Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

التصوير المباشر ل doi: 10.3791/51756 Published: July 7, 2014

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مبسطة تستخدم لإجراء التصوير الخلية الحية في سياق الدماغ اليرقات سليمة. النهج التصوير الخلية الحية لا تقدر بثمن لدراسة الخلايا الجذعية العصبية الانقسامات غير المتماثلة فضلا عن العمليات العصبية والتنموية الأخرى، كشف باستمرار الآليات التي تم تجاهلها سابقا.

Abstract

الخلايا الجذعية تقسيم غير متماثلة لتوليد خليتين ذرية غير متكافئة مع إمكانات مصير: الخلايا الجذعية تجديد الذات وخلية التفريق. نظرا أهميتها في التنمية والمرض، وفهم الآليات التي تحكم وكان انقسام الخلايا الجذعية غير المتماثلة منطقة قوية من الدراسة. لأنهم لين العريكة وراثيا والخضوع لجولات متتالية من الانقسام الخلوي عن مرة واحدة كل ساعة، والخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة، أو neuroblasts، هي النماذج التي لا غنى عنها لدراسة انقسام الخلايا الجذعية. وتقع على بعد حوالي 100 الخلايا الجذعية العصبية بالقرب من سطح كل من اثنين من فصوص الدماغ اليرقات، مما يجعل هذا النظام نموذجا مفيدا بشكل خاص للدراسات المجهر التصوير الحي. في هذا العمل، نستعرض العديد من الأساليب المستخدمة على نطاق واسع لتصور انقسامات الخلايا الجذعية، ونتناول مزايا وعيوب تلك التقنيات التي توظف فصلها مقابل أنسجة الدماغ سليمة نسبيا. نحن أيضا لدينا simplif التفاصيلبروتوكول العبوات الناسفة المستخدمة لازدراع العقول كلها من يرقات العمر الثالث للتصوير الخلايا الحية والتطبيقات تحليل الثابتة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخلايا الجذعية الحفاظ على التوازن من التمايز والتجديد الذاتي لتوليد التنوع الخلوية خلال التنمية في وقت مبكر واستبدال الخلايا التالفة في أنسجة البالغين. تنظيم هذا التوازن يمنع كلا من الخسارة والتوسع المفرط للسكان الخلايا الجذعية، التي يمكن أن تؤدي إلى تدهور الأنسجة ضارة أو تكون الأورام.

Neuroblasts (مصلحة الدولة للاحصاء) هي الخلايا الجذعية العصبية درس على نطاق واسع للنظام العصبي المركزي ذبابة الفاكهة (الشكل 1A) أن النموذج الأول خلال المراحل الجنينية 1، 2. مصلحة الدولة للاحصاء الخضوع لدورات متكررة من انقسام الخلايا غير المتماثلة (ACD) لإنتاج خليتين الحظ غير متكافئ: الخلايا الجذعية تجديد الذات وخلية التفريق. ويسترشد ACD بواسطة centrosomes، والعضيات غير الغشائي التي تكون بمثابة مراكز أنيبيب-تنظيم معظم الخلايا 3. خلال الانقسام، NB centrosomes تنظيم وتوجيه الإنقسامية المغزل بين القطبين على طول القمي، القاعدية القطبيةمحور إيتي. على الانقسام لتقسيم NB، المحددات مصير قمية التي تحدد مصير الخلايا الجذعية، والمحددات التي تحدد مصير القاعدية التمايز، وفصل في الخلايا الوليدة غير متكافئة.

في الدماغ المركزي اليرقات، نوعين من مصلحة الدولة للاحصاء يمكن التمييز بين عددهم، والموقف، عامل النسخ التعبير، والنسب الخلية (الشكل 1A) و 4-6. النوع الأول مصلحة الدولة للاحصاء هي الأكثر وفرة، وحوالي 90 منهم ملء الجانبين الأمامي والخلفي من كل الفص البصري في الدماغ 7. هذه مصلحة الدولة للاحصاء التعبير عن عامل النسخ Asense (ASE)، ويتقاسمونها مميز في واحدة NB-تجديد الذات واحد أصغر خلية الأم العقدة (GMC؛ الشكل 1B). كل GMC يخضع لتقسيم محطة واحدة لتوليد الخلايا العصبية أو اثنين الدبقية (الشكل 1B). في المقابل، فإن مصلحة الدولة للاحصاء ثماني النوع الثاني التي تعيش في الجانب الخلفي من كل الفص البصري تفتقر عاصي التعبير 5. أنها تخضع ACDلإنتاج واحد NB-تجديد الذات واحدة السلف العصبية المتوسطة (الشرطة الوطنية العراقية).

الشرطة الوطنية العراقية، في المقابل، يقسم غير متماثلة 3-5 مرات. كل من هذه النتائج انقسامات في تجديد الشرطة الوطنية العراقية وإنتاج GMC واحدة 4. بشكل جماعي، وهوية NB محددة وترتيب الزمني للGMC الولادة يؤدي إلى تنوع مذهل من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الكبار.

فهم بيولوجيا الخلايا التي ترتكز عليها NB ACD قد تحسنت إلى حد كبير من خلال استخدام تقنيات التصوير الخلية الحية. نشرت البروتوكولات المستخدمة من قبل الباحثين لمصلحة الدولة للاحصاء الصورة الحية تختلف على نطاق واسع. عموما، ومع ذلك، يمكن تجميع هذه الأساليب إلى فئتين عامة تتميز ما إذا كان غادر الدماغ سليمة اليرقات أو ميكانيكيا فصلها. كل التقنيات لها مزايا وعيوب متميزة اعتمادا على التطبيق الباحث.

تقارير مبكرة الكشف عن خلية الحية DIVI NBتنطوي بعض التوترات درجة التفكك دليل من الدماغ اليرقات. هذه البروتوكولات التفاصيل تلطيخ 8 أو 9 وبصرف النظر إغاظة الدماغ من أجل أن تنمو الثقافات الأولية على المدى القصير من مصلحة الدولة للاحصاء على coverslips الزجاج. لتحسين التصوير، وعادة ما تكون بالارض مصلحة الدولة للاحصاء مستديرة حول لل coverslips مع أي من الشرائح الزجاجية 8 أو 9 منصات الاغاروز. على الرغم من أن الخلايا بالارض تحسنت البصريات، وهذه التقنيات غالبا ما تؤدي إلى عيوب الإنقسامية NB، بما في ذلك الانحدار من ثلم الانقسام وعدم القدرة على تقسيم أكثر من مرة واحدة. لذلك، عادة ما تكون مناسبة البروتوكولات التي تشمل كلا من التفكك دليل والتشويه الجسدي من أنسجة المخ اليرقات فقط للغاية على المدى القصير (أي.، ودورة خلية واحدة أو أقل) التطبيقات. وبالمثل، وشبه السحق أو تسطيح العقول سليمة تماما بين الشرائح الزجاجية وcoverslips يحد من مرة واحدة قد تنفق التصوير عينة تعطى لفترة حوالي 30 دقيقة 10. على الرغم من هذا القيد، ثيتم استخدام النهج بنجاح ق 11-14.

الجهود التي بذلت مؤخرا لصورة حية فصلها مصلحة الدولة للاحصاء حد التشويه الجسدي من الخلايا المعزولة. هذه التقنيات هي مفيدة بشكل خاص للتطبيقات حيث أنه من الضروري للحفاظ على مزارع الخلايا لدورات انقسام الخلايا متعددة. على سبيل المثال، خلايا متناثرة من العقول فصلها يدويا قد تكون جزءا لا يتجزأ جزئيا في جلطة مصنوعة من خليط من الفيبرينوجين وثرومبين 15 للتصوير على المدى الطويل 16. بدلا من ذلك، قد تكون العقول explanted أول فصل كيميائيا مع كولاجيناز الانزيم، بجانب تعطل يدويا عن طريق مرور المتكررة من خلال طرف الماصة، ومطلي لاحقا على أطباق أسفل بولي-L-يسين المغلفة الزجاج 17 و 18. طلاء الزجاج مع الأطباق إما الفيبرينوجين أو بولي-L-يسين يعزز المرفق وطفيفة انتشار الخلايا المستديرة، تقديمهم أقرب إلى ساترة ممكن دون تحريف المادية الكبرى. في additiعلى، وهذه الأساليب تشمل زراعة مصلحة الدولة للاحصاء في المتوسطة التي قد يتم تبادلها بسهولة لتجارب اضطراب الدوائية 18. عموما، والطلاء مباشرة فرقت مصلحة الدولة للاحصاء يحسن البصريات التصوير دون التضحية قدرات التصوير على المدى الطويل. في الآونة الأخيرة، وبروتوكول اصفا زراعة على المدى الطويل من مصلحة الدولة للاحصاء تم فصلها تفصيلا 19.

ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يخلو من حدوده. وهناك العديد من المحاذير لمصلحة الدولة للاحصاء التصوير فصلها الحية. في مجال خلايا متناثرة، على سبيل المثال، فإنه من الصعب تحديد الأنساب NB محددة مكانيا التي يتم تنظيمها في الدماغ سليمة 1. وبالمثل، التمييز بين النوع الأول النوع الثاني مقابل مصلحة الدولة للاحصاء داخل الأنسجة فصلها هو أيضا تحديا دون التعبير عن استشفاف النسب أو الجينات المحورة سلالة محددة، مثل worniu-GAL4، asense-GAL80 20. على الرغم من أن هذه الجينات المحورة هي مفيدة جدا لبعض التطبيقات، فإنها لا تحد من الباحثين من تلك الجينات المحورة السابقينضغطت تحت سيطرة العنصر UAS محسن 21 وتتطلب خطط الجينية أكثر تعقيدا. الدراسات التي تهم التنمية المكانية أو الزمانية من مصلحة الدولة للاحصاء، وبالتالي، يتطلب التصوير في الجسم الحي في سياق الأنسجة سليمة.

علاوة على ذلك، من مصلحة الدولة للاحصاء الدراسات الجنينية فصلها تشير إلى أن الاتصال الجسدي من الخلايا المجاورة هو أمر حاسم لتوطين البيني من الأقطاب الرئيسية محددات 22، 23. تظهر هذه الدراسات معزولة تماما مصلحة الدولة للاحصاء لم يعد الحفاظ على محور المغزل الإنقسامية ثابتة. بدلا من ذلك، وعرض هذه الخلايا محور المغزل أكثر عشوائية وزوايا واسعة من الفصل بين براعم GMC المتعاقبة، وربما يرجع ذلك إلى فقدان قمية المواقع الجسيم المركزي 22. على الرغم من أن العلاقة بين مصلحة الدولة للاحصاء اليرقات والخلايا المجاورة لها لم تدرس على نطاق واسع، فإنه يجدر النظر أن اليرقات المكروية الخلايا الجذعية قد تؤثر على قطبية الخلية أو غيرهاالسلوكيات. للحفاظ على السياق الفسيولوجية للاليرقات مصلحة الدولة للاحصاء، ونحن ACD صورة من العقول كلها.

بالنظر إلى القيود المتأصلة المرتبطة التصوير فصلها مصلحة الدولة للاحصاء، وضعت لدينا مختبر وغيرها بروتوكولات لصورة جولات متعاقبة من NB ACD من العقول اليرقات كله. تقنيات لصورة أدمغة سليمة في كثير من الأحيان استبدال سطح جامدة من الزجاج على جانب واحد من الغرفة الثقافة مع غشاء مرن لمنع تشويه الأنسجة أو ضرر والسماح لتبادل الغازات. تنطوي على بعض الأساليب تصاعد العقول explanted في خليط من الحشرات متوسطة زراعة، ومصل، وحمض الأسكوربيك مع الهيئات الدهون معزولة عن اليرقات عشرة 24. تضاف الهيئات الدهون معزولة لأنها تفرز mitogen المعروف لتحفيز انقسام الخلايا NB 25. هذا البروتوكول يحافظ على سلامة الأنسجة لأكثر من 3 ساعة، وبالتالي، قابلة للتصوير طويلة الأجل 24، 26-28. في الآونة الأخيرة، وبروتوكول يصف خط الطولالتصوير ز الأجل من أدمغة يرقات سليمة في وجود حمض الأسكوربيك، ومصل، والهيئات الدهون وردت تفاصيلها 29. الأهم من ذلك، لأن الأنسجة لا يتم كشفها ولا يجمد، وهذا النهج هو أقل فائدة للتطبيقات حيث يتم تبادل زراعة المتوسطة (على سبيل المثال، ودراسات المخدرات، immunodepletion، الخ).

لدينا مختبر وتبسيط إعداد جبل كامل من العقول اليرقات الحية للتصوير طويلة الأجل 30، 31. والميزة الرئيسية لبروتوكول لدينا مقارنة مع الآخرين هو بساطته: ملاحظاتنا تشير لا مصل، حمض الأسكوربيك، الانسولين، ولا الأجسام الدهنية المضافة هي ضرورية لصورة جولات متعاقبة من NB ACD. على الرغم من أن المواد المضافة، مثل الانسولين، وكانت مفيدة للتصوير لفترات طويلة من الانقسامات الخلايا الجذعية والهجرة الجماعية 32 خلية في المبايض ذبابة الفاكهة 33، ويبدو أن الاستغناء عن NB ACD، كما يتكون لدينا المتوسطة التصوير من خليط بسيط من ستاndard الحشرات المتوسطة زراعة الخلايا تستكمل مع مضاد فطري للمضادات الحيوية لمنع التلوث. من خلال استخدام الأطباق ثقافة أسفل الغاز قابلة للاختراق أو الزجاج قابلة لإعادة الاستخدام، وكنا قادرين على الحفاظ على عدة جولات من المتعاقبة NB ACDs. يمكن بسهولة العينات explanted نفسه استخدامها لالمناعي وغيرها من الإجراءات مع الأنسجة الثابتة. في هذا البروتوكول، ونحن من التفصيل تشريح أدمغة يرقات سليمة، فضلا عن إعداد العقول لتحليل كل من الحية والثابتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد المواد المطلوبة لازدراع الأمخاخ الثالث الطور اليرقات

  1. وتعد الأدوات اللازمة لتسليخ مجهري.
    1. إقامة أداتين تشريح (مشرط وهوك) عن طريق وضع دبوس تشريح أول واحد في كل حامل دبوس. تأمين المسامير بإحكام باليد أو مع كماشة (الشكل 1C).
    2. استخدام زوج من ملقط القديمة لثني واحد دبوس تشريح إلى حوالي 120 درجة زاوية. القيام بذلك تحت المجهر تشريح للتأكد من أن النصف العلوي من دبوس شقة تقع عند عقد حامل دبوس في متناول اليد. وسوف تستخدم هذه الأداة كما مشرط لعقد لأسفل أو شريحة من خلال الأنسجة.
    3. استخدام زوج من ملقط القديمة لثني دبوس الثانية في هوك التي سيتم استخدامها لعقد وكشط بعيدا الأنسجة.
    4. تغطية كل أداة تشريح مع طرف ماصة لحماية الأدوات من التلف. مع الرعاية، ويمكن استخدام الأدوات بشكل جيد للتشريح إلى أجل غير مسمى. استبدال دبابيس التالفة أو المشوهة عند الضرورة.
    </ لى>
  2. إعداد تشريح المتوسطة.
    1. في نسيج الثقافة هود، وتمييع تكملة للمضادات الحيوية مضاد فطري في شنايدر زراعة المتوسطة. دوامة وسائل الإعلام لدمج الملحق.
    2. إعداد عدة 5 مل aliquots من وسائل الإعلام تستكمل. تخزين جميع وسائل الإعلام في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
    3. تدفئة قسامة 5 مل من المتوسط ​​تستكمل إلى درجة حرارة الغرفة. رسم المتوسطة إلى 5 مل حقنة معقمة وعقيمة المسمار على 0.2 ميكرون تصفية حقنة.
  3. حدد اليرقات للتشريح. استخدام مسبار تشريح لتحديد يزحفون الثالث يرقات العمر الدماغ كما ستكون اسهل لتشريح. اختياري: إيداع اليرقات على لوحة آغار العنب.
    ملاحظة: عدم استخدام قوارير مزدحمة أكثر من اللازم أو زجاجات مع "الغذاء الرطب"، وهذه تميل إلى القوة الثانية أو الأولى يرقات العمر إلى الزحف للخروج قبل الأوان.
    ملاحظة: بعض الخلفيات الوراثية يستلزم استخدام يرقات الأصغر سنا. هذا لا يؤثر على البروتوكول، ولكن لا تجعل دissection أكثر صعوبة.

2. تشريح الجهاز العصبي المركزي

  1. على شريحة زجاجية واحدة، وخلق اثنين من 50 مل من وسائل الإعلام حمامات دافئة تشريح مفصولة حوالي 3 سم. وسوف تستخدم تجمع واحد للتشريح الإجمالي والأخرى المستخدمة للتشريح غرامة (الشكل 1C).
  2. نقل العديد من اليرقات إلى واحدة من قطرات سائل الإعلام.
  3. نقل ساترة مع اليرقات إلى مجهر تشريح. التكبير في بركة تحتوي على يرقات بحيث نهايات الأمامي والخلفي من اليرقات يمكن تمييز.
  4. استخدام أزواج من ملقط لفهم منتصف المنطقة من يرقة واحدة. أخذ الزوج الثاني من ملقط في اليد الأخرى وفهم يرقة بالقرب من نفس المنطقة. سحب اثنين من أزواج من ملقط بصرف النظر المسيل للدموع بلطف اليرقة في النصف. تكرار اثنين من الخطوات المذكورة أعلاه لجميع اليرقات على ساترة.
  5. التخلص من نصفين الخلفي من الجسم اليرقات قبل نقلهم إلى الأنسجة.
  6. التكبير في يرقة بحيث الmouthhooks الأمامي الإلكترونية هي واضحة للعيان. استخدام كل من أزواج من ملقط لخلق شق صغير، أو الدرجة الأولى، على طرفي نقيض من mouthhooks اليرقات بين الصدر الثالث والأول العصابات سنينة الأمامي.
  7. فهم mouthhooks مع ملقط في يد غير المهيمنة. استخدام ملقط في اليد الأخرى لقشر بلطف بعيدا بشرة في اتجاه الأمامي إلى الخلفي. تواصل قشر ببطء بعيدا بشرة حتى يتعرض الجهاز العصبي المركزي.
  8. عزل الجهاز العصبي المركزي عن باقي اليرقة التي تمزق الأنسجة مع ملقط. توخي الحذر عدم تعكير صفو النظام العصبي المركزي.
    خطوة حاسمة: لا الساحبة على الجهاز العصبي المركزي! تجاهل العينات التالفة مع تمزق الحبل البطني العصب (الشكل 2A) أو الفصوص البصرية المشوهة (أرقام 2B 2B و').
  9. تكرار اثنين من الخطوات المذكورة أعلاه لجميع اليرقات على ساترة. نقل الأنسجة explanted صحية للالثاني (نظيفة) مجموعة من المتوسطة على ساترة للمرحلة تشريح غرامة.
  10. استخدام أدوات تشريح دبوس لازالة الأنسجة الطرفية (على سبيل المثال، العين، الجناح، والساق أسطوانة) من الدماغ. حرك مشرط بين مطلوبة (الدماغ) والأنسجة غير المرغوب فيها، تعلق في النسيج الضام إلى ساترة. استخدام الخطاف لندف بلطف بعيدا الأنسجة غير المرغوب فيها أثناء الضغط في وقت واحد مشرط لساترة في حركات مثل المنشار.
  11. خطوة حاسمة: العمل ببطء وروية لإزالة كافة الأقراص من كل الدماغ. توخي الحذر عدم تعكير صفو التشكل الدماغ. والدماغ السليم لها الحبل البطني العصب سليمة ومتماثل، الفصوص البصرية الجولة (الشكل 2C).

3. تصاعد الأمخاخ Explanted للتصوير مباشر

  1. عكس صحن الثقافة الغاز نفاذية 50 مم مع الفيلم واضحة مواجهة (الشكل 2D). كساد حقنة لإيداع قطرة صغيرة (حوالي 30 ميكرولتر) من المتوسط ​​على رانه وسط الطبق.
  2. نقل أدمغة معزولة، واحدة في كل مرة، إلى تراجع المتوسط ​​على الطبق. استخدام أداة ربط لتلقط الدماغ تحت الفص البصري. بدلا من ذلك، استخدام ملقط لفهم محاور إسقاط من الحبل البطني العصب.
  3. جمع 5-10 العقول في قطرة من المتوسط. سوف يغرق أدمغة باستخدام أدوات تشريح أدمغة دبوس لدفع الفرد إلى أسفل قطرة من المتوسطة وكثير منهم محاصرين في الغضروف المفصلي (الشكل 2E).
  4. توجيه العقول باستخدام أدوات تشريح دبوس لمحاذاة العقول تبعا لمصلحة الدولة للاحصاء ليمكن تصوير (الشكل 3A). لصورة مصلحة الدولة للاحصاء الظهرية، ووضع الحبل البطني العصب أسفل (على طول الغشاء). لصورة مصلحة الدولة للاحصاء-anterio بطني، ضع أدمغة مع الحبل البطني العصب تواجه التصاعدي (بعيدا عن غشاء). محاذاة العقول بحيث كل الحبال البطني العصب تشير في نفس الاتجاه داخل الطائرة س ص.
  5. استخدام حقنة أو نقل البلاستيك عipette لوضع 4 الهالوكربون (HC) قطرات النفط (حوالي 30 ميكرولتر لكل منهما) على الغشاء نفاذية الغاز. يجب أن يكون حجم كل قطرة من النفط تعادل بعضها البعض، وإلى تراجع المتوسط. الفضاء قطرات من الزيت لتتوافق مع أربع زوايا ساترة تتمحور حول تراجع زراعة المتوسطة. كاملة مرة واحدة، فإن قطرات خمسة (أربعة قطرات من زيت وقطرة واحدة من المتوسطة في الوسط) تشبه أوجه خمسة على النمط الغربي الزهر (الشكل 3B).
  6. خفض و# 1.5 مم 22 ساترة على التجميع بحيث يضرب جميع قطرات 5 في نفس الوقت. الحفاظ على الضغط حتى عبر عينات يقلل من احتمال أنها سوف تتعطل. انتظر حوالي 3 دقائق كما النفط والمتوسطة تفريق تحت وطأة ساترة. وهناك شكل مثل وسائل الإعلام عبر تشكيل (أرقام 3C و 3D).
  7. خطوة حاسمة: اخفض ساترة على سطح العقول عن طريق إزالة وسائل الاعلام الزائد باستخدام ورقة الفتيل الأنسجة (فيقوإعادة 3C). تفعل هذا في حين يراقب العينة تحت نطاق تشريح. كما تتم إزالة وسائل الإعلام، فإن خفض ساترة. توقف مرة واحدة ساترة تلامس العقول. لا الإفراط في الفتيل وهذا سوف يسبب تشويه نسيج الدماغ أو انفجارات.
  8. إذا الظهرية التصوير مصلحة الدولة للاحصاء (الشكل 3E)، والانتقال إلى الخطوة 3.9. إذا التصوير anterio بطني مصلحة الدولة للاحصاء، يجب أن يتم نقل ساترة قليلا (عن طريق بايعاز بلطف مع ملقط) في الاتجاه من النصائح الحبل البطني العصب. هذا يتسبب في الدماغ لتدوير، والذي يجلب فصوص المخ على اتصال مباشر مع ساترة لتسهيل التصوير (الشكل 3F).
  9. ختم الغرفة من خلال تطويق ساترة مع كميات صغيرة من النفط الهالوكربون (الشكل 3D). فائض المعروض النفطي من ناز ساترة ينبغي التقليل ونشف بعيدا مع الأنسجة.

4. تصوير لايف وسط الدماغ Neuroblasts

ملاحظة: للحصول على هذا العمل، الغزل القرص نيكون الكسوف تيتم استخدام المجهر متحد البؤر (المجهر المقلوب) للتصوير حي؛ تفاصيل الإعداد لدينا وقد نشرت سابقا 31. بدلا من ذلك، يمكن تصوير العينة باستخدام نظام تستقيم.

  1. إضافة قطرة من زيت الغمر إلى ساترة فقط فوق العقول التي شنت. وهذا سوف يساعد توسيط الهدف مباشرة فوق العينة.
  2. خطوة حاسمة: الحفاظ على العقول في درجة حرارة ثابتة من 25 درجة مئوية مع حاضنة المرحلة. وضع بلطف العينة التي شنت في حاضنة المرحلة، وتغطي الغرفة مع غطائه.
  3. تحديد مصلحة الدولة للاحصاء المركزي الدماغ باستخدام الضوء تنتقل من خلال التركيز على الخلايا الجولة الكبيرة التي تتواجد في المناطق الوسطى وسطي من الفص البصري؛ لا تستخدم برنامج التحصين الموسع ومضان. هذا يصبح أسهل مع الممارسة. من المهم جدا لفضح عينة لأقل قدر من ضوء ممكن. لا تضيعوا الوقت أدمغة التصوير التي تضررت.
  4. مرة واحدة في المكان، واتخاذ التعرض سريعة باستخدام متحد البؤر لتحديد الموقع المناسب والعمق. الحد من عمق ميكرومتر إلى 10-15 الأولى. ضبط حسب الحاجة، وتأخذ صورة اختبار آخر.
    1. خطوة اختيارية: جمع فيلم الاختبار من الحبل البطني العصب لضمان عدم وجود الانجراف س ص. إذا تم الكشف عن الانحراف، الانتظار 15-30 دقيقة للعينة لتسوية. إذا لم يستقر الانجراف في 30 دقيقة، وإعداد نموذج جديد. يمكن عادة الانجراف كبرى أن ترجع إلى إضافة الزيت الزائد، أو حجم غير متساوية من زيت قطرات أثناء التركيب.
  5. للقضاء على الانحراف المحوري (ض العائمة) استخدام جهاز التلقائي المستمر التركيز يستخدم الصمام بالأشعة تحت الحمراء. بدلا من ذلك، يدويا تصحيح البؤري.
  6. مرة واحدة يتم تحديد NB من الفائدة، والمضي قدما مع نظام التصوير. كما هو الحال مع جميع التصوير الخلية الحية، وكمية من ضوء الليزر، وقت التعرض، وكاميرا binning، التكبير الهدف، الوقت و / أو ض خطوة فاصلة ويجب علينا جميعا أن يكون الأمثل تجريبيا لإجراء تجربة معينة للإجابة على السؤال في متناول اليد. الهدف هو تقليل السد ضوءفي حين لا يزال في سن جمع بيانات مفيدة. انظر المناقشة لإرشادات إضافية.
    1. صورة وحدة التخزين بالكامل من خلال جمع NB 12-14 الصور متباعدة من قبل 1 ميكرون في محور ض. ضبط دقة الوقت لالتقاط دورات خلية واحدة أو متعددة من نفس NB. كمبدأ توجيهي عام، استخدم 10-30 ثانية لفترات واحد التصوير دورة الخلية و1-3 دقيقة فترات لدورات متعددة الخلايا.
  7. خطوة حاسمة: تأكد من أن العينة هو صحي عن طريق رصد مدة الانقسام. إذا الانقسام يحتاج إلى أكثر من 15 دقيقة، والانتقال إلى الدماغ أخرى. والدماغ السليم تظهر العديد من مصلحة الدولة للاحصاء في نفس مجال الرؤية تمر عدة جولات من الانقسام. لاحظ أن كل دورة الخلية أطول من سابقتها قليلا بسبب وقوع اضرار طفيفة.
  8. مرة واحدة التصوير اكتمال تفكيك غرفة الحضانة، وتجاهل كل شيء ولكن الأطباق زراعة الغاز نفاذية. شطف سطح الطبق الثقافة مع الايثانول 95٪ والقضاء جيدا بمنديل. كرر مرتين أخريين.

    5. إعداد العقل للالمناعي

    1. جمع 20 أو أكثر explanted العقول في أنبوب 1.5 مل تحتوي على ما يقرب من 0.2 مل من المتوسط ​​تستكمل.
    2. إزالة المتوسطة من أنبوب وشطف أدمغة مرة واحدة مع 0.5 مل PBSTx (الفوسفات مخزنة المالحة، PBS، مع 0.3٪ تريتون X-100). دعونا العقول تستقر في قاع الأنبوب بين كل تبادل السائل. يتم استخدام تريتون X-100 المنظفات لpermeabilize الأنسجة. الشطف وعادة ما يستغرق أقل من 30 ثانية؛ ببساطة إزالة PBSTx مرة واحدة وقد استقر العقول إلى أسفل الأنبوب.
    3. استبدال الحل مع 0.5 مل من 9٪ الإلكترون المجهري الصف بارافورمالدهيد مخففة في PBSTx. احتضان مع الإيماءة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. التخلص من تثبيتي وفقا للوائح النفايات الخطرة.
    5. غسل العينات مع 0.5 مل PBSTx لمدة 15 دقيقة. كرر الخطوة غسل مع PBSTx الطازجة مرتين أخريين.
    6. استبدال الحل مع 0.5 مل PBT (PBS، 1 ٪ الأبقار مصل الزلال (BSA)، و 0.1٪ توين 20). احتضان مع الإيماءة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة كتل الربط غير محدد من الأجسام المضادة للأنسجة.
    7. استبدال الحل مع 0.5 مل الأجسام المضادة الأولية مخففة في PBT تستكمل مع 4٪ مصل الماعز العادي (خ ع). احتضان مع الإيماءة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    8. تجاهل أو حفظ الأجسام المضادة الأولية مخففة.
    9. غسل العينات مع 0.5 مل PBT لمدة 15 دقيقة. كرر الخطوة غسل مع PBT الطازجة مرتين أخريين.
    10. استبدال الحل مع 0.5 مل من تعديل PBT (PBS، 2٪ BSA، 0.1٪ توين 20، و 4٪ خ ع). احتضان مع الإيماءة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    11. استبدال الحل مع 0.5 مل المخفف الضد الثانوية في PBT المعدلة. احتضان مع الإيماءة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    12. استبدال الحل مع 0.5 مل PBST (PBS مع 0.1٪ توين 20). احتضان مع الإيماءة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوة غسل مع PBST الطازجة مرتين أخريين.

    "jove_title"> 6. تصاعد عينات للالمناعي

    1. نقل بعناية عينات بمثابة قطرة على شريحة زجاجية، وتقييد هبوط نحو يسار وسط الشريحة.
    2. إضافة إلى انخفاض كبير (حوالي 2 سم في القطر) من تصاعد المتوسطة (على سبيل المثال، Aqua-Poly/Mount) إلى وسط الشريحة. تجنب تجمع من PBST التي هي نحو اليسار.
    3. استخدام ملقط لنقل أدمغة من تجمع إلى تجمع PBST من تصاعد المتوسطة. مضيفا تصاعد المتوسطة مباشرة على الجزء العلوي من العقول قد يعطل ميولهم ويجب تجنبها.
    4. تحت المجهر الخفيفة، وترتيب العينات في المتوسطة المتزايدة مع الجانب الذي سيتم تصويره مواجهة.
    5. مع الشريحة تحت المجهر الضوئي، وانخفاض ببطء الزجاج ساترة # 1.5 على أعلى من العينات. خطوة اختيارية: طرد فقاعات الهواء طفيفة عن طريق دفع برفق على ساترة.
    6. تسمح المتوسطة المتزايدة للبلمرة لعدة ساعات، أو بين عشية وضحاها، من خلال الكذب الشرائح المسطحة، وخفيفةالمحمية في درجة حرارة الغرفة.
    7. الشرائح ويمكن تصويرها في اليوم التالي، أو تخزينها قبل التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد أوضحت التصوير الحي عددا من الآليات التي تنظم NB ACD. قبل الحصول على الصور، فمن الضروري لتحديد ظروف التصوير المثلى. فمن الضروري لتحقيق التوازن في معدل التقاط الإطار مع مدة التصوير الخلية الحية. لتحليل الخلوية الجميلة، على سبيل المثال، زيادة الزمانية وربما تكون هناك حاجة القرار البصرية. عندما تصور دورة الخلية NB واحد (الشكل 4A)، ويمكن زيادة المعدل الذي يتم التقاط الصور دون إدخال photodamage. عادة، يمكن رصد الأحداث انقسام الخلايا واحد في حوالي 10-30 فترات زمنية ثانية. طريقة واحدة لزيادة القرار الزماني دون الإضرار الأنسجة لتعديل معدل الحصول على الصور. على سبيل المثال، يمكن الشروع الوقت الفاصل بين التصوير في انخفاض معدل الإطار، والتي يتم بعد ذلك زيادة على المراقبة من ميزة مثيرة للاهتمام أو نقطة زمنية (فيلم 1).

التصوير جولات متعاقبة من انقسام الخلايا ( (الشكل 4B). نحن عادة صورة متعددة (اثنين أو أكثر) جولات من ACD من خلال حجم الخلية بأكملها في NB 1-3 فترات زمنية دقيقة على مدى فترة من 2-3 ساعة. يمكن تحسين كل من القرار الزماني وفترة اقتناء التصوير عن طريق الحد من كمية الضوء التي تصل العينة. على سبيل المثال، الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسامات المتتالية NB يجوز تمديد ما يزيد على 8 ساعات إذا تم تصويرها فقط طائرة البصرية واحد. يتم سرد مجموعة مختارة من خطوط المعدلة وراثيا مفيدة بشكل خاص لدراسة NB ACD (الجدول 1) 16، 31، 34-38.

لتحليل عدد كبير من العينات، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لتحليل مصلحة الدولة للاحصاء ثابت. بروتوكول تثبيت دينا يحافظ على التشكل العام للمصلحة الدولة للاحصاء ومتوافق مع المقايسات المناعي (أرقام 4C-4E). كله الدماغ جبل ثابتقد يمكن تصوير نانوثانية في التكبير المنخفض (الشكل 4C) لتصور الحجم الكلي الدماغ وشكل أو للكشف عن مصلحة الدولة للاحصاء. لتصور مصلحة الدولة للاحصاء أو شهامة ذريتها في مزيد من التفاصيل، ويجب أن تستخدم أعلى التكبير. في التكبير المعتدلة (الشكل 4D)، ويمكن ملاحظة بأكمله مجموعات NB النسب. لتحليل مفصل الخلوية، يتم استخدام أعلى التكبير (الشكل 4E).

الشكل 1
الشكل 1. Explanting أدمغة كامل لتصوير الخلايا الحية من NB ACD. A) ويتكون الجهاز العصبي المركزي اليرقات من فصين البصرية والحبل البطني العصب. نوعين فرعيين من مصلحة الدولة للاحصاء ملء الفص البصري في المواقف النمطية: النوع الأول (الأزرق الداكن) والنوع الثاني (الضوء الأزرق) ب) مصلحة الدولة للاحصاء الخضوع ACD. مع كل انقسام الخلايا، ويشق NB تثير GMC واحد (أو الشرطة الوطنية العراقية، لا تظهر) وتجدد الخلايا الجذعية NB. سوف شهامة تقسيم تثير اثنين الخلايا العصبية (أو الدبقية، لا تظهر). C) ويتم تجميع اثنين من الأدوات تسليخ مجهري عن طريق إدراج دبابيس تشريح في أصحاب دبوس. وexplanted الانحناء دبابيس يخلق أدوات فريدة من نوعها، مشرط وربط، والتي تستخدم لقطع، بيرس، وتهجير الأنسجة غير المرغوب فيها دون الإضرار الدماغ الكامنة. D) الأمخاخ في واحدة من اثنين من حمامات وسائل الإعلام تشريح (الدوائر الزرقاء). ويستخدم واحد مجموعة من متوسطة إلى إزالة الجهاز العصبي المركزي من يرقات (تشريح الإجمالي)، ويستخدم حمام السباحة أخرى لتسليخ مجهري غرامة من الأنسجة الطرفية من أدمغة explanted (تشريح غرامة).

الرقم 2
الشكل 2. Preservأوجه من الدماغ أثناء التشكل تسليخ مجهري. تشريح الدماغ يمكن المتسرعة لحث تلف الأنسجة الشديدة التي تشمل (A) التي مزقتها الحبال البطني العصب أو (B) مشوهة الفصوص البصرية. وينبغي تجنب حتى أكثر مكرا تلف الأنسجة (B ') لتصوير الخلايا الحية. (C) مثال لعينة الأنسجة السليمة مناسبة للتصوير الحية. د)، والغاز نفاذية الغشاء واضحة بصريا. E) مجموعة من عدة أدمغة الأصحاء مرتبة في زراعة المتوسطة على طبق الغاز نفاذية. هذه العقول هي جاهزة للتحميل للفحص المجهري. شريط النطاق: (AC)، و 100 ميكرومتر؛ (D)، 25 مم؛ (E) 1 مم.

الرقم 3
الرقم 3. تركيب العقول لتصوير الخلايا الحية. أ) الدماغيتم محاذاة ق في الصفوف داخل قطرة من زراعة المتوسطة المودعة في وسط الطبق. B) ويحيط قطرة من المتوسط ​​عن طريق قطرات من زيت HC من حجم مساو تقريبا. قطرات من زيت أربعة HC وانخفاض المركزية متوسطة تشبه خمسة جوانب يلعب النرد. بعد خفض ساترة على قطرات من الزيت، والطراز (C) الفتيل من الأنسجة KimWipe وتستخدم لاسترضاء تصل السوائل الزائدة. D) وطوقت الحافة الخارجية للساترة بطبقة رقيقة من النفط لوقف التبخر من المتوسطة زراعة. هذه العقول هي الآن جاهزة للفحص المجهري. E و F) وتوجه النسبي الدماغ إلى ساترة يحدد neuroblasts يمكن الوصول إليها للتصوير الخلايا الحية. يتم تصوير E) neuroblasts الظهرية عن طريق ترتيب أدمغة مع الجانب البطني لمس غشاء منفذ الغاز . F) يمكن تصوير neuroblasts الأمامي-البطني عن طريق آرanging أدمغة مع الجانب الظهري لمس غشاء منفذ الغاز ثم بايعاز ساترة، والأنسجة الكامنة، في الاتجاه من النصائح الحبل البطني العصب. هذه الحركة يميل قليلا الفصوص البصرية مثل أن الاتصالات سطح anterio الظهرية ساترة، وبذلك يصبح محور التصوير المطلوب في محاذاة الكمال (الخط الأخضر).

الرقم 4
الشكل 4. ممثل النتائج من التصوير المباشر لتقسيم neuroblasts. ألف وباء) التصوير لايف من NB وقف الانقسامات الخلوية في الأعمال التحضيرية جبل بأكمله باستخدام 40X، NA 1.3 هدف النفط الغمر. يتم عرض الوقت ودقيقة: ثانية نسبة إلى بداية الوقت الفاصل بين A) اللقطات من الوقت الفاصل بين التصوير من دورة خلية واحدة من NB-Moesin معربا عن GFP.(GFP-مو). ويمكن زيادة معدل الحصول على الصور من دورة خلية واحدة لتعزيز القرار الزماني دون التسبب photodamage. B) اللقطات من الوقت الفاصل بين التصوير دورات انقسام الخلايا المتعاقبة من NB-GFP التعبير عن كل مو وعلامة الجسيم المركزي GFP المسمى. لفترة طويلة المرتبطة دورات متعددة الخلية يتطلب القرار الزماني لتجنب انخفاض photodamage. لاحظ أن طول الفترة الزمنية بين كل الزيادات في انقسام الخلايا أثناء التصوير. CE) التوقعات متحد البؤر الخلايا الجذعية ثابت من الاستعدادات جبل بأكمله. C)) إلى صورة عن مصلحة الدولة للاحصاء تقع على كلا الفصين البصرية، ويستخدم 20X التكبير. هذا التحليل مفيد بشكل خاص لدراسة مورفولوجية الدماغ الشامل وتحديد أرقام NB (الضوء الأزرق)، وغيرها. D) غالبية مصلحة الدولة للاحصاء (الوردي) من الفص البصري واحد يمكن تصور مع 40X التكبير. الأنابيب الدقيقة، (الخضراء). E)

الفيلم 1. التصوير لايف من دورة الخلية NB احد. الصور الوقت الفاصل بين لانقسام الخلايا NB واحد من الدماغ معربا عن GFP-مو لتسمية قشرة الخلية. تم الحصول على الصور من طائرة بصري 40X التكبير في واحد. في هذا الفيلم، والإطارات الملتقطة كل 15 ثانية. بعد حوالي 7 دقائق من الاستحواذ، وارتفعت نسبة إلى إطار واحد كل 5 ثوانى. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.

الفيلم 2. التصوير لايف جولات متتالية سو NB ACD. الصور في الوقت مضي NB تمر ثلاث جولات من انقسام الخلايا في الدماغ معربا عن GFP-مو وعلامة الجسيم المركزي GFP المسمى. تم الحصول على صور في 2 فترات زمنية دقيقة في 60X التكبير. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.

خط وصفت الهيكل الخلوي Fluorophore التعبير / المروج الاقتباس
YFP-Asterless مريكز YFP اليوبيكويتين Rebollo، وآخرون (2007) ديف. خلية 12: 467.
SAS6-mCherry مريكز mCherry الذاتية Rusan وPeifer (2007) J. بيول الخلية. 177
GFP-SAS6 مريكز GFP الذاتية (BAC) Lerit وRusan (2013) J. بيول خلية 202: 1013.
GFP-PACT مريكز GFP اليوبيكويتين مارتينيز كامبوس، وآخرون. J. بيول خلية 165: 673.
GFP-SAS4 الجسيم المركزي GFP اليوبيكويتين ديكس وراف (2007) بالعملة. بيول 17: 1759.
GFP بولو الجسيم المركزي GFP الذاتية . موتينيو سانتوس، وآخرون (1999) خلية بيول 91: 585.
GFP-γ-23C تويولين الجسيم المركزي GFP اليوبيكويتين Lerit وRusan (2013) J. بيول خلية 202: 1013.
GFP-Centrosoدقيقة الجسيم المركزي GFP UAS Megraw، وآخرون (2002) J. الخلية العلوم 115: 4707.
GFP-SPD-2 الجسيم المركزي GFP اليوبيكويتين ديكس وراف (2007) بالعملة. بيول 17: 1759.
mCherry α-تويولين ميكروتثبول mCherry اليوبيكويتين Rusan وPeifer (2007) J. بيول خلية 177: 13.
GFP-α-تويولين ميكروتثبول GFP اليوبيكويتين . Rebollo، وآخرون (2004) بلوس بيول 2: E8.
جوبيتر-GFP ("G147") ميكروتثبول GFP الذاتية موران، وآخرون (2001) PNAS 98:. 15050.
mCherry-كوكب المشتري أنيبيبق mCherry UAS Cabernard والفلاني (2009) ديف. خلية 17: 134.
H2AvD-mRFP DNA mRFP الذاتية باندي، وآخرون (2005) J. الخلية العلوم 118: 733.
H2AvD-GFP الحمض النووي GFP الذاتية كلاركسون، وسانت (1999) بيول DNA الخلية 18: 457.
Moesin-GFP الأكتين القشرية GFP الاسكواش السباغيتي Kiehart، وآخرون (2000) J. بيول خلية 149: 471.

الجدول 1. مجموعة مختارة من خطوط المعدلة وراثيا مفيدة للدراسة ACD. هذه التركيبات الانصهار هي مفيدة بشكل خاص لدراسة انقسام الخلية. يتم استخدامها بشكل روتيني في الدراسات NB التصوير الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التصوير الخلية الحية هو نهج لا تقدر بثمن تستخدم لدراسة الآليات التي تنظم ACD من الخلايا الجذعية، وتمايز الخلايا الأنساب، والتشكل من أنسجة معقدة. على الرغم من أن المجموعات البحثية قد استخدمت تاريخيا مجموعة متنوعة من التقنيات لتصور NB ACD، هذه النهج يمكن تصنيفها بصفة عامة إلى فئتين التي تختلف في المقام الأول فيما يتعلق ما إذا كان يتم ترك أنسجة المخ سليمة أو فصلها.

فصل التصوير مصلحة الدولة للاحصاء مزاياه. لأحد، وفصلها مصلحة الدولة للاحصاء هي أسهل للصورة لأنها سهلة وخاصة لتحديد كأكبر (حوالي 12 ميكرون في القطر) خلايا في طبق زراعة. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا الجذعية كلها تقريبا التي يتم تربيتها على سطح الزجاج تكون قريبة بالتساوي على الهدف المجهر طوال فترة الحصول على الصور. تحسين نوعية البصرية من الوقت الفاصل بين الصور كذلك مع استخدام إما بولي-L-يسين أو الفيبرينوجين الزجاج المطلي للحث على وزارة شؤون المرأةط تسطيح الجولة مصلحة الدولة للاحصاء 16، 17. ميزة أخرى لمصلحة الدولة للاحصاء التصوير فصلها نمت في الثقافة هو السهولة التي يمكن تبادلها زراعة المتوسطة. مرة واحدة خلايا التمسك سطح الزجاج المطلي، زراعة المتوسطة تحتوي على أي عدد من منبهات الدوائية، الخصوم، أو الأجسام المضادة immunoblocking، الخ. ويمكن إضافة أو إزالة. أخيرا، أثبتت النهج الأخيرة لتصور مصلحة الدولة للاحصاء فصلها أن هذا الأسلوب هو، في الواقع، قابلة لللفترات طويلة الحصول على الصور 18، 19.

مع ذلك، نأت مساوئ التصوير وتشمل مصلحة الدولة للاحصاء تعقيد البروتوكول. معظم وسائل التفصيل طويلة (30-60 دقيقة) الهضم الكيميائي، تليها خطوة حضانة طويلة (60 دقيقة) للسماح للخلايا مشتتة لتسوية والتمسك طبق زراعة 17، 19.

في المقابل، مصلحة الدولة للاحصاء التصوير من الدماغ سليمة يحفظ كل منسياق الفسيولوجية والتشكل من الأنسجة. وتشمل مزايا لهذا النهج القدرة على تحديد الأنساب NB المحددة التي تتطور في الترتيبات النمطية أو في أوقات محددة التنموية 1. لذلك، لدينا بروتوكول مبسطة لديه الأداة التي تتجاوز دراسات ACD، كما أنه يسمح أيضا للتحقيق حية من التمايز والتشكل الأحداث. عيب واحد إلى هذا الأسلوب، ومع ذلك، هو عدم القدرة على تبادل زراعة المتوسطة. لذلك، يجب أن الباحثين المهتمين في مجال التصوير على المدى الطويل من الانقسامات الخلايا الجذعية المتعاقبة النظر في النهج (الثقافة الأولية فصلها مقابل جبل بأكمله) الذي يناسب تطبيقها. وبالمثل، على ضرورة زراعة المضافة، مثل الأنسولين أو مصل، وينبغي أن تحدد تجريبيا يعتمد على الظروف التصوير (مدة التصوير، وكمية الضوء ضرب العينة، الخ.) والإعداد التجريبية.

بشكل عام، ونحن نوصي باستخدام فصلمصلحة الدولة للاحصاء د للدراسات حيث أنه من الضروري لتقييم استجابة حادة من مصلحة الدولة للاحصاء لإدخال جزيئات صغيرة (على سبيل المثال، مثبطات، الخ.)، للتطبيقات عالية الإنتاجية عندما تسليخ مجهري غرامة قدرها العقول قد تكون مرهقة جدا، وللدراسات التصوير المتقدمة التي تتطلب NB ليكون في اتصال جسدي مع ساترة. في المقابل، فإننا نوصي باستخدام العقول سليمة للتطبيقات حيث أنه من المفيد أن الصورة بضعة مصلحة الدولة للاحصاء من نفس الدماغ، وخاصة بالنسبة للدراسات أن التفاعلات خلية خلية القلق، والاستقلال الذاتي، والتحليل نسيلي، يتغير شكل الخلية، والتحقيقات الأخرى حيث الأم البيئة من الخلايا هو المهم.

لضمان الإعداد الناجح للأدمغة سليمة للتصوير الحية، العديد من الخطوات الحاسمة يجب أن يتم تنفيذ بعناية. قبل كل شيء، لا بد من تجنب تعريض الأنسجة لصدمة لا لزوم لها. على وجه التحديد، explanting الدماغ وإزالة الأنسجة الطرفية يجب أن يتم تنفيذ بحذر. واحديجب تقليل الاتصال المباشر بين أدوات تشريح والدماغ. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي للمرء تجنب التجاذبات أو سحب على الأنسجة التي تعلق على الدماغ. يمكن أن سوء الأنسجة يؤدي بسهولة في العقول ممزقة أو مشوهة. في أيدينا، مصلحة الدولة للاحصاء من العقول التالفة نادرا ما تفرق. الأفراد الذين هم جديدة لتشريح الدماغ اليرقات غالبا ما تستفيد من اتقان تشريح قبل محاولة إعداد العينات للتصوير الحية.

آخر خطوة حاسمة في البروتوكول هو تركيب من العقول قبل أن يعيش التصوير الخلية. وحدات التخزين الصحيح لكلا المتوسطة زراعة والنفط HC ضرورية لإكمال إعداد مفيدة. على الرغم من أنه من الصعب قياس دقيق للزج النفط HC مع الماصة، يمكن للمرء الاقتراب من حجم الصحيح (حوالي 30 ميكرولتر) من خلال العين. الكثير من السائل يمنع ساترة من الاستقرار في المكان. في كثير من الأحيان، وهذا يؤدي في أدمغة تتحرك على سطح الطبق زراعة. خلال التصوير الحي، وساترة غير المستقرة هو مؤشر الضعف الاقتصاديدنت عندما الانجرافات الأنسجة أو فصوص رول البصرية. وينبغي تجنب العينات التي لم يتم وضعه في المكان. على العكس من ذلك، مضيفا القليل جدا أو متوسطة زراعة النتائج HC النفط في تلف الأنسجة كارثية، بما في ذلك انفجار الفصوص البصرية. هناك توازن دقيق بين استخدام ما يكفي من النفط السائل والمتوسطة للتعامل مع الوزن ساترة مقابل استخدام الكثير من السوائل، والذي يسبب ساترة إلى الشريحة. هو أفضل تعلمت هذا التوازن من خلال الممارسة. بشكل عام، فمن الأفضل أن الصورة فقط تلك العقول التي لديها مورفولوجيا صحية، مثل الحبل البطني العصب سليمة ومتناظرة، الفصوص البصرية الجولة.

مرة واحدة هي التي شنت على عينة من دون الانجراف كشفها، والحفاظ على عينة قيد الحياة يصبح الجانب الحاسم القادم من هذا البروتوكول. وأفضل طريقة لتحقيق ذلك من خلال الحفاظ على درجة حرارة مناسبة، والأهم، والتقليل من كمية الضوء التي تصل العينة. الإعداد المجهر والعينة نوعان من المتغيرات التي ستحكم نجاح لإيف التصوير الخلية. سوف أهداف عالية الجودة، والمرشحات (~ نقل 98٪)، والكاميرات (الإلكترون ضعفت العودة التكاثر والتكميلية أكسيد المعدن أشباه الموصلات) على الجانب الانبعاثات تسمح لأحد أن يقلل من كمية الضوء التي تصل العينة على الجانب الإثارة. ومن المعروف جيدا أن الضوء الأزرق (التي تستخدم لصورة GFP) شديد السمية للخلايا. يجب على المرء تحديد مقدار ضوء الإجمالي (مجموع مرات التعرض) لنموذج معين يمكن أن يتسامح ثم انتشرت ذلك الوقت مجموع طول مدة التجربة. على سبيل المثال، إذا كان العينة لا تتحمل سوى 500 التعرض ضوء الليزر على أساس الإعداد المجهر وجه الخصوص، ثم يمكن للمرء أن جمع 50 مداخن × 10 شريحة. يمكن متباعدة هذه أكوام من قبل 1 دقيقة لجمع دورة الخلية NB واحد، أو 2-3 دقيقة لجمع ~ 3 دورات الخلية. بالإضافة إلى ذلك، تحسين إعدادات لكل الوراثي هو أمر حاسم لتصوير حي ناجحة. خلال الفترة الأمثل، وهذه نقطة انطلاق جيدة ل488 نانومتر قوة الليزر هو 25-50 μW المنبثقة من 100X، NA 1.4 و# 160؛ الهدف النفط الغمر. أخيرا، لا بد من تحديد ما هي حالة التصوير سوف يجيب بشكل صحيح في هذه المسألة في متناول اليد، كما هو الحال دائما أن هناك حاجة إلى التصوير الأكثر تطورا.

لإجراء التجارب مع الأنسجة إما حية أو ثابتة، قد يتم تنظيمها العقول وذلك لصورة الأنساب NB محددة. على سبيل المثال، من أجل مصلحة الدولة للاحصاء نوع الصورة الثانية، التي تتواجد نمطية في المنطقة الخلفي الإنسي من الفص البصري فإن المرء جبل العقول، كما هو موضح في الشكل 3E. لأن النمط المكاني والزماني لمصلحة الدولة للاحصاء الدماغ المركزي قد تم توثيقه جيدا يمكن للمرء استخدام بروتوكول لدينا لصورة مجموعة متنوعة من مجموعات محددة NB مع استخدام أي عدد من بنيات المعدلة وراثيا على نطاق واسع أن يتم التعبير تحت كل مكان، أو من الناحية المثالية، المروجين الذاتية (الجدول 1). مع ذلك، وتكنولوجيات وضع العلامات نسب محددة 20 تبقى مفيدة لعدد من التطبيقات.مع تحليل الثابتة، والعقول مع أضرار طفيفة مقبولة عموما. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تأجيل إزالة كاملة من الأنسجة الطرفية حتى قبل تضمين العقول في تصاعد المتوسط. الدراسات مع الأنسجة الثابتة هي مفيدة بشكل خاص عندما يجب تصوير أعداد كبيرة من مصلحة الدولة للاحصاء.

في الختام، دراسات NB ACD استفادت كثيرا من استخدام كلا التصوير الخلية الحية وتحليل مفصل الثابتة. بروتوكول المذكورة هنا تفاصيل نهج واحد لإعداد يرقات ذبابة الفاكهة لتطبيقات إما حية أو الثابتة. نتوقع أن التحقيق المستمر للNB ACD من خلال دراسات مفصلة تكشف رواية التصوير والنتائج المثيرة التي سوف تقدم فهمنا للخلايا الجذعية في التنمية والمرض. تطبيق التصوير الحية على المدى الطويل من أدمغة يرقات سليمة لديه القدرة على كشف رؤى جديدة في التسلسل الزمني للالتمايز والتشكل الأحداث التي تحكم التنمية (وديجينالمساع) الجهاز العصبي المركزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل قسم الأبحاث جماعية في المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI (1ZIAHL006126) والطبية الحيوية زمالة ما بعد الدكتوراه Lenfant منحت لDAL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm Sarstedt 94.6077.410 A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium Invitrogen 21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) Invitrogen 15240-062 A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. 
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long Fine Science Tools 26018-17
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle Fisher Scientific 08-965-A
Syringe filter, 0.22 μm pore size Fisher Scientific 09-719A
Syringe, 5 ml BD Biosciences 309646
Plastic transfer pipette Fisher Scientific S30467-1
Paraformaldehyde, 32% EM-grade Electron Microscopy Sciences 15714 CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Invitrogen D1306 A dye that labels DNA and is excited by UV light.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
  2. Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
  3. Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
  4. Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
  5. Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
  6. Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
  7. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  8. Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
  9. Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
  10. Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
  11. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
  12. Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
  13. Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
  14. Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
  15. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
  16. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
  17. Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
  18. Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
  19. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
  20. Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  22. Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
  23. Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
  24. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
  25. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
  26. Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
  27. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
  28. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
  29. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
  30. Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
  31. Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
  32. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
  33. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
  34. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
  35. Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
  36. Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
  37. Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
  38. Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).
التصوير المباشر ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات Neuroblasts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).More

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter