Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

النمذجة الخلايا النجمية إمراض Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Astrocytomas هي ورم في المخ الأولية الأكثر شيوعا وورم أرومي دبقي (GBM)، والصف الرابع نجمي، هو النوع الفرعي الأكثر شيوعا وعدوانية مع بقاء متوسط ​​من 12-15 شهرا 1،2. غزو ​​astrocytomas منتشر، خاصة GBM، يحول دون الاستئصال الجراحي الكامل، ويحد من فعالية العلاجات المساعدة، وحتما يؤدي إلى تكرار بعد العلاج 3. المرضى في البداية الحالي إما مع دي نوفو (الابتدائي) GBM أو مع انخفاض astrocytomas الدرجة التي يتقدم حتما إلى (الثانوي) GBM 4. GBM هو غير متجانس genomically وتميزت الطفرات يستبعد بعضها بعضا وتحدث المشارك في الجينات التي تتحكم في مسارات الإشارات الأساسية الثلاثة: مجموعة 1 / S (الميزانية العادية) حاجز دورة الخلية، مستقبلات التيروزين كيناز (RTK)، وTP53 مسالك 5-7. يتكون من أربعة أنواع فرعية GBM الجينومية مع ملامح التعبير المتميزة التي تشبه أنواع مختلفة من الخلايا في الدماغ، مما يشير إلى أن GBM هو نوع فرعي influالوسن بواسطة خلية منشئه 6،8،9. مطلوبة نماذج نجمي أفضل لتحديد دور مجموعات محددة من الطفرات في أنواع خلية معينة خلال نجمي المرضية. والاستفادة من هذه النماذج لأكثر كفاءة تطوير العقاقير قبل السريرية تساعد في نهاية المطاف تحسين نتائج المرضى. وتشمل النماذج الحالية نجمي إنشاء خطوط الخلايا البشرية، المريض المستمدة xenografts (PDX)، المعدلة وراثيا الخلايا النجمية الإنسان الطبيعية والخلايا الجذعية العصبية (NSC)، والفئران المعدلة وراثيا (GEM) 10-14. طورنا بديلا، GEM غير الجرثومية (nGEM) نموذج 15 باستخدام خلايا الدماغ الأساسية - الخلايا النجمية القشرية وNSC - تحصد من GEM بإيواء مجموعات مختلفة من الأليلات أنكجنيك floxed. وكان الهدف هو توليد نماذج نجمي مع الخلايا المحددة وراثيا التي يمكن وصفها ظاهريا سواء في المختبر وفي الجسم الحي، وربما استخدامها لتطوير العقاقير قبل السريرية في الاولالفئران مناعية الحكومية المختصة.

خطوط الخلايا البشرية أنشأ هي النموذج الأكثر شيوعا من ورم نجمي المرضية والاستجابة المخدرات في المختبر وفي الجسم الحي، وهي من الناحية الفنية على التوالي إلى الأمام، على نطاق واسع، وقد عرفت حركية وtumorigenicity على xenografting مثلي في الفئران العوز المناعي 10،11،16-18 . ومن عيوبها عدم القدرة على توليد خطوط الخلايا أنشئت من astrocytomas منخفض الدرجة، مما يحد من الدراسة فقط لastrocytomas عالية الجودة؛ عدم وجود خلايا محددة المنشأ؛ وجود تشوهات الجينية المعقدة، وغالبا مع التشكيلات الجينية التي تختلف بشكل ملحوظ من عينة المرضى الأصلي؛ والقابلية للالمظهرية والانجراف الوراثي خلال الثقافة التسلسلية في المصل 11،17،19-22. النتائج المظهرية للطفرات أنكجنيك الفردية في خطوط الخلايا GBM الإنسان المنشأة يمكن ملثمين من قبل العديد من التشوهات التي هي في الواقع الحاضر، والتي غالبا ما يحول دون elucidation من النتائج المباشرة الوراثي، النمط الظاهري.

يتم إنشاؤها من خلال PDX مرور تحت الجلد من خلايا ورم نجمي معزولة المريض في الفئران العوز المناعي أو من خلال ثقافتهم الكروية وغير ملتصقة في تعريفها، وخالية من مصل المتوسطة قبل الحقن مثلي في أدمغة الفئران العوز المناعي 12،23. PDX المحافظة أكثر دقة المشهد الجيني من astrocytomas الإنسان، ولكن على غرار خطوط الخلايا البشرية المنشأة، وأثر المظهري من الطفرات أنكجنيك الفردية يمكن ملثمين بسبب التعقيد الجيني على 19،24. لتحديد عواقب المظهرية للطفرات أنكجنيك محددة، لا سيما في استجابة لعلاجات جديدة، وكثيرا ما تستخدم الألواح من خطوط الخلايا البشرية أنشأ أو PDX لإنشاء الارتباطات الوراثي، النمط الظاهري، وتظهر التعميم، وتقليل احتمال حدوث آثار خط معين الخلية. بينما PDX ألخص بدقة بصمات النسيجية المرضية من astrocytomas الإنسان، المؤتمر الوطني العراقيluding الغزو، xenografts مثلي من خطوط الخلايا البشرية أنشئت عموما لا 21،23،25. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا النجمية الإنسان العادي ومجلس الأمن القومي تم هندستها وراثيا مع الطفرات أنكجنيك محددة لنموذج نجمي تكون الأورام في التجارب المختبرية والحية 13،14،26. هذه الخلايا تفتقر إلى التعقيد الجيني من خطوط الخلايا البشرية القائمة وPDX وألخص بدقة التشريح البشري نجمي، ولكن تتطلب xenografting في القوارض العوز المناعي في الجسم الحي. لأن كل نماذج الخلية البشرية تتطلب المضيفين لمنع القوارض العوز المناعي بوساطة المناعة رفض طعم أجنبي، فشلت هذه النماذج لتلخيص التفاعلات ورم سدى الأم لنظام مسانج وتفتقر إلى نظام المناعة سليمة، مما يحد من التحقيق قبل السريرية المستهدفة سدى والمناعة تغييري العلاجات 10،11.

GEM الفحص تصريح من عواقب المظهري من مجموعات محددة سلفا من مؤتة أنكجنيكستعقد تكون الأورام في الجسم الحي خلال موضعية. في حين GEM غير مشروط لديها طفرات في جميع أنحاء الأنسجة التنمية، GEM مشروط وfloxed الأليلات أنكجنيك التي تمكن استهداف الطفرات عن طريق تقييد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة لأنواع معينة من الخلايا من خلال استخدام نوع معين الخلية المروجين 10،11،15،18. وقد استخدمت مشروط نجمي GEM لتوضيح الأدوار الوظيفية للطفرات أنكجنيك في أنواع الخلايا متميزة داخل الدماغ سليمة 11. الأداة المساعدة قبل السريرية من gliomagenesis في الموقع باستخدام GEM مشروط محدودة بسبب عدد من العوامل بما في ذلك 1) عدم وجود القرين في المختبر، 2) صعوبة في توليد أفواج كبيرة من الفئران مع الأنماط الوراثية المعقدة، 3) كمون طويلة من ورم في تطوير الموقع ، 4) والاستوكاستك تطور الورم. لأنه في الوضع الطبيعي تكون الأورام يفتقر إلى نموذج المقابلة في المختبر، اختبار المخدرات في المختبر لا يمكن إجراء ثإيث التقليدية نماذج GEM المشروطة. على عكس أنواع أخرى من السرطان، ونادرا ما يسببها نماذج GEM مشروطة من astrocytomas بواسطة الطفرات أنكجنيك واحدة 11. ومن ثم يلزم تربية مخططات معقدة لتوليد GEM مشروط مع الطفرات أنكجنيك متعددة. وعلاوة على ذلك، يحدث نجمي بدء مع انتفاذ متغير بعد فترة كمون طويلة في هذه النماذج، في حين تقدم لastrocytomas عالية الجودة يحدث عادة في غير موحدة، الطريقة العشوائية ويعطي في نهاية المطاف إلى نشوء الأورام مع المناظر الطبيعية الجينية المعقدة وحركية النمو السريع 27، 28. وانتفاذ متغير وطبيعة العشوائية من تطور خبيث في نماذج GEM مشروطة يتطلب أن الفئران الفردية يتم فحص التصوير الشعاعي بواسطة لاكتشاف وجود وموقع astrocytomas الدرجة العالية قبل تسجيلهم في التجارب قبل السريرية المخدرات. أخذت معا، وهذه القيود تعوق توليد واختبار أفواج كبيرة من GEM مشروط المطلوبة للعلاقات العامةeclinical اختبار المخدرات.

نظام GEM-TVA تقييمات النتائج والكفاءات، الذي يستخدم فيروسات الطيور (تقييمات النتائج والكفاءات) ناقلات لنقل العدوى GEM هندسيا للتعبير عن مستقبلات الفيروسي (TVA) على أنواع معينة الخلية العصبية، وقد استخدمت على نطاق واسع لنموذج نجمي تكون الأورام 11. على النقيض من GEM مشروط، وهذا النظام يتيح نموذج إدخال الطفرات أنكجنيك متعددة في أنواع خلايا معينة دون الحاجة لخطط تربية المعقدة. ومع ذلك، يقتصر من قبل انتفاذ متغير، شرط لتقسيم الخلايا بنشاط لتحقيق التكامل الفيروسي، والإدراج عشوائي من الجينات المحورة في جينوم المضيف 29.

غير الجرثومية GEM (nGEM) النماذج، التي تستخدم الخلايا تحصد من GEM، أصبحت ذات أهمية متزايدة لأنها التغلب على الكثير من أوجه القصور في أنظمة أخرى نموذج 15. دور الشروع في نوع من الخلايا والطفرات التي تحدث المشارك في نجمي المرضية من الصعب ردعالألغام باستخدام أنشئت خطوط الخلايا GBM الإنسان أو PDX لأنها مستمدة من الأورام في نهاية المرحلة التي تراكمت الطفرات الوراثية واسعة في أنواع الخلايا غير محددة أثناء تطور الخبيث. في المقابل، جميع الصفوف من astrocytomas يمكن نمذجة باستخدام nGEM عن طريق إحداث طفرات جينية محددة داخل أنواع محددة تنقية خلايا الدماغ 11،30. وهكذا، فإن تأثير الطفرات الجينية المحددة ونوع من الخلايا على الظواهر الخلوية والجزيئية يمكن تحديدها في المختبر وفي الجسم الحي. على غرار خطوط الخلايا GBM الإنسان المعمول بها، الأولي في المختبر اختبار المخدرات باستخدام nGEM يمكن استخدامها لتحديد أولويات العقاقير في الجسم الحي اختبار باستخدام الخلايا نفسها. تكون الأورام في الجسم الحي ومن ثم يمكن تحديد بواسطة allografting خلايا nGEM orthotopically في أدمغة تتزاحم مسانج المناعة المختصة 30. ولهذه النماذج طعم خيفي مثلي تسمح في الجسم الحي اختبار ليس فقط من التقليدية السامة للخلايا لالثانية المستهدفة العلاجات، ولكن المناعة تغييري والعلاجات المستهدفة سدى كذلك. أخيرا، يمكن تحديد دور المكروية على بدء الورم والتقدم من خلال مقارنة النتائج بين nGEM ونماذج GEM التقليدية باستخدام نفس الطفرات في أنواع الخلايا نفسها.

نحن وغيرنا قد وضعت نجمي nGEM باستخدام الخلايا الأولية - الخلايا النجمية، مجلس الأمن القومي، أو خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف (OPC) - GEM تحصد من 30-34. كان المبرر وراء تطوير نجمي nGEM لخلق نموذج لتحديد عواقب المظهرية للطفرات أنكجنيك في أنواع معينة من الخلايا التي يمكن استخدامها لاختبار المخدرات قبل السريرية في المختبر والمجراة على الحيوانات في مأمن الحكومية المختصة. نحن حصاد الخلايا النجمية WT ظاهريا القشرية وNSC من غير لجنة المساواة العرقية، معربا، GEM مشروط الحفاظ على> 94٪ C57 / BL6 الخلفية مع مسار floxed RB - RB1 loxP / loxP، أو TgGZT121 - وfloxed RTK / RAS / مسار PI3K - NF1 loxP / loxP، KRAS G12D، PTEN loxP / loxP - الجينات في توليفات مختلفة 35-39. نحن الناجم عن إعادة التركيب الوراثي في المختبر باستخدام ناقلات الفيروسة الغدانية ترميز لجنة المساواة العرقية recombinase. لأن المحاصيل نجمية القشرية تحتوي على خليط من أنواع الخلايا، استخدمنا ناقلات Ad5GFAPCre أو الجينات المحورة أنكجنيك المهيمنة، مثل TgGZT 121 طردوا من المروج GFAP البشري، لإثراء لGFAP + الخلايا النجمية القشرية في هذه الثقافات. حددنا عواقب المظهري من G 1 / S (م ع)، MAPK، والطفرات في الخلايا النجمية مسار PI3K القشرية ومجلس الأمن القومي في المختبر وفي الجسم الحي. MAPK وPI3K تنشيط مسار G1 / S-المعيبة النجمية تحاكي جزيئيا GBM البشري proneural، وعند حقن مثلي، والأورام التي تشكلت في مكان محدد مسبقا مع حركية النمو موحدة، الإختفاء قصيرة، والنسيجيةبصمات القاعدة على الإنسان GBM 30. الرصد الطولي للنمو الورم في الجسم الحي الإيدز قبل السريرية لاختبار المخدرات من خلال تطبيع الأفواج العلاج والتحليل الكمي من نمو الورم في الاستجابة للعلاج 40. نحن مصممون حركية نمو الورم عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي الطولي للفئران حقنت وسيفيراز يعبرون عن الخلايا النجمية القشرية. ولذلك، الخلايا النجمية القشرية وNSC المستمدة من GEM مشروط توفر نظام نموذجي لين العريكة للتعريف عواقب وظيفية من الطفرات المرتبطة نجمي ونظام نموذج محتمل لتطوير العقاقير قبل السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمت الموافقة على جميع الدراسات على الحيوانات من جامعة نورث كارولينا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. التثقيف القشرية النجمية من الفئران حديثي الولادة

  1. إعداد
    1. جعدة 2-3 أنسجة مهمة حساسة ووضع في الجزء السفلي من قارورة تحتوي على 70٪ من الإيثانول. وضع تشريح مقص، ملقط منحني و 2 أزواج من ملقط الصغرى على التوالي في هذه القارورة. وتستخدم الأنسجة لتجنب الانحناء ملقط الصغيرة.
    2. إضافة 1 مل من HBSS الى 60 ملم طبق زراعة الأنسجة. إعداد طبق منفصل لكل حيوان والحفاظ على الأطباق على الجليد.
    3. تخدير الحيوانات في اللوائح المؤسسية.
    4. الحارة 7 مل من DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (DMEM كاملة) لكل حيوان في 37 ° C حمام الماء. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 1.1.1-1.1.4 ~ 15 دقيقة.
  2. الأنسجة الحصاد
    1. التضحية الماوس حديثي الولادة (اليوم 1-3) في institutiاللوائح اونال.
    2. إزالة مقص تشريح من الإيثانول، والسماح لهم بالتنقيط الجافة، وجعل سهمي قطع في الجلد فوق الجمجمة من الحبل الشوكي إلى الأنف.
    3. اجراء خفض في الجمجمة على طول الدرز السهمي، بدءا من الحبل الشوكي وتوسيع الماضي بصيلات الشم. العناية للحفاظ على نصائح مقص بالقرب من السطح الداخلي للجمجمة لتقليل الضرر أنسجة المخ.
    4. باستخدام ملقط المنحني، قشر بلطف كل من نصف الكرة الجمجمة أفقيا بعيدا عن الدماغ.
    5. باستخدام ملقط الصغرى على التوالي، قرصة بلطف بعيدا الجزء الظهري من كل نصف الكرة القشرية ووضعه في طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على HBSS. الحرص على تجنب المخيخ والبصلة الشمية. لا تأخذ أي نوع من الأنسجة تحت الجسم الثفني.
    6. باستخدام مجهر تشريح و 2 أزواج من ملقط الصغيرة، وإزالة بلطف السحايا من كل نصف الكرة القشرية. العودة طبق زراعة الأنسجة لالجليد حتى بداية homogenizatio الأنسجةن.
    7. كرر الخطوات من 1.2.1 خلال 1.2.6 لكل حيوان إضافي. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 1.2.1-1.2.7 ~ 30 دقيقة.
  3. الأنسجة التجانس
    1. باستخدام شفرة حلاقة نظيفة، الزهر ناعما نصفي الكرة الأرضية القشرية ونقل إلى لوحة نسيج الثقافة هود.
    2. نقل الأنسجة إلى مكعبات العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي. غسل لوحة مع 1 مل من الجليد الباردة HBSS ونقل إلى أنبوب يحتوي على الأنسجة.
    3. الانتظار حتى يستقر الأنسجة إلى أسفل الأنبوب، ثم إزالة الزائد بعناية HBSS باستخدام ماصة.
    4. إضافة 2 مل من درجة حرارة الغرفة التربسين / EDTA. ماصة ~ 10X مع ماصة 1 مل لمواصلة تنأى الخلايا.
    5. احتضان تعليق الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 - 20 دقيقة. مزيج بعناية من قبل انعكاس كل 5 دقائق.
    6. إضافة 3 مل من DMEM الكامل لكبح التربسين. ماصة ~ 10X مع ماصة 1 مل لخلط الحل.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. إزالةطاف مع ماصة 1 مل. لا نضح المتوسطة لأن بيليه قد تكون فضفاضة.
    9. Resuspend وبيليه في 4 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM. نقل تعليق خلية إلى 75 سم المسمار أعلى قارورة زراعة الأنسجة. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 1.3.1-1.3.9 ~ 50 دقيقة.
    10. حوالي 16 ساعة بعد الحصاد نجمية، وغسل القارورة مع 4 مل من 37 درجة مئوية HBSS، ثم يضاف 4 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM. الحفاظ على الخلايا النجمية القشرية عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. ملاحظة: الخطوة غسل مهمة لإزالة الخلايا غير ملتصقة والحطام من الطبق الثقافة.
    11. عندما تكون الثقافة هي ~ 95٪ متموجة، يهز ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2، إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا منفصلة، ​​ثم غسل القارورة مع 4 مل من 37 درجة مئوية HBSS. إضافة 4 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM والحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لإثراء الثقافات لالنجمية القشرية، وتلويث الخلايا الدبقية الصغيرة وخلايا دبقية قليلة التغصن السلف تنفصل مع هذا الإجراء ويتم إزالتها من الثقافة 41.
    12. كرر الخطوات 1.3.1-1.3.11 لكل حيوان.
  4. تحريض بالتعديل الوراثي
    1. 24 ساعة بعد الانتهاء من خطوة 1.3.11، استبدل المتوسطة مع 2 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM. إضافة 1 مل من 37 ° C SCM تحتوي على 1 ميكرولتر من> 10 10 PFU / مل من Ad5CMVCre أو Ad5GFAPCre. احتضان لمدة 6 ساعة عند 32 درجة مئوية في 5٪ CO 2 .CAUTION: احتياطات السلامة عند التعامل مع استخدام BSL2 اتش المؤتلف.
    2. إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس وإضافة 37 ° C DMEM كاملة دون الفيروس إلى الخلايا النجمية القشرية. تنبيه: احتياطات السلامة عند التعامل مع استخدام BSL2 الفيروسات الغدية المؤتلف وتجاهل وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس في أنظمة المؤسسية. ملاحظة: للحصول على 5 الثقافات نجمية، الخطوات من 1.4.1 - 1.4.3 سيستغرق ~ 15 دقيقة باستثناء حضانة 6 ساعة.
    3. توسيع الثقافات نجمية القشرية لفيالتجارب المختبرية وتوصيف الجسم الحي. ملاحظة: تحديد وجود الطفرات التالية إعادة التركيب من قبل لجنة المساواة العرقية-PCR مع الاشعال محددة لجين معاد أو immunoblots إما البروتين تحور معين أو إشارات لها عواقب. الوقت اللازم لتحقيق الاستقرار المظهري الثقافات نجمية القشرية بعد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية سوف تعتمد على الطفرات المستخدمة ويجب أن تحدد تجريبيا (الشكل 2).

2. زراعة الخلايا الجذعية العصبية من الفئران حديثي الولادة

  1. إعداد
    1. قبل البدء في تشريح، وإعداد 4 مل من محلول الهضم في الدماغ عن طريق إضافة 3.1 ملغ و 1.3 ملغ غراء السيستين إلى 4 مل تفارق المتوسطة - 98 ملي نا 2 SO 4، 30 ملم K 2 SO 4، 5.8 ملم MgCl 2، 0.25 مم CaCl 2 ، 1 ملم HEPES (من 1 M HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4 الأسهم) 20 ملي الجلوكوز، 0.001٪ الفينول الأحمر، و0.125 ملي هيدروكسيد الصوديوم. إضافة غراءوالسيستين إلى المتوسطة التفكك سوف تتحول الصفراء الحل.
    2. احتضان في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. مزيج دوريا من قبل انقلاب.
    3. إضافة 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم قطرة من الحكمة حتى يعود الهضم حل لإضاءة اللون الأحمر.
    4. في ثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة، وتصفية العقيمة الحل الهضم باستخدام فلتر حقنة (0.22 ميكرون حجم المسام). يبقي الحل الهضم على الجليد.
    5. تحضير 50 ​​مل من الخلايا الجذعية المتوسطة (SCM) عن طريق خلط 44.5 مل NSC بصل متوسطة، 5 مل NSC ملحق، 0.5 مل البنسلين، الستربتومايسين، 50 ميكرولتر 0.2٪ الهيبارين، 10 ميكرولتر 100 ميكروغرام / مل EGF، و 10 ميكرولتر 100 ميكروغرام / مل bFGF. SCM غير مستقر لمدة 1 أسبوع عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
    6. إعداد كامل HBSS (cHBSS) عن طريق خلط 50 مل من 10X HBSS، 1.25 مل 1 M HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4)، 15 مل 1 M D-الجلوكوز، 5 مل 100 مم CaCl 2، 5 مل 100 ملي MgSO 4، و 2 مل 1 M NaHCO 3. جلب الحجم الإجمالي إلى 500 مل مع DDH 2 O.
    7. تصفية تعقيم cHBSS الطرافةهكتار 0.2 ميكرون حجم المسام مرشح وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    8. جعدة 2-3 أنسجة مهمة حساسة ووضع في الجزء السفلي من قارورة تحتوي على 70٪ من الإيثانول. وضع تشريح مقص، ملقط منحنية، و 2 أزواج من ملقط الصغرى على التوالي في هذه القارورة. وتستخدم الأنسجة لتجنب الانحناء ملقط الصغيرة. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 2.1.1-2.1.8 ~ 45 دقيقة.
  2. الأنسجة الحصاد
    1. تضحية حديثي الولادة (اليوم 1-3) في الفئران اللوائح المؤسسية.
    2. إزالة مقص تشريح من الايثانول 70٪، والسماح لهم لبالتنقيط الجاف، واجراء خفض السهمي في الجلد فوق الجمجمة من الحبل الشوكي إلى الأنف.
    3. اجراء خفض في الجمجمة على طول الدرز السهمي، بدءا من الحبل الشوكي وتوسيع الماضي بصيلات الشم. العناية للحفاظ على نصائح مقص بالقرب من السطح الداخلي للجمجمة لتقليل الضرر أنسجة المخ.
    4. باستخدام ملقط المنحني، قشر بلطف كل من نصف الكرة الجمجمة أفقيا بعيدا عنالدماغ.
    5. بلطف إزالة المخ بأكمله ومكان في cHBSS الجليد الباردة.
    6. باستخدام مجهر تشريح، وإزالة بعناية السحايا من الدماغ مع أدوات تشريح غرامة.
    7. وضع الدماغ على سطحه السفلي وإزالة المخيخ / الدماغ المؤخر والبصلة الشمية / القشرة الأمامية مع العمودي (الاكليلية) يقطع مع مشرط حجم 11.
    8. تدوير الدماغ المتبقية بنسبة 90 درجة وضعه على الجزء الذيلية، وبالتالي توليد رأي الاكليلية من الدماغ. تحديد موقع البطينات الجانبية.
    9. قطع قسم تكعيبي تحتوي على منطقة subventricular (SVZ).
    10. نقل SVZ التي تحتوي على الأنسجة إلى 60 ملم الأنسجة صحن الثقافة مع الثلج النقي cHBSS البرد وأنسجة اللحم المفروم مع حجم 11 مشرط.
    11. نقل الأنسجة المفروم إلى العقيمة أنبوب 15 مل. وضع أنبوب على الجليد.
    12. غسل طبق بتري مع cHBSS البرد 1-2 مل الجليد. نقل محلول الغسيل إلى أنبوب يحتوي على الأنسجة.
    13. كرر الخطوات 2.2.1-2.2.12 مع neonata إضافيةل الفئران إذا لزم الأمر. نقل كل 15 مل أنابيب لنسيج الثقافة هود للفترة المتبقية من البروتوكول. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، والخطوات 2.2.1 - 2.2.13 سيستغرق ~ 45 دقيقة.
  3. الأنسجة التجانس
    1. وضع حل الهضم (المعد في الخطوة 2.1.1) في 37 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق. أيضا، دافئة SCM 2 مل في الدماغ في 37 ° C حمام الماء.
    2. إزالة بعناية طاف من الأنسجة المفروم مع ماصة 1 مل. لا نضح.
    3. إضافة 2 مل 37 ° C حل الهضم لكل 15 مل أنبوب وتخلط بعناية من قبل انقلاب.
    4. احتضان في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. مزيج من قبل انعكاس كل 5 دقائق.
    5. إضافة 2 مل أخرى من 37 درجة مئوية حل لكل أنبوب الهضم وكرر الخطوة 2.3.4.
    6. تسمح للخلايا لتستقر في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية، ثم إزالة طاف من هضم الأنسجة باستخدام ماصة 1 مل.
    7. إضافة 2 مل من 10 ميكرومتر E-64 المخفف في cHBSS وتخلط بعناية من قبل انقلاب.
    8. تسمح للخلايا لتستقر في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية، ثم إزالة طاف من الأنسجة هضمها.
    9. إضافة 1 مل من 37 ° C cHBSS والتجانس مع ماصة 1 مل (~ 20 السكتات الدماغية). تجنب حقن فقاعات الهواء خلال تجانس الأنسجة.
    10. تمرير جناسة الأنسجة من خلال 40 ميكرون حجم المسام خلية مصفاة، ثم شطف مصفاة مع 5 مل من 37 درجة مئوية cHBSS.
    11. أجهزة الطرد المركزي لجناسة الأنسجة في 125 x ج لمدة 5 دقائق.
    12. إزالة 95٪ من طاف مع ماصة 1 مل من دون إزعاج بيليه الخلية. بيليه الخلايا و resuspend بعناية في 200 ميكرولتر 37 ° C SCM مع ماصة غيض 200 ميكرولتر.
    13. إضافة 1.8 مل 37 ° C SCM ونقل تعليق خلية إلى بئر العقيمة 6 لوحة جيدا. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 2.3.1-2.3.14 ~ 75 دقيقة.
  4. ثقافة العصبية الخلايا الجذعية
    1. تجديد المتوسطة بعد 3 أيام، وذلك بإضافة 2 مل 37 °C SCM.
    2. بعد 7 أيام، ونقل neurospheres إلى أنبوب 15 مل، والسماح للneurospheres تسوية عن طريق الجاذبية ل> 5 دقائق.
    3. إزالة طاف وإضافة 2 مل 37 ° C SCM.
    4. نقل neurospheres لبئر جديد من لوحة 6 جيدا.
    5. إضافة 2 مل من 37 درجة مئوية SCM كل 3-4 أيام، وتغيير المتوسطة تماما كل 7 أيام.
    6. إذا neurospheres و> 100 ميكرون في القطر، وفصل بعناية مع الخلايا الجذعية حل التفكك وreplate مجلس الأمن القومي في كثافة الخلية المطلوبة.
  5. تحريض بالتعديل الوراثي
    1. إضافة 1 مل من 37 ° C SCM تحتوي على 1 ميكرولتر من> 10 10 PFU / مل من Ad5CMVCre أو Ad5GFAPCre إلى 2 مل من المجلس الأعلى للقضاء حاليا على الخلايا. تنبيه: احتياطات السلامة عند التعامل مع استخدام BSL2 اتش المؤتلف.
    2. احتضان لمدة 6 ساعة عند 32 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
    3. نقل SCM مع neurospheres في أنبوب 15 مل وترك مجالات تسوية عن طريق الجاذبية لمدة 5 دقائق.
    4. إزالة طاف أولا مع ماصة 1 مل، ثم مع ماصة 200 ميكرولتر. تنبيه: احتياطات السلامة عند التعامل مع استخدام BSL2 الفيروسات الغدية المؤتلف وتجاهل وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس في أنظمة المؤسسية.
    5. إضافة 2 مل من 37 درجة مئوية SCM دون الفيروس إلى مجلس الأمن القومي، ثم نقل إلى لوحة 6 جيدا. ملاحظة: للحصول على 5 الثقافات مجلس الأمن القومي، الخطوات 2.5.1-2.5.5 سيستغرق ~ 15 دقيقة باستثناء حضانة 6 ساعة.
    6. في اليوم التالي، كرر الخطوات من 2.5.1-2.5.5، تليها neurosphere الركض عند الضرورة. ويمكن الآن توسيع مجالات لمدة 2-3 الممرات في المختبر قبل توصيف وحقن مثلي في أدمغة فئران في الجسم الحي. ملاحظة: تحديد وجود الطفرات التالية إعادة التركيب من قبل لجنة المساواة العرقية-PCR مع الاشعال محددة لجين معاد أو immunoblots إما البروتين تحور معين أو إشارات لها عواقب. الوقت اللازم لتحقيق الاستقرار المظهري الثقافات NSC بعد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية-سيعتمدعلى الطفرات المستخدمة ويجب أن تحدد تجريبيا (الشكلان 2 و 3).

3. مثلي من حقن الخلايا في الدماغ معاد للمستلم Iimmunocompetent الفئران

  1. إعداد 5٪ ميثيل السليلوز
    1. حل 5 ز 15 من القانون الجنائي السليلوز الميثيل في الماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي من 50 مل في زجاجة 100 مل المسمار الغطاء. إضافة مسحوق ببطء مع التحريك في 4 درجات مئوية لمنع تراكمها. ويمكن ان يستغرق فترة تصل الى 24 ساعة من اثارة في 4 درجات مئوية لجميع السليلوز الميثيل لدخول الحل.
    2. تزن الزجاجة وتسجيل الوزن.
    3. الأوتوكلاف 5٪ الحل السليلوز الميثيل. تعقيمها مرة واحدة، فإن السليلوز الميثيل تصبح مادة هلامية نصف صلب.
    4. تزن الزجاجة وحساب الوزن المفقود خلال التعقيم.
    5. جو معقم و مطهر بإضافة 1 مل من الماء المعقم لكل غرام من الوزن المفقود.
    6. وضع على الجليد وإضافة 50 مل من الجليد الباردة 2X DMEM. </ لى>
    7. مزيج بين عشية وضحاها باستخدام محرك مغناطيسي في 4 درجات مئوية. استخدام تقنية معقمة لتقسيم 5٪ الحل السليلوز الميثيل إلى 20 مل مأخوذة. مخزن aliquots في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر أو حتى انتهاء صلاحية 2X DMEM. ملاحظة: إعداد 5٪ ميثيل السليلوز الحل في الخطوات 3.1.1-3.1.7 سيستغرق ~ 2.5 أيام.
  2. إعداد القشرية النجمية للحقن
    1. الخلايا النجمية القشرية الحصاد عندما ~ 90٪ متموجة.
    2. لموسم الحصاد، نضح DMEM كاملة وغسل الأطباق مع حجم مساو من 37 ° C HBSS.
    3. إضافة التربسين يكفي لتغطية لوحة. إمالة بلطف والاستفادة من لوحة حتى تبدأ الخلايا لفصل.
    4. تعطيل التربسين مع حجم مساو من 37 درجة مئوية استكمال DMEM.
    5. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل وغسل لوحة مع نفس الحجم من 37 ° C DMEM الكامل المستخدمة في 3.2.4.
    6. نقل وسائل الإعلام لغسل الأنبوب الذي يحتوي الخلايا. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق.
    7. نضح قخلايا upernatant وresuspend في 1 مل من 37 درجة مئوية استكمال DMEM.
    8. عد تعليق خلية باستخدام عدادة الكريات أو العداد الخلية المناسبة أخرى لتحديد عدد الخلايا / ميكرولتر.
    9. نقل العدد المطلوب من الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق.
    10. خلايا resuspend في 800 ميكرولتر من 37 درجة مئوية استكمال DMEM. تحديد حجم الكرية خلية (الحجم الكلي للتعليق الخلية - 800 ميكرولتر). ملاحظة: من الضروري لتحقيق تركيز خلية دقيق للحقن. وبالتالي، لا بد من تحديد حجم الكرية خلية في هذه الخطوة من أجل حساب حجم 5٪ السليلوز الميثيل لإضافة في الخطوة 3.2.12.
    11. نقل الخلايا إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge ثم الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق.
    12. نضح طاف من بيليه الخلايا و resuspend الخلايا النجمية القشرية في حجم مناسب من 5٪ السليلوز الميثيل الجليد الباردة (المطلوب السعة الإجمالية - حجمبيليه خلية) للحصول على العدد المطلوب من خلية / ميكرولتر.
    13. وضع الخلايا على الجليد حتى الحقن.
    14. وضع الزجاج حقنة 250 ميكرولتر إلى تكرار مستضد الصيدلي ثم وضع إبرة حادة 18 G على حقنة.
    15. سحب المكبس ببطء مع الإبرة في نجمية تعليق القشرية. سيكون هناك فقاعة الهواء فوق الخلايا التي يجب إزالتها، منذ فقاعات الهواء وضغط ويقلل من حجم حقن فعلا في الدماغ.
    16. عقد رأس الإبرة فقط فوق نجمية تعليق القشرية ودفع المكبس بسرعة. سوف فقاعة الهواء يتحرك أسرع من تعليق خلية وسيتم طرد معظمهم.
    17. تتم إزالة كرر الخطوة حتى 3.2.16 جميع فقاعات الهواء من الإبرة.
    18. ملء الحقنة إلى حوالي ~ 200 ميكرولتر، ثم اضغط الإبرة صعودا وسحب المكبس مرة أخرى حتى يتوقف. يمكن إزالة فقاعات الهواء قليلا من خلال عقد إبرة غيض تصل بسرعة ودفع المكبس في حوالي 50 ميكرولتر ثم تنسحب ببطء إلى طاقتها.
    19. إبقاء طرف تستقيم وكرر الخطوة 3.2.18 4-5x.
    20. تجاهل إبرة قياس 18 وتناسب إبرة 27 G على حقنة.
    21. اضغط على الزر الموجود على موزع المستضد حتى يتم طرد السوائل من الإبرة. ملاحظة: للحصول على 1 نجمية خط الخلية، الخطوات 3.2.1-3.2.21 سيستغرق ~ 60 دقيقة.
  3. إعداد مجلس الأمن القومي للحقن
    1. عندما neurospheres و> 100 ميكرون في القطر، ونقل إلى 15 مل أنابيب والسماح للneurospheres تسوية عن طريق الجاذبية ل> 5 دقائق.
    2. إزالة طاف ويفرق بين neurospheres مع التفكك كاشف طيف، مثل الخلايا الجذعية حل التفكك أو accutase وفقا لتعليمات الجهة الصانعة أو 0.05٪ مع التربسين-EDTA كما هو موضح 42.
    3. تمنع الكواشف التفكك وفقا لتعليمات الشركة المصنعة دون تعريض الأمن القومي للمصل. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو العداد الخلية المناسبة أخرى لتحديد عدد الخلايا / ميكرولتر.
    5. نقل العدد المطلوب من مجلس الأمن القومي إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    6. الخلايا resuspend في 800 ميكرولتر من 37 درجة مئوية HBSS. تحديد حجم الكرية خلية (الحجم الكلي للتعليق الخلية - 800 ميكرولتر). ملاحظة: من الضروري لتحقيق تركيز خلية دقيق للحقن. وبالتالي، لا بد من تحديد حجم الكرية خلية في هذه الخطوة من أجل حساب حجم 5٪ السليلوز الميثيل لإضافة في الخطوة 3.3.9.
    7. نقل الخلايا إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge ثم الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
    8. نضح طاف والانتهاء من إعداد الخلايا لحقن مثلي كما في 3.2.12-3.2.21. ملاحظة: للحصول على 1 NSC خط الخلية، الخطوات 3.3.1-3.3.9 سيستغرق ~ 60 دقيقة.
  4. إعداد الماوس للحقن
    1. تخدير الحيوان المتلقي عن طريق الحقن IP من 250 ملغ / كغ آفيرتين (2،2،2 ثلاثي بروم إيثانول) أو 100 ملغم / كغم من الكيتامين بالإضافة إلى 10 ملغ / كغ زيلازين، في المبادئ التوجيهية IACUC المؤسسية. ملاحظة: المستغلة هي الفئران في 3-6 أشهر من العمر والمضيفين طعم خيفي هنا. الفئران في أعمار مختلفة يمكن استخدامها للتحقيق في تأثير microenvironmental من العمر الدماغ التنموي على تكون الأورام.
    2. حلق فروة الرأس على موقع شق مع كليبرز أو مقص.
    3. تعقيم موقع الجراحة مع 3 مسحات بالتناوب من الايثانول 70٪ وبيتادين.
    4. تطبيق مرهم للعين للعيون لمنع أي ضرر بسبب فقدان طرفة المنعكس.
    5. تقييم عمق التخدير بواسطة دواسة انسحاب (قرصة أخمص قدميه) المنعكس. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 3.4.1-3.4.5 ~ 15 دقيقة.
  5. زرع مثلي
    1. تأمين الحيوان في إطار التجسيمي.
    2. ماكالبريد شق فوق الدرز السهمي حوالي 0.5 سنتيمترا بين الأذنين والعينين.
    3. تحديد موقع على تقاطع الغرز الاكليلية والسهمي (Bregma)، وكذلك تقاطع الغرز اللامي والسهمي (لامدا). ضمان Bregma وامدا هي في نفس المستوى الأفقي.
    4. نعلق حقنة تحتوي على تعليق خلية وتكرار المستضد موزع إلى الإطار التجسيمي على رأسه. جلب رأس الإبرة 27 G في اتصال مع Bregma. هذا هو الأصل الذي سيتم استخدامه للتلاعب من ثلاثة إحداثيات الأبعاد.
    5. رفع الإبرة قليلا قبالة سطح الجمجمة والتحرك 2 مم الجانبية و1 مم منقاري من Bregma.
    6. خفض الإبرة بعناية من خلال الجمجمة لفي الوجهة 4 ملم بطني من Bregma. ملاحظة: نحن تستخدم هذه الإحداثيات المجسم لاستهداف العقد القاعدية. يمكن استخدام الإحداثيات المجسم مختلفة للتحقيق في تأثير microenvironmental المختلفةمناطق المخ على تكون الأورام.
    7. حقن 5 ميكرولتر من تعليق الخلية من خلال تفعيل مستضد موزع التكرار مرة واحدة. ترك الإبرة في مكانها لمدة 2 دقيقة للسماح للتوازن الضغط داخل الجمجمة.
    8. سحب الإبرة ببطء على مدى فترة من 30 ثانية. استخدام مسحة القطن لممارسة الضغط على أي نزيف قد تحدث.
    9. تقريب حواف الجرح وإغلاق الجرح باستخدام لاصق الأنسجة. إدارة 20 ميكرولتر من يدوكائين تحت الجلد في موقع شق. ملاحظة: للحصول على 5 الفئران، وسوف تتخذ الخطوات 3.5.1-3.5.9 ~ 50 دقيقة. وافق UNC IACUC استخدام بعد العملية الجراحية لتخدير موضعي فقط. يوصى بالتشاور مع IACUC المؤسسي المحلي بشأن متطلبات استخدام مسكن بعد العملية الجراحية بعد هذا الإجراء.
  6. رعاية ما بعد الجراحة
    1. وضع الحيوانات في، قفص دافئ نظيف للتعافي. لا ينبغي أن توضع الحيوانات مباشرة إلى الفراش، كما قد تحدث تطلع عرضي.
    2. مراقبةالحيوانات لاستئناف السلوك العادي مثل الاستمالة، وتناول الطعام، والتغوط. ملاحظة: استئناف السلوك العادي يمكن أن ~ 60 دقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قمنا بتطوير نظام نموذج nGEM مع الخلايا النجمية القشرية وNSC تحصد من حديثي الولادة GEM إيواء floxed الأليلات أنكجنيك الشرطية التي يمكن وصفها ظاهريا في المختبر وفي الجسم الحي (الشكل 1). من أجل التحقيق في عواقب الطفرات أنكجنيك تحديدا في الخلايا النجمية القشرية في المختبر، فمن الأهمية بمكان لإثراء الأولى للالنجمية. الحصاد نجمية القشرية تحتوي على خليط من الخلايا الدبقية الصغيرة، النجمية، الخلايا قليلة التغصن، OPC، والخلايا العصبية، ولكن يمكن أن الطرق الميكانيكية والجينية تساعد في تخصيب نجمية. حين تموت الخلايا العصبية في ظل ظروف طبيعية ثقافة، الخلايا الدبقية الصغيرة و oligodendrocytes يمكن إزالتها عن طريق هز 41،43 بين عشية وضحاها. بالإضافة إلى ذلك، إعادة التركيب الجيني للfloxed، الأليلات أنكجنيك تستهدف GFAP + الخلايا النجمية باستخدام Ad5GFAPCre يمكن أن تثري للالنجمية. استخدمنا هذا الأسلوب لتصيب المحاصيل القشرية من الجراء RB1 loxP / loxP GEM مع فلوXED NF1 loxP / loxP و / أو PTEN loxP الأليلات / loxP. تسبب العدوى Ad5GFAPCre ميزة التكاثري في GFAP + الخلايا النجمية معاد، التي زادت نجمية النقاء من 59٪ إلى> 90٪ بعد 5-9 الممرات في الثقافة (أرقام 2A و 2B). بدلا من ذلك، نحن المخصب لالنجمية بالإعراب تي 121 تحت سيطرة المروج GFAP للحث على الاستفادة التكاثري في الخلايا النجمية تحصد من TgGZT 121 الفئران (الشكل 2C). بينما تنمو الخلايا النجمية القشرية ملتصقة إلى الطبق ثقافة (الشكل 2C)، NSC تنمو neurospheres غير ملتصقة في المختبر (الشكل 3A). كلا WT مجلس الأمن القومي ومجلس الأمن القومي مع معاد، floxed الأليلات أنكجنيك - TgGZT 121 (T)، KRAS G12D (R)، وحذف PTEN متماثلة اللواقح (P - / -)، ويشار إلى TRP- / - - تعبير عن علامة Sox2 مجلس الأمن القومي، في حين فقط NSC تحصد من GEM تحتوي على 121 TgGZT التعبير T 121 بعد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة (الشكل 3B).

لتحديد كيفية G 1 / S (الميزانية العادية)، MAPK و / أو مسار PI3K التعديلات تؤثر على نمو GFAP + الخلايا النجمية في المختبر، تم فحص انتشار استخدام طريقتين. أظهر MTS والعد الخلية التي التعبير عن T 121 و KRAS G12D زاد انتشار الخلايا النجمية القشرية (الشكلان 4A و 4B). وبالمثل، متماثل RB1 (الميزانية العادية) وNF1 (N)، جنبا إلى جنب مع حذف متخالف PTEN (P +) الحذف أيضا زيادة انتشار نجمية القشرية (الشكل 4C). الخلايا تحولت لديها قدرة غير محدودة التكاثري. آثار تحويل الطفرات يمكن قياسها في المختبر باستخدام عمودالمقايسات تشكيل بنيويورك. لذا نحن اختبار آثار تحويل من T 121 و KRAS G12D التعبير وحذف PTEN متماثل في TRP - / - الخلايا النجمية القشرية التي كتبها مستعمرة تشكيل الفحص كما هو موضح سابقا 44. في حين أن الخلايا النجمية WT لم تشكل مستعمرات، شكلت T مستعمرات الخلايا النجمية في الكفاءة بنسبة 1.03٪. والجدير بالذكر، TRP - / - كان النجمية أعلى مستعمرة الكفاءة في تشكيل 6.40٪ (الجدول 1). لكي تكون مناسبة لاختبار المخدرات قبل السريرية، فمن المهم أن في نماذج ورم في المختبر يمكن معالجته بسهولة وراثيا. تغيرات جينية إضافية ويمكن إدخال ثابت في الخلايا النجمية القشرية بواسطة بلازميد أو ناقلات فيروسية. كمثال، فإننا transduced ستابلي الجين luciferase المراسل إلى TRP - / - الخلايا النجمية (TRP - / - لوك) باستخدام VSV-pseudotyped pMSCV فيروسات النواقل. التعبير عن وسيفيراز ارتفع التلألؤ ~ 1،000 أضعاف مقارنة مع الخلايا الأبوية ( في المختبر. لقد أظهرنا سابقا أن العلاج مع جرعة منخفضة PI-103، مثبط mTOR س المزدوج / PI3K، PI3K تثبيط الإشارات دون أن يؤثر خلية حيوية 30. ومع ذلك، لم يتم تحديد الآثار السامة للخلايا / تثبيط الخلايا من أعلى PI-103 جرعة. وبالتالي، نحن اختبار ما إذا كانت PI-103 يمكن أن تقلل TRP - نمو نجمية في المختبر - /. تسبب PI-103 انخفاضا القصوى 88٪ في TRP - نمو نجمية الشكل (4E) - /. لقد استخدمت سابقا المغايرة مثلي من TRP - / - الخلايا النجمية لاختبار العلاجات الأخرى ذات الصلة سريريا في الجسم الحي (شميد وآخرون، قدمت مخطوطة.) 45،46. وتشير هذه البيانات إلى أن الخلايا النجمية القشرية تتحول تحصد من GEM مشروط قد توفر نظام نموذج مرن فيه لأداء الاختبارات قبل السريرية المخدرات في هيئة التصنيع العسكري المختص المناعةه.

تتطلب Xenografts من خطوط الخلايا البشرية القائمة وPDX المضيفين العوز المناعي. على النقيض من PDX، العديد من خطوط الخلايا GBM الإنسان المنشأة لا ألخص والمظاهر التشريحية المرضية من GBM. على سبيل المثال، U87MG xenografts مثلي شكلت أورام مقيدة التي لم تغزو الدماغ العادي (الشكل 5A). في المقابل، حقن TRP - / - الخلايا النجمية في أدمغة المناعة المختصة الفئران مسانج أسفرت الأورام الغازية التي لخص الملامح النسيجية من نظرائهم الإنسان، وخاصة غزو الدماغ العادي (الشكل 5B). لقياس طولي TRP - / - نمو طعم خيفي، تم التضحية الفئران بعد كل 5 أيام حقن الخلايا وتحديد عبء الورم عن طريق قياس منطقة الورم على أقسام الدماغ H & E الملون. زادت مساحة الورم بشكل كبير على مر الزمن (الشكل 5C). حقن مثلي من 10 5 TRP - / - الخلايا النجمية في صأدت العقول ecipient إلى الاعتلال العصبي، مع بقاء متوسط ​​22 يوما (الشكل 5D). بالإضافة إلى الخلايا النجمية القشرية، أجرينا حقن مثلي باستخدام TRP - / - مجلس الأمن القومي. كانت الأورام NSC المستمدة-T 121 إيجابي، التكاثري، وحافظت على التعبير عن Sox2 علامة NSC (الشكل 6) - TRP - /. من المذكرة، حقن الخلايا النجمية القشرية وNSC تحصد من WT C57BL / 6 الفئران وكذلك الخلايا النجمية القشرية WT ظاهريا أو NSC مع unrecombined، floxed الأليلات أنكجنيك من GEM مشروط فشل في انتزاع تكون الأورام خلال هذا الإطار الزمني (لا تظهر البيانات). وقد استخدم التصوير الطولي في الجسم الحي لمراقبة حركية نمو الورم في استجابة للعلاجات الدوائية 40. وبالتالي، TRP - / - تم حقن الخلايا النجمية لوك في أدمغة تتزاحم مسانج المختصة المناعي ونمو الورم كان يحددها التسلسلي التصوير تلألؤ بيولوجي. زاد تلألؤ بيولوجي 15 أضعاف خلال 16 يوما(أرقام 7A و 7B). لقد أثبتنا أن الخلايا النجمية القشرية وNSC تحصد من GEM المشروط يمكن تعديلها وراثيا وتتميز ظاهريا في المختبر وفي الجسم الحي لتعريف علم الوراثة وبيولوجيا الخلايا نجمي المرضية ويحتمل أن تستخدم لتطوير العقاقير قبل السريرية.

الشكل 1
الرقم 1. تخطيطي نجمية القشرية وNSC الحصاد من nGEM. كانت تحصد ظاهريا WT النجمية القشرية وNSC من GEM مع الأليلات أنكجنيك المشروطة. وكان المستحث بالتعديل الوراثي في المختبر مع ناقلات AdCre. وتتميز الخلايا تحولت ظاهريا في المختبر بطرق مختلفة والحية عن طريق الحقن مثلي في أدمغة مأمن الحكومية المختصة،تتزاحم مسانج.

الشكل 2
الشكل 2. إثراء GFAP + الخلايا النجمية على الركض التسلسلي في المختبر. الصور المناعي تمثيلية تظهر GFAP + الخلايا النجمية تحصد من RB1 loxP / الجراء loxP GEM مع NF1 loxP / loxP و / أو PTEN loxP / loxP الذي كان المستحث بالتعديل الوراثي مع Ad5GFAPCre والخلايا passaged مرات X (PX) (A). الكمي لإثراء GFAP + الخلايا النجمية في لوحة A. البارات تمثل الخطأ المعياري 3-24 مكررات (B). المناعي ممثل (أعلى) والنقيض من المرحلة (القاع) وصور من الخلايا النجمية القشرية الملتصقة تحصد من TgGZT 121 GEM الجراء التي تعبر عن T 121 من المروج GFAP في تمريرسن 9 بعد إعادة التركيب مع Ad5CMVCre في المختبر (C). وتم قياس كمية الخلايا النجمية حيث بلغ عدد GFAP + (الخضراء) خلايا مقسوما على العدد الكلي للنوى دابي الملون (الازرق) في كل فقرة أخرى. واتخذت صورة في 10X التكبير الأصلي (A، C). تمثل قضبان مقياس 100 ميكرون (A، C). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. WT ومعاد NSC تحصد من TRP - / - GEM. الصور النقيض من المرحلة التمثيلية للظاهريا WT (أعلى) وTRP - / - (القاع) NSC نمت في المختبر كما neurospheres (A). تلطيخ المناعي التمثيلي للT 121 (الخضراء) وSox2(الحمراء) في التعبير WT (أعلى) وTRP - / - (القاع) neurospheres (B). تمثل قضبان مقياس 100 ميكرون (A، B). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. توصيف النجمية القشرية في المختبر. تم تحديد نمو WT وTR النجمية القشرية عن طريق عد الخلايا على أيام 1-7 (A). تم تحديد الكثافة النسبية الضوئية (OD) من الخلايا النجمية القشرية WT وTR بواسطة MTS (B). النمو النسبي للWT وRB1 معاد - / -، NF1 - / -، PTEN +/- (RbNP +/-) النجمية والتي يحددها MTS (C). التلألؤ من TRP الوالدين - / - وإبليسبورصة عمان معربا عن TRP - / - الخلايا النجمية (TRP - / - لوك) (D). OD النسبي للTRP - / - الخلايا النجمية تعامل مع PI103 لمدة 5 أيام على النحو الذي يحدده MTS (E). تم حساب انتشار وجرعة استجابة باستخدام معادلة النمو الأسي في GraphPad بريزم 5. البارات تمثل الخطأ المعياري من 6 مكررات لكل حالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. في الجسم الحي gliomagenesis. ممثل قسم H & E الملون من طعم أجنبي U87MG يظهر الورم هوامش منفصلة (A). ممثل H & E القسم الملون من TRP - / - طعم خيفي يظهر الغزو منتشر من الدماغ العادي (B). أشرطة النطاق في اليسار واليمين H & E صور تمثل 1 ملم و 100 ميكرون على التوالي. تم تحديد منطقة الورم من خلال تحليل أقسام H & E الملون من الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين من العقول، تتزاحم مسانج المناعة المختصة حقن TRP 10 5 - / - الخلايا النجمية والتضحية في فترات 5 أيام بعد الحقن. (C). ويظهر طعم خيفي الذين تتراوح أعمارهم بين الفئران إلى الاعتلال بقاء متوسط ​​22 يوما (D) - كابلان ماير تحليل بقاء TRP - /.

الرقم 6
الرقم 6. المناعي من TRP + NSC المغايرة. تظهر الصور المناعي تمثيلية TRP + NSC حقنها في أدمغة، تتزاحم مسانج المناعة المختصة تعبير T 121 (الخضراء) وSox2 (أبيض) وتتكاثر، على النحو الذي يحدده EDU (الحمراء) التأسيس. كانت الفئران perfused لمع ايدو والتضحية 6 أسابيع بعد الحقن وأدمغتهم مع perfused امتصاص العرق. شريط النطاق يمثل 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. التصوير طولية من TRP - / - لوك المغايرة. صور تمثيلية تلألؤ بيولوجي (A) والكمي لتدفق وسيفيراز على مر الزمن (B) معارض نمو TRP - / - المغايرة في والفئران مسانج المناعة المختصة حقن مع 10 TRP 5 - / - الخلايا النجمية القشرية لوك والتقط في الأيام المشار إليها ما بعد الحقن.ز "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

النمط الجيني كفاءة الطلاء (٪) SEM
WT 0 0
T 1.03 0.15
TRP - / - 6.40 0.83

الجدول 1. مستعمرة تشكيل الخلايا النجمية القشرية. WT، وTRP T - / - تم مطلي النجمية القشرية في ثلاث نسخ في 4،000، 2،000، و 250 خلية / جيدا على التوالي. كانت ملطخة المستعمرات مع الكريستال البنفسجي بعد 14 يوما تصفيح، تصوير، وشاركunted باستخدام يماغيج. تم حساب كفاءة الطلاء حيث بلغ عدد المستعمرات مقسوما على عدد الخلايا مطلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية لضمان حصاد والثقافة من الخلايا النجمية القشرية هي 1) السليم لاستئصال القشرة دون أخذ الأنسجة تحت الجسم الثفني، 2) لإزالة السحايا، 3) لفصل الخلايا تماما، و4) لإثراء لGFAP + الخلايا النجمية. على الرغم من أن كنا الميكانيكية (الهز) وراثي (تقييد إعادة التركيب الجيني مع ناقلات Ad5GFAPCre أو الاستفادة من تحويل التحوير المهيمن (TgGZT 121) تحت سيطرة المروج GFAP) أساليب لإثراء لGFAP + الخلايا النجمية، وقد استخدمت تقنيات أخرى لتنقية القشرية الخلايا النجمية. على سبيل المثال، يمكن إزالتها عن طريق علاج الخلايا الدبقية الصغيرة تلويث الثقافات متموجة مع مثبط الإنقسامية تليها ل يسين استر الميثيل 47. التشكل والتعبير محات من الخلايا النجمية تنقية ميكانيكيا ومثقف في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الدم تختلف عن الخلايا النجمية معزولة تماما، مع hypothesi السابقزد لتمثيل إما خلايا غير ناضجة أكثر نجمي أو نجمية النمط الظاهري رد الفعل 48،49. وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير طريقة لتنقية immunopanning مستقبلي الخلايا النجمية القوارض القشرية وملامح التعبير عنها بشكل وثيق يحاكي تماما النجمية المنقى عند المثقف في النمو، وسائل الإعلام المصل خالية تستكمل عامل 49. تأثير، طريقة الميكانيكي التقليدي للالقشرية تخصيب نجمية والثقافة مقابل طريقة immunopanning أكثر وضعت مؤخرا على الظواهر التحقيق لا تزال غير واضحة هنا. بغض النظر عن الطريقة المستخدمة، من الضروري إثراء لGFAP + الخلايا النجمية القشرية لتحديد عواقب المظهرية للطفرات أنكجنيك تحديدا في هذا نوع من الخلايا.

الخطوات الحاسمة لحصاد NSC هي 1) لتحديد بدقة SVZ، 2) لتقليل الأضرار التي لحقت SVZ خلال تشريح، و 3) لتصفية الخلايا التالية التفكك قبل الطلاء. PreciNSC حد ذاته تقنية تشريح ضرورية لتحديد موقع وحصاد SVZ. لأن NSC تنمو في الثقافة تعليق، فمن الضروري لتصفية تعليق الخلية بعد التفكك إلى تقليل كمية الحطام العائم. على الرغم من أننا استخدمت النمو في المجلس الاعلى للقضاة لتحديد لمجلس الأمن القومي، NSC يمكن عزل مستقبلي من قبل مضان تنشيط الفرز خلية من خلايا الأنسجة جناسة SVZ 50. بعد تحريض بالتعديل الوراثي في المختبر، فمن المهم رصد الخصائص الخلوية من نجمية القشرية والثقافات NSC عبر الممرات. لأننا لم إثراء مستقبلي للالنجمية أو مجلس الأمن القومي أثناء الحصاد الأنسجة، ونحن رصدها متسلسل التخصيب ونقاء كميا من نوع خلية من الفائدة عن طريق تلطيخ المناعي مع علامات محددة معروفة الخلية من نوع (GFAP لالنجمية، Sox2 لNSC). بالإضافة إلى ذلك، نوصي الرصد المنهجي لعواقب الإشارات المتوقعة من الطفرات أنكجنيك قبل وبعد مرور عند كل لجنة المساواة العرقية-التوسط سواءد إعادة التركيب من قبل immunoblotting وظاهريا تميز خلايا في أقرب مرور الذي يتم تكبير النقاء والطفرات المستحثة التعديلات إشارات استقرار.

من الاعتبارات المهمة في الاستفادة من الثقافات الخلية الأولية هي قدرتها تنسخي الكامنة والتأثير المظهري من الطفرات المستحثة. ظاهريا WT النجمية الفئران حدت قدرة تنسخي ولا يمكن passaged 3-4 مرات في الثقافة قبل أن يخضع الشيخوخة تنسخي 31. وعلاوة على ذلك، يرتبط العديد من الطفرات السرطانية، وبخاصة في MAPK الجينات المسار، والسبب الناجم عن الجين الورمي الشيخوخة في المختبر 51. وبالتالي، إذا فشلت الطفرات المستحثة أن يخلد الخلايا وحمايتها من الشيخوخة الناجمة عن الجين الورمي، فإنها لا يمكن passaged متسلسل لتوصيف المظهري في المختبر. oncoproteins الفيروسية مثل فيروس الورم الحليمي البشري E6 / E7 وSV40 T كبيرة مستضد استخدمت على نطاق واسع أن يخلد العديد من مو البشرية وأنواع الخلايا rine في الثقافة، بما في ذلك الخلايا النجمية 13،26،30. لقد أظهرنا سابقا أن الاجتثاث عن G1 / S نقطة تفتيش دورة الخلية مع T كان كافيا أن يخلد النجمية القشرية، ولكن لا يكفي للتسبب astrocytomas قاتلة في الجسم الحي. في المقابل، تفعيل MAPK وPI3K يشير في TRP - / - الخلايا النجمية أدت إلى تشكيل GBM في نظام نموذجي طعم خيفي مثلي 30. وهكذا، فإن آثار الطفرات T، R، P وعلى الفئران التحول نجمية في المختبر كما حددتها المقايسات تشكيل مستعمرة ترتبط تكون الأورام في الجسم الحي في المغايرة مثلي.

مثل كل النماذج التي تتطلب زرع الجراحية للخلايا الورم، وحقن مثلي من تحول الخلايا nGEM في أدمغة فئران مسانج سوف تثير استجابة الجرح الحادة، ووصف دباق رد الفعل. خلال هذا الرد، والخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا النجمية، السلف دبقية قليلة التغصن (NG2 +) الدبقية، والخلايا الدبقية الصغيرة، مؤيد للحياةأكل والحصول على دولة التمايز أكثر بدائية، إلى حد كبير استجابة للبروتينات يفرز مثل القنفذ الصوتي 52،53. ومع ذلك، فإن المرحلة التكاثري من رد الفعل دباق ردا على جرح طعنات قصيرة نسبيا، عادة أسبوع واحد 53. لقد أظهرنا سابقا أن حقن TRP - / - يستحث الخلايا النجمية تكون الأورام بكفاءة خلال هذا الإطار الزمني، مما أسفر astrocytomas منخفض الدرجة التي تقدم في كثير من الأحيان إلى astrocytomas عالية الجودة، بما في ذلك GBM. في المقابل، حقن T أو TP - / - الخلايا النجمية وضع نادرا في astrocytomas منخفض الدرجة في 1-3 أسابيع بعد الحقن وهذه الأورام تفشل في التقدم إلى الدرجة العالية astrocytomas 30. وعلاوة على ذلك، يفشل حقن ظاهريا البرية من نوع الخلايا النجمية القشرية ومجلس الأمن القومي وحده لانتزاع تكون الأورام (لا تظهر البيانات). وجدنا أن TRP - / - نمو طعم خيفي يزيد أضعافا مضاعفة 2-3 أسابيع بعد الحقن، وإطار زمني خلالها المرحلة التكاثري لتتفاعلإيف دباق قد انتهت (الأرقام 5 و 7). لحساب microenvironmental التأثيرات المحتملة على تكون الأورام على حقن تحول الخلايا nGEM في أدمغة فئران مسانج، ولا سيما خلال المرحلة التكاثري من دباق رد الفعل، ونحن نوصي أداء الحقن السيطرة على الخلايا النجمية القشرية WT ظاهريا أو NSC عند التحقيق إئتلافات جديدة من unrecombined، floxed أنكجنيك الأليلات. نوصي أيضا رصد كفاءة من تكون الأورام في كل من (معاد) خلايا WT ظاهريا وتحويلها على فترات أسبوعية خلال الشهر الأول بعد الحقن، كما وصفناها سابقا 30.

من خلال التلاعب الجيني للخلايا إما حقن أو طعم خيفي المضيفة نفسها، ونموذج نظام نجمي nGEM يمكن استخدامها لنموذج جوانب كثيرة من نجمي المرضية، بما في ذلك التفاعلات ورم سدى. كمثال، فإننا المهندسة TRP - / - astrocy القشريةقسم التدريب والامتحانات للتعبير عن وسيفيراز لتحديد حركية نمو الورم في الجسم الحي (الشكل 7). بدلا من ذلك، خلايا nGEM يمكن تعديلها وراثيا لتعبير عن بروتين فلوري وحقن orthotopically في أدمغة GEM مع الخلايا العصبية fluorescently المسمى أو الأوعية الدموية لتحديد التفاعلات بين الخلايا السرطانية وخلايا المخ العادية 54. تأثير microenvironmental من منطقة في الدماغ أو سن التنموي على gliomagenesis يمكن تحديد orthotopically حقن خلايا nGEM في مواقع مختلفة أو في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين مختلف. على الرغم من الإختفاء الورم قصيرة ومفيدة للبقاء قبل السريرية لاختبار المخدرات، والتنمية السريعة الورم قد لا يكون مثاليا لنموذج بعض جوانب نجمي المرضية، بما في ذلك تطور خبيث، والغزو، والتفاعلات ورم أسنان. بقاء nGEM المضيفين طعم خيفي يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير عدد الخلايا المحقونة والرصد المنهجي انتفاذ الورم والكمون 30.

astrocytomas الإنسان معقدة genomically وتظهر البينية واسعة وبين ورم التجانس 5-7،55،56. وتشمل المصادر المحتملة لهذا التجانس الطفرات الجسدية التي تبدأ تكون الأورام، والطفرات المكتسبة خلال عملية تطورية من تطور خبيث، وإمكانات النمو للخلايا التي تحدث هذه الطفرات. وقد حددت مشاريع التسلسل نطاق واسع العديد من الطفرات المرتبطة نجمي وأنماطها المشترك قوع 7. وقد اعتمدت هذه الدراسات على خوارزميات بيوينفورمتيك لتحديد الطفرات التي تحدث في كثير من الأحيان، وتسمية الطفرات التي هي مكون الورم المحتمل، مثال. "الطفرات سائق" أن بدء تكون الأورام أو دفع تطور الخبيث. ومع ذلك، فإن إمكانات أنكجنيك العديد من هذه الطفرات، والمحتملة نوع من الخلايا التحديد، لم يتم التحقيق بشكل منهجي في أنظمة نموذجية. نقترح أن النماذج nGEM شtilizing النجمية القشرية ومجلس الأمن القومي كما هو موضح هنا، وكذلك أنواع الخلايا العصبية الأخرى التي يمكن تنقيته ونمت في الثقافة، وتوفير نظام متعدد الاستعمالات لإجراء مثل هذه التحقيقات. ويمكن بعد ذلك يتم التحقيق مدى كفاية وضرورة التحول من الطفرات مرشح جديدة تم تحديدها من خلال مشاريع كبيرة تسلسل منهجي باستخدام gain- الوراثية التقليدية والنهج الخسارة من وظيفة مع أنواع معينة خلية nGEM بايواء الطفرات التي تحدث في مسارات التعاون المشتركة الخليج للحاسبات الآلية الأساسية التي GEM مشروط موجودة 5. نقترح أيضا أن لوحات من nGEM بايواء مجموعات متنوعة من طفرات في عدة أنواع الخلايا العصبية سوف تكون مفيدة في نمذجة عدم التجانس الجيني من astrocytomas الإنسان. بالإضافة إلى ذلك، نماذج نجمي nGEM مع الخلايا النجمية القشرية وNSC المستمدة من GEM مشروط قد تقدم نموذجا للتنمية لين العريكة المخدرات قبل السريرية لاختبار أولي في المختبر كل من أحادية ويمكن الجمع بين العلاجاتأن يؤديها في هذه الخلايا لتوجيه أكثر كفاءة في الجسم الحي اختبار المخدرات في المناعة المختصة الفئران مسانج. وعلاوة على ذلك، تحوير المناعة، والعلاجات المستهدفة سدى يمكن اختبارها في نماذج نجمي nGEM مع المناعة المختصة، ويستضيف طعم خيفي مسانج. وهكذا، ونماذج نجمي nGEM مع الخلايا النجمية القشرية وحولت NSC هي نظام نموذجا قيما لتحديد عواقب وظيفية من مجموعات من الطفرات أنكجنيك في أنواع معينة من الخلايا ويمكن أن تكون مفيدة في اختبار المخدرات قبل السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Tags

علم الأعصاب، العدد 90، نجمي، النجمية القشرية والفئران المعدلة وراثيا، ورم أرومي دبقي، الخلايا الجذعية العصبية، طعم خيفي مثلي
النمذجة الخلايا النجمية إمراض<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, … More

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter