Summary
פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.
Abstract
תאי גזע מתחלקים סימטרי כדי ליצור שני תאי צאצאים עם פוטנציאל לא שוויוני גורל: תאי גזע עצמי חידוש ותא מבדל. בהתחשב את הרלוונטיות שלהם לפיתוח ומחלה, הבנת המנגנונים השולטים בחלוקת תא גזע סימטרי הייתה אזור חזק של מחקר. כי הם גנטי צייתנים ולעבור סיבובים רצופים של חלוקת תא בערך פעם בכל שעה, בתאי הגזע של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה, או neuroblasts, הם מודלים חיוניים לחקר חלוקת תא גזע. אודות 100 תאי גזע עצביים נמצאים סמוך לפני השטח של כל אחת משתי אונות מוח הזחל, מה שהופך את מערכת מודל זה שימושי במיוחד עבור מחקרי מיקרוסקופיה ההדמיה לחיות. בעבודה זו, נסקור מספר גישות בשימוש נרחב כדי להמחיש חלוקות תא גזע, ואנו פונים את היתרונות וחסרונות של אלה טכניקות שמעסיקות ניתקו לעומת רקמות מוח שלמות יחסית. אנחנו גם פירוט simplifפרוטוקול מטען המשמש לexplant מוח כולו מזחלים שלישיים instar הדמיה תא חי ויישומי ניתוח קבועים.
Introduction
תאי גזע לשמור על איזון של בידול והתחדשות עצמית כדי ליצור גיוון סלולארי במהלך התפתחות מוקדמת והחלפת תאים פגועים ברקמות בוגרות. רגולציה של הומאוסטזיס זה מונעת גם האובדן והתרחבות יתר של אוכלוסיית תאי גזע, אשר יכול לגרום לניוון רקמה מזיק או היווצרות גידול.
Neuroblasts (NBS) הם תאי הגזע העצביים למדו נרחב של מערכת דרוזופילה עצבים המרכזית (איור 1 א), כי הטופס הראשון בשלבים עובריים 1, 2. NBS לעבור סיבובים חוזרים ונשנים של חלוקת תא לא סימטרית (ACD) כדי לייצר שני תאים נגזר על איפה ואיפה: בתאי גזע עצמי חידוש ותא מבדל. ACD מונחה על ידי centrosomes, האברונים שאינם קרומיים המשמשים כמרכזי microtubule-המארגן של רוב התאים 3. במהלך מיטוזה, centrosomes NB לארגן ולכוון את ציר mitotic דו קוטבי יחד קוטב apical-הבזלייםציר ity. על המחשוף של NB החלוקה, גורמי פסגת גורל המציינים את גורל תאי גזע, וגורמי גורל בסיסיים המציינים בידול, הם הפרדה לתאי בת לא שווים.
במוח המרכזי הזחל, שני סוגים של NBS עשויים להיות מכובדים על ידי מספרם, מיקום, ביטוי גורם שעתוק, ושושלת תא (איור 1 א) 4-6. הקלד אני NBS הם הנפוץ ביותר, ועל 90 שלהם לאכלס את הצדדים הקדמי והאחוריים של כל אונה אופטית של המוח 7. NBS אלה מבטאים גורם שעתוק Asense (ASE), והם מחלקים את אופייני לNB עצמי חידוש אחד ותא אחד קטן יותר גנגליון אמא (GMC; איור 1). כל GMC עובר חטיבת מסוף יחידה ליצירת שני תאי עצב או גליה (איור 1). לעומת זאת, NBS שמונה סוג II המאכלסים את הצד האחורי של כל אונה אופטית חסר הבעת ASE 5. הם עוברים ACDכדי לייצר NB עצמי חידוש אחד ואב אחד ביניים עצביים (INP).
INP, בתורו, מחלק סימטרי שלושה עד חמש פעמים. כל אחת מתוצאות הענפים אלה בהתחדשות של INP והייצור של GMC אחת 4. באופן קולקטיבי, זהות NB הספציפית והצו הזמני של לידת GMC מולידים את הגיוון העצבי המדהים של מערכת העצבים המרכזית למבוגר.
הבנת הביולוגיה של התא שבבסיס NB ACD שופרה בהרבה באמצעות השימוש בטכניקות הדמיה תא חיות. פרוטוקולים שפורסמו בשימוש על ידי חוקרים לNBS חי התמונה משתנים במידה רבה. בסך הכל, עם זאת, שיטות אלו עשויות להיות מקובצים לשתי קטגוריות כלליות מאופיינות האם מוח הזחל נותר בשלמותה או באופן מכאני ניתק. לשניהם יש טכניקות יתרונות ברורים וחסרונות בהתאם ליישום של החוקר.
דיווחים מוקדמים חושפים divi תא NB החיהוא קונה כרוך במידה מסוימת של ניתוק הידני של מוח הזחל. פירוט פרוטוקולים אלה מריחת 8 או 9 מתגרה מלבד המוח כדי לגדול תרבויות עיקריות לטווח הקצר של NBS על coverslips זכוכית. כדי לשפר את ההדמיה, NBS העגול בדרך כלל שטוח על coverslips עם שתי שקופיות זכוכית 8 או רפידות agarose 9. למרות שתאים שטוחים השתפרו אופטיקה, טכניקות אלה לעתים קרובות להוביל לפגמים המיטוטי NB, כוללים רגרסיה של תלם המחשוף וחוסר היכולת לחלק יותר מפעם אחת. לכן, פרוטוקולים שכוללים גם ניתוק ידני ועיוות פיזית של רקמת מוח הזחל בדרך כלל מתאימים רק לטווח קצר מאוד (כלומר., מחזור תא אחד או פחות) יישומים. כמו כן, חצי מעיכה או השטחת מוח שלם בין שקופיות זכוכית coverslips לחלוטין מגבילה את הזמן אפשר לבלות הדמיה דגימה שניתנה לכ 30 דקות תקופת 10. למרות ההגבלה, thi זההגישה של נוצלה בהצלחת 11-14.
מאמצים אחרונים לחית תמונה ניתקו מגבלת NBS עיוות פיזית של התאים המבודדים. טכניקות אלה הן שימושיות במיוחד עבור יישומים בהם יש צורך לקיים בתרביות תאים למחזורי חלוקת תא מרובים. לדוגמא, תאים מפוזרים ממוחם ניתק באופן ידני עשויים להיות מוטבעים באופן חלקי בקריש עשוי מהתערובת של פיברינוגן וטרומבין 15 להדמיה לטווח ארוך 16. לחלופין, מוח explanted עשוי להיות ראשון מבחינה כימית ניתק עם collagenase האנזים, ליד שיבש באופן ידני על ידי מעבר חוזר ונשנה באמצעות pipet קצה, ומצופה לאחר מכן במנות-ליזין המצופה פולי-L זכוכית תחתונה 17, 18. ציפוי כלים מזכוכית עם או פיברינוגן או פולי-L-ליזין מקדם את הקובץ המצורף וקל התפשטות של תאים עגולים, להביא אותם קרוב לcoverslip אפשרי ללא עיוות פיזית גדולה. בadditiב, שיטות אלה כרוכים culturing NBS במדיום שניתן להחליף בקלות לניסויי הפרעות תרופתיים 18. בסך הכל, באופן ישיר ציפוי התפזר NBS משפר אופטיקה הדמיה מבלי להקריב את יכולות הדמיה לטווח ארוך. לאחרונה, פרוטוקול המתאר את culturing לטווח הארוך של NBS ניתק כבר פורט 19.
עם זאת, גישה זו אינה נטולת מגבלות. יש כמה אזהרות להדמית NBS ניתק בשידור חי. בתחום של תאים מפוזרים, למשל, קשה לזהות שושלות NB ספציפיות שמאורגנות במרחב במוח שלם 1. כמו כן, הבחנה סוג I לעומת סוג השני NBS בתוך רקמה ניתקת היא גם מאתגרת ללא הביטוי של קליעים נותבים שושלת או transgenes תת סוג ספציפי, כגון worniu-GAL4, asense-GAL80 20. למרות transgenes אלה הם די שימושיים עבור יישומים מסוימים, הם מגבילים את החוקרים ללשעבר transgenes אלהלחץ תחת שליטתו של האלמנט משפר כטב"מ 21 ודורשים תוכניות גנטיות מורכבות יותר. מחקרים הנוגעים לפיתוח המרחבי או זמני של NBS, אם כן, דורשים בתחום ההדמיה vivo בהקשר של רקמה שלמה.
יתר על כן, מחקרים של NBS העוברי ניתק מצביעים על כך שהמגע הפיזי של תאים סמוכים הוא קריטי עבור לוקליזציה ביניים של קוטביות מפתח גורמי 22, 23. מחקרים אלה מראים NBS המבודד לחלוטין כבר לא לשמור על ציר ציר mitotic בלתי משתנה. במקום זאת, תאים אלה להציג ציר ציר אקראי יותר וזוויות רחבים של הפרדה בין ניצני GMC הרצופים, אולי בשל אובדן מיצוב centrosome פסגת 22. למרות שהקשר בין NBS הזחל ותאי השכנים שלהם לא נחקר בהרחבה, זה שווה בהתחשב בכך שmicroenvironment תאי גזע הזחל עשוי פוגע בקוטביות תא או אחרתהתנהגויות. כדי לשמור על ההקשר הפיזיולוגי של NBS זחל, אנו התמונה ACD מהמוח כולו.
בהתחשב במגבלות המבניות הקשורים NBS הדמיה ניתקה, המעבדה ועוד הקימו פרוטוקולים לסיבובים רצופים תמונה של NB ACD מהמוח של זחל כולו. טכניקות למוח בשלמות תמונה לעתים קרובות להחליף את המשטח הנוקשה של זכוכית בצד אחד של חדר התרבות עם קרום גמיש כדי למנוע עיוות רקמה או נזק ולאפשר חילוף גזים. חלק מהשיטות כרוכות בהרכבת מוח explanted בתערובת של מדיום חרקים culturing, סרום, וחומצה אסקורבית עם גופי השומן מבודדים מעשרה זחלים 24. גופי השומן המבודדים מתווספים בגלל שהם מפרישים mitogen ידוע לעורר חלוקת תא NB 25. פרוטוקול זה שומר על שלמות הרקמה במשך 3 שעות, והוא, אם כן, ניתן להדמיה לטווח ארוך 24, 26-28. לאחרונה, פרוטוקול המתאר את לוןהדמיה גרם לטווח של מוח של זחל בשלמותה בנוכחות חומצה אסקורבית, סרום, וגופי שומן שפורטה 29. חשוב לציין, כי הרקמה לא נחשפה ולא משותק, גישה זו היא פחות שימושית עבור יישומים בהם בינוני culturing הוא החליף (למשל, מחקרים בסמים, immunodepletion, וכו '.).
המעבדה שלנו יש לפשט את כל הכנת הר מוחות זחל חיים להדמיה לטווח ארוך 30, ביום 31. היתרון העיקרי לפרוטוקול שלנו על פני אחרים הוא בפשטותו: התצפיות שלנו מצביעות גם בסרום, חומצה אסקורבית, אינסולין, ולא גופי שומן הם תוספים נחוצים כדי סיבובים רצופים תמונה של NB ACD. למרות שתוספים, כגון אינסולין, היו שימושיים עבור ההדמיה הממושכת של חלוקות תא גזע 32 ונדידת תאים קולקטיבית בשחלות דרוזופילה 33, הם נראים מיותרים לNB ACD, כמדיום ההדמיה שלנו מורכב מתערובת פשוטה של STAndard הבינוני culturing תא חרקים בתוספת האנטיביוטיקה antimycotic על מנת למנוע זיהום. באמצעות השימוש בכלי תרבות שימוש חוזרים גז חדיר או זכוכית תחתונה, היינו מסוגל לקיים כמה סבבים של ACDs NB רצוף. דגימות explanted אותו יכול בקלות לשמש לimmunofluorescence והליכים אחרים עם רקמה קבועה. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את הנתיחה של מוח של זחל בשלמותה, כמו גם ההכנה של מוח לניתוח גם בשידור חי וקבוע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת חומרים הדרושים לexplant מוח השלישי Instar הזחל
- הכן את הכלים דרושים לmicrodissection.
- לזייף שני כלים לנתח (אזמל וקרס) על ידי הצבת סיכה לנתח הסינגל ראשון לכל בעל פינים. אבטח את הסיכות בחוזקה ביד או עם צבת (תרשים 1C).
- השתמש זוג מלקחיים ישנים לכופף פינים לנתח אחד לזווית ° כ 120. לעשות את זה תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להבטיח כי את החצי העליון של הסיכה שוכב כאשר בעל הסיכה מוחזק ביד. כלי זה ישמש כאזמל להחזק את מקש או לחתוך דרך רקמות.
- השתמש זוג מלקחיים ישנים לכופף את הסיכה השנייה לתוך וו שישמש להחזיק ולגרד מן הרקמות.
- כיסוי כל כלי לנתח עם קצה פיפטה כדי להגן על הכלים מנזק. בזהירות, כלים בנויים היטב יכולים לשמש לנתיחה ללא הגבלת זמן. החלף סיכות פגומות או מעוותות במידת צורך.
- הכן לנתח בינוני.
- במכסת מנוע בתרבית רקמה, לדלל את תוספת האנטיביוטיקה antimycotic לתוך מדיום culturing של שניידר. לערבל את התקשורת כדי לשלב את התוסף.
- הכן כמה aliquots 5 מיליליטר של התקשורת בתוספת. לאחסן את כל התקשורת על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
- לחמם aliquot 5 מיליליטר של מדיום בתוספת לטמפרטורת חדר. צייר את המדיום לתוך מזרק מיליליטר סטרילי 5 ולדפוק על מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר סטרילי.
- בחר זחלים לנתיחה. השתמש בדיקה לנתח כדי לבחור זחלי instar שלישיים זוחלים כמו המוח יהיה קל לנתח. אופציונליים: הפקדת זחלים על צלחת אגר ענבים.
שים לב: אין להשתמש בבקבוקונים צפופים יתר על המידה או בקבוקים עם "מזון רטוב", כמו אלה נוטים לכפות זחלי instar שני או ראשון לזחול החוצה בטרם עת.
הערה: חלק מהרקע גנטי יחייב שימוש בזחלים צעירים. זו אינה משפיעה על הפרוטוקול, אך אין להפוך את דissection קשה יותר.
2. Dissection של מערכת העצבים המרכזית
- בשקופית זכוכית יחידה, ליצור שתי בריכות 50 מיליליטר של תקשורת לנתח חמה מופרדת על ידי כ 3 סנטימטר. בריכה אחת תשמש לנתיחה ברוטו ואחרת המשמשת לנתיחה קנס (איור 1 ג).
- להעביר כמה זחלים לאחד את טיפות התקשורת.
- הזז את coverslip עם זחלים למיקרוסקופ לנתח. קרב לתוך הבריכה המכילה את הזחלים כך שהקצוות הקדמי והאחוריים של הזחלים ניכרים.
- השתמש בזוגות של מלקחיים כדי לתפוס את אמצע האזור של זחל אחד. קח את הזוג שני של מלקחיים ביד השנייה ולתפוס את הזחל בסמוך לאותו האזור. משוך את שני זוגות מלקחיים מלבד לקרוע את הזחל בחצי בעדינות. חזור על שני שלבים לעיל עבור כל הזחלים על coverslip.
- השלך את החצאים האחוריים של גוף הזחל בהעברתם לרקמות.
- קרב לזחל כך שהmouthhooks קדמי דואר גלוי לעין. השתמש בשני זוגות מלקחיים כדי ליצור חתך קטן, או ברמה גבוהה, משני צדי מתרס של mouthhooks הזחל בין בית החזה השלישי ולהקות denticle הקדמית הראשונות.
- לתפוס את mouthhooks עם המלקחיים ביד הלא הדומיננטית. השתמש במלקחיים ביד השנייה כדי לקלף בעדינות לציפורן בכיוון קדמי לאחורי. תמשיך לקלף לאט לציפורן עד שמערכת העצבים המרכזית היא חשופה.
- לבודד את מערכת העצבים המרכזית משאר הזחל על ידי קריעת רקמות עם המלקחיים. השתמש בזהירות שלא להפריע את מערכת העצבים המרכזית.
שלב קריטי: אל למשוך על מערכת העצבים המרכזית! בטל דגימות פגומות עם חוט קרוע עצב הגחון (איור 2 א) או אונות אופטיות מעוותות (2B דמויות ו2B '). - חזור על שני שלבים לעיל עבור כל הזחלים על coverslip. העברת רקמת explanted בריאהשני בריכה (נקייה) של מדיום על coverslip לשלב הנתיחה בסדר.
- השתמש בכלי הסיכה לנתח כדי לסלק את הרקמות ההיקפיים (לדוגמא, דיסקי העין, כנף, וברגל) מהמוח. חלק את האזמל בין רציתי (המוח) והרקמות לא רצויות, מצמיד את רקמת החיבור לcoverglass. השתמש בוו להקניט בעדינות את הרקמה לא רצויה תוך כדי הלחיצה בו זמנית את האזמל לcoverslip בתנועות כמו מסור.
- שלב קריטי: עבוד לאט ובזהירות כדי להסיר את כל הדיסקים ממוח. השתמש בזהירות שלא להפריע את מורפולוגיה המוח. מוח בריא יהיה כבל שלם הגחון עצב וסימטרי, אונות אופטיות עגולות (איור 2C).
3. הרכבת explanted מוחות עבור הדמית חיה
- הפוך צלחת תרבות 50 מ"מ גז חדיר עם הסרט ברור כלפי מעלה (איור 2 ד). לדכא את המזרק להפקיד טיפה קטנה (כ 30 μl) של מדיום על tמרכזו של המנה.
- העבר את המוח המבודד, אחת בכל פעם, לירידה של מדיום בצלחת. השתמש בכלי הקרס להרים את המוח מתחת לאונות אופטיות. לחלופין, להשתמש במלקחיים כדי לתפוס אקסונים מקרינים מחוט עצב הגחון.
- לאסוף 5-10 מוחות בירידה של מדיום. להטביע את המוח על ידי שימוש בכלי הסיכה לנתח כדי לדחוף את המוח אדם לתחתית הירידה של מדיום כמו רבים מהם יהיה לכודים במניסקוס (2E איור).
- לכוון את מוחם באמצעות הכלים הסיכה לנתח כדי ליישר את המוח בהתאם לNBS להיות צילם (איור 3 א). לתמונה NBS הגב, הנח את חוט עצב הגחון פונה כלפי מטה (לצד הקרום). לתמונה NBS anterio-הגחון, הנח את המוח עם חוט עצב הגחון פונה כלפי מעלה (הרחק מקרום). יישר את המוח כך שכל חוטי עצב הגחון להצביע באותו הכיוון במישור XY.
- השתמש במזרק או p העברת פלסטיקipette למקום 4 halocarbon (HC) טיפות שמן (כ 30 μl כל אחד) על גבי הקרום החדיר הגז. היקפה של כל טיפה של שמן צריך להיות שווה ערך לזה ולירידה של מדיום. חלל הטיפות של שמן למתאימות לארבע הפינות של coverslip התרכז סביב הירידה של מדיום תרבית. לאחר מלא, הטיפות חמש (ארבע טיפות של שמן וירידה של מדיום אחד במרכז) תהיה דומות לחמשת היבטים על קוביות בסגנון מערבי (איור 3 ב).
- מנמיכים coverslip מ"מ 1.5 # 22 על ההרכבה כך שהוא פוגע בכל 5 טיפות באותו הזמן. שמירה על אף לחצים על פני הדגימות מפחיתה את הסבירות שהם יהיו משובשים. חכה דק 'על 3 כמו השמן ובינוני לפזר תחת משקליו של coverslip. צורה דמוית צלב של תקשורת תהווה (3C דמויות ו3D).
- שלב קריטי: מנמיכים את coverslip על פני השטח של המוח על ידי הסרת תקשורת עודפת באמצעות פתיל נייר טישו (figuמחדש 3 ג). לעשות את זה תוך כדי הצפייה במדגם מתחת למשטח הביתור. כמו תקשורת מוסרת, coverslip יפחית. תפסיק פעם אחת coverslip נוגע במוח. האם לא נגמר-פתיל כמו זה יגרום לפיצוצי עיוות רקמות או מוח.
- אם גב ההדמיה NBS (איור 3E), עבור לשלב 3.9. אם NBS anterio-הגחון ההדמיה, coverslip צריך להתרגש מעט (בעדינות על ידי דוחף אותה עם מלקחיים) בכיוון של הטיפים חוט עצב הגחון. זה גורם למוח לסובב, מה שמביא את אונות המוח בקשר ישיר עם coverslip כדי להקל הדמיה (איור 3F).
- לאטום את החדר על ידי המקיף את coverslip עם כמויות קטנות של שמן halocarbon (איור 3D). עודפי שמן נוטף מcoverslip צריך להיות ממוזער ומחק משם עם רקמה.
4. הדמיה חיה של neuroblasts המוח המרכזי
הערה: לעבודה זו, ספינינג דיסק ניקון Eclipse Tiמיקרוסקופ confocal (מיקרוסקופ הפוכה) שימש להדמית חיה; פרטי ההתקנה שלנו כבר פורסמו בעבר ביום 31. לחלופין, המדגם ניתן הדמיה באמצעות מערכת זקופה.
- הוסף טיפה של שמן טבילה לcoverslip בדיוק מעל המוח רכוב. זה יעזור למרכז את המטרה באופן ישיר מעל המדגם.
- שלב קריטי: שמור על מוח בטמפרטורה קבועה של 25 ° C עם חממת במה. בעדינות עמדת המדגם רכוב לתוך חממת הבמה ולכסות את התא עם המכסה שלה.
- אתר NBS המוח המרכזי באמצעות אור מועבר על ידי התמקדות בתאים הגדולים, עגולים, שמתגוררים באזורים של האונות אופטיות המרכזיים והמדיאלי; לא משתמש עלית הקרינה. זה הופך להיות קל יותר עם תרגול. חשוב מאוד לחשוף את הדגימה לכמות המינימאלית של אור ככל האפשר. אל תבזבז את מוח הדמיה בזמן שהם פגומים.
- פעם אחת במקום, לקחת חשיפות מהירות באמצעות confocal ללקבוע את מיקום ועומק ראויים. הגבל את עומק 10-15 מיקרומטר הראשון. להתאים לפי צורך, ולקחת בדיקת תמונה אחרת.
- שלב אופציונאלי: לאסוף את סרט בדיקה של חוט עצב הגחון כדי להבטיח שאין להיסחף XY. אם להיסחף מזוהה, לחכות 15-30 דקות למדגם להתיישב. אם הסחף לא להתיישב ב30 דקות, להכין מדגם חדש. הנדידה גדולה בדרך כלל יכולה להיות נעוצים בתוספת של עודף שמן, או אינה שווה בגודל של טיפות שמן במהלך הרכבה.
- כדי למנוע סחיפה צירית (Z-להיסחף) להשתמש במכשיר אוטומטי רציף התמקדות המשתמש LED אינפרא אדום. לחלופין, לתקן באופן ידני את מישור המוקד.
- ברגע שNB של עניין מזוהה, להמשיך עם משטר הדמיה. כמו בכל ההדמיה התא חי, כמות של אור הלייזר, זמן חשיפה, binning מצלמה, ההגדלה אובייקטיבית, זמן ו / או מרווח Z-צעד חייבים להיות כל מותאם באופן אמפירי בניסוי מסוים כדי לענות על השאלה בהישג היד. המטרה היא למזער את סכר אורבזמן שגיל עדיין איסוף נתונים שימושיים. ראה דיון להנחיות נוספות.
- תמונה כל הנפח של NB על ידי איסוף 12-14 תמונות במרווחים של 1 מיקרומטר בציר ה-z. התאם את הרזולוציה הזמן כדי ללכוד מחזורי תא בודדים או מרובים של אותו NB. כקו מנחה כללי, השתמש 10-30 מרווחי שניות להדמית מחזור התא בודד ו1-3 מרווחי דקות למחזורי תא מרובים.
- שלב קריטי: ודא שהמדגם הוא בריא על ידי ניטור משך מיטוזה. אם מיטוזה לוקחת יותר מ15 דקות, לעבור למוח אחר. מוח בריא יציג NBS רבים בתוך אותו שדה ראייה עובר כמה סבבים של מיטוזה. שים לב שכל מחזור תא הוא מעט ארוכה יותר מקודמתה בשל נזק קל.
- ברגע ההדמיה תושלם, לפרק את תא הדגירה, וזורקים הכל, אבל מנות culturing גז חדיר. יש לשטוף את משטח צלחת התרבות עם 95% אתנול ולנגב היטב עם רקמה. חזור על פעולה עוד פעמיים.
5. הכנת המוח לImmunofluorescence
- לאסוף יותר explanted או 20 מוח לתוך צינור 1.5 מיליליטר מכיל כ 0.2 מיליליטר של מדיום להשלימו.
- הסר בינוני מהצינור ולשטוף את המוח פעם אחת עם 0.5 מיליליטר PBSTx (בופר פוספט, PBS, עם 0.3% טריטון X-100). בואו מוחות ליישב לתחתית של התחתית בין כל חילופים של נוזל. חומר ניקוי טריטון X-100 משמש לpermeabilize הרקמות. שטיפה בדרך כלל לוקחת פחות מ 30 שניות; פשוט להסיר את PBSTx ברגע שהמוח התיישבו לחלק התחתון של הצינור.
- החלף את הפתרון עם 0.5 מיליליטר של 9% paraformaldehyde כיתה במיקרוסקופ אלקטרונים בדילול מלא בPBSTx. דגירה עם nutation 15 דקות בטמפרטורת חדר.
- השלך מקבע על פי תקנות פסולת מסוכנות.
- שטוף את הדגימות עם 0.5 מיליליטר PBSTx ל15 דקות. חזור על השלב לשטוף עם PBSTx הטרי עוד שתי פעמים.
- החלף את הפתרון עם 0.5 מיליליטר PBT (PBS, 1 % הסרום אלבומין שור (BSA), ו0.1% 20-Tween). דגירה עם nutation במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. בלוקים צעד זה לא ספציפי המחייב של נוגדנים לרקמה.
- החלף את הפתרון עם 0.5 נוגדן ראשוני מיליליטר המדולל בPBT בתוספת 4% עזים בסרום נורמלי (NGS). דגירה עם nutation הלילה בשעה 4 ° C.
- בטל או לשמור את הנוגדן הראשוני בדילול מלא.
- שטוף את הדגימות עם 0.5 מיליליטר PBT במשך 15 דקות. חזור על השלב לשטוף עם PBT הטרי עוד שתי פעמים.
- החלף את הפתרון עם 0.5 מיליליטר של PBT שונה (PBS, BSA 2%, Tween-20 0.1%, ו -4% NGS). דגירה עם nutation במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- החלף את הפתרון עם 0.5 נוגדנים משני מיליליטר המדולל לPBT שונה. דגירה עם nutation עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר.
- החלף את הפתרון עם 0.5 מיליליטר PBST (PBS עם Tween-20 0.1%). דגירה עם nutation 15 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על השלב לשטוף עם PBST הטרי עוד שתי פעמים.
"Jove_title"> 6. דוגמאות הרכבה לImmunofluorescence
- בזהירות להעביר דגימות כמו ירידה בשקופית זכוכית, המגביל את הירידה לכיוון השמאלי של מרכז השקופית.
- הוסף טיפה גדולה (כ -2 ס"מ קוטר) של מדיום הרכבה (לדוגמא, Aqua-Poly/Mount) למרכז השקופית. הימנע מהברכה של PBST שהוא לכיוון השמאל.
- שימוש במלקחיים להעביר את מוחם מהברכה של PBST לבריכה של הרכבה בינונית. הוספת מדיום הרכבה ישירות על גבי המוח עלולה לשבש את האורינטציה שלהם ויש להימנע.
- , תחת מיקרוסקופ אור לסדר את הדגימות בהרכבה בינונית עם הצד שיהיה צילם פונה כלפי מעלה.
- עם השקופיות מתחת למיקרוסקופ האור, לאט לאט להוריד coverslip זכוכית # 1.5 על גבי הדגימות. שלב אופציונאלי: לסלק בועות אוויר קטין על ידי דחיפה קלה על coverslip.
- לאפשר ההרכבה בינונית לפלמר במשך כמה שעות, או הלילה, על ידי שוכב שקופיות שטוחות, אורמוגן, בטמפרטורת חדר.
- השקופיות יכולות להיות צילמו ביום שלמחרת, או לאחסן לפני ההדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיה חיה כבר הובהרה מספר המנגנונים המווסתים NB ACD. לפני רכישת תמונה, יש צורך לקבוע את תנאי הדמיה אופטימליים. זה הכרחי כדי לאזן את שיעור לכידת המסגרת עם משך ההדמיה תא חי. לניתוח הסלולר בסדר, למשל, הגדיל את זמן וייתכן שתהיה הצורך ברזולוציה אופטית. כאשר חזותי מחזור אחד NB תא (איור 4 א), הקצב שבו תמונות שנתפסו ניתן להגדיל ללא החדרת נזקי. בדרך כלל, אירועי חלוקת תא יחיד עשויים להיות במעקב בכ 10-30 מרווחי זמן שניות. אחת דרכים להגדיל את הרזולוציה הזמנית מבלי לפגוע ברקמות היא לווסת את קצב רכישת תמונה. לדוגמא, הזמן לשגות הדמיה יכולה להיות יזם במסגרת שיעור נמוך יותר, אשר לאחר מכן עלה על תצפית של תכונה מעניינת או נקודה (סרט 1) זמן.
סיבובים רצופים הדמיה של חלוקת תא (
לניתוח של מספר הגדול של דגימות, לעתים קרובות יש צורך לנתח NBS הקבוע. פרוטוקול הקיבעון שלנו משמר את המורפולוגיה הכוללת של NBS והוא תואם את מבחני immunofluorescence (איורים 4C-4E). brai הר קבוע כלNS יכול להיות צילם בהגדלה נמוכה (איור 4C) כדי להמחיש את הגודל הכללי של המוח וצורה או לזהות NBS. כדי להמחיש NBS או GMCs צאצאיהם בפירוט רב יותר, יש להשתמש בהגדלה גבוהה יותר. בהגדלה מתונה (איור 4D), אשכולות שושלת NB כל אפשר לראות. לניתוח מפורט הסלולר, ההגדלה גבוהה משמשת (4E איור).
איור 1. Explanting כל מוחות הדמיה תא חי של NB ACD. א) מערכת העצבים המרכזית הזחל מורכב משתי אונות אופטיות וחוט עצב הגחון. שני תת סוגים של NBS לאכלס את האונה אופטית בעמדות סטריאוטיפיות:. NBS סוג I (כחול כהה) וסוג השני (תכלת) B) לעבור ACD. עם כל חלוקת תא,דבק NB להצמיח אחד GMC (או INP, לא מוצג) ומחדש את תאי גזע NB. GMCs יחלק להצמיח שני נוירונים (או גליה, לא מוצג). C) שני כלים microdissection נאספו על ידי החדרת סיכות לנתח למחזיקי סיכה. מוח כיפוף הסיכות יוצר כלים ייחודיים, אזמל וקרס, אשר משמשים לנתק, פירס, ולעקור רקמות לא רצויות מבלי לפגוע במוח הבסיסי. ד) explanted לאחת משתי בריכות של תקשורת לנתח (עיגולים כחולים). בריכה אחת בינוני משמשת כדי להסיר את מערכת העצבים המרכזית מהזחלים (לנתיחה ברוטו), והברכה אחרת משמשת לmicrodissection קנס של רקמות היקפי ממוחה explanted (דיסקציה בסדר).
איור 2. Preservע מורפולוגיה המוח במהלך microdissection. נתיחת המוח חפוזה יכול לגרום נזק לרקמות קשות שכולל () חוטים קרועים הגחון עצב או (ב) מעוותת אונות אופטיות. ועוד יותר נזק לרקמות עדינות (ב ') יש להימנע הדמיה תא חי. (ג) דוגמא של דגימת רקמה בריאה מתאימה להדמיה לחיות. קרום ברור אופטי, גז חדיר. E) אוסף של כמה מוחות בריאים המסודרים בculturing בינוני על צלחת גז חדיר ד '). המוח של אלה הם מוכנים להיות מותקנים עבור מיקרוסקופיה. סרגל קנה מידה: (AC), 100 מיקרומטר; (ד '), מ"מ 25; מ"מ (ה) 1.
איור 3. הרכבה מוח להדמית תא חי. א) מוחים מיושרים בשורות בתוך ירידה של מדיום culturing הופקדה במרכז צלחת. ב ') הירידה של מדיום מוקפת בטיפין של שמן HC של נפח שווה בערך. ארבע הטיפות של שמן HC והירידה של מדיום המרכזי דומות להיבטי חמישה לשחק בקוביות. לאחר coverslip הוא הוריד על הטיפות של שמן, (C) פתיל נושן מתוך רקמת KimWipe ומשמש לספוג נוזלים עודפים. ד) הקצה החיצוני של coverslip מוקף על ידי שכבה דקה של שמן כדי לעצור את האידוי של מדיום התרבית. המוח אלה נמצא כעת מוכנים למיקרוסקופיה. E ו-F) הכיוון של יחסית מוח coverslip קובע אילו neuroblasts נגישות להדמית תא חי. neuroblasts הגבי) E הם צילמו על ידי הסדרת המוח עם צד הגחון נוגע בקרום החדיר הגז . F) neuroblasts קדמית, הגחון עשויה להיות צילמה על ידי עיבודanging המוח עם צד הגב נוגע בקרום החדיר הגז ולאחר מכן דוחף את coverslip, והרקמה הבסיסית, בכיוון של הטיפים חוט עצב הגחון. תנועה זו מעט מטה אונות אופטיות כך שאנשי קשר anterio-הגבי פני השטח coverslip, מביאים את ציר ההדמיה הרצויה ליישור מושלם (קו ירוק).
איור 4. תוצאות נציגת ההדמיה חיה של neuroblasts החלוקה. A ו-B) הדמיה חיה של NB נובע חלוקות תא בהכנות הר שלמות באמצעות 40X, מטרת נפט טבילה 1.3 NA. שעה מוצגת כדקות: שניות ביחס לתחילת הזמן לשגות) סטילס מהזמן לשגות הדמיה של מחזור תא בודד מNB להביע GFP-Moesin.(GFP-מו). שיעור רכישת התמונה של מחזור תא יחיד עשוי להיות מוגבר כדי לשפר את הרזולוציה של זמן ללא גרימת נזקי. ב ') סטילס מהזמן לשגות הדמיה של מחזורי חלוקת תא רצופים מNB להביע שני GFP-מו וסמן centrosome-GFP שכותרתו. תקופה הממושכת הקשורים במחזורי תאים מרובים מחייבת החלטה זמנית מופחתת, כדי למנוע נזקי. שים לב שמשך הזמן בין כל עליות חלוקת התא במהלך הדמיה. לספירה) תחזיות Confocal של תאי גזע קבועים מהכנות הר שלמות. C)) לתמונה כל NBS ממוקם על שני אונות אופטיות, משמש בהגדלה 20X. ניתוח זה הוא שימושי במיוחד כדי לבחון את המורפולוגיה הכללית של המוח ולכמת מספרי NB (תכלת), וכו '. ד') רוב NBS (ורוד) מאונה אופטית בודדת עשויים להיות דמיינו עם 40X ההגדלה. Microtubules, (ירוק). ה)
סרט 1. הדמיה חיה של מחזור תא NB אחת. זמן לשגות תמונות של חלוקת תא NB בודדת ממוח להביע GFP-מו לתייג את קליפת התא. תמונות נרכשו ממטוס אופטי יחיד ב40X ההגדלה. בסרט הזה, מסגרות נתפסו כל שנייה 15. לאחר כ 7 דקות של רכישה, השיעור הוגדל ל מסגרת אחת כל 5 שניות. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 2. סיבובים רצופים הדמית חית oו NB ACD. זמן לשגות תמונות של NB שעברו שלושה סיבובים של חלוקת תא במוח להביע GFP-מו וסמן centrosome-GFP שכותרתו. תמונות נרכשו ב2 מרווחי זמן דק 'ב 60x ההגדלה. לחץ כאן לצפייה בסרט.
| קו | מבנה תאי שכותרתו | Fluorophore | ביטוי / יזם | ציון לשבח |
| YFP-Asterless | Centriole | YFP | היוביקוויטין | Rebollo, et al. (2007) Dev. תא 12:. 467. |
| SAS6-mCherry | Centriole | mCherry | אנדוגני | רוסאן וPeifer (2007) י Biol תא. 177 |
| ה-GFP-SAS6 | Centriole | ה-GFP | אנדוגני (BAC) | Lerit ורוסאן (2013) י תא Biol 202:. 1013. |
| ה-GFP-PACT | Centriole | ה-GFP | היוביקוויטין | מרטינז-Campos, et al. J. תא Biol 165:. 673. |
| ה-GFP-SAS4 | Centrosome | ה-GFP | היוביקוויטין | דיקס והרף (2007) Curr. Biol 17:. 1759. |
| ה-GFP-פולו | Centrosome | ה-GFP | אנדוגני | . Moutinho-סנטוס, et al (1999) Cell Biol 91:. 585. |
| ה-GFP-γ-טובולין 23C | Centrosome | ה-GFP | היוביקוויטין | Lerit ורוסאן (2013) י תא Biol 202:. 1013. |
| ה-GFP-Centrosoדקות | Centrosome | ה-GFP | כטב"מ | Megraw, et al. (2002) י תא Sci 115:. 4707. |
| ה-GFP-SPD-2 | Centrosome | ה-GFP | היוביקוויטין | דיקס והרף (2007) Curr. Biol 17:. 1759. |
| α-mCherry-טובולין | Microtubules | mCherry | היוביקוויטין | רוסאן וPeifer (2007) י תא Biol 177:. 13. |
| ה-GFP-α-טובולין | Microtubules | ה-GFP | היוביקוויטין | . Rebollo, et al (2004) PLoS Biol 2:. E8. |
| יופיטר-GFP ("G147") | Microtubules | ה-GFP | אנדוגני | מורין, et al (2001) PNAS 98:.. 15050. |
| mCherry-יופיטר | Microtubuleשל | mCherry | כטב"מ | Cabernard וDoe (2009) Dev. תא 17: 134. |
| H2AvD-mRFP | ה-DNA | mRFP | אנדוגני | פנדיי, et al. (2005) י תא Sci 118:. 733. |
| H2AvD-GFP | ה-DNA | ה-GFP | אנדוגני | קלרקסון וסנט (1999) Cell-DNA Biol 18:. 457. |
| Moesin-GFP | אקטין קליפת המוח | ה-GFP | דלעת ספגטי | Kiehart, et al. (2000) י תא Biol 149:. 471. |
טבלת 1. בחירה של קווים מהונדסים שימושיים לחקר ACD. מבני היתוך אלה הם שימושיים במיוחד לחקר חלוקת תא. הם נמצאים בשימוש באופן שיגרתי במחקרי הדמיה לחיות NB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה תא חי היא גישה לא יסולא בפז לשמש כדי לחקור את המנגנונים המווסתים ACD של תאי גזע, ההתמיינות של שושלות תאים, והמורפוגנזה של רקמות מורכבות. למרות שקבוצות המחקר היסטורית השתמשו במגוון של טכניקות כדי להמחיש NB ACD, הגישות הללו ניתן לקבץ בדרך כלל לשתי קטגוריות שבעיקר שונה ביחס לשאלה האם רקמת המוח נותרה בשלמותה או מנותק.
הדמיה ניתקה יש NBS היתרונות שלה. עבור אחד, ניתק NBS הם קלים יותר לתמונה משום שהם קלים במיוחד להזדהות כתאים (כ 12 מיקרומטר קוטר) הגדולים ביותר בצלחת תרבית. יתר על כן, כמעט כל תאי גזע שנמצאים בתרבית על משטח זכוכית יהיו קרובים במידה שווה למיקרוסקופ המטרה במשך כל תקופת רכישת תמונה. האיכות האופטית של זמן לשגות תמונות הוא השתפר עוד יותר עם השימוש או פולי-L-ליזין או פיברינוגן זכוכית מצופה לגרום SEMi-השטחת 16 NBS העגול, 17. יתרון נוסף להדמית NBS ניתק גדל בתרבות הוא הקלות שבה ניתן להחליף בינוני culturing. ברגע שתאים לדבוק משטח הזכוכית המצופה, culturing בינוני המכיל כל מספר של אגוניסטים תרופתיים, יריבים, או נוגדני immunoblocking, וכו '. ניתן להוסיף או להסירו. לבסוף, הגישות האחרונות כדי להמחיש NBS ניתק הוכיחו כי טכניקה זו היא, אכן, מקובל הרכישה ממושכת תמונה 18, 19.
יחד עם זאת, החסרונות להדמיה ניתקו NBS כולל את המורכבות של הפרוטוקול. פירוט רוב השיטות ארוכות (30-60 דקות) עיכול כימי, ואחריו צעד ארוך דגירה (60 דקות) כדי לאפשר לתאים מפוזרים להתיישב ולדבוק בצלחת התרבית 17, 19.
לעומת זאת, NBS הדמיה ממוח שלם משמר שניהקשר פיסיולוגי ומורפולוגיה של הרקמה. היתרונות לגישה זו כוללים את היכולת לזהות שושלות NB ספציפיות המתפתחות בהסדרים סטריאוטיפיים או בזמנים ההתפתחותי מוגדרים 1. לכן, יש הפרוטוקול פשוטה שלנו שירות שמשתרע מעבר ללימודים של ACD, כפי שהוא מאפשר גם לחקירה בשידור חי של אירועי בידול והמורפוגנזה. חסרון אחד לשיטה זו, לעומת זאת, הוא חוסר היכולת להחליף culturing בינוני. לכן, חוקרים מתעניינים בתחום הדמיה לטווח הארוך של חלוקות תא גזע רצופות חייבים לשקול את הגישה (התרבות העיקרית ניתקה מול ההר שלם) המתאימה ביותר ליישום שלהם. כמו כן, את הצורך בתוספי culturing, כגון אינסולין או בסרום, צריך להיקבע באופן אמפירי המבוסס על תנאי ההדמיה (משך ההדמיה, כמות האור שפגע במדגם, וכו '.) והתקנה ניסיונית.
באופן כללי, אנו ממליצים על ניצול לנתקNBS ד למחקרים שבם יש צורך להעריך את התגובה חריפה של NBS לכניסתה של מולקולות קטנות (למשל, מעכבים, וכו '.), עבור יישומי תפוקה גבוהה כאשר microdissection קנס של מוח עשוי להיות מסורבל מדי, ועל מחקרי הדמיה מתקדמים שדורשים NB להיות במגע פיזי עם coverslip. בניגוד לכך, אנו ממליצים על שימוש במוח שלם ליישומים שבם הוא שימושי לתמונה כמה NBS מאותו המוח, ובמיוחד למחקרים שאינטראקציות דאגה תאי תאים, אוטונומיה, ניתוח משובט, שינויי צורת תא, וחקירות אחרות שבם הילידים הסביבה של התאים היא חשובה.
כדי להבטיח ההכנה המוצלחת של מוח שלם הדמיה לחיות, כמה שלבים קריטיים חייבים להיות מוצאים להורג בזהירות. בראש ובראשונה, הוא הכרחי כדי למנוע חשיפה של הרקמה לטראומה מיותרת. באופן ספציפי, explanting המוח והסרת רקמה היקפית, יש לבצעו בזהירות. אחדצריך למזער את המגע ישיר בין הכלים לנתח והמוח. בנוסף, יש להימנע ממושכים או מושכים על רקמה מחוברת למוח. טיפולו כושל הרקמה יכול בקלות לגרום למוח קרוע או מעוותים. בידיים שלנו, NBS ממוח פגום לחלק רק לעתים רחוקות. אנשים שנמצאים חדשים לנתיחה מוח זחל לעתים קרובות נהנים משליטה בנתיחה לפני שתנסה להכין את הדגימות להדמיה לחיות.
עוד צעד קריטי בפרוטוקול הוא ההרכבה של המוח לפני גר הדמיה תא. הכרכים הנכונים של שניהם בינוני culturing ושמן HC הם חיוניים כדי להשלים את הכנה שימושית. למרות שקשה למדוד במדויק את שמן HC צמיג עם pipet, אפשר להתקרב לאמצעי האחסון הנכון (כ 30 μl) על ידי העין. יותר מדי נוזלים מונעים את coverslip מיישוב למקומו. לעתים קרובות, זה גורם למוח לנוע על פני השטח של צלחת התרבית. במהלך הדמיה חיות, coverslip מעורער הוא Eviשקע כאשר מרחף הרקמה או רול אונות האופטי. יש להימנע מדוגמאות שאינם ממוקמים במקום. להיפך, הוספה בינונית culturing מעט מדי או תוצאות נפט HC בנזק לרקמות קטסטרופלי, כוללים אונות אופטיות פרץ. יש איזון זהיר בין השימוש מספיק מדיום נוזלי ושמן לטיפול במשקל של coverslip לעומת שימוש יותר מדי נוזלים, מה שגורם coverslip לשקופית. איזון זה למד הטוב ביותר באמצעות תרגול. באופן כללי, עדיף לתמונה רק את אלה שיש להם את המוח של מורפולוגיה בריאה, כגון חוט שלם הגחון עצב ואונות אופטיות סימטריות ועגולות.
לאחר המדגם הוא רכוב בלי להיסחף לזיהוי, שמירה על המדגם בחיים הופכת להיות ההיבט הקריטי הבא של פרוטוקול זה. זו מושגת הטובה ביותר על ידי שמירה על טמפרטורה נכונה, והכי חשוב, למזער את כמות האור שפוגעת במדגם. התקנת מיקרוסקופ והמדגם הם שני המשתנים שקובעים את ההצלחה של ליטרive הדמיה תא. יעדים באיכות גבוהים, מסננים (~ שידור 98%), ומצלמות (אלקטרון בחזרה דליל, הכפלה ומוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימים) בצד הפליטה יאפשרו אחד כדי להפחית את כמות האור שפוגעת במדגם בצד העירור. זה ידוע היטב שאור הכחול (המשמש לתמונת GFP) הוא רעיל לתאים. יש לקבוע כמה אור כולל (הכולל זמני חשיפה) מדגם נתון יכול לסבול ולאחר מכן התפשט באותה תקופה בסך הכל לאורך כל תקופת הניסוי. לדוגמא, אם מדגם יכול רק לסבול 500 חשיפות אור הלייזר מבוססות על התקנת מיקרוסקופ מסוימת, אז אפשר לאסוף 50 ערימות x 10 פרוסה. יכולים להיות מחולקת בערימות אלה על ידי 1 דקות כדי לאסוף מחזור אחד NB תא, או 2-3 דקות כדי לאסוף ~ 3 מחזורי תא. בנוסף, אופטימיזציה של הגדרות עבור כל גנוטיפ היא קריטית עבור הדמיה חיה מוצלחת. במהלך תקופת אופטימיזציה, נקודת התחלה טובה ל488 כוח לייזר ננומטר היא 25-50 μW נובע מ100X, 1.4 NA &# 160; מטרת נפט טבילה. לבסוף, יש לקבוע מה מצב הדמיה יהיה לענות כראוי את השאלה בהישג היד, כמו שזה לא תמיד המקרה של צורך בהדמיה המתוחכמת ביותר.
עבור ניסויים עם רקמה או לחיות או קבוע, עשויים להיות מותקנים מוחות כדי שושלות NB ספציפיות תמונה. לדוגמא, על מנת סוג התמונה השני NBS, שסטריאוטיפי מתגורר באזור האחורי-המדיאלי של האונה אופטית 7, אפשר היה לעלות על המוח, כפי שמודגם באיור 3E. מכיוון שדפוס המרחב ובזמן של NBS המוח המרכזי תועד 1 היטב, ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו לתמונת מגוון של אשכולות NB ספציפיים תוך ניצול כל מספר של המבנים הזמינים באופן נרחב מהונדסים שבאים לידי ביטוי בכל מקום תחת או, באופן אידיאלי, היזמים אנדוגני (טבלה 1). עם זאת, טכנולוגיות תיוג שושלת ספציפית 20 יישארו שימושיות עבור מספר היישומים.עם ניתוח קבוע, מוח עם נזק קל הם בדרך כלל מתקבל על הדעת. בנוסף, ההסרה של רקמה היקפית המלאה יכולה להידחות עד ממש לפני הטבעת המוח בהרכבה בינונית. מחקרים עם רקמה קבועה הם שימושיים במיוחד כאשר מספר גדול של NBS חייב להיות צילם.
לסיכום, מחקרים של NB ACD הפיקו תועלת רבה מהשימוש בשני הדמיה תא חי וניתוח קבוע מפורט. הפרוטוקול המתואר כאן פרטי גישה אחת כדי להכין את זחלי דרוזופילה עבור יישומים או לחיות או קבועים. אנו צופים החקירה של NB ACD המשיכה באמצעות מחקרי הדמיה מפורטים תחשוף רומן ותוצאות מרגשים שתקדם את ההבנה של תאי גזע שלנו בפיתוח ומחלות. היישום של הדמיה לחיות לטווח הארוך של מוח של זחל בשלמותה יש פוטנציאל לחשוף תובנה חדשות לגבי הרצף הזמני של אירועי בידול והמורפוגנזה הקובעים את ההתפתחות (וdegeneration) של מערכת העצבים המרכזית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי חטיבת מחקר של שבירת קירות במכונים הלאומיים לבריאות / NHLBI (1ZIAHL006126) וLenfant ביו פוסט דוקטורט מלגה הוענקו לDAL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. |
| Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | A high viscosity inert oil that is clear and colorless. |
| Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissecting needle/probe with plastic handle | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Syringe filter, 0.22 μm pore size | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Syringe, 5 ml | BD Biosciences | 309646 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Paraformaldehyde, 32% EM-grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling. |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | A dye that labels DNA and is excited by UV light. |
References
- Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
- Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
- Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
- Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
- Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
- Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
- Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
- Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
- Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
- Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
- Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
- Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
- Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
- Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
- Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
- Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).
