Summary
Denne protokol beskriver en strømlinet metode, der anvendes til at udføre levende celler i forbindelse med en intakt larve hjerne. Live-cell imaging metoder er uvurderlig for studiet af asymmetriske neurale stamceller divisioner samt andre neurogene og udviklingsprocesser, konsekvent afdække mekanismer, der tidligere blev overset.
Abstract
Stamceller opdele asymmetrisk at generere to afkom celler med ulige skæbne potentiale en selvfornyende stamcelle og en differentierende celle. I betragtning af deres relevans for udvikling og sygdom, at forstå de mekanismer, der styrer asymmetriske stamceller division har været et robust område af undersøgelsen. Fordi de er genetisk medgørlig og gennemgå successive runder af celledeling om én gang hver time, stamceller fra Drosophila centralnervesystemet eller neuroblasts, er uundværlige modeller for studiet af stamceller division. Omkring 100 neurale stamceller er placeret nær overfladen af hver af de to larve hjernen lapper, hvilket gør dette modelsystem særligt anvendelige til direkte billeddannelse mikroskopi studier. I dette arbejde, vi gennemgå flere tilgange i vid udstrækning anvendes til at visualisere stamceller celledelinger, og vi tager fat de relative fordele og ulemper ved de teknikker, som anvender dissocieres versus intakte hjernevæv. Vi har også detalje vores simplifIED protokol, der bruges til at eksplanteres hele hjerner fra tredje stadie larver for levende celler og applikationer faste analyse.
Introduction
Stamceller opretholde en balance af differentiering og selvfornyelse at generere cellulær mangfoldighed i den tidlige udvikling og udskift beskadigede celler i voksent væv. Regulering af denne homeostase forhindrer både tab og over-ekspansion af stamceller befolkning, hvilket kan resultere i skadelige vævsdegenerering eller tumorigenese.
Neuroblasts (NBS) er de i vid udstrækning undersøgte neurale stamceller Drosophila centralnervesystemet (figur 1A), der først dannes under fosterstadiet 1, 2. NBs gennemgå gentagne runder af asymmetrisk celledeling (ACD) til at producere to ulige skæbnesvangre celler: en selvfornyende stamceller og en differentierende celle. ACD er styret af centrosomes, ikke-hindeagtige organeller, der fungerer som de mikrotubuli-organiserende centre i de fleste celler 3.. Under mitosen, NB centrosomes organisere og orientere bipolar mitotiske spindel langs den apikale-basal polarhed akse. Ved spaltning af dividere NB, apikale skæbne determinanter, der angiver stamceller skæbne og basale skæbne determinanter, der angiver differentiering er adskilt i de ulige datter celler.
I larvestadiet centrale hjernen, kan to typer NBS adskiller sig ved deres antal, placering, transskription faktor udtryk, og celleafstamning (figur 1A) 4-6. Type I NBs er den mest udbredte, og omkring 90 af dem befolke anteriore og posteriore sider af hver optik lap af hjernen 7. Disse NBs udtrykke transkriptionsfaktoren aSense (ASE), og de typisk opdele i en selvfornyende NB og en mindre ganglion mor celle (GMC, figur 1B). Hver GMC gennemgår en enkelt terminal division at generere to neuroner eller glia (figur 1B). I modsætning hertil otte type II NBs der befolker den bageste side af hvert optisk lap mangler Ase udtrykket 5. De gennemgår ACDat producere en selvfornyende NB og en mellemliggende neurale stamfader (INP).
INP gengæld sig asymmetrisk tre til fem gange. Hver af disse divisioner resulterer i regenerering af INP og produktionen af en enkelt GMC 4. Kollektivt specifikke NB identitet og den tidsmæssige rækkefølge af GMC fødsel giver anledning til forbløffende neuronal mangfoldighed voksne centralnervesystemet.
Forstå cellebiologi der ligger til grund NB ACD er blevet kraftigt forbedret gennem brug af levende celle imaging teknikker. Udgivet protokoller, der bruges af forskere til billede levende NBs varierer meget. Samlet, men disse metoder kan inddeles i to overordnede kategorier kendetegnet ved, om den larve hjerne efterlades intakt eller mekanisk dissocieret. Begge teknikker har forskellige fordele og ulemper afhængig af forskerens ansøgning.
Tidlige rapporter afslører levende NB celle udbyttemelser indebærer en vis grad af manuel dissociation af larvestadiet hjernen. Disse protokoller detalje smearing 8 eller drille hinanden 9 hjernen for at vokse på kort sigt primære kulturer af NBS på dækglas. For at forbedre billeddannelse, er de runde NBs normalt fladtrykt på dækglas med enten glasslides 8 eller agarose puder 9. Selv flade celler har forbedret optik disse teknikker ofte føre til NB mitotiske mangler, herunder regression af spaltning fure og den manglende evne til at opdele mere end én gang. Derfor er protokoller, der involverer både manuel dissociation og fysisk forvrængning af larvestadiet hjernevæv normalt kun velegnet til meget kort sigt (dvs.., En cellecyklus eller mindre) programmer. Ligeledes semi-Squashing eller helt udfladning intakte hjerner mellem glasslides og dækglas begrænser den tid, man kan tilbringe billeddannelse en given prøve til en ca 30 min periode 10. På trods af denne begrænsning, This tilgang er blevet anvendt med succes 11-14.
Seneste bestræbelser på at billedet levende dissocieret NBs grænse fysisk forvridning af de isolerede celler. Disse teknikker er særligt nyttige til anvendelser, hvor det er nødvendigt for at opretholde cellekulturer til flere celledeling cyklusser. For eksempel kan dispergerede celler fra manuelt dissocierede hjerner være delvist indlejret i en blodprop lavet af en blanding af fibrinogen og thrombin 15 til langsigtet billeddannelse 16. Alternativt kan eksplanterede hjerner være første kemisk dissocieret med enzymet collagenase næste manuelt afbrudt ved gentagen passage gennem en pipettespids, og derefter udpladet på poly-L-lysin-coatede glasbund retter 17, 18. Coating glasskåle med enten fibrinogen eller poly-L-lysin fremmer fastgørelsen og let spredning af runde celler, hvilket bringer dem så tæt på dækglasset som muligt uden store fysiske forvrængning. I additipå disse metoder involverer dyrkning NBS i medium, som let kan udskiftes med farmakologiske perturbations forsøg 18. Samlet direkte plating spredt NBs forbedrer imaging optik uden at ofre langsigtede billeddannelse kapaciteter. For nylig har en protokol, der beskriver den langsigtede dyrkning af dissocieret NBs været detaljerede 19.
Men denne fremgangsmåde er ikke uden begrænsninger. Der er flere advarsler billeddannelse levende dissocierede NBs. I et felt af dispergerede celler, for eksempel, er det vanskeligt at identificere specifikke NB slægter, der er rumligt organiseret i den intakte hjerne 1. Ligeledes skelne type I versus type II NBs inden dissocieret væv er også udfordrende uden udtryk for slægt sporstoffer eller subtypespecifik transgener, såsom worniu-GAL4, aSense-GAL80 20. Selv om disse transgener er ganske nyttigt for nogle programmer, de begrænser forskere til dem transgener extrykkes under kontrol af UAS enhancerelement 21 og kræver mere komplekse genetiske skemaer. Undersøgelser, der vedrører den rumlige eller tidsmæssige udvikling NBS kræver derfor in vivo billeddannelse i forbindelse med en intakt væv.
Desuden undersøgelser af dissocierede embryonale NBs indikerer, at den fysiske kontakt af tilstødende celler er afgørende for interfase lokalisering af nøgle polaritet determinanter 22, 23. Disse undersøgelser viser helt isoleret NBs ikke længere fastholde den invariante mitotiske spindel akse. I stedet viser disse celler en mere randomiserede spindelaksen og brede vinkler af adskillelse mellem successive GMC knopper, måske på grund af tabet af apikale centrosome positionering 22. Selvom forholdet mellem larvernes NBs og deres omkringliggende celler ikke er blevet grundigt undersøgt, er det værd at overveje at larve stamceller mikromiljø kan krænkes celle polaritet eller andetadfærd. For at opretholde den fysiologiske sammenhæng larve NBS vi billede ACD fra hele hjerner.
I betragtning af de iboende begrænsninger, der er forbundet med billedbehandling dissocieret bemyndigede organer, har vores laboratorium, og andre etablerede protokoller til billede successive runder af NB ACD fra hele larve hjerner. Teknikker til billede intakte hjerner ofte erstatter den stive overflade af glas på den ene side af kulturen kammer med en fleksibel membran for at forhindre væv eller beskadigelse, og giver mulighed for gasudveksling. Nogle fremgangsmåder involverer montering eksplanterede hjerner i en blanding af insekt dyrkningsmedium, serum og ascorbinsyre med fedt organer isoleret fra ti larver 24. De isolerede fedt organer er tilføjet, fordi de udskiller et mitogen kendt for at stimulere NB celledeling 25. Denne protokol bevarer integriteten af vævet i over 3 timer, og er derfor egnede til langvarig billeddannelse 24. 26-28. For nylig, en protokol, der beskriver long sigt billeddannelse af intakte larvestadium hjerner i nærværelse af ascorbinsyre, serum og fedt organer er beskrevet 29. Vigtigt er det, fordi vævet er hverken udsættes eller immobiliseret, denne metode er mindre nyttigt for applikationer, hvor dyrkning medium udveksles (fx undersøgelser narkotika, immunodepletion osv.).
Vores laboratorium har forenklet hele mount forberedelse af levende larve hjerner for langsigtet billeddannelse 30, 31. Den største fordel ved at vores protokol over andre er dets enkelhed: vores observationer indikerer hverken serum, ascorbinsyre, insulin, ej heller fedt organer er nødvendige tilsætningsstoffer til billede successive runder af NB ACD. Selvom tilsætningsstoffer, såsom insulin, har været nyttige for den forlængede billeddannelse af stamceller celledelinger 32 og kollektiv celle migration i Drosophila æggestokke 33, de synes at være undværlig til NB ACD, som vores billeddannende medium består af en simpel blanding af standard insekt celledyrkning medium suppleret med antibiotika-antimykotikum at forhindre forurening. Gennem brug af genanvendelige gas-gennemtrængelige eller glasbund kultur retter, har vi været i stand til at opretholde flere runder af successive NB ACD'er. De samme eksplanterede prøver kan let bruges til immunfluorescens og andre procedurer med faste væv. I denne protokol, vi detalje dissektion af intakte larve hjerner, samt udarbejdelse af hjerner for både live og fast analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af Nødvendige materialer til Eksplanter tredje stadie larve Brains
- Forbered værktøjer der kræves for mikrodissektion.
- Forge to dissekere værktøjer (en skalpel og en krog) ved først at placere en enkelt dissekere pin i hver pin holderen. Fastgør benene stramt i hånden eller med en tang (figur 1C).
- Brug et par gamle tænger til at bøje en dissekere pin til en ca 120 ° vinkel. Gør dette under et dissektionsmikroskop for at sikre, at den øverste halvdel af stiften ligger fladt, når kegleholderens holdes i hånden. Dette værktøj vil blive brugt som en skalpel til at holde ned eller skære gennem væv.
- Brug et par gamle pincet til at bøje den anden stift ind i en krog, der vil blive anvendt til at holde og skrabes væk væv.
- Dæk hver dissektionsinstrument med en pipettespids til at beskytte de værktøjer fra skader. Med omhu, kan velformede værktøj skal bruges til dissektion på ubestemt tid. Udskift beskadigede eller deformerede ben som nødvendigt.
- Forbered dissekere medium.
- I en vævskultur hætte, fortyndes antibiotikum-antimykotikum supplement til Schneiders dyrkning medium. Swirl medierne til at indarbejde tillægget.
- Forbered flere 5 ml portioner af de suppleret medier. Opbevar alle medier ved 4 ° C, indtil klar til brug.
- Varm en 5 ml alikvot af suppleret medium til stuetemperatur. Tegn mediet i en steril 5 ml sprøjte og skru på en steril 0,2 um sprøjtefilter.
- Vælg larver til dissektion. Brug en dissekere sonde til at vælge kravlende tredje stadie larver som hjernen vil være nemmest at dissekere. Valgfrit: depositum larver på en drue agarplade.
Bemærk: Brug ikke overdrevent overfyldt hætteglas eller flasker med "våd mad," som disse har tendens til at tvinge anden eller første stadie larver at kravle ud for tidligt.
Bemærk: Nogle genetiske baggrunde vil nødvendiggøre bruge yngre larver. Dette påvirker ikke protokollen, men gør dissection vanskeligere.
2.. Dissektion af det centrale nervesystem
- På en enkelt glasplade, skal du oprette to 50 ml puljer af varme Dissecting medier adskilt af omkring 3 cm. Én pulje vil blive brugt til grov dissektion og andre bruges til fin dissektion (figur 1C).
- Overfør flere larver til en af de medier dråber.
- Flyt dækglasset med larver et dissektionsmikroskop. Ind i puljen indeholdende larver, således at de forreste og bageste ender af larver er mærkbar.
- Brug en par pincet til at gribe den midt-regionen af et enkelt larve. Tag en anden pincet i den anden hånd og gribe larve tæt på samme region. Træk de to par tænger hinanden forsigtigt rive larve i halve. Gentag de to ovenstående trin for alle larver på dækglasset.
- Bortskaf den bageste halvdele af larve legeme ved at overføre dem til en væv.
- Zoom ind i en larve, så the anterior mouthhooks er klart synlige. Brug begge par pincet til at skabe et lille snit eller hak, på modsatte sider af larvernes mouthhooks mellem tredje thorax og første anterior denticle bands.
- Tag fat i mouthhooks med pincet i den ikke-dominerende hånd. Brug pincet i den anden hånd til forsigtigt at skrælle væk kutikula i en forreste-til-bageste retning. Fortsæt til langsomt trække væk kutikula indtil det centrale nervesystem er udsat for.
- Isoler det centrale nervesystem fra resten af larve ved at rive væv med pincet. Vær forsigtig ikke at forstyrre det centrale nervesystem.
Kritisk skridt: Træk ikke på det centrale nervesystem! Kassér beskadigede prøver med et iturevet ventrale nerve ledning (figur 2A) eller forvrængede optiske lapper (figur 2B og 2B). - Gentag de to ovenstående trin for alle larver på dækglasset. Overfør den sunde eksplanterede væv tilsekund (ren) pulje af medium på dækglasset for den fine dissektion scenen.
- Brug dissekere pin værktøjer til at fjerne de perifere væv (f.eks øjet, fløj, og ben-diske) fra hjernen. Skub skalpel mellem det ønskede (hjernen) og den uønskede væv, pinning bindevævet til dækglas. Brug krogen til forsigtigt at drille væk den uønskede væv samtidig trykker på skalpellen til dækglasset i saw-lignende bevægelser.
- Kritisk skridt: Arbejd langsomt og bevidst at fjerne alle diske fra hver hjerne. Vær forsigtig ikke at forstyrre hjernens morfologi. En sund hjerne vil have en intakt ventrale nerve ledning og symmetrisk, runde optiske lapper (figur 2C).
3.. Montering eksplanterede Brains til Live Imaging
- Vend en 50 mm gas-gennemtrængelige kultur skål med klar folie opad (figur 2D). Tryk sprøjten til at deponere en lille dråbe (ca. 30 ul) i medium på than midten af skålen.
- Overfør isolerede hjerne, en ad gangen, til dråbe medium på skålen. Brug krogen værktøj til at øse op en hjerne under de optiske lapper. Alternativt kan du bruge pincet til at gribe axoner der rager ud fra den ventrale nerve ledningen.
- Saml 5-10 hjerner i drop medium. Nedsænk hjerner ved hjælp af dissekere pin værktøjer til at skubbe de enkelte hjerner til bunden af faldet i mediet, da mange af dem vil blive fanget på menisken (Figur 2E).
- Vend hjerner ved hjælp af dissekere pin værktøjer til at tilpasse hjerner afhængigt af NBS, der skal afbildes (figur 3A). Til billedet ryggens NBs placere ventrale nerve ledningen nedad (langs membranen). Til billede anterio-ventrale NBs placere hjerner med den ventrale nerve ledningen opad (væk fra membran). Juster hjerner, således at alle de ventrale nerve snore peger i samme retning inden for xy-planet.
- Brug en sprøjte eller plast overførsel pipette at placere 4 halogencarbon (HC) oliedråber (ca. 30 ul hver) på gas-gennemtrængelige membran. Mængden af hver dråbe olie bør svare til hinanden og til drop medium. Space dråber af olie til at svare til de fire hjørner af et dækglas centreret omkring dråbe dyrkning medium. Når du er færdig, vil de fem dråber (fire dråber olie og en dråbe af medium i midten) ligne de fem facetter på vestlig terninger (figur 3B).
- Sænk en # 1.5 22 mm dækglas på samlingen, således at det rammer alle 5 dråber på samme tid. Opretholdelse af et jævnt tryk over prøverne reducerer sandsynligheden for, at de vil blive forstyrret. Vent omkring 3 min som olie-og medium spredes under vægten af dækglasset. Et kryds-lignende form for medier vil danne (figurerne 3C og 3D).
- Kritiske trin: Sænk dækglasset på overfladen af hjerner ved at fjerne overskydende medie ved hjælp af en silkepapir væge (Figure 3C). Gør dette, mens du ser prøven under den dissekere omfang. Som medie er fjernet, vil dækglasset sænkes. Stop når dækglasset rører hjerner. Må ikke over-væge da dette vil medføre vævsdistortion eller hjerne eksplosioner.
- Hvis imaging dorsale NBs (figur 3E), gå til trin 3.9. Hvis billedbehandling anterio-ventrale NBs skal dækglasset være lidt flyttes (ved forsigtigt nudging det med en pincet) i retning af de ventrale nerve ledningen tips. Dette får hjernen til at rotere, hvilket bringer hjernen lapper i direkte berøring med dækglasset for at lette billeddannelse (figur 3F).
- Forsegle kammeret ved omkranser dækglasset med små mængder af halogencarbon olie (figur 3D). Overskydende olie siver fra dækglasset bør minimeres, og duppes væk med en serviet.
4.. Levende Imaging for Central Brain neuroblasts
Bemærk: For dette arbejde, et Nikon Eclipse Ti spinning-diskkonfokal mikroskop (inverteret mikroskop) blev anvendt til direkte billedvisning; oplysninger om vores setup har tidligere været offentliggjort 31. Alternativt kan prøven, der skal afbildes ved hjælp af en opretstående system.
- Tilføj en dråbe immersionsolie til dækglasset lige over de monterede hjerner. Dette vil hjælpe centrere målet direkte over prøven.
- Kritisk skridt: Oprethold hjerner ved en konstant temperatur på 25 ° C med en scene inkubator. Forsigtigt placere monterede prøven i scenen kuvøse og dække kammeret med låget.
- Find centrale hjerne NBs hjælp transmitteret lys ved at fokusere på de store, runde celler, der findes i de centrale og mediale områder af optiske lapper, brug ikke epi-fluorescens. Det bliver nemmere med praksis. Det er meget vigtigt at eksponere prøven til den mindste mængde lys som muligt. Spild ikke tiden imaging hjerner, der er beskadiget.
- Når først på plads, tage hurtige eksponeringer ved hjælp af konfokal tilbestemme ordentlig placering og dybde. Begræns dybde til den første 10-15 um. Juster efter behov, og tage en anden test billede.
- Valgfrit trin: Saml en test film af ventrale nerve ledning for at sikre, at der ikke er nogen xy afdrift. Hvis der registreres afdrift, vente 15-30 min for prøven for at bosætte sig. Hvis afdrift ikke bosætte sig i 30 minutter, forberede en ny prøve. Major afdrift kan normalt spores tilbage til tilsætning af overskydende olie, eller den ulige størrelse oliedråber under monteringen.
- For at eliminere aksiale afdrift (z-drift) bruger en kontinuerlig automatisk fokusering enhed, der bruger en infrarød LED. Alternativt manuelt korrigere brændplanet.
- Når en NB af interesse er identificeret, fortsætte med billedbehandling regime. Som med alle levende celler, mængden af laserlys, eksponeringstid, kamera binning, objektiv forstørrelse, tid og / eller z-trins interval skal alle være empirisk optimeret til et bestemt eksperiment for at besvare spørgsmålet ved hånden. Målet er at minimere lys dæmningalder, mens du stadig at indsamle brugbare data. Se diskussion for yderligere vejledning.
- Billede hele mængden af NB ved at indsamle 12-14 billeder fordelt med 1 um i z-aksen. Juster tidsopløsning til at fange en enkelt eller flere cellecykler af samme NB. Som en generel retningslinje, bruger 10-30 sek intervaller for enkelt celle cyklus billedbehandling og 1-3 min intervaller for flere cellecykler.
- Kritisk trin: Kontroller, at prøven er sundt ved at overvåge varigheden af mitose. Hvis mitose tager mere end 15 min, gå videre til en anden hjerne. En sund hjerne vil vise mange NBs inden for samme synsfelt undergår flere runder af mitose. Bemærk, at hver celle cyklus er lidt længere end den foregående grund lysskade.
- Når billeddannelse er færdig, adskille rugekammeret, og kassere alt, men gas-gennemtrængelige dyrkning retter. Skyl dyrkningsskålen overflade med 95% ethanol og tørres godt med en serviet. Gentag to gange mere.
5.. Udarbejdelse af Brains for Immunofluorescence
- Saml 20 eller flere eksplanterede hjerner i et 1,5 ml rør indeholdende ca 0,2 ml suppleret medium.
- Fjern mediet fra røret og skyl hjerner gang med 0,5 ml PBSTx (phosphatbufret saltvand, PBS med 0,3% Triton X-100). Lad hjerner afregne til bunden af røret mellem alle udvekslinger af væske. Triton X-100 detergent anvendes til at permeabilisere væv. Skylning tager typisk mindre end 30 sek; blot fjerne PBSTx engang hjerner har afgjort til bunden af røret.
- Udskift opløsningen med 0,5 ml 9% elektronmikroskopi klasse paraformaldehyd fortyndet i PBSTx. Inkuberes med nutationen i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Bortskaf fiksativ i henhold til farligt regler affald.
- Vask prøverne med 0,5 ml PBSTx i 15 min. Gentag vasketrinet med frisk PBSTx to gange mere.
- Udskift opløsningen med 0,5 ml PBT (PBS, 1% Bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% Tween-20). Inkuberes med nutationen i 1 time ved stuetemperatur. Dette trin blokerer specifik binding af antistof til væv.
- Udskift opløsningen med 0,5 ml primært antistof fortyndet i PBT suppleret med 4% normalt gedeserum (NGS). Inkuberes med nutationen natten over ved 4 ° C.
- Kasser eller gemme den fortyndede primære antistof.
- Vask prøverne med 0,5 ml PBT i 15 min. Gentag vasketrinet med frisk PBT to gange mere.
- Udskift opløsningen med 0,5 ml modificeret PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20, og 4% NGS). Inkuberes med nutationen i 1 time ved stuetemperatur.
- Udskift opløsningen med 0,5 ml sekundært antistof fortyndet i modificerede PBT. Inkuberes med nutationen i 2 timer ved stuetemperatur.
- Udskift opløsningen med 0,5 ml PBST (PBS med 0,1% Tween-20). Inkuberes med nutationen i 15 minutter ved stuetemperatur. Gentag vasketrinet med frisk PBST to gange mere.
- Overføre forsigtigt prøverne som en dråbe på en glasplade, der begrænser drop mod venstre for midten af dias.
- Læg et stort fald (ca. 2 cm i diameter) til montering af medium (for eksempel Aqua-Poly/Mount) til centrum af objektglasset. Undgå puljen PBST, der er mod venstre.
- Brug pincet til at overføre hjerner fra puljen PBST til puljen til montering medium. Tilføjelse montering medium direkte på toppen af hjerner kan forstyrre deres orientering og bør undgås.
- Under et lysmikroskop, arrangere prøver montering medium med den side, der vil blive afbildet opad.
- Med dias under lysmikroskop, langsomt sænke en # 1.5 dækglas oven på prøverne. Valgfrit trin: Frigør mindre luftbobler ved let at trykke på dækglasset.
- Lad monteringsmedium til at polymerisere i flere timer, eller natten over ved liggende dias flad, letbeskyttet ved stuetemperatur.
- Slides kan blive afbildet næste dag, eller oplagres til billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-imaging har belyst en række mekanismer, der regulerer NB ACD. Forud for billede erhvervelse, er det nødvendigt at bestemme de optimale billeddiagnostiske forhold. Det er nødvendigt at skabe balance mellem frame capture rate med varigheden af levende celler. For fine celleanalyse, for eksempel forøget tidsmæssig og kan være påkrævet optisk opløsning. Når visualisere et enkelt NB cellecyklus (figur 4A), kan den hastighed, hvormed indfanges øges uden at indføre solskader. Typisk kan en enkelt celle division hændelser skal overvåges ca 10-30 sek tidsintervaller. En måde at øge den tidsmæssige opløsning uden at beskadige væv er at modulere billede erhvervelse sats. For eksempel, kan der indledes time-lapse billeddannelse ved en lavere frame rate, som derefter forøget ved observation af en interessant træk eller tidspunkt (film 1).
Imaging successive runder af celledeling (
Til analyse af et stort antal prøver, er det ofte nødvendigt at analysere faste NBs. Vores fiksering protokol bevarer den overordnede morfologi af NBS og er forenelig med immunfluorescens-assays (figur 4C-4E). Hele mount fast brains kan afbildes ved lav forstørrelse (figur 4C) at visualisere den samlede hjernens størrelse og form eller for at afsløre NBs. At visualisere NBs eller deres afkom GMC mere detaljeret, skal større forstørrelse anvendes. Ved moderat forstørrelse (figur 4D), kan hele NB afstamning klynger overholdes. For detaljeret cellulær analyse, højere forstørrelse anvendes (Figur 4E).
Figur 1.. Eksplanteres hele hjerner for levende celler af NB ACD. A) larvestadiet centralnervesystemet består af to optiske lapper og en ventral nerve ledning. To undertyper NBS befolker den optiske lap i stereotype holdninger:. Type I (mørk blå) og type II (lyseblå) B) NBs gennemgå ACD. Med hver celledeling, denNB spalter at give anledning til en GMC (eller INP, ikke vist) og regenererer NB stamcelle. GMC vil splitte at give anledning til to neuroner (eller glia, ikke vist). C) To mikrodissektions værktøjer samles ved at indsætte dissekere stifter i kegleholderne. Bøje nedenfor skaber unikke værktøjer, en skalpel og en krog, som bruges til at skille, gennembore og fortrænge uønsket væv uden at beskadige den underliggende hjerne. D) Hjernerne eksplanteret i en af to puljer af dissekere medier (blå cirkler). En pulje af medium anvendes til at fjerne det centrale nervesystem fra larver (grov dissektion), og den anden pool er bruges til finjustering mikrodissektion af perifere væv fra eksplanterede hjerner (fint dissektion).
Figur 2. Preservation af hjernens morfologi under mikrodissektion. Hasty hjerne dissektion kan fremkalde alvorlige vævsskader, der omfatter (A) revet ventrale nerve ledninger eller (B) forvrænget optiske lapper. Endnu mere subtile vævsskade (B ') bør undgås for levende celler. (C) Et eksempel på en sund vævsprøve egnet til levende billeder. D) En optisk klar, gasgennemtrængelig membran. E) en samling af flere sunde hjerner arrangeret i dyrkning af medium på en gaspermeabel skålen. Disse hjerner er klar til at blive monteret til mikroskopi. Scale bar: (AC), 100 m; (D), 25 mm; (E) 1 mm.
Figur 3.. Montering hjerner for levende celler. A) Brains er bragt i rækker i en dråbe dyrkningsmediet deponeret i midten af skålen. B) Faldet i medium omgivet af dråber af HC olie omtrent lige volumen. De fire dråber HC olie og den centrale dråbe medium ligne de fem facetter af at spille terninger. Efter et dækglas sænkes ned dråber af olie, er (C) en væge dannet af Kimwipe væv og anvendes til at opsuge overskydende væske. D) Den udvendige kant af dækglasset er omgivet af et tyndt lag olie for at stoppe fordampningen af dyrkningsmediet. Disse hjerner er nu klar til mikroskopi. E og F) Orienteringen af hjernen i forhold til dækglasset bestemmer, hvilke neuroblaster er tilgængelige for levende celler. E) Dorsal neuroblaster afbildes ved at arrangere hjerner med den ventrale side rører gasgennemtrængelig membran . F) Anterior-ventrale neuroblasts kan afbildes af arr.Anging hjerner med den dorsale side rører gasgennemtrængelig membran og derefter puffer dækglasset, og det underliggende væv, i retning af ventrale nerve ledningen tips. Denne bevægelse lidt vipper de optiske lapper sådan, at anterio-dorsale overflade kontakter dækglasset, hvilket bringer den ønskede billedbehandling akse i perfekt tilpasning (grøn linie).
Figur 4.. Repræsentative resultater fra levende billeddannelse af delende neuroblasts. A og B) Levende billeddannelse af NB stamceller afdelinger i hele mount præparater ved en 40X, 1,3 NA olieimmersionsobjektiv. Tiden vises som min: sek i forhold til starten af time-lapse A) Stills fra time-lapse billeddannelse af en enkelt celle cyklus fra en NB udtrykker GFP-moesin.(GFP-Moe). Billedet købet på en enkelt celle cyklus kan øges til forbedre tidsmæssig opløsning uden at fremkalde solskader. B) Stills fra time-lapse billeddannelse af successive celledeling cykler fra en NB udtrykker både GFP-Moe og et GFP-mærket centrosome markør. Den forlængede periode er forbundet med flere cellecykler nødvendiggør reduceret tidsmæssig opløsning for at undgå solskader. Bemærk, at længden af tid mellem hver celledeling stiger i løbet af billeddannelse. CE) Konfokale fremskrivninger af faste stamceller fra hele mount forberedelser. C)), til billede alle NBs på begge optiske lapper, er 20X forstørrelse anvendes. Denne analyse er især nyttigt at undersøge den samlede hjerne morfologi og kvantificere NB-numre (lyseblå) osv. D) Størstedelen NBS (rosa) fra et enkelt optisk lap kan visualiseres med 40X forstørrelse. Mikrotubuli (grøn). E)
Movie 1. Levende billeder af en enkelt NB cellecyklus. Time-lapse billeder af en enkelt NB celledeling fra en hjerne udtrykker GFP-Moe til at mærke den celle cortex. Billeder blev erhvervet fra en enkelt optisk plan på 40X forstørrelse. I denne film blev rammer fanget hvert 15. sek. Efter omkring 7 min for erhvervelsen blev steg til ét billede hvert 5. sek. Klik her for at se filmen.
Movie 2. Live-billeddannelse successive runder of NB ACD. Time-lapse billeder af en NB gennemgår tre runder af celledeling i en hjerne, der udtrykker GFP-Moe og et GFP-mærket centrosome markør. Billederne blev optaget på 2 min tidsintervaller på 60X forstørrelse. Klik her for at se filmen.
| Linje | Mærket cellestruktur | Fluorophor | Expression / Promoter | Citation |
| YFP-Asterless | Centriole | YFP | Ubiquitin | Rebollo et al. (2007) Dev. Cell 12:. 467. |
| SAS6-mCherry | Centriole | mCherry | Endogen | Rusan og Peifer (2007) J. Cell Biol. 177 |
| GFP-SAS6 | Centriole | GFP | Endogene (AKB) | Lerit og Rusan (2013) J. Cell Bio 202:. 1013. |
| GFP-PACT | Centriole | GFP | Ubiquitin | Martínez-Campos, et al. J. Cell Bio 165:. 673. |
| GFP-SAS4 | Centrosome | GFP | Ubiquitin | Dix og Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759. |
| GFP-Polo | Centrosome | GFP | Endogen | . Moutinho-Santos, et al (1999) Biol Cell 91:. 585. |
| GFP-γ-tubulin 23C | Centrosome | GFP | Ubiquitin | Lerit og Rusan (2013) J. Cell Bio 202:. 1013. |
| GFP-Centrosomin | Centrosome | GFP | UAS | Megraw et al. (2002) J. Cell Sci 115:. 4707. |
| GFP-SPD-2 | Centrosome | GFP | Ubiquitin | Dix og Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759. |
| mCherry-α-tubulin | Mikrotubuli | mCherry | Ubiquitin | Rusan og Peifer (2007) J. Cell Bio 177:. 13.. |
| GFP-α-tubulin | Mikrotubuli | GFP | Ubiquitin | . Rebollo, et al (2004) PLoS Biol 2:. E8. |
| Jupiter-GFP ("G147") | Mikrotubuli | GFP | Endogen | Morin, et al (2001) PNAS 98:.. 15050. |
| mCherry-Jupiter | Mikrotubulis | mCherry | UAS | Cabernard og Doe (2009) Dev. Cell 17: 134. |
| H2AvD-mRFP | DNA | mRFP | Endogen | Pandey et al. (2005) J. Cell Sci 118:. 733. |
| H2AvD-GFP | DNA | GFP | Endogen | Clarkson og Saint (1999) DNA Cell Bio 18:. 457. |
| Moesin-GFP | Cortical actin | GFP | Spaghetti squash | Kiehart et al. (2000) J. Cell Biol 149:. 471. |
Tabel 1.. Et udvalg af nyttige transgene linjer for studiet af ACD. Disse fusionskonstruktioner er især nyttige til at studere celledeling. De anvendes rutinemæssigt i NB levende billeddiagnostiske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levende celler er en uvurderlig metode, der anvendes til at undersøge de mekanismer, der regulerer ACD af stamceller differentieringen af cellelinier og morfogenese af komplekse væv. Selv forskergrupper historisk har anvendt en række forskellige teknikker til at visualisere NB ACD, kan disse fremgangsmåder generelt opdeles i to kategorier, som primært adskiller sig med hensyn til, hvorvidt hjernevæv efterlades intakt eller adskilles.
Imaging dissocieret NBs har sine fordele. For én, dissocieres NBs er lettere at billedet fordi de er særligt let at identificere de største (ca. 12 um i diameter) celler i en dyrkning skålen. Desuden vil næsten alle stamceller, der er dyrket på en glasoverflade være lige så tæt på mikroskop mål i hele perioden billede erhvervelse. Den optiske kvalitet af time-lapse billeder er yderligere forbedret med brugen af enten poly-L-lysin eller fibrinogen belagt glas at inducere semi-udfladning af runde NBs 16, 17. En anden fordel til billeddannelse dissocierede NBs dyrket i kultur er den lethed, hvormed der kan udveksles dyrkning medium. Når celler holde sig til den belagte glasoverflade, dyrkning medium indeholdende en række farmakologiske agonister, antagonister eller immunoblocking antistoffer osv. kan tilføjes eller fjernes. Endelig har de seneste tilgange at visualisere dissocierede NBs vist, at denne teknik er, ja, gøres til genstand for køb langvarig billede 18, 19.
Ikke desto mindre de ulemper, billedbehandling adskilt, NBs inkluderer kompleksiteten af protokollen. De fleste metoder detalje lange (30-60 min) kemisk fordøjelse, efterfulgt af en lang inkubation (60 min) til at give spredte celler til at bosætte sig og holde sig til dyrkning fad 17, 19.
I modsætning hertil, billedbehandling NBs fra en intakt hjerne bevarer bådefysiologisk kontekst og morfologi af vævet. Fordelene ved denne fremgangsmåde omfatter evnen til at identificere specifikke NB slægter der udvikler sig i stereotype arrangementer eller på bestemte udviklingsmæssige gange 1. Derfor er vores forenklede protokol har hjælpeprogram, der strækker sig ud over studier af ACD, da det giver også mulighed for live undersøgelse af differentiering og morfogenese begivenheder. En ulempe ved denne fremgangsmåde er imidlertid den manglende evne til at udveksle dyrkning medium. Derfor skal forskere er interesserede i langsigtede billeddannelse af hinanden stamceller divisioner overveje den tilgang (dissocierede primær kultur versus hele mount) der passer bedst til deres ansøgning. Ligeledes behovet for dyrkning af additiver, såsom insulin eller serum, skal bestemmes empirisk baseret på billedbehandling (varighed billedbehandling, mængden af lys, som rammer prøven, osv.) Og forsøgsopstilling.
Generelt anbefaler vi at udnytte afstandd NBs til undersøgelser, hvor det er nødvendigt at vurdere den akutte reaktion NBS til indførelsen af små molekyler (fx inhibitorer, osv.), til high-throughput programmer, når fine mikrodissektion hjerner kan være for besværligt, og for avancerede billeddiagnostiske undersøgelser som kræver NB at være i fysisk kontakt med dækglas. I modsætning hertil anbefaler vi udnytter intakte hjerner til applikationer, hvor det er nyttigt at billedet et par NBs fra samme hjerne og især til undersøgelser, der vedrører celle-celle interaktioner, selvstændighed, klonal analyse, celle form ændringer, og andre undersøgelser, hvor den indfødte miljø af cellerne er vigtig.
For at sikre en vellykket forberedelse af intakte hjerner for levende billeddannelse, skal flere kritiske trin omhyggeligt henrettet. Fremmest er det vigtigt at undgå at udsætte vævet for unødvendige traumer. Konkret eksplanteres hjernen og fjerne perifere væv skal udføres med omhu. Énbør minimere den direkte kontakt mellem de dissekere værktøjer og hjernen. Desuden bør man undgå at rykke eller trække på væv fastgjort til hjernen. Fejlhåndtering vævet kan let resultere i iturevet eller forvrænget hjerner. I vores hænder, NBs fra beskadigede hjerner sjældent deler. Personer, der er nyt for larvernes hjerne dissektion ofte gavn af at mestre dissektion før du forsøger at forberede prøver til direkte billedvisning.
Et andet afgørende skridt i protokollen er monteringen af hjerner før leve cell imaging. De korrekte mængder af både dyrkningsmedium og HC olie er afgørende for at fuldføre et nyttigt præparat. Selv om det er vanskeligt at måle den tyktflydende HC olie med en pipette, kan man tilnærme den korrekte mængde (ca. 30 ul) af øjet. For meget væske forhindrer dækglasset fra afregning på plads. Ofte resulterer dette i hjernen bevæger sig på overfladen af dyrkningen skålen. Under Live billeddannelse, en urolig dækglas er evident når vævet driver eller den optiske lapper roll. Prøver, der ikke er anbragt på plads, bør undgås. Tværtimod tilføje for lidt dyrkningsmediet eller HC olie resulterer i katastrofale vævsbeskadigelse, herunder burst optiske lapper. Der er en forsigtig balance mellem at bruge nok flydende medium og olie til at håndtere vægten af dækglasset versus at bruge for meget væske, som forårsager dækglasset til at glide. Denne balance er bedst læres gennem praksis. Generelt er det bedst kun at billedet de hjerner, der har en sund morfologi, såsom et intakt ventrale nerve ledning og symmetriske, runde optiske lapper.
Når prøven er monteret uden påviselig afdrift, holder prøven i live bliver den næste kritisk aspekt af denne protokol. Dette opnås bedst ved at opretholde en korrekt temperatur og, vigtigst, minimere mængden af lys, som rammer prøven. Mikroskopet setup og prøven er de to variabler, der styrer succes live cell imaging. Målsætninger Høj kvalitet, filtre (~ 98% transmission) og kameraer (back-tyndet elektron multiplicere og komplementær metal-oxid halvleder) for udledningen side tillader en at reducere mængden af lys, der rammer prøven på excitation side. Det er velkendt, at blåt lys (brugt til billede GFP) er meget toksisk for celler. Man må afgøre, hvor meget den samlede lys (totale eksponering gange) en given prøve kan tolerere, og derefter sprede det samlede tid langs hele forsøget. For eksempel, hvis en prøve kan kun tåle 500 laserlys engagementer baseret på en bestemt mikroskop setup, så man kunne samle 50 x 10 slice stakke. Disse stakke kunne fordelt med 1 min til at indsamle en enkelt NB cellecyklus, eller 2-3 min at indsamle ~ 3 cellecyklusser. Hertil kommer, at optimere indstillingerne for hver genotype er afgørende for en vellykket direkte billedvisning. Under optimering periode, et godt udgangspunkt for 488 nm laser magt er 25-50 uW stammer fra en 100X, 1,4 NA &# 160; olieimmersionsobjektiv. Endelig må man afgøre, hvad imaging betingelse vil korrekt besvare spørgsmålet ved hånden, da det ikke altid er tilfældet, at der er behov for den mest sofistikerede billeddannelse.
Til forsøg med enten levende eller fikseret væv, kan være monteret hjerner så billedspecifikke NB slægter. For eksempel, for at billedet type II NBS som stereotypically bor i den posteriore-midterområdet af den optiske lap 7, ville man montere hjerne, som illustreret i figur 3E. Fordi den rumlige og tidsmæssige mønster af centrale hjerne bemyndigede organer er veldokumenteret 1 kan man bruge vores protokol til billede en lang række konkrete NB klynger, mens udnytte enhver række af de bredt tilgængelige transgene konstruktioner, der er udtrykt under allestedsnærværende eller ideelt set endogene promotorer (tabel 1). Ikke desto mindre linjespecifikt mærknings-teknologier 20 forbliver nyttige for en række applikationer.Med fast analyse hjerner med mindre skader er generelt acceptable. Endvidere kan fuldstændig fjernelse af perifere væv udsættes indtil lige før indlejring hjerner i monteringsmedium. Undersøgelser med fikseret væv er særligt anvendelige, når store antal NBS skal afbildes.
Konklusionen er, har undersøgelser af NB ACD høj grad nydt godt af brugen af både live cell imaging og detaljeret faste analyse. Protokollen beskrevet her i detaljer en fremgangsmåde til fremstilling af Drosophila larver enten levende eller faste programmer. Vi forventer en fortsat undersøgelse af NB ACD gennem detaljerede billeddiagnostiske undersøgelser vil afsløre nye og spændende resultater, der vil fremme vores forståelse af stamceller i udvikling og sygdom. Anvendelsen af langsigtede billeddannelse af intakte larve hjerner har potentiale til at afdække nye indsigter i den tidsmæssige rækkefølge af differentiering og morfogenese begivenheder, der styrer udviklingen (og Degenbejde) af det centrale nervesystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af opdelingen af intramuralt forskning på National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) og en Lenfant Biomedical Postdoc Fellowship tildelt DAL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | A high viscosity inert oil that is clear and colorless. |
| Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissecting needle/probe with plastic handle | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Syringe filter, 0.22 μm pore size | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Syringe, 5 ml | BD Biosciences | 309646 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Paraformaldehyde, 32% EM-grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | A dye that labels DNA and is excited by UV light. |
References
- Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
- Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
- Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
- Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
- Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
- Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
- Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
- Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
- Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
- Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
- Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
- Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
- Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
- Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
- Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
- Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).
