Abstract
在神经生理学的一个主要挑战是在大脑皮质中表征的许多抑制性细胞类型的响应特性和功能。 在这里，我们分享我们的战略得到稳定的，良好的分离鉴定，从抑制性的单单元记录在麻醉的小鼠皮层利用利马和他的同事开发出1的方法。录音小鼠在特定的神经元亚群表达Channelrhodopsin-2（的ChR2）上进行。该群体的成员是通过它们的响应于蓝光的短暂闪光。这种技术 - 被称为“PINP”，或神经元群体的光刺激辅助识别 - 可以与标准的细胞外记录设备来实现。它可以作为一种廉价的和可替代的钙成像或目视制导修补，用于靶向细胞外记录到确定的转基因细胞中的用途。 ħERE我们提供了一套指引，以优化在日常实践中的方法。我们具体地细化我们的策略用于靶向小清蛋白阳性（PV +）细胞，但已经发现，它适用于其它中间神经元的类型，以及，如促生长素抑制素表达（SOM +）和钙网膜蛋白表达（CR +）的interneurons。
Protocol
注：以下协议是按照卫生指引的国家机构批准的俄勒冈州动物护理和使用委员会的大学。
1.急性手术
- 麻醉用氯胺酮-美托咪定鸡尾酒的动物，通过腹膜内（IP）的注射剂（ 表1）。
注意：在这些实验中使用的小鼠，通过杂交的依赖于Cre的ChR2-EYFP转基因line10到中间神经元驱动线（; SST-iCre12，SOM +;铬iCre12，CR + Pvalb-iCre11，PV +）生成的。病毒递送的ChR2或相关视蛋白的应该同样有效，假设类似的表达水平得到。 - 在开始手术，确保动物展品温柔的脚趾捏没有反应。整个实验过程中重新施用麻醉剂按需要保持此深度麻醉。如果使用注射麻醉剂，可选择植入一个IP导管维护注射。
- 保持水合用生理盐水或乳酸林格氏通过使用适当稀释的麻醉剂鸡尾酒进行维护注射剂（ 表1）在整个试验溶液（大约3毫升/千克/小时），例如动物。
- 将动物在一个立体或其他头部保持装置。确保头骨是安全性很高。这是为维持稳定的单细胞记录必不可少的。
- 适用opthalamic软膏的眼睛，防止干涩。保持体温在36.5-37℃。
- 进行脑池排水的追加记录的稳定性。使用手术刀刀片，从头盖骨的后表面除去组织以暴露小脑延髓池。做一个小切口，在硬脑膜漏脑脊液。使用刀片的唯一的最前端，并避免接触小脑或脑干。
- 使用手术刀，执行一个小开颅手术（〜2 mm 2的）在感兴趣的皮层区域（听觉皮层，大约-2.3毫米后前囟的，中线为4.5mm横向）。
- 去除硬脑膜和覆盖暴露的皮层有一层暖琼脂糖0.5 - 1毫米厚（1.5％琼脂糖中的盐水，0.9％的NaCl;适用于〜37℃）。保持整个实验的琼脂糖湿润通过周期性地施加几滴盐水。
2.录像设置
- 准备钨电极（7-14MΩ，127微米直径，12°锥尖，环氧涂层）。强力胶将电极在玻璃毛细管中，并添加热缩管为把手（ 图1）。
- 安装在电动（或液压）显微电极，设置在旅游垂直于皮质表面。滑动线接地的皮肤下，对颅骨。避免与在头部的侧面和颈背部的肌肉接触，因为它们可以产生肌电工件。
- 放大使用的细胞外安培的电信号适合于单细胞记录里音响器，优选配备一个阻抗检查模式。监控正在进行的扣球活动（带通300 - 5000赫兹）有两个示波器和一组有源音箱。这里，所记录的数据以10kHz的采样速率连续地进行数字化;尖峰离线提取。
- 通过琼脂糖推进电极直到前端到达皮层的表面上。注意这一步通过显微镜。 “零”的显微这个位置。
- 到最佳近似记录的深度，在视觉上确认，在一个渗透的末端抽出电极时电极尖端退出皮质表面处的深度为零。
注：操纵器读取和观察到的电极位置之间的差异表明它已漂移相对于组织。这可以通过脑或动物，或操纵漂移的不稳定性引起的。- 作为一个额外的检查，以确保这个零设定点对应于皮层的表面上，监视刺激诱发电位而穿过组织的第一几百微米前进。当监测场电位，降低细胞外放大器的低带通滤波器的截止到10赫兹。确认该局部场电位的极性反转周围的〜100μm的深度，该层I / II型边界13附近。这是为听觉皮层可靠的参考点，但是它可能不同其它皮层区。
- 安装的光纤耦合到蓝色光源（ 图2）上的手动微操纵。使用显微镜，定位纤维尽量靠近琼脂糖尽可能的表面的前端。居中光束在电极将进入组织。
- 调节光源的具有能够提供一个TTL指定的宽度和所需时间的（晶体管 - 晶体管逻辑）脉冲串的一个控制单元的输出正如一个Arduino（ 图3），一台计算机的I / O卡（如图所示），或市售的脉冲发生器。
- 监测两个示波器的信号。
- 测量总的光功率（mW）在光纤使用功率计的前端。使用此值由纤维芯的横截面面积除以计算照度（毫瓦/毫米2）。首先在10的范围内的强度值- 15毫瓦/毫米2，如果需要向下调整，直到工件被消除。
- 检查光文物在琼脂糖电极，准备进入组织。开始搜索的脉冲串（ 例如，30毫秒的光脉冲，500毫秒刺激间隔（ISI））。
- 消除瞬态光构件（ 图4），通过重新定位纤维相对于电极的光来改变入射光的角度。如果文物仍然存在，请尝试降低光功率。在日Ë极少数情况下的工件不能被完全消除（仅最小化），扩展搜索脉冲的持续时间。这可以识别真正的神经尖峰帮助。
3.直PINP式“
- 通过大脑推进电极慢慢在约1微米/秒的速率。使用一个示波器监测正在进行的活动。另一方面，触发激光脉冲。
- 监听的光诱发尖峰音频监视器上的微弱“散列”，这表明该电极接近的ChR2 +细胞和经常可以感知的电信号是在示波器上明显好之前。放慢前进的速度。
注意：如果该小区直接处于所述电极的路径，光诱发活动将变得更大（响）。作为电极接近单个中间神经元，散列将解析成均匀的尺寸和形状的小而良好定义的峰值。 - 当李向右诱发尖峰大到足以触发单独的示波器，开始这样做。调整在水平轴的缩放来观察尖峰的波形的精确形状。
- 停止并等待组织来解决。抵制诱惑，将电极靠近细胞。本步骤是稳定的记录是至关重要的。如果几分钟之后的信号 - 噪声比并没有得到改善 - 即，组织已经解决，但它并没有使电池的任何靠近电极的前端 - 提前5微米还并再次等待。
- 重复这个过程，直到该峰或动作电位的槽能够可靠地捕获与设置远高于本底噪声（ 例如，+ 300μV或更大）的电压阈值。
注意：有样品瓶抑制性时的误报或不明确的风险很小。大多数细胞可以很容易地跟随脉冲序列具有30毫秒的持续时间和间普勒本质上间隔500毫秒或更快，具有2-5毫秒（ 图5）的可靠第一穗延迟。多数光伏+细胞，尤其是能够维持烧成整整1秒（ 图6）。因为这些都是抑制性神经元，disynaptic（间接）激活是不是一个大问题。
- 重复这个过程，直到该峰或动作电位的槽能够可靠地捕获与设置远高于本底噪声（ 例如，+ 300μV或更大）的电压阈值。
- 在录音时，显示屏上的第一个示波器正在进行的活动。保持的尺寸以及使用所述第二示波器尖峰形状密切关注。注意其对扬声器的声音质量。
- 倾听的突然变化，这表明该细胞要么是画得太靠近电极（它有可能被刺穿或损坏），或者是渐行渐远。如果尖峰变大和变形，退了出去;如果他们变得更小，推进电极。缓慢移动的2微米的步骤。
- 通过叠加所有尖峰的波形相一致的峰值或波谷确认记录事后的质量。改变电压THRES按住。在很宽的范围内的阈值的，应该永远只能是均匀的高度（ 图5a）中的一个一致的尖峰形状。
- 如果在任何点上的信号变成与尖峰从相邻的神经元受到污染，继续前进。前进很慢，就断开的机会，该电极将传递出的相邻小区的范围内，但留在目标神经元的范围。 （这通常是不成功的。）
- 通过皮层（900+微米）在各渗透的整个深度移动电极。如果没有光敏感的神经元被许多穿透，或者反过来，录音污染定期与邻国-CHR 2 - 细胞峰值后出现，尝试一种新的电极。
注意：即使在同一个批次，各电极的阻抗和尖几何形状也有很大差别。这两个因素导致了有效的“侦听半径”的电极，其必须足够大，以检测光诱发尖峰的wh搜索ILE，但限于足以使记录孤立的单一中间神经元。 - 如所希望的测试电极的阻抗。为了避免损坏组织，这样与所述电极中的琼脂糖层的上部的前端，以及外面的大脑。内含有7-14MΩ的范围内，确切的阻抗不是性能，或者收率肯定预测，对于这种应用。这就是说，它是听半径的合理代理：低阻抗电极拿起更多的单位;较高的阻抗，更少。
- 在实验结束时，安乐死的动物通过体制认可的方法，例如麻醉剂过量，或麻醉下的深平面颈脱位。
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Representative Results
在这里，我们分享我们的战略得到单单元录音来自遗传，分类抑制性的麻醉小鼠皮层，利用，利马等[1]。 表1详细建议的麻醉剂鸡尾酒，氯胺酮美托咪定，乙酰丙嗪（开发的光遗传学方法“密匙“）。 图1示出了钨微电极，用于记录制备。 图2中包含的电路图一个简单的LED控制单元; 图3包含配置和代码为选通光输出与一个Arduino微控制器; 图4示出的例子所述光诱导的电工件的协议中进行讨论。文物偶尔遇到（左图），但容易纠正（右图）。 图5显示录音的例子，从三种类型的确定的光的interneurons（PV + CR +和SOM +）。左PANEL表示原始电压迹线和对齐的波形，代表种信号 - 噪声比的一个可以期望获得与该策略。尖峰被可靠地捕捉用的几百微伏的固定电压阈值。栅格图（右图）显示光诱发反应，从而允许明确鉴定的ChR2阳性的interneurons短延时和可靠性。 图6显示电压痕迹从三个PV +的interneurons，回应一个1秒的光脉冲。多数光伏+细胞可以维持高频烧成几百毫秒，这使它们特别容易辨认。
图1.准备电极。 准备好的电极（A）图。该电极是阿菲固定的使用两个小滴强力胶和加速器的最小量（如扎普-它）的玻璃毛细管。热缩套管的抓地力增加，使用非常低的热量。电极通常附带的连接器引脚预先连接。（B）准备好的钨微电极安装在电极夹的照片。
图2。 电路图用于LED控制单元 。用于光传输的简单和便宜的电路。甲超亮发光二极管（475纳米）连接到散热器和连接到一个光纤电缆（直径800微米）的另一端。 LED的输出被选通一个TTL脉冲。所述控制单元包含用于调节光强度的电压模式电源。 2K POT：电位器来控制光的强度。 P / S：直流电源增刊 LY（ 例如 ，笔记本电脑充电器）。提示122：达林顿晶体管。 4N35：光隔离器。这里列出的零件成本<10美元。
图3。 Arduino的代码和配置一个 TTL脉冲序列的门控光输出可以使用一个Arduino单片机产生。该程序规定的脉冲持续时间和ISI为一个循环的脉冲串。说明加载程序到电路板上可以的Arduino的“开始”页面上找到（ http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ）。 请点击这里查看此图的放大版本。
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图4.光神器金属电极很容易受到光的文物，出现在开始和脉冲偏移（左图，滤波后的信号，300 - 5000赫兹）。它们通常可以通过重新定位纤维相对于电极的光来改变入射光的角度，和/或降低的光功率完全（右图）消除。
图5.示例细胞。 （一）从确定的光的interneurons，PV +（紫色），CR +（绿色），SOM +（红色）的典型例子录音。细胞对搜索脉冲序列响应（脉冲持续时间30毫秒，ISI 500毫秒），提供了可靠的突发尖峰。面板的右侧显示100槽对齐的尖峰和。平均插值波形（10×从10kHz的采样速率过取样）（B）的栅格地块为同一文件，显示短延时（〜2 - 5毫秒）。的光诱发的尖峰和一致的定时（C）的均值和第一穗延迟标准差（5 - 10脉冲）为44 PV +的interneurons（平均均值和标准差：3.4 +/- 2.6毫秒）的样本。 请点击这里查看该图的放大版本。
图持续反应6.一个例子可以是特别有信心在确定PV +的interneurons因为他们中的绝大多数能够承受高频发射数百毫秒- 让人联想到他们的反应，当前的射出体外 14。三的ChR2 / PV电池响应于1秒的光脉冲：2定期整个脉冲的整个持续时间触发，并且不小区中的一个不寻常的例子（<遇到细胞的10％）。
| KMA（20.0毫升） | |||
| 加入2ml 100mg / ml的氯胺酮（10毫克/毫升，一旦稀释） | |||
| 0.4毫升的1毫克/毫升Dexdomitor（美托咪定，0.02毫克/毫升，一旦稀释） | |||
| 0.05毫升的100mg / ml的乙酰丙嗪（0.25毫克/毫升，一旦稀释） | |||
| 17.55毫升0.9％盐水 | |||
| 【用法用量，成年小鼠（15 - 64 G） | |||
| 击倒0.012毫升/克*体重（氯胺酮= 120毫克/千克） | |||
| 保养：0.0025毫升/ G *体重（氯胺酮= 25毫克/千克） |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChR2-EYFP Line | Jackson Colonies | 12569 | |
| Pvalb-iCre (PV) Line | Jackson Colonies | 8069 | |
| Sst-iCre (SOM) Line | Jackson Colonies | 13044 | |
| Cr-iCre (CR) Line | Jackson Colonies | 10774 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | Type III-A, High EEO |
| Micro Point (dural hook) | FST | 10066-15 | |
| Surgical Scissors | FST | 14084-09 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 (handle), 10011-00 (blades) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Foster & Smith | 9N-76855 | |
| Homeothermic Blanket | Harvard Apparatus | 507220F | |
| Tungsten Microelectrodes | A-M Systems | 577200 | 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated |
| Capillary Glass Tubing | Warner Instruments | G150TF-3 | |
| Heat Shrink Tubing | DigiKey | A332B-4-ND | |
| Zapit Accelerator | DVA | SKU ZA/ZAA | Use with standard Super Glue. |
| Microelectrode AC Amplifier 1800 | AM Systems | 700000 | |
| MP-285 Motorized Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| 4-channel Digital Oscilloscopes | Tektronix | TDS2000C | |
| Powered Speakers | Harman | Model JBL Duet | |
| Manual Manipulator | Scientifica | LBM-7 | |
| 800 µm Fiber Optic Patch Cable | ThorLabs | FC/PC BFL37-800 | |
| Power Meter | ThorLabs | PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor) | |
| 475 nm Cree XLamp XP-E | DigiKey | XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND | LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com). |
| Arduino UNO | DigiKey | 1050-1024-ND |
References
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Tags
神经科学，第93，光遗传学，Channelrhodopsin，的ChR2，皮质，
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