehören die Komplexität des Protokolls. Die meisten Methoden ausführlich lange (30-60 min) chemische Verdauung, gefolgt von einem langen Schritt Inkubation (60 min), damit verteilten Zellen absetzen und sich an die Kulturschale 17, 19.

Im Gegensatz dazu, Imaging NBs von einem intakten Gehirn bewahrt sowohl diephysiologischen Kontext und die Morphologie des Gewebes. Die Vorteile dieses Ansatzes sind die Fähigkeit, spezifische NB Linien, die in stereotypen Arrangements oder an definierten Entwicklungs mal 1 entwickeln zu identifizieren. Daher weist das vereinfachte Protokoll-Dienstprogramm, das über Untersuchungen von ACD erstreckt, da es auch für den Live-Untersuchung der Differenzierung und Morphogenese Ereignisse. Ein Nachteil dieser Methode ist jedoch die Unfähigkeit, den Austausch Kulturmedium. Daher müssen die Forscher daran interessiert, langfristige Darstellung von aufeinander folgenden Stammzell Divisionen den Ansatz (dissoziiert Primärkultur gegen ganze Berg), die ihre Anwendung am besten passt zu betrachten. Ebenso kann die Notwendigkeit für die Kultivierung Additive, wie beispielsweise Insulin oder Serum sollten empirisch basierend auf den Abbildungsbedingungen (Dauer der Bildgebung Menge an Licht, das auf die Probe, etc.) Und Versuchsanordnung bestimmt werden.

Im Allgemeinen empfehlen wir die Verwendung distanzierend NBs für Studien, in denen es notwendig ist, um die akute Reaktion des NBs auf die Einführung von kleinen Molekülen (z. B. Inhibitoren, etc.) zu bewerten, für die Hochdurchsatz-Anwendungen, wenn feine Mikrodissektion der Gehirne vielleicht zu umständlich, und für erweiterte Imaging-Studien , die die NB erfordern in physischen Kontakt mit dem Deckglas sein. Im Gegensatz dazu empfehlen wir die Verwendung intakten Gehirn für Anwendungen, bei denen es sinnvoll, Bild ist ein paar NBs aus dem gleichen Gehirn, und vor allem für Studien, dass die Anliegen der Zell-Zell-Interaktionen, Autonomie, klonalen Analyse, Zellformänderungen und andere Untersuchungen, wo der gebürtige Umgebung der Zellen wichtig ist.

Um die erfolgreiche Vorbereitung der intakten Gehirn für die Live-Darstellung zu gewährleisten, müssen einige kritische Schritte sorgfältig ausgeführt werden. Vor allem ist es notwendig zu vermeiden, dass das Gewebe zu unnötigen Trauma. Insbesondere Explantation das Gehirn und das Entfernen peripheren Gewebe sollte mit Vorsicht durchgeführt werden. Einsollte direkten Kontakt zwischen den Werkzeugen und Sezieren des Gehirns zu minimieren. Außerdem sollte man vermeiden, Zerren oder Ziehen am Gewebe des Gehirns angebracht. Falsche Handhabung kann das Gewebe leicht in zerrissenen oder verzerrt Gehirn führen. In unseren Händen, NBs von beschädigten Gehirn selten teilen. Personen, die neu in Larven Gehirnsezierung sind profitieren oft von der Beherrschung der Dissektion, bevor Sie versuchen, um Proben für die Live-Darstellung vorzubereiten.

Ein weiterer entscheidender Schritt in der Protokoll ist die Montage der Köpfe vor der Zell Bildgebung. Die richtigen Mengen der beiden Kulturmedium und HC Öl sind unerlässlich, um eine nützliche Vorbereitung abzuschließen. Obwohl es schwierig ist, um das viskose Öl HC mit einer Pipette genau zu messen, kann man das korrekte Volumen (30 ul) mit dem Auge anzunähern. Zu viel Flüssigkeit verhindert, dass das Deckglas absetzen einrastet. Häufig führt dies in den Gehirnen Bewegung auf der Oberfläche der Kulturschale. Während der Live-Bildgebung ist eine unruhige Deck evident, wenn die Gewebe Stollen oder die optischen Loben Rolle. Proben, die nicht an Ort und Stelle positioniert sind, sollten vermieden werden. Im Gegenteil, die Zugabe von zu wenig Kulturmedium oder HC Öl führt zu katastrophalen Gewebeschäden, einschließlich Burst optischen Loben. Es ist eine sorgfältige Balance zwischen der Verwendung von flüssigen Medium und genug Öl, um das Gewicht des Deckglases im Vergleich zu viel Flüssigkeit, die bewirkt, dass das Deckglas zu rutschen behandeln. Dieses Gleichgewicht wird am besten durch die Praxis gelernt. In der Regel ist es am besten, nur Bild diese Gehirne, die eine gesunde Morphologie, wie eine intakte Bauchmark und symmetrisch, rund optischen Loben haben.

Sobald die Probe ohne nachweisbare Drift montiert, die Probe am Leben zu halten wird die nächste kritische Aspekt dieses Protokolls. Dies wird am besten durch die Aufrechterhaltung der richtigen Temperatur und, was am wichtigsten ist, die Minimierung der Menge an Licht, das die Probe trifft erreicht. Die Mikroskopaufbau und die Probe sind die beiden Variablen, die den Erfolg von l regieren wirdive Cell Imaging. Hohe Qualitätsziele, Filter (~ 98% Transmission) und Kameras (zurück-Elektronenvervielfachungs verdünnt und komplementären Metall-Oxid-Halbleiter) auf der Emissionsseite wird erlauben, die Menge des Lichts, das die Probe auf der Anregungsseite trifft zu reduzieren. Es ist bekannt, daß blaues Licht (um Bild GFP) verwendete hoch Zellen toxisch. Man muss feststellen, wie viel Gesamtlicht (Gesamtbelichtungszeiten) kann eine bestimmte Probe dulden und dann verbreitet, dass die Gesamtzeit an die Dauer des Experiments. Zum Beispiel, wenn eine Probe nur tolerieren 500 Laserlicht Forderungen nach einer bestimmten Mikroskopaufbau, dann ein 50 x 10-Slice-Stacks sammeln. Diese Stacks könnte von 1 min Abstand, um eine einzige NB Zellzyklus, oder 2-3 min zu sammeln, um ~ 3 Zellzyklen zu sammeln. Darüber hinaus optimiert die Einstellungen für jeden Genotyp ist entscheidend für eine erfolgreiche Live-Bildgebung. Während der Optimierungsphase, ein guter Ausgangspunkt für die 488 nm Laserleistung ist 25-50 uW von einem 100X, 1.4 NA & ausgeh# 160; Ölimmersionsobjektiv. Schließlich muss man bestimmen, was Abbildungsbedingung richtig die Frage auf der Hand, denn es ist nicht immer der Fall, dass die modernsten bildgebenden erforderlich.

Für Experimente mit entweder lebenden oder fixierten Gewebe, Hirn montiert werden kann, um bestimmte Bild NB Linien. Zum Beispiel, um die Bild Typ-II-NBs, die stereotyp in der posterior-medialen Bereich der optischen Loben 7 wohnen, ein montieren würde das Gehirn, wie in 3E dargestellt. Da die räumlichen und zeitlichen Muster der zentralen Hirn NBs sind gut dokumentiert ein, kann man unser Protokoll zur Abbildung einer Vielzahl von spezifischen NB-Cluster unter Ausnutzung beliebige Anzahl der weithin verfügbar transgene Konstrukte, die unter allgegenwärtig exprimiert werden, oder idealerweise endogenen Promotoren zu verwenden (Tabelle 1). Dennoch linienspezifische Kennzeichnungstechnologien 20 bleiben für eine Reihe von Anwendungen nützlich.Mit festen Analyse sind Gehirne mit kleinen Schäden in der Regel akzeptabel. Darüber hinaus kann die vollständige Entfernung der peripheren Gewebe, bis gerade vor dem Einbetten in die Gehirne Montagemedium verschoben werden. Studien mit fixiertem Gewebe sind besonders nützlich, wenn eine große Anzahl von BS muss abgebildet werden.

Zusammenfassend haben Studien von NB ACD stark von der Verwendung von sowohl Live Cell Imaging und detaillierte Analyse festprofitiert. Die hier vorgestellte Protokoll Details ein Ansatz zum Drosophila-Larven für entweder live oder feste Anwendungen vorzubereiten. Wir erwarten die weitere Untersuchung der NB ACD durch detaillierte Bildgebungsstudien wird neue und spannende Ergebnisse, die unser Verständnis von Stammzellen in der Entwicklung und Krankheit voranbringen zu offenbaren. Die Anwendung von langfristigen Live-Aufnahmen von intakten Larven Gehirn hat das Potenzial, neue Einblicke in die zeitliche Abfolge der Differenzierung und Morphogenese Ereignisse, die die Entwicklung bestimmen (und degen aufzudeckenarbeit) des zentralen Nervensystems.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung an den National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) und eine Lenfant Biomedizinische Postdoctoral Fellowship an DAL ausgezeichnet unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm Sarstedt 94.6077.410 A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium Invitrogen 21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) Invitrogen 15240-062 A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. 
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long Fine Science Tools 26018-17
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle Fisher Scientific 08-965-A
Syringe filter, 0.22 μm pore size Fisher Scientific 09-719A
Syringe, 5 ml BD Biosciences 309646
Plastic transfer pipette Fisher Scientific S30467-1
Paraformaldehyde, 32% EM-grade Electron Microscopy Sciences 15714 CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Invitrogen D1306 A dye that labels DNA and is excited by UV light.

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Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).More

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).

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