Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Live-Imaging av Published: July 7, 2014 doi: 10.3791/51756
Automatic Translation
1, 1, 1
1National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

Summary

Denne protokollen detaljer en strømlinjeformet metode som brukes til å gjennomføre levende celle bildebehandling i sammenheng med en intakt larve hjernen. Live-cell imaging-tilnærminger er uvurderlig for studiet av asymmetriske nevrale stamceller divisjoner samt andre nevrogene og utviklingsprosesser, konsekvent avdekke mekanismene som tidligere ble oversett.

Abstract

Stamceller dele asymmetrisk å generere to avkom celler med ulik skjebne potensial: en selvfornyende stamcelle og en differensierende celle. Gitt deres relevans for utvikling og sykdom, forstå mekanismene som styrer asymmetrisk stamcelle divisjon har vært en robust fagområde. Fordi de er genetisk medgjørlig og gjennomgår suksessive runder av celledeling omtrent en gang hver time, stamcellene i Drosophila sentralnervesystemet, eller neuroblasts, er uunnværlig modeller for studier av stammen celledeling. Rundt 100 nevrale stamceller er plassert i nærheten av overflaten av hvert av de to larvehjernelapper, noe som gjør dette modellsystemet er spesielt nyttig for direkte avbildning mikros studier. I dette arbeidet, vurderer vi flere tilnærminger mye brukt for å visualisere stamcelle divisjoner, og vi adressere de relative fordeler og ulemper ved de teknikker som ansetter dissosiert versus intakte hjernen vev. Vi har også detalj vår simplifIED protokoll som brukes eksplanterer Hjernene fra tredje stadiums larver for live cell imaging og faste analyse applikasjoner.

Introduction

Stamceller opprettholde en balanse mellom differensiering og selvfornyelse for å generere mobil mangfold under tidlig utvikling og erstatte skadede celler i voksen vev. Regulering av dette homeostase hindrer både tap og over-utvidelse av stamcelle befolkningen, noe som kan resultere i skadelig vev degenerasjon eller tumorigenesis.

Neuroblasts (NBS) er de mye studert neural stamceller i Drosophila sentralnervesystemet (figur 1A), som først dannes ved embryonale trinn 1, 2. NBs gjennomgå gjentatte runder med asymmetrisk celledeling (ACD) til å produsere to ulikt skjebnebestemt celler: en selvfornyende stamcelle og en differensierende celle. ACD styres av centrosomes, de ikke-membran organeller som fungerer som de mikrotubulus-organiseringssenter av de fleste cellene tre. Under mitose, NB centrosomes organisere og orientere bipolar mitotisk spindel langs den apikale-basal polarligheten aksen. Ved spalting av å dele NB, apikale skjebne determinants som angir stamcelle skjebne, og basal skjebne determinants som angir differensiering, er adskilt i den skjeve datterceller.

I larve sentrale hjernen, kan to typer NBS være preget av deres antall, posisjon, transkripsjonsfaktor uttrykket, og celle avstamning (figur 1A) 4-6. Type I NBS er de mest tallrike, og om lag 90 av dem fylle de fremre og bakre sidene av hver optisk flik av hjernen 7.. Disse NBs uttrykke transkripsjonsfaktor Asense (Åse), og de ​​karakteristiske dele inn i en selvfornyende NB og en mindre ganglion mor celle (GMC, figur 1B). Hver GMC gjennomgår en enkelt terminal divisjon til å generere to nevroner eller gliaceller (Figur 1B). I kontrast, de åtte Type II NBs som befolker den bakre side av hver optisk lapp mangler Ase uttrykk fem. De gjennomgår ACDå produsere en selvfornyende NB og en mellomliggende nevrale stamceller (INP).

Den INP i sin tur skiller asymmetrisk tre til fem ganger. Hver av disse avdelinger resulterer i regenerering av INP og produksjonen av en enkelt GMC 4.. Kollektivt, den spesifikke NB identitet og tidsmessige rekkefølgen av GMC fødsel gir opphav til den forbløffende nevronale mangfold av voksne sentralnervesystemet.

Forstå cellebiologi som ligger til grunn NB ACD er blitt vesentlig forbedret gjennom bruk av levende celle imaging teknikker. Publisert protokollene som brukes av forskere til bilde levende NBs varierer mye. Samlet, men disse metodene kan grupperes i to generelle kategorier preget av hvorvidt larve hjernen er intakt eller mekanisk dissosiert. Begge teknikkene har klare fordeler og ulemper avhengig av forskerens søknad.

Tidlige rapporter avslører levende NB celle utbytteutslipp innebære en viss grad av manuell dissosiasjon av larve hjernen. Disse protokollene detalj smøre 8 eller erting hverandre ni hjernen for å vokse kortsiktige primærkulturer av NBS på glass dekkglass. For å bedre bildebehandling, er de runde NBs vanligvis flatet på Dekkglass med enten glassplater 8 eller agarose pads ni. Selv om flate celler har forbedret optikk, er disse teknikker fører ofte til NB mitotiske defekter, herunder regresjon av spalting furen og manglende evne til å dele seg mer enn en gang. Derfor er protokoller som involverer både manuell dissosiasjon og fysisk forvrengning av larve hjernevev vanligvis bare egnet til svært kortsiktig (dvs.., En cellesyklus eller mindre) applikasjoner. Likeledes, begrenser semi-squashing eller helt flate intakte hjerne mellom glassplater og dekk den tid en kan bruke imaging en gitt prøven til en ca 30 min perioden 10. Til tross for denne begrensningen, this tilnærming har vært brukt med hell 11-14.

Siste innsats til bilde levende dissociated NBS grense fysisk forvrengning av de isolerte celler. Disse teknikkene er spesielt nyttige for anvendelser hvor det er nødvendig for å opprettholde cellekulturer for flere celledeling sykluser. For eksempel kan dispergerte celler fra manuelt dissosierte hjerner være delvis innleiret i en blodpropp laget av en blanding av fibrinogen og trombin 15 for langvarig avbildning 16.. Alternativt kan eksplanterte hjerner være første kjemisk dissosiert med enzymet collagenase, neste manuelt avbrutt av gjentatte passasje gjennom en pipette tips, og deretter belagt på poly-L-lysin-belagt glassbunn retter 17, 18. Coating glass retter med enten fibrinogen eller poly-L-lysin fremmer vedlegget og svak spredning av runde celler, og bringer dem så nær dekkglass som mulig uten store fysiske forvrengning. I tilpå disse metoder involverer dyrkning av NBS i medium som lett kan byttes mot farmakologiske perturbasjons eksperimenter 18. Overall, direkte plating spredt NBS forbedrer bilde optikk uten å ofre langsiktige imaging evner. Nylig, har en protokoll som beskriver den langsiktige dyrking av dissociated NBS blitt beskrevet 19.

Imidlertid er denne metode ikke uten begrensninger. Det er flere begrensninger til bildebehandling levende dissosiert NBs. I et felt av dispergerte celler, for eksempel, er det vanskelig å identifisere spesifikke NB linjene som er romlig organisert i intakte hjerne 1.. Likeledes, skille Type I versus Type II NBs innenfor dissociated vev er også utfordrende uten uttrykk for avstamning sporstoff eller subtype spesifikke transgener, slik som worniu-Gal4, asense-GAL80 20. Selv om disse transgener er ganske nyttig for enkelte programmer, de begrense forskerne til de transgener extrykket under kontroll av UAS forsterkerelement 21 og krever mer kompliserte genetiske ordninger. Studier som angår den romlige eller tidsmessig utvikling av NBS, derfor krever in vivo avbildning i sammenheng med en intakt vev.

Videre studier av dissosiert embryonale NBS tyder på at den fysiske kontakt mellom tilstøtende celler, er kritisk for den inter lokalisering av nøkkelen polaritet determinanter 22, 23. Disse studiene viser helt isolert NBS ikke lenger opprettholde invariant mitotisk spindel aksen. I stedet, disse cellene vise en mer randomiserte spindel aksen og brede vinkler av separasjon mellom påfølgende GMC knopper, kanskje på grunn av tap av apikale sentrosomen posisjonering 22. Selv om forholdet mellom larve NBs og deres nabocellene ikke har blitt grundig studert, er det verdt å vurdere at larvestamcellemikromiljøet kan skje på bekostning celle polaritet eller annenatferd. For å opprettholde den fysiologiske sammenheng med larve NBS, vi image ACD fra hele hjerner.

Gitt den iboende begrensninger knyttet til bildebehandling dissosiert NBs, har vår lab og andre etablerte protokoller til bilde suksessive runder med NB ACD fra hele larve hjerner. Teknikker til bilde intakte hjerne ofte erstatte den stive overflate av glasset på den ene side av kulturkammer med en fleksibel membran for å hindre at vevet forvrengning eller skade og tillate for gassutveksling. Noen metoder innebærer montering eksplanterte hjernene i en blanding av insekt dyrking medium, serum og askorbinsyre med fett organer isolert fra ti larver 24.. De isolerte fete kropper er lagt fordi de skiller ut en mitogen kjent for å stimulere NB celledeling 25. Denne protokollen bevarer integriteten av vev på over 3 timer, og er derfor mottagelig for langvarig avbildning 24, 26-28. Nylig har en protokoll beskriver long-term avbildning av intakte larve hjerner i nærvær av askorbinsyre, serum, organer og fett er blitt beskrevet 29. Viktigere, fordi vevet er verken utsettes eller immobilisert, er denne tilnærmingen mindre nyttig for applikasjoner der dyrking medium utveksles (f.eks medikamentstudier, immunodepletion, osv..).

Vårt laboratorium har forenklet hele fjellet utarbeidelse av levende larve hjerner for langsiktig bildebehandling 30, 31. Den største fordelen til vår protokoll over andre er dens enkelhet: våre observasjoner tyder på verken serum, askorbinsyre, insulin, og heller ikke fett kropper er nødvendige tilsetningsstoffer til bilde suksessive runder med NB ACD. Selv om tilsetninger, som for eksempel insulin, har vært anvendelige for langvarig avbildning av stammen celledelinger 32 og samlecellemigrering in Drosophila eggstokkene 33, synes de å være unnværlig for NB ACD, som vår bildedannende medium består av en enkel blanding av standard insektcelle dyrkningsmedium supplert med antibiotisk-antimykotisk for å unngå forurensning. Gjennom bruk av gjenbrukbare gass-permeable eller glassbunn kultur retter, har vi vært i stand til å opprettholde flere runder med påfølgende NB ACDs. De samme eksplanterte prøver kan lett brukes for immunfluorescens og andre prosedyrer med fast vev. I denne protokoll har vi detalj disseksjon av intakte larve hjernen, så vel som fremstillingen av hjernen for både direkte og fast-analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av Materialer som er nødvendige for å Eksplanter Tredje Instar Larve Brains

  1. Forbered verktøy som kreves for microdissection.
    1. Smi to dissekere verktøy (en skalpell og en krok) ved først å plassere en enkelt dissekere pin hver pin holderen inn. Fest pinnene tett for hånd eller med en tang (figur 1C).
    2. Bruk et par gamle pinsett til å bøye en dissekere pin til en ca 120 ° vinkel. Gjør dette under et dissekere mikroskop for å sikre at den øverste halvdelen av pinnen ligger flatt når pinneholderen holdes i hånden. Verktøyet vil bli brukt som en skalpell til å holde nede eller skjære gjennom vevet.
    3. Bruk et par gamle tang for å bøye den andre tapp i en krok som skal brukes til å holde og skrape bort vev.
    4. Dekke hver dissekere verktøy med en pipette tips for å beskytte de verktøyene fra skade. Med forsiktighet, kan velformede verktøy benyttes til disseksjon ubestemt tid. Skadde eller deformerte pins som nødvendig.
    </ Li>
  2. Forbered dissekere medium.
    1. I en vev kultur hette, fortynne antibiotika-antimycotic supplement inn i Schneiders dyrkning medium. Virvle media å innlemme supplement.
    2. Forbered flere 5 ml porsjoner av supplert medium. Oppbevar alle medier ved 4 ° C til alt er klart til bruk.
    3. Varm en 5 ml aliquot av medium supplert til romtemperatur. Tegn mediet inn i en steril 5 ml sprøyte og skru på en steril 0,2 mikrometer sprøyte filter.
  3. Velg larver for disseksjon. Bruk en dissekere probe for å velge kryp tredje stadiums larver som hjernen vil være lettest å dissekere. Valgfritt: innskudd larver på en drue agar plate.
    Merk: Ikke bruk altfor overfylte ampuller eller flasker med "våt mat", da disse har en tendens til å tvinge andre eller første stadiums larver å krype ut for tidlig.
    Merk: Noen genetiske bakgrunn vil nødvendiggjøre hjelp yngre larver. Dette påvirker ikke protokollen, men gjør ikke dissection vanskeligere.

2. Disseksjon av sentralnervesystemet

  1. På et enkelt glass lysbilde, lage to 50 ml bassenger av varme dissecting media atskilt med ca 3 cm. En pool vil bli brukt for grovt disseksjon og annet brukt for fine disseksjon (figur 1C).
  2. Overfør flere larver til en av mediedråper.
  3. Flytt dekkglass med larvene til en dissekere mikroskop. Zoom inn i bassenget som inneholder larvene, slik at de fremre og bakre ender av larvene er merkbar.
  4. Bruk et par av pinsett til å ta tak i mid-regionen i en enkelt larve. Ta et andre par tenger i den andre hånden og gripe larven nær den samme region. Trekk de to parene med tang fra hverandre for å forsiktig rive larven i halvparten. Gjenta de to siste trinn for alle larver på dekkglass.
  5. Kvitt deg med de bakre halvdelene av larvekroppen ved å overføre dem til en vev.
  6. Zoom inn i en larve, slik at the fremre mouthhooks er klart synlig. Bruk begge par av tenger for å lage et lite innsnitt eller hakk, på motsatte sider av larve mouthhooks mellom den tredje thorax og første fremre denticle bånd.
  7. Ta tak i mouthhooks med pinsett i den ikke-dominante hånd. Bruk pinsett i den andre hånden til å forsiktig skrelle bort skjellaget i en anterior-til-posterior retning. Fortsett å sakte skrelle bort hårstråene til det sentrale nervesystemet er utsatt.
  8. Isoler det sentrale nervesystemet fra resten av larven ved å rive vev med pinsett. Vær forsiktig for ikke å forstyrre det sentrale nervesystemet.
    Kritisk trinn: Ikke dra på sentralnervesystemet! Kast ødelagte prøver med en revet ventral nerve ledningen (Figur 2A) eller forvrengte optiske fliker (Tall 2B og 2B ').
  9. Gjenta de to siste trinn for alle larver på dekkglass. Overfør sunt eksplantert vev tilandre (ren) pool av medium på dekkglass for den fine disseksjon scenen.
  10. Bruk dissekere pin verktøy for å rydde vekk de perifere vev (f.eks, øye, vinge, og leg-plater) fra hjernen. Skyv skalpell mellom ønsket (hjernen) og uønsket vev, låsing bindevevet til dekkglass. Bruk kroken forsiktig erte bort uønsket vev mens samtidig å trykke på skalpell til dekkglass i saw-lignende bevegelser.
  11. Kritisk trinn: Arbeid sakte og bevisst for å fjerne alle plater fra hver hjernen. Vær forsiktig for ikke å forstyrre hjernens morfologi. En sunn hjerne vil ha en intakt ventral nerve ledningen og symmetrisk, runde Optiske fliker (figur 2C).

Tre. Montering eksplantert Brains for Live Imaging

  1. Invertere en 50 mm gasspermeabelt kultur fatet med klar film vendt opp (figur 2D). Trykk sprøyten å sette en liten dråpe (ca. 30 mL) av medium på than midt på fatet.
  2. Overfør de isolerte hjerner, ett om gangen, til slipp av medium på fatet. Bruk kroken verktøy til å skyfle opp en hjerne under de optiske fliker. Alternativt kan du bruke tang til å gripe axons utstikk fra ventrale nerve ledningen.
  3. Samle 5-10 hjerner i dråpe medium. Senk hjernene ved hjelp av dissekere pinne verktøy for å presse de enkelte hoder i bunnen av dråpe medium som mange av dem vil bli fanget på menisken (figur 2E).
  4. Orienter hjernene ved hjelp av dissekere pinne verktøy for å justere hjerner avhengig av NBS som skal avbildes (figur 3A). Til image dorsal NBS, plasserer den ventrale nerve ledningen vendt nedover (langs membranen). Skal avbilde anterio-ventral NBs, plassere hjernen med den ventrale nerve ledningen vendt oppover (vekk fra membran). Rett hjernen slik at alle de ventrale nerveledninger peker i samme retning innenfor xy-planet.
  5. Bruk en sprøyte eller plast overføring pipette å plassere fire halogenkarbon (HC) olje-dråper (omtrent 30 mL hver) på gass-permeabel membran. Volumet av hver dråpe olje bør være ekvivalent med hverandre og med slipp av medium. Mellomrom på oljedråpene slik at det svarer til de fire hjørner av et dekkglass sentrert rundt dråpe dyrkning medium. Når prosessen er ferdig, vil de fem dråper (fire dråper olje og en dråpe av medium i midten) ligne de fem fasetter om Western-style terninger (Figur 3B).
  6. Senk en # 1,5 22 mm dekkglass på montasjen slik at den treffer alle 5 dråper ved samme tidspunkt. Opprettholde et jevnt trykk over prøvene reduserer sannsynligheten for at de vil bli forstyrret. Vent i omtrent 3 minutter i olje-og mellom dispergere under vekten av dekkglasset. En cross-lignende form av media vil danne (Tall 3C og 3D).
  7. Kritisk trinn: Senk dekkglass på overflaten av hjernen ved å fjerne overflødig medier med en silkepapir veke (Figure 3C). Gjør dette mens du ser på prøven under dissekere omfang. Som media er fjernet, vil dekk lavere. Stopp når dekk berører hjernen. Ikke over-veke, da dette vil føre til at vevet forvrengning eller hjerne eksplosjoner.
  8. Hvis bildebehandling dorsal NBS (figur 3E), går videre til trinn 3.9. Hvis bilde anterio-ventral NBs, må dekk bli litt beveget (ved forsiktig tulle med tang) i retning av ventrale nerve ledningen tips. Dette fører til hjernen til å rotere, noe som bringer de hjernelapper i direkte kontakt med dekkglass for å lette avbildning (figur 3F).
  9. Forsegl kammeret ved å omslutte dekkglass med små mengder av halogenkarbon olje (figur 3D). Overflødig olje oser fra dekkglass bør begrenses, og utslettet bort med en vev.

4. Levende Imaging av sentrale hjernen neuroblasts

Merk: For dette arbeidet, et Nikon Eclipse Ti spinne-diskkonfokal mikroskop (invertert mikroskop) ble anvendt for direkte avbildning; detaljer om vårt oppsett har tidligere blitt publisert 31. Alternativt kan prøven avbildes ved hjelp av en opprettstående system.

  1. Legg en dråpe immersjonsolje til dekk like over de monterte hjerner. Dette vil bidra til å sentrere målet direkte over prøven.
  2. Kritisk trinn: opprettholde hjerner ved en konstant temperatur på 25 ° C med en scene inkubator. Forsiktig posisjonere montert prøven inn i scenen inkubatoren og dekker kammeret med sitt lokk.
  3. Finn sentrale hjerne NBs hjelp overført lys ved å fokusere på de store, runde celler som finnes i de sentrale og mediale deler av de optiske lapper, ikke bruk epi-fluorescens. Dette blir lettere med praksis. Det er svært viktig å utsette prøven til den minste mengden av lys som mulig. Ikke kast bort tid bildebehandling hjerner som er skadet.
  4. En gang på plass, ta raske eksponeringer ved hjelp av confocal tilbestemme riktig sted og dybde. Begrense dybden til den første 10 til 15 mikrometer. Juster etter behov, og ta en ny test image.
    1. Valgfritt trinn: Samle en test film av ventral nerve ledningen for å sikre at det ikke xy drift. Hvis det oppdages drift, vente 15-30 min for utvalget å avgjøre. Dersom drift ikke bosette seg i 30 min, forberede en ny prøve. Major drift kan vanligvis spores tilbake til tilsetning av overflødig olje, eller ulik størrelse på olje faller under montering.
  5. For å eliminere axial drift (z-drift) benytte en kontinuerlig automatisk fokusering enhet som bruker en infrarød LED. Alternativt manuelt rette fokusplanet.
  6. Når en NB av interesse er identifisert, fortsett med bildebehandling regime. Som med all levende celle avbildning, mengden av laserlys, eksponeringstid, kamera binning, objektivforstørrelsen, tid og / eller z-trinnintervall må alle være empirisk optimaliseres for et bestemt eksperiment for å svare på spørsmålet for hånden. Målet er å minimere lys damalder og samtidig samle nyttige data. Se diskusjonen for ytterligere veiledning.
    1. Bilde hele volumet av den NB ved å samle 12-14 bilder adskilt av en mikrometer i z-aksen. Juster tidsoppløsningen for å fange opp en eller flere cellesykluser av samme NB. Som en generell retningslinje, bruker 10-30 sek intervaller for enkelt celle syklus bildebehandling og 1-3 min intervaller for flere cellesykluser.
  7. Kritisk skritt Bekreft at prøven er sunt ved å overvåke varigheten av mitose. Hvis mitose tar mer enn 15 min, gå videre til en annen hjerne. En sunn hjerne vil vise mange NBs innenfor samme synsfelt gjennomgår flere runder med mitose. Legg merke til at hver cellesyklus er litt lengre enn den foregående på grunn av lett skade.
  8. Når bildebehandling er fullført, demontere inkubasjon kammer, og kast alt, men de gasspermeable dyrking retter. Skyll kulturskåloverflaten med 95% etanol og tørker godt med en vev. Gjenta to ganger til.

    5. Utarbeidelse av Brains for Immunfluorescens

    1. Samle 20 eller flere eksplanterte hjernene til et 1,5 ml rør inneholdende tilnærmet 0,2 ml supplert medium.
    2. Fjern mediet fra røret og skyll hjerner en gang med 0,5 ml PBSTx (Phosphate Buffered Saline, PBS med 0,3% Triton X-100). Let hjerner utfeller til bunnen av røret mellom utveksling av væske. Triton X-100 vaskemiddel brukes til permeabilize vev. Skylling vanligvis tar mindre enn 30 sekunder; bare fjerne PBSTx gang hjerner har lagt seg på bunnen av røret.
    3. Sett på løsningen med 0,5 ml av 9% elektronmikros grade paraformaldehyd fortynnet i PBSTx. Inkuber med nutation i 15 min ved romtemperatur.
    4. Kvitt deg med fiksativ i henhold til regelverket for farlig avfall.
    5. Vask prøvene med 0,5 ml PBSTx i 15 min. Gjenta vasketrinn med fersk PBSTx to ganger til.
    6. Bytt løsningen med 0,5 ml PBT (PBS, en% Bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% Tween-20). Inkuber med nutation for en time ved romtemperatur. Dette trinn blokkerer den ikke-spesifikk binding av antistoff til vevet.
    7. Sett oppløsning med 0,5 ml primært antistoff fortynnet i PBT supplert med 4% normalt geiteserum (NGS). Inkuber med nutation natten ved 4 ° C.
    8. Kast eller lagre den fortynnede primære antistoff.
    9. Vask prøvene med 0,5 ml PBT i 15 min. Gjenta vasketrinn med fersk PBT to ganger til.
    10. Sett på løsningen med 0,5 ml av modifisert PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Tween-20, og 4% NGS). Inkuber med nutation for en time ved romtemperatur.
    11. Bytt løsningen med 0,5 ml sekundært antistoff fortynnet i modifisert PBT. Inkuber med nutation for to timer ved romtemperatur.
    12. Sett oppløsning med 0,5 ml PBST (PBS med 0,1% Tween-20). Inkuber med nutation i 15 min ved romtemperatur. Gjenta vasketrinn med fersk PBST to ganger til.

    1. Nøye overføre prøvene som en dråpe på en glass-slide, begrenser rulle mot venstre for midten av lysbildet.
    2. Legg til en stor dråpe (omtrent 2 cm i diameter) av monteringsmedium (for eksempel Aqua-Poly/Mount) til midten av lysbildet. Unngå pool av PBST som er mot venstre.
    3. Bruk pinsett til å overføre hjernen fra bassenget av PBST til pool av monteringsmedium. Legge monteringsmedium direkte på toppen av hjernen kan forstyrre deres orientering, og bør unngås.
    4. Under et lysmikroskop, ordne prøvene i monteringsmedium med den siden som skal avbildes opp.
    5. Med raset under lysmikroskop, sakte senke en # 1,5 glass dekkglass på toppen av prøvene. Valgfritt trinn: løsne små luftbobler ved å skyve forsiktig på dekkglass.
    6. Tillat monteringsmedium til å polymerisere i flere timer eller over natten, ved å ligge slides flat, lettbeskyttet, ved romtemperatur.
    7. Lysbilder kan avbildes neste dag, eller lagres før bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Live-imaging har belyst en rekke mekanismer som regulerer NB ACD. Før bilde oppkjøpet, er det nødvendig å bestemme optimale bildeforhold. Det er nødvendig å balansere ramme fange sats med varigheten av levende celle bildebehandling. For fin cellulær analyse, for eksempel økt temporal-og optisk oppløsning kan være nødvendig. Ved å visualisere en enkelt NB cellesyklus (figur 4A), vil hastigheten ved hvilken bildene blir tatt økes uten å innføre photodamage. Vanligvis kan enkelt celledeling hendelser overvåkes på ca 10-30 sek tidsintervaller. En måte å øke den tidsmessige oppløsningen uten å skade vevet er å modulere bildeinnlastingen hastighet. For eksempel kan time-lapse bildebehandling initieres ved en lavere bildefrekvens, som deretter økes ved observasjon av en interessant funksjon eller tidspunkt (Movie 1).

Imaging suksessive runder med celledeling ( (figur 4B). Vi vanligvis bilde flere (to eller flere) runder med ACD gjennom hele NB cellevolum på 1-3 min tidsintervaller i løpet av en periode på 2-3 timer. Både tidsmessig oppløsning og bildeinnhentingsperioden kan bli bedre ved å begrense mengden av lys som treffer prøven. For eksempel kan time-lapse avbildning av suksessive NB divisjoner utvides i overkant av åtte timer om bare en enkelt optisk flyet er fotografert. Et utvalg av særlig nyttige transgene linjer for studiet av NB ACD er oppført (Tabell 1) 16, 31, 34-38.

For analyse av store antall prøver, er det ofte nødvendig å analysere faste NBS. Vår fiksering protokoll bevarer den totale morfologi av NBS og er kompatibel med immunfluorescens-analyser (figur 4C-4E). Hele montere fast brains kan bli fotografert ved lav forstørrelse (Figur 4C) for å visualisere den samlede hjernestørrelse og form, eller å oppdage NBS. For å visualisere NBs eller deres avkom GMC i mer detalj, må høyere forstørrelse brukes. Ved moderat forstørrelse (Figur 4D), kan hele NB avstamning klynger holdes. For detaljert cellular analyse, er høyere forstørrelse brukt (figur 4E).

Figur 1
Figur 1 eksplantere Hjernene for live cell imaging av NB ACD.. A) Larvesentralnerve-systemet består av to optiske fliker og en ventral nerveledning. To undergrupper av NBS fylle syns lapp i stereotype stillinger:. Type I (mørk blå) og Type II (lys blå) B) NBs gjennomgå ACD. Med hver celledeling, denNB spalter for å gi opphav til en GMC (eller INP, ikke vist), og regenererer NB stamcelle. GMC vil dele seg å gi opphav til to neuroner (eller glia, ikke vist). C) To mikrodisseksjon verktøy er satt sammen ved å sette inn dissekere pinnene i pinneholdere. Bøye pinnene skaper unike verktøy, en skalpell og en krok, som brukes til å kutte, pierce, og fortrenge uønsket vev uten å skade den underliggende hjerne. D) Brains er eksplantert inn i en av to bassenger av dissekere media (blå sirkler). En pool av mediet brukes til å fjerne sentralnervesystemet fra larver (brutto disseksjon), og det andre basseng benyttes for fine mikrodisseksjon av perifere vev fra eksplanterte hjerner (fin disseksjon).

Fig. 2
Figur 2. Preservasjon av hjernen morfologi under microdissection. Hasty hjernen disseksjon kan indusere alvorlig vevsskade som omfatter (A) revet ventrale nerveledninger eller (B) forvrengt optiske fliker. Enda mer subtil vevsskade (B ') bør unngås for live cell imaging. (C) Et eksempel på et sunt vev prøve egnet for direkte avbildning. D) En optisk klar, gasspermeabel membran. E) En samling av flere friske hjerner anordnet i dyrkning medium på en gass-permeabel form. Disse hoder er klar til å monteres for mikroskopi. Skala bar: (AC), 100 mikrometer; (D), 25 mm; (E) 1 mm.

Figur 3
Figur 3. Montering hjerner for live cell imaging. A) Brains er innrettet i rader i en dråpe av dyrkingsmedium avsatt i sentrum av skålen. B) Den dråpe medium er omgitt av dråper av HC olje på omtrent likt volum. De fire dråper HC olje og sentrale dråpe medium likne de fem fasetter av å spille terninger. Etter at et dekkglass er senket ned på oljedråpene, er (C) en veke formet av Kimwipe vev og brukt til sop opp overflødig væske. D) Den ytre kanten av dekkglasset er omgitt av et tynt lag av olje for å stoppe fordampning ved dyrkingen medium. Disse hjerner er nå klar for mikroskopi. E og F) Orienteringen av hjernen i forhold til dekk bestemmer hvilke neuroblasts er tilgjengelige for live cell imaging. E) Dorsal neuroblasts er avbildes ved å arrangere hjernen med ventral side berøre gass permeable membran . F) Anterior-ventral neuroblasts kan bli fotografert av arrAnging hjernen med ryggsiden berører gasspermeabel membran, og deretter nudging dekkglass, og det underliggende vev, i retning av den ventrale nervelednings tips. Denne bevegelsen kan vippes litt de optiske lapper slik at anterio-dorsalflate kontakter dekkglass, og bringer de ønskede bilde aksen i perfekt justering (grønn linje).

Figur 4
Figur 4 Representative resultater fra levende avbildning av skillelinjene neuroblasts. A og B) direkte avbildning av NB stamcelle divisjoner i hele fjellet preparater ved hjelp av en 40X, 1,3 NA olje-nedsenking mål.. Tid vises som min: sek i forhold til starten av time-lapse A) Stills fra time-lapse avbildning av en enkelt celle syklus fra en NB uttrykker GFP-Moesin.(GFP-Moe). Bildeinnlastingen frekvensen av en enkelt celle syklus kan økes for å øke tidsmessig oppløsning uten å indusere photodamage. B) Stills fra time-lapse avbildning av påfølgende celledeling sykluser fra en NB uttrykker både GFP-Moe og en GFP-merket sentrosomen markør. Den lengre periode assosiert med flere cellesykluser nødvendig redusert tidsoppløsning for å unngå photodamage. Legg merke til at tiden mellom hver celledeling øker i løpet av bildebehandling. CE) Confocal projeksjoner av faste stamceller fra hele fjellet forberedelser. C)) Til bilde alle NBs ligger på begge optiske lapper, er 20X forstørrelse brukes. Denne analysen er spesielt nyttig å se på den totale hjerne morfologi og å kvantifisere NB tall (lys blå), etc.) D Flertallet av NBS (rosa) fra en enkelt optisk lobe, kan bli visualisert med 40 ganger forstørrelse. Mikrotubuli, (grønn). E)

Movie en. Levende avbildning av en enkelt NB cellesyklus. Time-lapse bilder av en enkelt NB celledeling fra en hjerne som uttrykker GFP-Moe til å merke cellen cortex. Bildene ble kjøpt fra en enkelt optisk fly på 40X forstørrelse. I denne filmen, ble rammene tatt hver 15 sek. Etter ca 7 min av oppkjøpet, ble satsen økt til ett bilde hver 5 sek. Klikk her for å se filmen.

Movie 2. Levende bilde påfølgende runder of NB ACD. time-lapse bilder av en NB gjennomgår tre runder med celledeling i en hjerne som uttrykker GFP-Moe og en GFP-merket sentrosomen markør. Bildene ble kjøpt på 2 min tidsintervaller på 60X forstørrelse. Klikk her for å se filmen.

Linje Merket Cellestruktur Fluoroforen Expression / Arrangøren Citation
YFP-Asterless Centriole YFP Ubiquitin Rebollo, et al. (2007) Dev. Cell 12:. 467.
SAS6-mCherry Centriole mCherry Endogene Rusan og Peifer (2007) J. Cell Biol. 177
GFP-SAS6 Centriole GFP Endogene (BAC) Lerit og Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013.
GFP-PACT Centriole GFP Ubiquitin Martinez-Campos, et al. J. Cell Biol 165:. 673.
GFP-SAS4 Sentrosomen GFP Ubiquitin Dix og Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759.
GFP-Polo Sentrosomen GFP Endogene . Moutinho-Santos, et al (1999) Biol Cell 91:. 585.
GFP-γ-tubulin 23C Sentrosomen GFP Ubiquitin Lerit og Rusan (2013) J. Cell Biol 202:. 1013.
GFP-Centrosomin Sentrosomen GFP UAS Megraw, et al. (2002) J. Cell Sci 115:. 4707.
GFP-SPD-2 Sentrosomen GFP Ubiquitin Dix og Raff (2007) Curr. Biol 17:. 1759.
mCherry-α-tubulin Mikrotubuli mCherry Ubiquitin Rusan og Peifer (2007) J. Cell Biol 177:. 13.
GFP-α-tubulin Mikrotubuli GFP Ubiquitin . Rebollo, et al (2004) PLoS Biol 2:. E8.
Jupiter-GFP ("G147") Mikrotubuli GFP Endogene Morin, et al (2001) PNAS 98:.. 15050.
mCherry-Jupiter Microtubules mCherry UAS Cabernard og Doe (2009) Dev. Cell 17: 134.
H2AvD-mRFP DNA mRFP Endogene Pandey, et al. (2005) J. Cell Sci 118:. 733.
H2AvD-GFP DNA GFP Endogene Clarkson og Saint (1999) DNA Cell Biol 18:. 457.
Moesin-GFP Kortikale aktin GFP Spaghetti squash Kiehart, et al. (2000) J. Cell Biol 149:. 471.

Tabell 1.. Annen nyttig transgene linjer for studiet av ACD. Disse fusjonskonstruksjoner er spesielt nyttige for å studere celledeling. De blir rutinemessig brukt i NB levende imaging studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Live-cell imaging er en uvurderlig metode som brukes for å studere mekanismene som regulerer ACD av stamceller, differensiering av celle linjene, og morphogenesis av komplekse vev. Selv forskningsgrupper har historisk sett benyttet en rekke teknikker for å visualisere NB ACD, kan disse metodene bli generelt grupperes i to kategorier som primært skiller seg med hensyn til hvorvidt hjernevev er intakt eller dissosiert.

Imaging dissociated NBS har sine fordeler. For ett, dissosiert NBs er lettere å bilde fordi de er spesielt lett å identifisere som de største (ca. 12 mikrometer i diameter) celler i en dyrkning fatet. Videre vil nesten all stamceller som er dyrket på en glassoverflate være like i nærheten av mikroskopobjektiv hele bildeinnhentingsperioden. Den optiske kvalitet av time-lapse bilder er ytterligere forbedret ved bruk av enten poly-L-lysin eller fibrinogen belagt glass for å indusere SEMi-utflating av runde NBS 16, 17. En annen fordel å bildebehandling dissosiert NBs dyrket i kultur er den enkle som dyrking medium kan utveksles. Når cellene holder seg til den belagte glassoverflaten, dyrking medium som inneholder en rekke farmakologiske agonister, antagonister, eller immunoblocking antistoffer, osv.. kan bli lagt til eller fjernet. Endelig har nyere tilnærminger for å visualisere dissosiert NBs vist at denne teknikken er faktisk mottagelig for langvarig image oppkjøpet 18, 19.

Likevel, ulempene til bildebehandling dissociated NBs inkluderer kompleksiteten i protokollen. De fleste metodene detaljert langvarig (30 til 60 min) kjemisk fordøyelse, etterfulgt av en lang inkubasjon trinn (60 min) for å tillate dispergerte celler til å slå seg og holder seg til dyrking fatet 17, 19.

I motsetning til dette avbildnings NBS fra et intakt hjernen bevarer bådefysiologisk sammenheng, og morfologien av vevet. Fordelene til denne tilnærmingen inkluderer muligheten til å identifisere spesifikke NB linjene som utvikler seg i stereotype ordninger eller ved definerte utviklingsmål ganger ett. Derfor har vår forenklet protokoll verktøy som strekker seg utover studier av ACD, som gjør det mulig også for live etterforskning av differensiering og morphogenesis hendelser. En ulempe med denne fremgangsmåte er imidlertid den manglende evne til å utveksle dyrkning medium. Derfor må forskere interessert i langsiktige avbildning av suksessive stamcelle divisjoner vurdere tilnærming (dissociated primære kultur versus hele fjellet) som passer best til deres søknad. Likeledes nødvendigheten for dyrking additiver, så som insulin eller serum, bør bestemmes empirisk basert på de bildedannende betingelser (varighet av avbildning, mengden av lys som treffer prøven, etc.) Og eksperimentelt oppsett.

Generelt anbefaler vi å benytte dissociated NBs for studier der det er nødvendig å vurdere den akutte responsen NBS til innføring av små molekyler (f.eks hemmere, osv..), for høy gjennomstrømning når fin microdissection av hjernen kan være for tungvint, og for avansert bildebehandling studier som krever NB å være i fysisk kontakt med dekkglasset. I kontrast, anbefaler vi utnytte intakte hjerne for applikasjoner hvor det er nyttig å image noen NBs fra samme hjernen, og spesielt for studier som bekymring celle-celle interaksjoner, autonomi, klonal analyse, celle form endringer, og andre undersøkelser der mors miljøet i cellene er viktig.

For å sikre en vellykket utarbeidelse av intakte hjerne for live bildebehandling, må flere viktige skritt være nøye utført. Fremst er det viktig å unngå å utsette vevet for unødvendige traumer. Nærmere bestemt eksplantasjon hjernen og fjerning av perifere vev bør utføres med forsiktighet. Ettbør redusere kontakt mellom de dissekere verktøy og hjernen. Dessuten bør man unngå å trekke eller dra i vev festet til hjernen. Mishandling vevet kan lett resultere i revet eller forvrengt hjerner. I våre hender, NBS fra skadede hjerner sjelden dele. Personer som er ny på larve hjernen disseksjon ofte nytte av å mestre disseksjon før du prøver å forberede prøver for live imaging.

Et annet kritisk punkt i protokollen er monteringen av hjernen før leve celle avbildning. De riktige volumer av både dyrking medium og HC olje er avgjørende for å fullføre en nyttig forberedelse. Selv om det er vanskelig å måle nøyaktig den viskøse hydrokarboner olje med en pipette, kan man ikke nøyaktig den korrekte volum (ca. 30 pl) av øyet. For mye væske hindrer dekkglass fra settling på plass. Ofte resulterer dette i hjernen som beveger seg på overflaten av dyrkning fatet. Under sanntidsavbildning er en ubetalt dekk evibulke når vevet fonner eller syns fliker roll. Prøver som ikke er plassert i stedet bør unngås. Tvert imot, det tilsettes for lite dyrkning medium eller HC olje resulterer i katastrofal skade på vev, inklusive serieoptiske fliker. Det er en nøye balanse mellom å bruke tilstrekkelig flytende medium og olje til å tåle vekten av dekkglass i forhold til ved bruk av for mye væske, noe som fører dekkglass for å gli. Denne balansen er best lært gjennom praksis. Generelt er det best å bare bildet disse hoder som har et sunt morfologi, slik som en intakt nerve ventral ledningen og symmetrisk, runde optiske fliker.

Etter at prøven er montert uten påvisbare drift, holder prøven i live blir den neste kritisk aspekt av denne protokoll. Dette oppnås best ved å opprettholde riktig temperatur og, viktigst, minimere mengden av lys som treffer prøven. Mikroskopet oppsett og prøven er de to variablene som vil styrer suksessen til live celle bildebehandling. Høy kvalitet mål, filtre (~ 98% overføring) og kameraene (back-tynnet elektron multiplisere og Complementary Metal Oxide Semiconductor) på utslippssiden vil gi en for å redusere mengden av lys som treffer prøven i magnetiseringsstrømmen side. Det er velkjent at blått lys (brukes til å avbilde GFP) er meget giftig for celler. Man må finne ut hvor mye total lys (totalt eksponeringstider) en gitt prøve kan tolerere, og deretter spre at total tid langs varigheten av forsøket. For eksempel, hvis en prøve kan bare tolerere 500 laserlys eksponeringer basert på en bestemt mikroskop oppsett, så man kunne samle 50 x 10-slice stabler. Disse stabler kunne bli spredt ut med en min til å samle en enkelt NB cellesyklus, eller 2-3 min å samle ~ 3 cellesykluser. I tillegg optimaliserer innstillingene for hver genotype er avgjørende for vellykket levende avbildning. Under optimalisering perioden, er et godt utgangspunkt for 488 nm laser makt 25-50 μW kommer fra en 100X, 1,4 NA &# 160; olje-nedsenking objektiv. Til slutt må man bestemme hva bildebehandling tilstand vil svare riktig på spørsmålet på hånden, så det er ikke alltid slik at den mest sofistikerte bildebehandling er nødvendig.

For eksperimenter med enten bor eller fast vev, kan hjernen bli montert slik at bildespesifikke NB linjene. For eksempel, for å bildet Type II NBS, som stereotypically ligge i den bakre-midtområde av den optiske lapp 7, ville man montere hjernen, som illustrert i figur 3E. Fordi romlig og tidsmessig mønster av sentrale hjerne NBs har blitt godt dokumentert ett, kan man bruke vår protokoll til bilde en rekke spesifikke NB klynger mens utnytte en rekke av de allment tilgjengelige transgene konstruksjoner som kommer til uttrykk i henhold til allestedsnærværende eller, ideelt sett, endogene arrangører (tabell 1). Likevel, avstamning-spesifikk merking teknologier 20 forbli nyttig for en rekke programmer.Med fast analyse, hjerner med mindre skader er generelt akseptabelt. I tillegg kan fullstendig fjerning av perifert vev utsettes til like før innstøping hjernen i monteringsmedium. Studier med faste vev er spesielt nyttig når store mengder NBS skal avbildes.

I konklusjonen, har studier av NB ACD stor nytte av bruk av både levende celle bildebehandling og detaljert fast analyse. Protokollen skissert her detaljer en tilnærming for å forberede Drosophila larver for enten levende eller faste programmer. Vi forventer en fortsatt etterforskning av NB ACD gjennom detaljerte imaging studier vil avdekke ny og spennende resultater som vil fremme vår forståelse av stamceller i utvikling og sykdom. Anvendelsen av langsiktig direkte avbildning av intakte larve hjerner har potensial til å avdekke ny innsikt i den temporale sekvensen av differensiering og morfogenese hendelser som styrer utviklingen (og Degensjonen) i sentralnervesystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av delingen av egenutført forskning ved National Institutes of Health / NHLBI (1ZIAHL006126) og en LENFANT Biomedical postdoktorstipend tildelt DAL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm Sarstedt 94.6077.410 A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium Invitrogen 21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) Invitrogen 15240-062 A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. 
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long Fine Science Tools 26018-17
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle Fisher Scientific 08-965-A
Syringe filter, 0.22 μm pore size Fisher Scientific 09-719A
Syringe, 5 ml BD Biosciences 309646
Plastic transfer pipette Fisher Scientific S30467-1
Paraformaldehyde, 32% EM-grade Electron Microscopy Sciences 15714 CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Invitrogen D1306 A dye that labels DNA and is excited by UV light.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
  2. Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
  3. Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
  4. Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
  5. Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
  6. Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
  7. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  8. Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
  9. Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
  10. Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
  11. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
  12. Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
  13. Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
  14. Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
  15. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
  16. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
  17. Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
  18. Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
  19. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
  20. Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  22. Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
  23. Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
  24. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
  25. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
  26. Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
  27. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
  28. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
  29. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
  30. Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
  31. Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
  32. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
  33. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
  34. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
  35. Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
  36. Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
  37. Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
  38. Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).

Tags

Neuroscience sanntidsavbildning Neuroblast stamcelle asymmetrisk divisjon sentrosomen hjerne cellesyklus mitose
Live-Imaging av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve neuroblasts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, … More

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter