Abstract
Een grote uitdaging neurofysiologie is de responseigenschappen en functie van vele celtypen remmende kenmerken in de cerebrale cortex. We delen hier onze strategie voor het verkrijgen van een stabiele, goed geïsoleerde single-unit registraties van geïdentificeerde remmende interneuronen in de verdoofde muis cortex met behulp van een methode die is ontwikkeld door Lima en collega's 1. Opnames worden uitgevoerd in muizen die Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specifieke neuronale subpopulaties. De leden van de bevolking worden geïdentificeerd door hun reactie op een korte flits van blauw licht. Deze techniek - aangeduid als "PINP", of fotostimulatie ondersteunde Identificatie van Neuronal Populaties - kan worden uitgevoerd met standaard extracellulaire opnameapparatuur. Het kan dienen als een goedkoop en toegankelijk alternatief calcium imaging of visueel geleide patches, voor de targeting extracellulaire registraties genetisch geïdentificeerde cellen. Here bieden wij een set van richtlijnen voor het optimaliseren van de methode in de dagelijkse praktijk. We verfijnd onze strategie specifiek voor het richten parvalbumine-positieve (PV +) cellen, maar hebben ontdekt dat het werkt voor andere soorten interneuron als goed, zoals somatostatine uiten (SOM +) en-calretinin uiten (CR +) interneuronen.
Protocol
OPMERKING: Het volgende protocol is in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen, zoals goedgekeurd door de Universiteit van Oregon Animal Care en gebruik Comite.
1. Acute Chirurgie
- Verdoven van het dier met een ketamine-medetomidine cocktail via intraperitoneale (ip) injectie (Tabel 1).
OPMERKING: De muizen gebruikt in deze experimenten worden gegenereerd door het kruisen van een cre-afhankelijke ChR2-eYFP transgene Line10 bestuurder lijnen (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +) interneuron. Virale levering van ChR2 of aanverwante opsins moet even goed werken, in de veronderstelling soortgelijke uitdrukking niveaus worden verkregen. - Voor het begin van de operatie, ervoor te zorgen dat het dier vertoont geen reactie op een zachte teen knijpen. Opnieuw toedienen anesthetica gehele experiment noodzakelijk om deze diepte van de anesthesie te handhaven. Als injecteerbare anesthetica, eventueel implanteren ip katheter onderhoud injecties.
- Houd het dier gehydrateerd met zoutoplossing of Ringer lactaat gehele experiment (ongeveer 3 ml / kg / uur), bij voorbeeld met behulp van een geschikt verdund verdoving cocktail voor onderhoud injecties (Tabel 1).
- Plaats het dier in een stereotaxisch of andere head-apparaat voor het houden. Zorg ervoor dat de schedel is goed beveiligd. Dit is essentieel voor het behoud van stabiele single cell opnames.
- Breng opthalamic zalf voor de ogen droog voorkomen. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 36,5-37 ° C.
- Voer een cisternal drain voor extra opname stabiliteit. Met behulp van een scalpel, verwijdert weefsel uit de achterste gezicht van de schedel naar de cisterna magna bloot. Maak een kleine inkeping in de dura aan de cerebrospinale vloeistof af te tappen. Gebruik alleen het uiterste puntje van het mes, en vermijd contact opnemen met de kleine hersenen of hersenstam.
- Met de scalpel Voer een kleine craniotomie (~ 2 mm 2) over de corticale interessegebied (voor auditievecortex, ruwweg -2,3 mm posterior van bregma, 4,5 mm lateraal van de middellijn).
- Verwijder de dura en bedekken de blootgestelde cortex met een laag warm agarose 0,5-1 mm dik (1,5% agarose in zoutoplossing, 0,9% NaCl; toepassing bij ~ 37 ° C). Houd de agarose vochtig gedurende het experiment door het periodiek aanbrengen van enkele druppels zoutoplossing.
2. Opname Set-up
- Bereid een wolfraam elektrode (7-14 MQ, 127 micrometer diameter, 12 ° conische tip, epoxy-coating). Superlijm de elektrode een glazen capillaire buis en voeg krimpkous grip (figuur 1).
- Monteer de elektrode op een gemotoriseerde (of hydraulische) micromanipulator, ingesteld orthogonaal te reizen naar het corticale oppervlak. Schuif een draad grond onder de huid, tegen de schedel. Contact met de spieren aan de zijkant van het hoofd en de nek ze elektromyografische artefacten kunnen genereren.
- Versterken het elektrische signaal met een extracellulair versterkerli fi er geschikt voor single-unit opnemen, bij voorkeur uitgerust met een impedantie check mode. Monitor lopende stekelige activiteit (band pass 300 - 5.000 Hz) met twee oscilloscopen en een set actieve luidsprekers. Hier worden de opgenomen data continu gedigitaliseerd met een sampling rate van 10 kHz; spikes zijn offline gehaald.
- Vooraf de elektrode door de agarose totdat de punt het oppervlak van de cortex bereikt. Observeer deze stap door een microscoop. "Zero" deze positie op de micromanipulator.
- Om zo goed benaderen de diepte van opname visueel bevestigen dat de elektrode verlaat het corticale oppervlak op een diepte van nul herroeping de elektrode aan het einde van een penetratie.
OPMERKING: een discrepantie tussen de manipulator lezen en de waargenomen elektrodepositie blijkt dat ten opzichte van het weefsel afgedreven. Dit kan worden veroorzaakt door instabiliteit van de hersenen of dier of manipulator drift.- Als extra controle om te verzekeren datDeze zero set-point komt overeen met de oppervlakte van de cortex, monitor-stimulus evoked potentials veld en bevordert tegelijk door de eerste paar honderd micrometer van weefsel. Bij het bewaken van potentials veld, hoe lager de onderste band-pass filter cutoff van de extracellulaire versterker tot 10 Hz. Controleer of de polariteit van de plaatselijke veldpotentiaal keert ongeveer een diepte van ~ 100 urn, bij layer I / II grens 13. Dit is een betrouwbaar referentiepunt voor auditieve cortex, maar eventueel voor andere corticale gebieden.
- Monteer een optische vezel gekoppeld met een blauwe lichtbron (figuur 2) op een handmatige micromanipulator. Gebruik van de microscoop, plaats het uiteinde van de vezel nabij het oppervlak van de agarose mogelijk. Centreer de balk waar de elektrode het weefsel zullen betreden.
- Regel de uitvoer van de lichtbron met een besturingseenheid die in staat is een TTL (transistor-transistor logica) pulstrein opgegeven breedte en DUURn- bijvoorbeeld een Arduino (figuur 3), een computer I / O-kaart (zoals getoond), of een commercieel verkrijgbaar pulsgenerator.
- Bekijk het signaal op beide oscilloscopen.
- Meet totale lichtsterkte (mW) aan het uiteinde van de optische vezel met een energiemeter. Met deze waarde bestralingssterkte (mW / mm2) berekend door deling van de dwarsdoorsnede van de vezelkern. Begin met een intensiteit waarde in het gebied van 10-15 mW / mm2 en naar beneden worden zonodig totdat artefacten geëlimineerd.
- Controleer voor lichte voorwerpen met de elektrode in de agarose, klaar om het weefsel voeren. Start het zoeken pulstrein (bijvoorbeeld 30 msec lichtpulsen, 500 msec interstimulus interval (ISI)).
- Elimineer voorbijgaande lichte voorwerpen (figuur 4) door herpositionering van de optische vezel ten opzichte van de elektrode naar de hoek van invallend licht te veranderen. Als artefacten aanhouden, probeer het verminderen van het licht macht. In the zeldzame geval dat artefacten niet volledig kan worden geëlimineerd (alleen geminimaliseerd), verlenging van de duur van de zoektocht puls. Dit kan helpen bij het identificeren waar neuronale spikes.
3. Straight PINP-in '
- Vooraf de elektrode langzaam door de hersenen op een snelheid van ongeveer 1 um / sec. Gebruik een oscilloscoop om activiteiten te monitoren. Anderzijds leiden van de laserpulsen.
- Luister voor de zwakkeren 'hash' van licht opgewekte spikes op de audio-monitor, die aangeeft dat de elektrode nadert een ChR2 + cel en kan vaak worden waargenomen ruim voor het elektrische signaal is zichtbaar op de oscilloscoop. Vertragen het tempo van de vooruitgang.
OPMERKING: Als de cel ligt direct in het pad van de elektrode, zal het licht opgewekte activiteit groter (en harder) groeien. Als de elektrode benadert één interneuron, zal de hash op te lossen in kleine, maar goed gedefinieerde pieken van uniforme grootte en vorm. - Zodra liGHT-opgewekte spikes zijn groot genoeg om triggeren individueel op de oscilloscoop, beginnen doen. Stel de schaal op de horizontale as om de exacte vorm van de piek golfvorm observeren.
- Stoppen en wachten tot het weefsel om zich te vestigen. Weersta de verleiding om de elektrode dichter bij de cel te verplaatsen. Deze stap is essentieel voor een stabiele opname. Wanneer na enkele minuten de signaal-ruisverhouding te wensen overlaat - dat het weefsel geregeld, maar het is gebracht de cel dichter bij het uiteinde van de electrode - voorschot 5 urn verder en wacht opnieuw.
- Herhaal dit proces totdat de piek of het dieptepunt van de actiepotentiaal op betrouwbare wijze kan worden vastgelegd met een voltage drempel goed gezet boven het ruisniveau (bijvoorbeeld +/- 300 mV of hoger).
OPMERKING: Er is weinig kans op vals-positieven of dubbelzinnigheid wanneer PINPing remmende interneuronen. De meeste cellen kunnen gemakkelijk volgen een reeks pulsen met een duur van 30 msec en inter-pulse interval 500 msec, of sneller, met een betrouwbare eerste piek latentie van 2,5 msec (Figuur 5). De meeste PV + cellen, in het bijzonder kunnen houden afvuren voor een volledige 1 sec (Figuur 6). Omdat dit remmende neuronen, disynaptic (indirect) de activering geen groot probleem.
- Herhaal dit proces totdat de piek of het dieptepunt van de actiepotentiaal op betrouwbare wijze kan worden vastgelegd met een voltage drempel goed gezet boven het ruisniveau (bijvoorbeeld +/- 300 mV of hoger).
- Tijdens het opnemen, monitoren continue activiteit op de eerste oscilloscoop. Houd in de gaten op de grootte en de vorm van spikes met behulp van de tweede oscilloscoop. Let op de kwaliteit van het geluid van de luidspreker.
- Aandachtig luisteren naar abrupte, die aangeven dat de cel ofwel tekening te dicht bij de elektrode (waar het risico loopt doorboord of beschadigd), of wegdrijven. Als de spikes worden groot en vervormd, terug uit; als ze kleiner worden, vooraf de elektrode. Beweeg langzaam in 2 micrometer stappen.
- Controleer de kwaliteit van de opname post-hoc door superpositie van alle spike golfvormen, afgestemd op het piekvermogen of trog. Varieer de spanning Thresvast te houden. Over een breed scala van drempelwaarden, moet er altijd maar één consistente spike vorm van uniforme hoogte (figuur 5a) zijn.
- Als op enig moment het signaal vervuild raakt met spikes van een naburig neuron, gaan we verder. Advance langzaam aan de off-kans dat de elektrode passeert buiten het bereik van de naburige cel, maar blijven afstand van het doel neuron. (Meestal is mislukt.)
- Beweeg de elektrode door de gehele diepte van cortex (900+ pm) in elke verdieping. Als er geen licht-responsieve neuronen worden aangetroffen na vele penetraties of, omgekeerd, worden opnames routinematig besmet met spikes uit naburige ChR2- cellen, probeer een nieuwe elektrode.
OPMERKING: Zelfs binnen één partij, kan de impedantie en tip geometrie van de afzonderlijke elektroden aanzienlijk variëren. Beide factoren dragen bij aan het effectief "luisteren radius" van de elektrode, die groot genoeg is om het licht opgewekte spikes detecteren wh moet zijnile zoeken, maar voldoende beperkt tot opname één interneuron afzonderlijk schakelen. - Test de impedantie van de elektroden naar wens. Om beschadiging van het weefsel te voorkomen, moet deze met de punt van de elektrode in het bovenste gedeelte van de agarose laag, ver buiten de hersenen. Binnen het bereik van 7-14 MQ, de exacte impedantie is niet zeker voorspeller van prestaties of opbrengst voor deze toepassing. Dat gezegd hebbende, het is een redelijke proxy voor het luisteren radius: lagere impedantie elektroden pick-up meer eenheden; hogere impedantie minder.
- Aan het einde van het experiment, inslapen de dierlijke institutioneel goedgekeurd middelen zoals anesthetische overdosis of cervicale dislocatie onder een diep niveau van verdoving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We delen hier onze strategie voor het verkrijgen van single-unit onderzoek van genetisch-geclassificeerde remmende interneuronen in de verdoofde muis cortex, met behulp van een optogenetic methode ontwikkeld door Lima et al. 1. Tabel 1 details de voorgestelde verdoving cocktail, Ketamine-Medetomidine-Acepromazine (" KMA "). Figuur 1 toont een micro-elektrode wolfraam, klaar voor opname. Figuur 2 is een schema voor een eenvoudige LED besturingseenheid. Figuur 3 bevat de configuratie en code voor gating lichtopbrengst met een Arduino microcontroller. Figuur 4 toont een voorbeeld van het-licht geïnduceerde elektrische artefacten besproken in het protocol. Artefacten worden soms aangetroffen (linker paneel), maar gemakkelijk te corrigeren (rechter paneel). Figuur 5 toont bijvoorbeeld opnamen van drie soorten optisch-geïdentificeerde interneuronen (PV +, CR +, en SOM +). De linker panel toont ruwe spanning sporen en uitgelijnd golfvormen, vertegenwoordiger van de aard van de signaal-ruis verhouding kan men verwachten te krijgen met deze strategie. Spikes worden betrouwbaar vastgelegd met een vaste spanning drempel van enkele honderden microvolts. Een raster plot (rechter paneel) toont de korte wachttijd en de betrouwbaarheid van het licht-reacties van de consument, die het mogelijk maken voor de ondubbelzinnige identificatie van ChR2-positieve interneuronen. Figuur 6 toont spanning sporen van drie PV + interneuronen, het reageren op een 1 sec lichtpuls. De meeste PV + cellen hoogfrequente sustain firing honderden milliseconden, waardoor ze bijzonder gemakkelijk te identificeren.
Figuur 1. Het voorbereiden van een elektrode. (A) Schematische weergave van een geprepareerde elektrode. De elektrode affivaste een glazen capillair buisje met twee kleine druppels Super Glue en een minimale hoeveelheid versneller (zoals Zap-It). Krimpkous is toegevoegd voor grip, met behulp van zeer laag vuur. Elektroden worden doorgaans geleverd met een connector pin gemonteerd is. (B) Foto van een voorbereide wolfraam micro-elektrode gemonteerd in een elektrode houder.
Figuur 2. Schakelschema voor een LED-controle-eenheid. Een eenvoudig en goedkoop circuit voor lichte levering. Een super heldere LED (475 nm) wordt een koellichaam en verbonden met het andere uiteinde van een glasvezelkabel (800 um diameter). De uitgang van de LED afgesloten met een TTL pulse. De besturing is voorzien van een voltage-mode stroomvoorziening voor instelbare lichtintensiteit. 2K POT: potentiometer om de lichtintensiteit te regelen. P / S: DC power supp ly (bijvoorbeeld laptop lader). TIP 122: Darlington transistor. 4N35: Optische isolator. De hier genoemde onderdelen kosten <$ 10.
Figuur 3. Arduino code en configuratie. Een TTL puls trein voor het poorten lichtopbrengst kan worden gegenereerd met behulp van een Arduino microcontroller. Het programma geeft een pulsduur en ISI voor een looping pulstrein. Instructies voor het laden van het programma op het bord is te vinden op pagina Arduino's "Aan de slag" ( http://arduino.cc/en/Guide/HomePage ). Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
igure 4 "fo: content-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 51757 / 51757fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figuur 4. Licht artefact Metalen elektroden gevoelig voor licht artefacten tevens bij de aanvang en de offset van pulsen (linker panel, gefilterde signaal, 300 - 5000 Hz). Zij kunnen gewoonlijk volledig (rechter paneel) worden geëlimineerd door herpositionering van de optische vezel ten opzichte van de elektrode naar de hoek van invallend licht te veranderen, en / of verlagen van het lichtvermogen.
Figuur 5. Voorbeeld cellen. (A) Typisch voorbeeld opnames van optisch-geïdentificeerde interneuronen, PV + (paars), CR + (groen), SOM + (rood). Cellen reageren op de zoektocht pulstrein (pulsduur 30 ms, ISI 500 ms) met een betrouwbare uitbarsting van spikes. Het paneel aan de rechterkant toont 100-trog uitgelijnd spikes en. de gemiddelde geïnterpoleerd golfvorm (10x overbemonsterde van een sampling rate van 10 kHz) (B) Raster kavels voor dezelfde bestanden tonen de korte latency (~ 2-5 msec). en consistente timing van licht opgewekte spikes (C) Gemiddelde en standaardafwijking van eerste-spike latencies (5-10 pulsen) voor een steekproef van 44 PV + interneuronen (gemiddelde gemiddelde en de standaarddeviatie: 3.4 +/- 2.6 msec). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Voorbeelden van aanhoudende responsen Men kan vooral vertrouwen identificeren PV + interneuronen als het merendeel hoogfrequent stoken kan volhouden honderden milliseconden -. Denken aan hun reacties op huidigeinjectie in vitro 14. Drie ChR2 / PV cellen reageren op 1 sec lichtpulsen: twee die regelmatig gedurende de gehele duur van de puls vuur en een ongebruikelijk voorbeeld van een cel die niet reageert (<10% van de cellen aangetroffen).
| KMA (20,0 ml) | |||
| 2 ml van 100 mg / ml ketamine (10 mg / ml, eenmaal verdund) | |||
| 0,4 ml van 1 mg / ml Dexdomitor (medetomidine 0,02 mg / ml, eenmaal verdund) | |||
| 0,05 ml 100 mg / ml Acepromazine (0,25 mg / ml, eenmaal verdund) | |||
| 17.55 ml 0,9% zoutoplossing | |||
| Dosering, volwassen muis (15-40 g) | |||
| Knock-down: 0,012 ml / g * body mass (ketamine = 120 mg / kg) | |||
| Onderhoud: 0,0025 ml / g * body mass (ketamine = 25 mg / kg) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChR2-EYFP Line | Jackson Colonies | 12569 | |
| Pvalb-iCre (PV) Line | Jackson Colonies | 8069 | |
| Sst-iCre (SOM) Line | Jackson Colonies | 13044 | |
| Cr-iCre (CR) Line | Jackson Colonies | 10774 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | Type III-A, High EEO |
| Micro Point (dural hook) | FST | 10066-15 | |
| Surgical Scissors | FST | 14084-09 | |
| Scalpel | FST | 10003-12 (handle), 10011-00 (blades) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Foster & Smith | 9N-76855 | |
| Homeothermic Blanket | Harvard Apparatus | 507220F | |
| Tungsten Microelectrodes | A-M Systems | 577200 | 12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated |
| Capillary Glass Tubing | Warner Instruments | G150TF-3 | |
| Heat Shrink Tubing | DigiKey | A332B-4-ND | |
| Zapit Accelerator | DVA | SKU ZA/ZAA | Use with standard Super Glue. |
| Microelectrode AC Amplifier 1800 | AM Systems | 700000 | |
| MP-285 Motorized Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| 4-channel Digital Oscilloscopes | Tektronix | TDS2000C | |
| Powered Speakers | Harman | Model JBL Duet | |
| Manual Manipulator | Scientifica | LBM-7 | |
| 800 µm Fiber Optic Patch Cable | ThorLabs | FC/PC BFL37-800 | |
| Power Meter | ThorLabs | PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor) | |
| 475 nm Cree XLamp XP-E | DigiKey | XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND | LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com). |
| Arduino UNO | DigiKey | 1050-1024-ND |
References
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
- Moore, A. K., Wehr, M. Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency. J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).
- Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals. Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).
- Markram, H., et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system. Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).
- Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli. Neuron. 73, 159-170 (2012).
- Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo. Nature. 488, 343-348 (2012).
- Letzkus, J. J., et al. A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex. Nature. 480, 331-335 (2011).
- Pi, H. J., et al. Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control. Nature. 503, 521-524 (2013).
- Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. A neural circuit for spatial summation in visual cortex. Nature. 490, 226-231 (2012).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159 (2005).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
- Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553 (2013).
Tags
Neurowetenschappen optogenetics Channelrhodopsin ChR2 cortex,
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
