מדריך ל Published: November 7, 2014 doi: 10.3791/51757

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Alexandra K. Moore¹, Michael Wehr¹

¹Institute of Neuroscience, University of Oregon

Abstract

אתגר גדול בנוירופיזיולוגיה היה לאפיין את מאפייני התגובה ותפקוד של סוגים הרבים של תאים מעכבים בקליפת המוח. אנחנו כאן לשתף את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יציבה, מבודדות היטב יחידה אחת מinterneurons המעכבת שזוהתה בקליפת מוח העכבר הרדים בשיטה שפותחה על ידי לימה ^ו1 עמיתים. הקלטות מבוצעות בעכברים המבטאים Channelrhodopsin-2 (ChR2) בתת אוכלוסיות עצביות ספציפיות. בני האוכלוסייה מזוהים בתגובתם להבזק קצר של אור הכחול. טכניקה זו - המכונה "PINP", או זיהוי סייע-photostimulation של אוכלוסיות נוירונים - יכולה להיות מיושמת עם ציוד הקלטה תאי סטנדרטי. זה יכול לשמש חלופה זולה ונגישה להדמית סידן או תיקון חזותי מודרך, לשם מיקוד הקלטות תאית לתאים גנטיים מזוהים. Here אנו מספקים סדרה של הנחיות לייעול השיטה בפרקטיקה יומיומית. אנו מעודנים האסטרטגיה שלנו באופן ספציפי למיקוד תאי parvalbumin-חיובי (+ PV), אבל מצאנו שזה גם עובד עבור סוגים אחרים interneuron, כגון (SOM +) להביע סומטוסטטין וinterneurons להביע calretinin (CR +).

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא הוא בהתאם למכונים הלאומי לבריאות הנחיות כפי שאושר על ידי אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים אורגון ועדת שימוש.

1. ניתוח חריף

1. להרדים את החיה עם קוקטייל קטמין-medetomidine, באמצעות הזרקת intraperitoneal (IP) (טבלת 1).
   הערה: העכברים משמשים בניסויים אלה נוצרים על ידי חציית line10 המהונדס cre תלוי ChR2-EYFP לinterneuron קווי נהג (Pvalb-iCre11, PV +; SST-iCre12, + SOM; Cr-iCre12, CR +). משלוח ויראלי של ChR2 או opsins קשור צריך לעבוד באותה מידה, בהנחת רמות ביטוי דומות מתקבלות.
2. לפני תחילת ניתוח, להבטיח שמצגי שהחיה לא בתגובת קמצוץ הבוהן עדינה. -לנהל מחדש הרדמה לאורך הניסוי כנדרש בכדי לשמור על עומק זה של הרדמה. אם אתם משתמשים בחומרי הרדמה בזריקות, לחלופין להשתיל צנתר IP לזריקות תחזוקה.
3. לשמור על בעלי החיים התייבשות עם מי מלח או תמיסת רינגר לקטט לאורך כל הניסוי (מיליליטר כ 3 / קילוגרם / שעה), לדוגמא על ידי שימוש בקוקטייל הרדמה מדולל כראוי לזריקות תחזוקה (טבלה 1).
4. מניחים את החיה במנגנון הראש-אחזקת stereotaxic או אחר. ודא שהגולגולת היא מאובטחת היטב. זה חיוני לשמירת הקלטות תא בודדות יציבה.
5. החל המשחה opthalamic לעיניים למניעת יובש. לשמור על טמפרטורת גוף ב36.5-37 ° C.
6. לבצע ניקוז cisternal ליציבות הקלטה נוספת. באמצעות להב סכין מנתחים, הסרת רקמה מן הפנים האחוריים של הגולגולת כדי לחשוף את Magna Cisterna. הפוך ניק קטן בדורה כדי לנקז את נוזל המוח והשדרה. השתמש בקצה מאוד של הלהב, ולהימנע מיצירת קשר עם גזע המוח הקטן או במוח.
7. שימוש באזמל, לבצע פתיחת גולגולת קטנה (~ 2 מ"מ ²⁾ מעל האזור בקליפת המוח של עניין (לשמיעהקליפת מוח, בערך -2.3 מ"מ אחורי של גבחת, 4.5 רוחב מ"מ של קו האמצע).
8. הסר את הדורה ולכסות את הקליפה נחשפה בשכבה של agarose החם 0.5-1 מ"מ עובי (agarose 1.5% בתמיסת מלח, 0.9% NaCl; להחיל ב ~ 37 ° C). שמור לח agarose לאורך כל הניסוי על ידי מעת לעת יישום כמה טיפות של תמיסת מלח.

2. הקלטת סט-אפ

1. הכן אלקטרודה טונגסטן (7-14 MΩ, 127 מיקרומטר קוטר, 12 ° קצה מחודד, מצופה אפוקסי-). דבק מגע אלקטרודה לצינור זכוכית נימים ולהוסיף צינורות חום להתכווץ לאחיזה (איור 1).
2. הר אלקטרודה על micromanipulator ממונע (או הידראולי), להגדיר לנסוע מאונך למשטח קליפת המוח. להחליק קרקע חוט מתחת לעור, על הגולגולת. יש להימנע ממגע עם השרירים בצד של הראש והעורף כפי שהם יכולים ליצור חפצי electromyographic.
3. להגביר את האות החשמלית באמצעות מגבר תאיאה בדיוני li מתאים להקלטת יחידה אחת, מצויד רצוי עם מצב בדיקת עכבה. לעקוב אחר פעילות שוטפת spiking (מעבירי פס תדרים 300 - 5,000 הרץ) עם שני אוסצילוסקופ ומערכת של רמקולים מוגברים. כאן, הנתונים שנרשמו הוא דיגיטציה ברציפות בקצב דגימה של 10 kHz; קוצים מופקים מחובר.
4. לקדם את האלקטרודה באמצעות agarose עד הקצה מגיע לפני השטח של קליפת המוח. שים לב שלב זה דרך מיקרוסקופ. "אפס" עמדה זו על micromanipulator.
5. כקירוב לעומק של הקלטה הטובה ביותר, חזותי לאשר שהקצה האלקטרודה יוצא משטח קליפת המוח בעומק של אפס בעת משיכת האלקטרודה בסוף החדירה.
   הערה: פער בין קריאת מניפולטור ואת המיקום האלקטרודה נצפה מצביעה על כך שהוא נסחף ביחס לרקמה. זה יכול להיגרם על ידי חוסר יציבות של המוח או של בעל חיים, או להיסחף מניפולטור.
   1. כבדיקה נוספת, כדי לוודא שאפס הגדרת נקודה זו תואמת את פני השטח של קליפת המוח, לפקח פוטנציאלים בתחום עורר גירוי תוך קידום דרך כמה מאה מיקרומטרים הראשונים של רקמה. כאשר ניטור פוטנציאל בתחום, להוריד את הפסקת מסנן להקה עוברת התחתונה של המגבר תאי עד 10 הרץ. ודא שהקוטביות של פוטנציאל השדה המקומי הופכת סביב עומק של ~ 100 מיקרומטר, ליד שכבת גבול I / II ^13. זוהי נקודת התייחסות אמינה לשמיעת קליפה, אבל זה יכול להיות שונה לאזורים בקליפת המוח אחרים.
6. הר סיבים אופטיים מצמידים את מקור אור כחול (איור 2) על micromanipulator ידני. שימוש במיקרוסקופ, מקם את קצה הסיב הקרוב אל פני השטח של agarose ככל האפשר. מרכז את הקרן שבה אלקטרודה תיכנס לרקמה.
7. להסדיר את הפלט של מקור האור עם יחידת בקרה מסוגלת לספק TTL (היגיון טרנזיסטור-טרנזיסטור) רכבת דופק של רוחב וduratio צויןn- למשל, Arduino (איור 3), כרטיס שהמחשב / O (כפי שמוצג), או מחולל את דופק זמין מסחרי.
   1. לפקח על האות בשני אוסצילוסקופ.
8. מדידת כוח מוחלט אור (mW) בקצו של הסיב האופטי באמצעות מד כוח. השתמש בערך זה כדי לחשב irradiance (mW / מ"מ ²⁾ על ידי החלוקה בשטח החתך של ליבת הסיב. תתחיל עם ערך עוצמה בטווח של 10-15 mW / ² מ"מ ולהתאים כלפי מטה במידת צורך, עד שחפצים בוטלו.
9. בדקו חפצי אור עם אלקטרודה בagarose, על סף כניסה לרקמות. התחל רכבת דופק החיפוש (לדוגמא, 30 הבזקי אור msec, 500 מרווח interstimulus msec (ISI)).
   1. לחסל את החפצים חולפים אור (איור 4) על ידי מיקום מחדש של סיבים האופטיים ביחס לאלקטרודה כדי לשנות את הזווית של אור האירוע. אם חפצים להתמיד, נסה להקטין את כוח האור. בהדואר מקרה נדיר שממצאים לא ניתן למנוע לחלוטין (רק ממוזערים), להאריך את משך הזמן של דופק החיפוש. זה יכול לסייע בזיהוי קוצים עצביים אמיתיים.

3. PINP-בישר '

1. לקדם את האלקטרודה באיטיות דרך המוח בשיעור של כ 1 מיקרומטר / sec. השתמש אוסצילוסקופ אחד כדי לפקח על פעילות שוטפת. מצד השני, לעורר את פעימות הלייזר.
2. תקשיב ל'החשיש 'הקלוש של קוצים אור עורר על צג השמע, אשר מציין כי האלקטרודה מתקרבת תא ChR2 + ולעתים קרובות יכולה להיתפס גם לפני האות החשמלי ניכרת באוסצילוסקופ. להאט את קצב ההתקדמות.
   הערה: אם התא נמצא בדיוק במסלול של האלקטרודה, פעילות האור עורר תגדל גדולה יותר (ויותר). כמו האלקטרודה גישות interneuron אחת, החשיש יפתור בצורת קוצים קטנים אך מוגדרים היטב בגודל ובצורה אחידים.
3. ברגע שliקוצים עוררים ght הם גדולים מספיק כדי לעורר את של בנפרד על אוסצילוסקופ, תתחיל לעשות זאת. התאם את קנה המידה על הציר האופקי כדי לבחון את צורתו של גל העלייה החדה המדויקת.
4. לעצור ולחכות לרקמות להתיישב. אל תתפתה להעביר את האלקטרודה קרובה יותר לתא. שלב זה הוא קריטי עבור הקלטה יציבה. אם לאחר כמה דקות את יחס אות לרעש לא השתפר - כי הוא, הרקמה יש התיישבה, אבל זה לא הביא את כל התא קרוב יותר לקצה האלקטרודה - מראש 5 מיקרומטר נוסף ושוב לחכות.
   1. חזור על תהליך זה עד שאחד השיא או השפל של פוטנציאל הפעולה יכול לנפול בפח באופן אמין עם סף מתח להגדיר היטב מעל רצפת הרעש (לדוגמא, +/- 300 μV או יותר).
      הערה: יש סיכון הקטן של שקר-חיוביים או עמימות כאשר PINPing interneurons המעכבת. רוב התאים יכולים בקלות לעקוב רכבת של פולסים עם משך זמן של 30 מילים-שני ובין-pulמרווח se 500 אלפיות שני, או מהיר יותר, עם זמן אחזור ספייק ראשון אמין של 2-5 msec (איור 5). רוב תאי PV +, בפרט, יכול לקיים את הירי לשניות מלאה 1 (איור 6). כי אלה הם נוירונים מעכבים, הפעלת disynaptic (עקיפה) היא לא דאגה גדולה.
5. בעת ההקלטה, לעקוב אחר פעילות שוטפת באוסצילוסקופ הראשון. להשגיח מקרוב על הגודל והצורה של קוצים באמצעות אוסצילוסקופ השני. שים לב לאיכות הצליל שלהם ברמקול.
   1. להקשיב בתשומת לב לשינויים פתאומיים, שמצביעים על כך שהתא הוא גם ציור קרוב מדי לאלקטרודה (שבו מסתכן בכך שפדה או פגומה), או שהוא נסחף משם. אם הקוצים הופכים לגדולים ומעוותת, לסגת; אם הם גדלים קטנים יותר, לקדם את האלקטרודה. לנוע באיטיות ב2 מיקרומטר צעדים.
   2. לאשר את האיכות של פוסט הוק-ההקלטה בגבבם כל צורות גל העלייה החדה, ומיושר לשיא או שפל. להשתנות thres המתחלהחזיק. על פני מגוון רחב של ערכי סף, שלא צריך רק פעם להיות צורת ספייק עקבית אחד בגובה האחיד (איור 5 א).
6. אם בכל נקודת האות הופכת מזוהמת עם קוצים מתא עצב סמוך, להמשיך הלאה. להתקדם לאט לאט, על הסיכוי קלוש שהאלקטרודה תעבור מחוץ לטווח של התא השכן, אך תישאר בטווח של הנוירון היעד. (זה בדרך כלל לא מוצלח.)
7. הזז את האלקטרודה דרך כל העומק של קליפת מוח (900 + מיקרומטר) בכל חדירה. אם אין תאי עצב אור תגובה הם נתקלו לאחר חדירות רבות או, לחלופין, הקלטות מזוהמות באופן שיגרתי עם קוצים מתאי ChR2- שכנים, לנסות אלקטרודה חדשה.
   הערה: גם בתוך אצווה אחת, הגיאומטריה העכבה וקצה אלקטרודות בודדות יכולה להשתנות במידה ניכרת. שני הגורמים משפיע על "רדיוס ההקשבה" האפקטיבי של האלקטרודה, אשר חייב להיות גדולים מספיק כדי לזהות קוצים אור עורר ש"שחיפוש איל, עדיין מוגבל מספיק כדי לאפשר הקלטת interneuron בודד בבידוד.
8. בדוק את העכבה של אלקטרודות לפי הצורך. כדי למנוע נזק לרקמה, לעשות את זה עם קצה האלקטרודה בחלק העליון של שכבת agarose, גם מחוץ למוח. בטווח של 7-14 MΩ, העכבה המדויקת אינה מנבא בטוח בביצועים, או תשואה, עבור יישום זה. שאמרו, זה proxy סביר לרדיוס האזנה: אלקטרודות נמוכה עכבה להרים יותר יחידות; גבוהה עכבה, פחות.
9. בסופו של הניסוי, להרדימו באמצעות אושר-מוסדי, כגון מנת יתר הרדמה, או נקע בצוואר הרחם תחת מטוס עמוק של הרדמה.

Representative Results

אנחנו כאן לשתף את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יחידה אחת מinterneurons המעכבת גנטי-מסווגת בקליפת העכבר בהרדמה, באמצעות שיטת optogenetic שפותחה על ידי ואח לימה אל. ^1. טבלת פרטים 1 קוקטייל ההרדמה הציע, קטמין-medetomidine-Acepromazine (" KMA "). איור 1 מתאר microelectrode טונגסטן, מוכן להקלטה. איור 2 מכילים תרשים מעגל עבור יחידת בקרת LED פשוט. איור 3 מכילים את התצורה וקוד לgating תפוקת אור עם מיקרו-בקר Arduino. איור 4 מראה דוגמא של החפצים החשמליים מושרה האור דנו בפרוטוקול. חפצים מדי פעם הם נתקלו (פנל משמאל), אבל לתקן בקלות (פנל מימין). איור 5 מראה הקלטות דוגמא משלושה סוגים של interneurons אופטית-מזוהה (+ PV, CR +, ו+ SOM). הרשות הפלסטינית עזבהNel מראה עקבות מתח גלם וצורות גל מיושרים, נציג של הסוג של אות לרעש אחד יחס יכול לצפות להשיג עם אסטרטגיה זו. קוצים נלכדים באופן אמין עם סף מתח קבוע של כמה מאה מייקרו-וולטים. עלילת סריקה (פנל מימין) מציגה את חביון ואמינות הקצר של תגובות אור עורר, המאפשרות זיהוי חד משמעי של interneurons ChR2-החיובית. איור 6 מציג מתח עקבות משלוש PV + interneurons, מגיב לאור דופק 1 שניות. רוב PV + תאים יכולים לקיים בתדירות גבוהה ירי של מאות מילי-שניות, מה שהופך אותם קל במיוחד לזהות.

איור 1. הכנת אלקטרודה.   (א) תרשים של האלקטרודה מוכנה. אלקטרודה היא Affiהיה קבוע לצינור זכוכית נימים באמצעות שתי טיפות קטנות של סופר דבק וכמות מינימאלית של מאיץ (כגון זאפ-זה). צינורות חום להתכווץ מתווסף לאחיזה, שימוש בחום נמוך מאוד. אלקטרודות בדרך כלל ספינה עם צילום פינים מצורף מראש. (ב) לmicroelectrode טונגסטן מוכן רכוב בבעל אלקטרודה.

איור 2. תרשים מעגל עבור יחידת בקרת LED. מעגל פשוט וזול לאספקת אור. נורית סופר מבריקה (475 ננומטר) מחוברת לגוף קירור ומצמידה את הקצה השני של כבל סיב אופטי (800 מיקרומטר קוטר). הפלט של הנורית מגודר עם דופק TTL. יחידת הבקרה משלבת כוח אספקת מתח במצב לעוצמת אור מתכווננת. 2K POT: פוטנציומטר כדי לשלוט בעוצמת אור. S / P: supp כוח DC ly (למשל, מטען נייד). טיפ 122: צמד דרלינגטון. 4N35: המבודד אופטי. החלקים המפורטים כאן עלות <$ 10.

איור 3. קוד Arduino ותצורה. רכבת דופק TTL לgating תפוקת אור יכולים להיות שנוצרו באמצעות מיקרו-בקר Arduino. התכנית מציינת משך דופק וISI לרכבת דופק לולאה. ניתן למצוא הוראות לטעינת התכנית על הלוח בעמוד "צעדים הראשונים" של Arduino (http://arduino.cc/en/Guide/HomePage). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

igure 4 "FO: = תוכן רוחב" "src =" 6in / קבצים / ftp_upload / 51,757 / "width =" 51757fig4highres.jpg 600 "/>
. איור 4. חפץ אור אלקטרודות מתכת רגישות לממצאי אור, נכחו בהופעה, ולאחר קיזוז של קטניות (פנל משמאל; אות מסוננת, 300 - 5,000 הרץ). הם בדרך כלל ניתן למנוע לחלוטין (פנל מימין) על ידי מיקום מחדש של סיבים האופטיים ביחס לאלקטרודה כדי לשנות את הזווית של אור האירוע, ו / או להקטין את כוח האור.

איור 5. תאי דוגמא. () הקלטות דוגמא אופייניות מinterneurons אופטית-מזוהה, PV + (סגול), CR + (ירוק), + SOM (אדום). תאים מגיבים לרכבת דופק החיפוש (משך דופק 30 ms, ISI 500 ms) בפרץ אמין של קוצים. הפנל מימין מראה 100 קוצים מיושר שוקת ו. צורת הגל הממוצע אינטרפולציה (10x oversampled מקצב דגימה של 10 קילוהרץ) חלקות סריקה (ב ') לאותם קבצים להראות השהיה הקצרה (~ 2 - 5 אלפיות שני). ותזמון עקבי של קוצים אור עורר (C) ממוצע ו סטיית התקן של השיהוי הראשון-ספייק (5 - 10 פעימות) למדגם של 44 PV interneurons + (ממוצע ממוצע וסטיית תקן: 3.4 +/- 2.6 אלפיות שנייה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6. דוגמאות לתגובות מתמשכים אחת יכול להיות בטוח במיוחד בזיהוי PV + interneurons כמו רובם יכולים לקיים בתדירות גבוהה ירי של מאות מילי-שניות -. מזכיר את התגובות שלהם לנוכחייםהזרקה במבחנה ^14. שלושה תאים ChR2 / PV מגיבים להבזקי אור 1 שניות: שני שיורים באופן קבוע לאורך כל תקופת הדופק, ודוגמא יוצאת דופן אחד של תא שאינו (<10% מתאים נתקלו).

טבלת 1. קטמין-medetomidine-Acepromazine ("KMA"). עקום למטה ומינון תחזוקה לעכבר בוגר, בדילול לשמור על הידרציה. הקוקטייל מחדש מנוהל כל 40 - 90 דקות, במידת צורך.

Discussion

למרות PINP באופן רעיוני פשוט, זה יכול להיות מאתגר בפרקטיקה. הקובע עיקרי של הצלחה הוא הבחירה של האלקטרודה. רדיוס ההאזנה החשמל הוא הפרמטר הקריטי. זה חייב להיות גדול מספיק כדי לזהות קוצים אור עורר כאשר הקצה הוא עדיין במרחק מה מתא ChR2 +, כך שאפשר להתאים את קצב התקדמות בהתאם. באותו הזמן, זה חייב להיות מוגבל מספיק כדי לאפשר בידוד יחידה אחת טוב. כלומר, האלקטרודה אסור גם להרים קוצים מיחידות ChR2- שכנים. את האיזון הנכון במונחים של רדיוס האזנה יהיה אתגר עבור כל סוג תא מטרה, אבל זה נכון במיוחד עבור interneurons המעכבת, שהם דלילים, קטנים, ולעתים קרובות נמצאים בסמיכות לצורת פירמידת תאים, אשר שיש לי תאי גדול יחסית קוצים. אפילו שימוש באסטרטגיות המוצעות כאן, התשואה הצפויה אינה גבוהה. התשואה הטיפוסית שלנו הייתה 0-2 PV + נוירונים / בעלי חיים, ניתנה criterIA בידוד יחידה אחת מצוין והקלטות שנמשכו למעלה מחצי שעה.

כאשר PINPing נוירונים מעכבים, הפעלת disynaptic (עקיפה) היא לא דאגה גדולה, כי נוירונים מעכבים הם יחסית סביר כדי להפעיל בעקיפין תאי פוסט-סינפטי. לPINPing הנוירונים מעוררים, הפעלת disynaptic היא משותפת; נוירונים רבים שהופעלו בתגובה לאור אינו מבטאים ChR2, אלא מקבלים עירור הסינפטי חזק מאלה שכן. אסטרטגיות ל, ישר מפלה מתאי עצב באופן עקיף הופעל הם דנו בפירוט ובאח לימה אל. ^1.

שיקולי אלקטרודה

אנחנו באופן שיטתי בחנו מגוון רחב של אלקטרודות וטכניקות הקלטה: טפטפות תיקון זכוכית עם טיפים בגדלים שונים, microelectrodes טונגסטן שונה בעכבה וגיאומטריה קצה, ומערכים רב-ערוצים (למשל, tetrodes). microelectrodes טונגסטן זוויתי, גבוה impedence(כפי שהוצע כאן) נתן, ללא ספק, את התשואה הטובה ביותר. דיון בסוגיות שהם פגשו בכל אחת מהטכניקות הבאות.

שימוש במערכי tetrode נמוכה עכבה ובדיקות רבת-ערוצית, שזיהינו קוצים אור עורר באופן שיגרתי; עם זאת, הם היו רק לעתים נדירות גדולים מספיק כדי למיין באופן אמין. במילים אחרות, יחס אות לרעש (SNR) היה בלתי מספק. מדי פעם אנו לא מקבלים הקלטות מצוינות עם tetrodes, אבל התשואה האסימפטוטי הייתה גבוהה יותר עם microelectrodes טונגסטן אחת, ואת האיכות של הקלטות הייתה הרבה יותר טובה. הטיפים tetrode הם יחסית בוטים, כמו גם, שהגבילו את המספר הכולל של חדירות אפשריות לכל בעל חיים. הבעיות שאנו נתקלים עם בדיקות רב-ערוצים החמירו כנראה את השימוש בתאורת שטח רחב. בניגוד ממוקד, צריכת חשמל נמוכה גירוי מסיבים מושתלים, תאורת שטח תגרום ירי סינכרוני בChR2 + נוירונים מעבר לאתר ההקלטה, שהובילה לגל עלייה חדה גבישקשה יותר למיין.

אלקטרודות תיקון זכוכית, כמו אלה המשמשים להקלטות מצורפים תא רופפים סטנדרטיים, היו גם לא מתאימות היטב למשימה, אבל מסיבות אחרות. התנגדות נמוכה (<5 MΩ) אלקטרודות תיקון מאוד מוטות לכיוון תאים פירמידליים, שהופך אותו קשה למקד interneurons המעכבת. אמנם זה יכול להיות מתוקן במידה מסוימת על ידי שימוש בעמידות גבוהה יותר (טיפ קטן) אלקטרודות, הבעיה הגדולה יותר עם אלקטרודות תיקון הוא רדיוס ההאזנה המוגבל מאוד שלהם. למרות הקלטות תיקון מצורף תא מספקות יחס אות לרעש גבוה מאוד, לא ניתן לאתר תאי אור מגיב מחוץ למצב מצורף תא. האסטרטגיה עם אלקטרודות תיקון היא, באופן בלתי נמנע, באופן אקראי ורצף להשיג הקלטות מצורפים תא, מעט מאוד מהם ChR2 להביע interneurons המעכבת.

עם אלקטרודות טונגסטן עכבה גבוהה פחית אחתשני לזהות קוצים אור עורר ממרחק, ולהשיג בידוד יחידה אחת טוב. הגיאומטריה של הקצה היא כנראה הגורם החשוב ביותר. ניסינו אלקטרודות טונגסטן משני יצרנים, עם עכבות החל 2-14 MΩ, וזוויות קצה 5-12 מעלות. מצאנו כי 12 מעלות זוויות קצה היו מעולים, אבל זה העכבה המדויקת הייתה פחות חשובה, בטווח של 7-14 MΩ. מצאנו כי אלקטרודות מצופות זכוכית היו רגישות יותר לחפצי אור בהשוואה לאלקטרודות מצופה אפוקסי, לכן אנו ממליצים האחרונים. לא ניסינו לעשות אלקטרודות טונגסטן המותאם אישית שלנו. כמו בכל סוג של אלקטרודה, מצבים שכיחים של כישלון הם לאבד את הבידוד או לפצוע נוירון. פרמטרים קצה שונים לא נראה שיש לו השפעה רבה על זה. במקום זאת, מחכה לרקמות להתיישב הוא הגורם החשוב יותר בשמירת הקלטות באיכות גבוהה.

משלוח אור

מכיוון שהאור משמש רקsa אמצעים לזיהוי תאים ChR2-חיוביים - ולא ויסות התפוקה שלהם באופן ספציפי - בטווח של עוצמות שמישים לצורך הניסוי הזה הוא רחב. גבול תחתון נקבע על ידי העובדה שעוצמת חייבת להיות מספיקה להפעלת תאי ChR2-חיוביים בעומק המרבי של תאי עניין שלך. מצאנו כי irradiances טיפ> 5 mW / ² מ"מ (הנמדד ב470 ננומטר) היו מספיק כדי לעורר תגובה חזקה מPV + תאים בשכבה עמוקה 6. irradiance בעומקים מסוימים בתוך המוח ניתן להעריך באמצעות מחשבון המבוסס על מדידות ישירות ביונקים רקמת המוח (למשל, http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php), אבל אנחנו ממליצים בחום לקביעת רצפה לניסויים משלך באופן אמפירי, באמצעות microelectrode עכבה נמוכה (1 - 3 MΩ, לפעילות multiunit). גבול עליון נקבע על ידי העובדה שגבוהה intensities יכול לגרום להפרעות קלות, שיכול לסבך את זיהוי של קוצים עוררו. בבעלי חיים מהונדסים, עוצמות גבוהות יכולות גם לגרום להפרעות electromyographic על ידי הפעלת ChR2 בPV החשוף + שרירים בצוואר והראש.

בבניית מערכת אספקת אור שלנו, מצאנו כי צימוד LED לסיב אופטי הוא סופו של דבר יותר נוח מאשר הצבת LED ישירות על המוח. האחרון הוא דרך יעילה מאוד כדי להעביר את האור, אבל יש כמה חסרונות מעשיים. הזרם העובר דרך המכשיר מייצר חפצים חשמליים שחייבים להיות מוגן, והנורית יוצרת חום משמעותי שחייבים להיות התפוגג עם גוף קירור גדול. יתר על כן, ממצאי אור (שני פוטו וelectromyographic) הם הרבה יותר קשה לשלוט בדפוס ההארה הרחב של נוריות. צימוד סיבים פותר את כל הבעיות האלה.

Materials

KMA (20.0 מיליליטר)

2 מיליליטר של 100 מ"ג / מיליליטר קטמין (10 מ"ג / מיליליטר, בדילול פעם אחת)

0.4 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר Dexdomitor (medetomidine; 0.02 מ"ג / מיליליטר, בדילול פעם אחת)

0.05 מיליליטר של 100 מ"ג / מיליליטר Acepromazine (0.25 מ"ג / מיליליטר, בדילול פעם אחת)

17.55 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9%

מינון, עכבר בוגר (15-40 ז)

לדפוק למטה: 0.012 מיליליטר / g * מסת גוף (קטמין = 120 מ"ג / קילוגרם)

תחזוקה: 0.0025 מיליליטר / g * מסת גוף (קטמין = 25 מ"ג / קילוגרם)

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChR2-EYFP Line	Jackson Colonies	12569
Pvalb-iCre (PV) Line	Jackson Colonies	8069
Sst-iCre (SOM) Line	Jackson Colonies	13044
Cr-iCre (CR) Line	Jackson Colonies	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook)	FST	10066-15
Surgical Scissors	FST	14084-09
Scalpel	FST	10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment	Foster & Smith	9N-76855
Homeothermic Blanket	Harvard Apparatus	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing	Warner Instruments	G150TF-3
Heat Shrink Tubing	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Use with standard Super Glue.
Microelectrode AC Amplifier 1800	AM Systems	700000
MP-285 Motorized Micromanipulator	Sutter	MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes	Tektronix	TDS2000C
Powered Speakers	Harman	Model JBL Duet
Manual Manipulator	Scientifica	LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Power Meter	ThorLabs	PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND