Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Моделирование Астроцитома Патогенез Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Астроцитомы наиболее распространенной первичной опухоли головного мозга и глиобластомы (GBM), IV астроцитома класса, является наиболее распространенным и агрессивным подтипом при медиане выживаемости 12-15 месяцев 1,2. Вторжение диффузных астроцитом, в частности GBM, исключает полное хирургическое удаление, ограничивает эффективность адъювантной терапии, и неизбежно приводит к рецидиву после лечения 3. Пациенты, изначально присутствующие либо с De Novo (первичной) GBM или с более низкими астроцитом класса, что неизбежно прогрессирует в (вторичной) GBM 4. GBM является геномно неоднородна и характеризуется взаимоисключающих и сопутствующих мутаций в генах, которые регулируют три основных сигнальных путей: G 1 / S (Rb) клеточного цикла контрольных точек, рецептора тирозинкиназы (RTK), и TP53 дорожками 5-7. GBM состоит из четырех геномных подтипов с различными профилями экспрессии, которые напоминают различные типы клеток мозга, предполагая, что GBM подтип ВЛИянием его клетки происхождения 6,8,9. Лучшие модели астроцитома обязаны определить роль конкретных комбинаций мутаций в определенные клеточные типы во астроцитому патогенезе. Используя эти модели для более эффективного развития доклинических наркотиков в конечном итоге поможет улучшить результаты лечения пациентов. Современные модели астроцитома включают установлены клеточные линии человека, пациента происходит ксенотрансплантаты (PDX), генетически модифицированные нормальные человеческие астроциты и нервные стволовые клетки (НСК) и генно-инженерных мышей (GEM) 10-14. Мы разработали альтернативный, не-зародышевой линии GEM (nGEM) модель 15 с использованием первичных клеток мозга - коры астроциты и NSC - найденным GEM, несущего различные комбинации floxed онкогенных аллелей. Целью было генерации моделей Астроцитома с генетически определенных клеток, которые могут быть фенотипически характеризующихся как в пробирке и в естественных и потенциально используемых для доклинической разработки лекарственных средств в Immune-компетентные мышей.

Штатные клеточные линии человека являются наиболее часто используется модель патогенеза астроцитому и ответ наркотиков в пробирке и в естественных условиях. Они технически прямо вперед, широко доступны, и определили кинетики и онкогенность на ортотопического ксенотрансплантации в иммунодефицитных мышей 10,11,16-18 . Их недостатки включают неспособность генерировать установленные клеточные линии из низкосортных астроцитом, ограничивая исследование только к высокой астроцитом; Отсутствие определенной ячейке происхождения; наличие сложных геномных нарушений, часто с геномных профилей, которые заметно отличаются от оригинального образца пациента; и восприимчивость к фенотипической и генотипической дрейфа во серийного культуры в сыворотке 11,17,19-22. Фенотипические последствия отдельных онкогенных мутаций в установленных клеточных линий человека GBM может маскироваться множества нарушений, которые на самом деле присутствует, которые часто исключает elucidation прямых последствий генотип-фенотип.

PDX генерируются через подкожной прохождения пациентом изолированы клетках астроцитомы в иммунодефицитных мышей или через их культуры как неадгезивных сфероидов в определенном, сыворотки среде до ортотопического инъекции в мозг иммунодефицитных мышей 12,23. PDX более точно поддерживать геномной ландшафт человека астроцитомы, но аналогично установленных клеточных линий человека, фенотипический эффект отдельных онкогенных мутаций могут быть замаскированы в связи с их геномной сложности 19,24. Чтобы определить фенотипические последствия конкретных онкогенных мутаций, особенно в ответ на новые методы лечения, панели, установленные клеточных линий или PDX человека часто используются, чтобы установить генотип-фенотип корреляции, показать обобщения, и свести к минимуму вероятность линии конкретных эффектов клеток. В то время как PDX точно воспроизводят гистопатологические признаки человеческой астроцитомы, IncЛУДИНГ вторжение, Ортотопическая ксенотрансплантаты из установленных клеточных линий человека вообще не 21,23,25. Кроме того, нормальные человеческие астроциты и НСК были генной инженерии с определенными онкогенных мутаций моделировать Астроцитома туморогенез в пробирке и в естественных 13,14,26. Эти клетки имеют геномную сложность установленных клеточных линий и PDX человека и точно воспроизводят человеческую Астроцитома гистопатологию, но требуют ксенотрансплантации в иммунодефицитных грызунов в естественных условиях. Потому что все модели клеток человека требуют иммунодефицитом грызунов для предотвращения иммунной опосредованного отторжения ксенотрансплантата, эти модели не резюмировать родные опухоли стромы взаимодействия сингенной системы и не имеют интактную иммунную систему, ограничивая доклинические исследования стромы целенаправленной и иммунной-модуляторных виды терапии, 10,11.

GEM разрешение экспертиза фенотипических последствий заранее определенных комбинаций онкогенного Мутания в естественных условиях в течение на месте туморогенеза. В то время как не-условное GEM есть мутаций внутри всех тканях в течение всего развития, условно GEM уже floxed онкогенные аллели, которые позволяют адресности мутаций путем ограничения Cre-опосредованной рекомбинации определенными типами клеток путем использования типоспецифических промоутеров клеток 10,11,15,18. Условный астроцитома GEM были использованы для выяснения функциональные роли онкогенных мутаций в различных типах клеток в интактным мозгом 11. Доклинические полезность на месте gliomagenesis помощью условного GEM ограничивается рядом факторов, включая 1) Отсутствие коррелят в пробирке, 2) трудности в формировании большие когорты мышей со сложными генотипов, 3) с длительным латентным периодом в развитии опухоли Ситу , 4) и стохастического прогрессирование опухоли. Поскольку на месте канцерогенез отсутствует модель, соответствующую в пробирке, тестирование препарата в пробирке не может быть выполнена WIth обычные условные модели GEM. В отличие от других видов рака, условные модели GEM астроцитомы редко, индуцированный отдельных онкогенных мутаций 11. Таким образом, сложные схемы размножения требуются для создания условного GEM с несколькими онкогенных мутаций. Кроме того, астроцитома инициация происходит с переменной пенетрантностью после длительного латентного в этих моделях, в то время как прогрессирование до высокого астроцитом обычно происходит в неоднородном, стохастического образом и в конечном итоге приводит к опухоли со сложными геномных пейзажей и стремительных кинетики роста 27, 28. Переменная пенетрантность и стохастический характер злокачественной прогрессии в условных моделей GEM требует, чтобы отдельные мышей быть экранированы рентгенографии для обнаружения присутствия и местоположения высокого астроцитом до их зачисления в доклинических испытаний лекарств. Взятые вместе, эти ограничения препятствуют поколения и тестирование крупных когорт условного GEM, необходимое для прeclinical тестирование на наркотики.

GEM система RCAS-тва, которые использует птичьего ретровирусов (Rcas) векторы заразить GEM инженерии выразить вирусный рецептор (TVA) по конкретным нейронных типов клеток, широко используется для моделирования Астроцитома туморогенез 11. В отличие от условного GEM, эта модель система позволяет введение нескольких онкогенных мутаций в определенных типах клеток без необходимости сложных схем селекции. Тем не менее, она ограничена переменной пенетрантностью, требование для активно делящихся клеток для достижения вирусного интеграции, и случайной вставки трансгенов в геном хозяина 29.

Номера для зародышевой линии GEM (nGEM) модели, которые используют клетки, полученные из GEM, становятся все более важными, потому что они преодолеть многие из ограничений других модельных систем 15. Роль инициирования типа клеток и сопутствующих мутаций в астроцитому патогенезе трудно сдерживатьшахта с использованием установленных клеточных линий GBM человека или PDX, потому что они являются производными от терминальной стадии опухоли, которые накопились обширные генетические мутации в неопределенных типов клеток в ходе злокачественной прогрессии. В отличие от этого, все сорта астроцитомы могут быть смоделированы с помощью nGEM путем индукции определяется генетические мутации в определенных очищенных типы клеток мозга 11,30. Таким образом, влияние специфических генетических мутаций и типа клеток на клеточном и молекулярном фенотипов может быть определена в пробирке и в естественных условиях. Как и в установленных клеточных линий человека GBM, начальная пробирке тестирования на наркотики при помощи nGEM могут быть использованы по приоритетам препараты для тестирования в естественных условиях, использующие одни и те же клетки. Опухолей ин виво может быть определена путем аллотрансплантации nGEM клетки ортотопически в мозг иммунокомпетентных сингенных помета 30. Эти Ортотопическая модели аллотрансплантатов поэтому позволяют в естественных условиях тестирования не только обычных цитотоксической ай целевой терапии, но иммунная-модуляторный и строме ориентированные виды терапии, а также. И, наконец, роль микроокружения на инициации и прогрессирования опухоли могут быть определены путем сравнения результатов между nGEM и обычные модели GEM с использованием тех же мутации в тех же типах клеток.

Мы и другие разработали Астроцитома nGEM использованием первичных клеток - астроцитов, NSC или клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC) - найденным GEM 30-34. Обоснованием разработке астроцитомой nGEM было создать модель для определения фенотипические последствия онкогенных мутаций в специфические типы клеток, которые потенциально могут быть использованы для доклинических испытаний препарата в пробирке и в естественных в иммунокомпетентных животных. Мы собрали фенотипически WT корковых астроциты и NSC от не-Cre выражающие, условное GEM поддерживается на> 94% C57 / BL6 фоне с floxed РБ пути - Rb1 LoxP / LoxP или TgGZT121 - и floxed RTK / РАН / PI3K пути - nf1 LoxP / LoxP, Крас G12D, PTEN LoxP / LoxP - гены в различных комбинациях 35-39. Мы индуцированной генетической рекомбинации в пробирке с помощью аденовирусные векторы, кодирующие Cre рекомбиназу. Поскольку корковые астроцитов урожаи содержат смесь типов клеток, мы использовали Ad5GFAPCre векторы или доминирующие онкогенные трансгены, такие как TgGZT 121 приводится в движение от промотора GFAP человека, для обогащения GFAP + кортикальных астроцитов в этих культурах. Мы определили фенотипические последствия G 1 / S (РБ), MAPK, и пути PI3K мутаций в корковых астроциты и НСК в пробирке и в естественных условиях. МАРК и PI3K пути активированные G1 / S-неполноценные астроциты молекулярно передразнил человек пронейральный GBM и, по ортотопического инъекции, образованные опухоли в заранее определенном месте с единых кинетики роста, короткие задержки, и гистологическиеаль отличительными чертами человеческого GBM 30. Продольный контроль роста опухоли в естественных условиях помогает доклинические испытания препарата через нормализации лечения когорт и количественного анализа роста опухоли в ответ на лечение 40. Мы определили кинетики роста опухоли по продольной биолюминесценции визуализации мышей, которым вводили люциферазы выражая корковых астроциты. Поэтому корковых астроциты и НСК, полученные из условного GEM обеспечить послушный модельную систему для определения функциональных последствий астроцитомы мутаций, связанных и потенциального модельной системы для доклинической разработки лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования на животных были одобрены Университета Северной Каролины Уходу за животными и использованию комитета.

1 Культивирование Кортикальная Астроциты от новорожденных мышей

  1. Подготовка
    1. Crumple 2-3 тонких тканей задач и поместить в нижней части колбу, содержащую 70% этанола. Поместите рассекает ножницы, изогнутые щипцы и 2 пары прямых микро щипцов в этой колбе. Ткани используются, чтобы избежать изгиба микро щипцы.
    2. Добавить 1 мл HBSS до 60 мм блюдо культуры ткани. Подготовьте отдельный блюдо для каждого животного и поддерживать блюда на льду.
    3. Обезболить животных на институциональных правил.
    4. Теплый 7 мл среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина (полное DMEM) для каждого животного в водяной бане при 37 °. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 1.1.1-1.1.4 займет ~ 15 мин.
  2. Ткань Урожай
    1. Жертвоприношение новорожденных мыши (1-3 день) за institutiOnal правила.
    2. Удалить рассекает ножницы из этанола, позволяют им капать сухие, и сделать сагиттальный разрез в коже над черепа от спинного мозга к носу.
    3. Сделайте надрез в черепе вдоль стреловидного шва, начиная от спинного мозга и расширение мимо обонятельных луковиц. Следите, чтобы кончики ножницами вблизи внутренней поверхности черепа, чтобы свести к минимуму повреждения головного мозга ткани.
    4. Использование изогнутых щипцов, аккуратно чистить каждое полушарие черепа вбок от мозга.
    5. Использование прямых микро щипцы, осторожно зажать от спинной части каждого коркового полушарии и поместите его в блюдо культуры ткани, содержащей HBSS. Позаботьтесь, чтобы избежать мозжечок и обонятельной луковицы. Не берите любую ткань ниже мозолистого тела.
    6. Использование рассекает микроскоп и 2 пары микро щипцы, осторожно удалите мозговые оболочки от каждого коркового полушарии. не Верните блюдо культуры ткани на лед, пока, начиная тканей homogenizatioн.
    7. Повторите шаги 1.2.1 через 1.2.6 для каждого дополнительного животного. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 1.2.1-1.2.7 займет ~ 30 мин.
  3. Ткань усреднении
    1. Используя чистую лезвие, мелко нарезать кубиками корковых полушария и переместить пластину к капот культуры ткани.
    2. Трансфер нарезанный кубиками ткани в стерильный 15 мл коническую трубку. Промыть пластины с 1 мл ледяной ССРХ и передать в пробирку, содержащую ткани.
    3. Подождите, пока ткань не оседает на дне пробирки, затем осторожно удалить избыток HBSS с помощью пипетки.
    4. Добавить 2 мл комнатной температуры трипсина / ЭДТА. Внесите ~ 10x с 1 мл пипетки для дальнейшего отмежеваться клетки.
    5. Инкубируйте клеточной суспензии при 37 ° С в течение 15 - 20 мин. Тщательно перемешать инверсии каждые 5 мин.
    6. Добавить 3 мл полной DMEM ингибировать трипсин. Внесите ~ 10x с 1 мл пипетки для смешивания раствора.
    7. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Удалитьсупернатант с 1 мл пипетки. Не аспирации среды, потому что осадок может быть потеряно.
    9. Ресуспендируют осадок в 4 мл 37 ° С завершить DMEM. Передача клеточной суспензии до 75 см с завинчивающейся крышкой колбу культуры тканей. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 1.3.1-1.3.9 займет ~ 50 мин.
    10. Около 16 ч после сбора урожая астроцитов, мыть колбы с 4 мл 37 ° C ССРХ, затем добавить 4 мл 37 ° C завершить DMEM. Поддержание корковых астроцитов при 37 ° С в 5% СО 2. ПРИМЕЧАНИЕ: стадия промывки важна для удаления неадгезивных клеток и мусора с блюдо культуры.
    11. Когда культура ~ 95% сливной, встряхивали в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2, удалить СМИ содержащие отдельные клетки, затем промыть колбу с 4 мл 37 ° C ССРХ. Добавить 4 мл 37 ° C завершить DMEM и поддерживать клетки при 37 ° С в 5% СО 2. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен для обогащения культур для корковых астроцитов, как загрязнение микроглии иКлетки-предшественники олигодендроцитов отсоединения с этой процедурой, и удаляются из культуры 41.
    12. Повторите шаги 1.3.1-1.3.11 для каждого животного.
  4. Индукция генетической рекомбинации
    1. 24 часа после завершения шага 1.3.11, заменить жидкость с 2 мл 37 ° C завершить DMEM. Добавьте 1 мл 37 ° C СКМ, содержащие 1 мкл> 10 10 БОЕ / мл Ad5CMVCre или Ad5GFAPCre. Выдержите в течение 6 ч при 32 ° С в 5% СО 2 .CAUTION: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантного аденовируса.
    2. Удалить вирус, содержащие медиа и добавьте 37 ° C полной DMEM без вируса корковых астроцитов. ВНИМАНИЕ: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантные аденовирусы и выбросьте вируссодержащей диск на институциональных правил. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 астроцитов культур, шаги 1.4.1 - 1.4.3 займет ~ 15 мин исключая 6 ч инкубации.
    3. Развернуть корковых культур астроцитов для впробирке и в естественных характеристик. Примечание: определения наличия мутации следующую CRE-рекомбинации с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для рекомбинации гена или иммуноблотах либо для конкретного мутантного белка или его последствий сигнализации. Время, необходимое для фенотипической стабилизации корковых культур астроцитов после Cre-рекомбинации будет зависеть от мутаций, используемых и должно быть определено опытным путем (Рисунок 2).

2. Культивирование нервные стволовые клетки из новорожденных мышей

  1. Подготовка
    1. Перед началом вскрытия, подготовки 4 мл пищеварения раствора на мозге, добавив 3,1 мг папаин и 1,3 мг цистеин к 4 мл диссоциации среды - 98 мм Na 2 SO 4, 30 мМ K 2 SO 4, 5,8 мМ MgCl 2, 0,25 мМ CaCl 2 , 1 мМ HEPES (от 1 М HEPES рН 7,4 складе) 20 мМ глюкозы, 0,001% фенола красного и 0,125 мМ NaOH. Добавление папаини цистеин диссоциации среде получится желтый раствор.
    2. Инкубировать в 37 ° С на водяной бане в течение 15 мин. Смешайте периодически переворачивая.
    3. Добавить 0,1 М NaOH по каплям, пока пищеварение решение не возвращает зажечь красный цвет.
    4. В капот культуры ткани, стерильный фильтр переваривание решение с использованием шприцевой фильтр (0,22 мкм размер пор). Держите пищеварения решение на льду.
    5. Подготовка 50 мл стволовых клеток среднего (SCM) путем смешивания 44,5 мл НСК базальной среды, 5 мл НСК добавки, 0,5 мл пенициллина-стрептомицина, 50 мкл 0,2% гепарина, 10 мкл 100 мкг / мл EGF, и 10 мкл 100 мкг / мл bFGF. СКМ стабилен в течение 1 недели при хранении при 4 ° С.
    6. Подготовить полное HBSS (cHBSS) путем смешивания 50 мл 10х HBSS, 1,25 мл 1 М HEPES (рН 7,4), 15 мл 1 М Д-глюкоза, 5 мл 100 мМ CaCl 2, 5 мл 100 мМ MgSO 4, и 2 мл 1 М NaHCO 3. Принесите общий объем до 500 мл с DDH 2 O.
    7. Фильтр стерилизовать cHBSS остроумиеха-фильтр размер 0,2 мкм пор и хранят при температуре 4 ° С.
    8. Crumple 2-3 тонких тканей задач и поместить в нижней части колбу, содержащую 70% этанола. Поместите рассекает ножницы, изогнутые щипцы, и 2 пары прямых микро щипцов в этой колбе. Ткани используются, чтобы избежать изгиба микро щипцы. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 2.1.1-2.1.8 займет ~ 45 мин.
  2. Ткань Урожай
    1. Жертвоприношение новорожденных (день 1-3) мышей на институциональных правил.
    2. Удалить рассекает ножницы из 70% этанола, позволяют им капать сухие, и сделать сагиттальный разрез в коже над черепа от спинного мозга к носу.
    3. Сделайте надрез в черепе вдоль стреловидного шва, начиная от спинного мозга и расширение мимо обонятельных луковиц. Следите, чтобы кончики ножницами вблизи внутренней поверхности черепа, чтобы свести к минимуму повреждения головного мозга ткани.
    4. Использование изогнутых щипцов, аккуратно чистить каждое полушарие черепа с боков отмозг.
    5. Аккуратно удалите весь мозг и место в ледяной cHBSS.
    6. Использование рассечение микроскоп, осторожно удалите мозговые оболочки из мозга с мелкими инструментами рассечение.
    7. Поместите мозг на его нижней поверхности и удалить мозжечок / задний мозг и обонятельной луковицы / лобной коры с вертикальной (корональной) режет с размером 11 скальпелем.
    8. Поверните оставшийся мозг на 90 °, чтобы поместить его на каудальной части, создавая таким образом корональной вид мозга. Найдите боковые желудочки.
    9. Вырежьте кубической раздел, содержащий субвентрикулярной зоне (СВЗ).
    10. Трансфер СВЗ содержащие ткани на 60 мм блюдо культуры ткани с свежим ледяной cHBSS и фарша ткани с размером 11 скальпелем.
    11. Передача Измельченную ткань в стерильную пробирку на 15 мл. Поместите пробирку на льду.
    12. Вымойте Петри с 1-2 мл ледяной cHBSS. Передача промывочного раствора в пробирку, содержащую ткани.
    13. Повторите шаги 2.2.1-2.2.12 с дополнительной neonataл мышей при необходимости. Перенесите все 15 мл пробирок на капот культуры ткани в течение оставшейся части протокола. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 2.2.1 - 2.2.13 займет ~ 45 мин.
  3. Ткань усреднении
    1. Поместите пищеварения решение (полученного на стадии 2.1.1) в водяной бане при 37 ° в течение 5 мин. Кроме того, теплая 2 мл СКМ за мозга в водяной бане при 37 °.
    2. Осторожно удалите супернатант из фарша ткани с 1 мл пипетки. Не аспирации.
    3. Добавить 2 мл 37 ° C пищеварения раствора на 15 мл трубки и аккуратно перемешать переворачиванием.
    4. Инкубировать в 37 ° С на водяной бане в течение 15 мин. Смешайте по инверсии каждые 5 мин.
    5. Добавить еще 2 мл 37 ° С раствору пищеварения в каждую пробирку и повторите шаг 2.3.4.
    6. Разрешить клетки оседают на дне пробирки под действием силы тяжести, а затем удалить супернатант из сброженных ткани с использованием 1 мл пипетки.
    7. Добавить 2 мл 10 мкМ E-64, разведенного в cHBSS и аккуратно перемешать переворачиванием.
    8. Разрешить клетки оседают на дне пробирки под действием силы тяжести, а затем удалить супернатант из сброженных ткани.
    9. Добавьте 1 мл 37 ° C cHBSS и гомогенизации с наконечником в 1 мл пипетки (~ 20 ударов). Избегайте инъекционных пузырьков воздуха в течение ткани гомогенизации.
    10. Проходят тканевого гомогената через ситечко размер пор клеток 40 мкм, затем смойте сетчатый фильтр с 5 мл 37 ° C cHBSS.
    11. Центрифуга тканевого гомогената при 125 х г в течение 5 мин.
    12. Удалить 95% супернатанта с 1 мл пипетки, не нарушая осадок клеток. Тщательно ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл 37 ° C СКМ при пипетки 200 мкл.
    13. Добавить 1,8 мл 37 ° C SCM и передачи клеточной суспензии на лунку стерильного 6-луночного планшета. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 2.3.1-2.3.14 займет ~ 75 мин.
  4. Neural стволовых клеток Культура
    1. Пополнять среду после 3-х дней, добавив еще 2 мл 37 °C СКМ.
    2. После 7 дней, передать нейросферы в 15 мл пробирку и пусть нейросферы поселиться под действием силы тяжести в течение> 5 мин.
    3. Удалить супернатант и добавить 2 мл 37 ° C SCM.
    4. Перенесите нейросферы на новый колодец 6-луночного планшета с.
    5. Добавить 2 мл 37 ° C СКМ каждые 3-4 дня, и изменить среду полностью каждые 7 дней.
    6. Если нейросферы> 100 мкм в диаметре, тщательно отделить раствором стволовых клеток диссоциации и replate НСК при желаемой плотности клеток.
  5. Индукция генетической рекомбинации
    1. Добавьте 1 мл 37 ° C СКМ, содержащие 1 мкл> 10 10 БОЕ / мл Ad5CMVCre или Ad5GFAPCre в 2 мл СКМ в настоящее время на клетки. ВНИМАНИЕ: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантного аденовируса.
    2. Инкубировать в течение 6 ч при 32 ° С в 5% СО 2.
    3. Трансфер SCM с нейросферы в 15 мл пробирку и пусть сферы поселиться под действием силы тяжести в течение 5 мин.
    4. Удалить супернатант сначала с 1 мл пипетки, а затем с 200 мкл пипетки. ВНИМАНИЕ: Использование BSL2 меры безопасности при обращении с рекомбинантные аденовирусы и выбросьте вируссодержащей диск на институциональных правил.
    5. Добавить 2 мл 37 ° C СКМ без вируса к НСК, а затем перенести в 6-луночного планшета с. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 культур НСК, шаги 2.5.1-2.5.5 займет ~ 15 мин исключая 6 ч инкубации.
    6. На следующий день повторите шаги 2.5.1-2.5.5, затем нейросфера пассажей при необходимости. Сферы теперь может быть расширена за 2-3 проходов до характеризации в пробирке и ортотопического инъекции в мозг мыши в естественных условиях. Примечание: определения наличия мутации следующую CRE-рекомбинации с помощью ПЦР с праймерами, специфичными для рекомбинации гена или иммуноблотах либо для конкретного мутантного белка или его последствий сигнализации. Время, необходимое для стабилизации фенотипической культур NSC после CRE-рекомбинации будет зависетьна мутаций, используемых и должно быть определено эмпирически (фиг.2 и 3).

3 Ортотопическая впрыска рекомбинированных клеток в мозг получателя Iimmunocompetent мышей

  1. Получение 5% метилцеллюлозы
    1. Растворить 5 г 15 сП метилцеллюлозы в деионизированной водой до конечного объема 50 мл в 100 мл завинчивающейся крышкой бутылки. Добавьте порошок медленно при перемешивании при 4 ° С для предотвращения образования комков. Это может занимать до 24 часов перемешивания при 4 ° С в течение всего метилцеллюлоза, чтобы ввести раствор.
    2. Взвесьте бутылку и записать вес.
    3. Автоклав 5% растворе метилцеллюлозы. После того, как в автоклаве, метилцеллюлоза станет полутвердые гель.
    4. Взвесьте бутылку и рассчитать вес потерял во время обработки в автоклаве.
    5. Соблюдая правила асептики, добавьте 1 мл стерильной воды на каждый грамм веса потерял.
    6. Поместите на льду и добавляют 50 мл охлажденного льдом 2x DMEM. </ LI>
    7. Смешайте в течение ночи с использованием магнитной мешалки при 4 ° С. С помощью стерильной техники разделить на 5% растворе метилцеллюлозы в 20 мл аликвоты. Храните аликвоты при 4 ° С в течение до шести месяцев или до 2x DMEM истекает. Примечание: Получение 5% раствора метилцеллюлозы в шагах 3.1.1-3.1.7 будет ~ 2,5 дней.
  2. Подготовка корковых астроциты для инъекций
    1. Урожай корковых астроциты когда ~ 90% сливающиеся.
    2. Для уборки, аспирата полное DMEM и мыть тарелки с равным объемом 37 ° C ССРХ.
    3. Добавьте достаточно трипсин, чтобы покрыть пластину. Осторожно наклоните и постучите по планшету, пока клетки начинают отделяться.
    4. Деактивировать трипсин с равным объемом 37 ° С завершить DMEM.
    5. Трансфер клетки к 50 мл коническую трубку и мыть тарелку с таким же объемом 37 ° C полной DMEM, используемой в 3.2.4.
    6. Трансфер стирки СМИ в пробирку, содержащую клетки. Центрифуга при 200 х г в течение 3 мин.
    7. Аспирируйте сupernatant и ресуспендирования клеток в 1 мл 37 ° С завершить DMEM.
    8. Количество суспензии клеток с помощью гемоцитометра или другого соответствующего счетчика клеток, чтобы определить количество клеток / мкл.
    9. Передача требуемое количество клеток к новому 15 мл коническую пробирку. Центрифуга при 200 х г в течение 3 мин.
    10. Ресуспендируют клеток в 800 мкл 37 ° C завершить DMEM. Определить объем клеточного осадка (общий объем клеточной суспензии - 800 мкл). ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для достижения точной концентрации клеток для инъекций. Таким образом, объем клеточного осадка должен быть определен на этом этапе для того, чтобы рассчитать объем 5% метилцеллюлозы, чтобы добавить в шаге 3.2.12.
    11. Передача клеток в стерильную 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем центрифугируют при 200g в течение 3 мин.
    12. Аспирируйте супернатант от осадка клеток и ресуспендируют корковых астроцитов в соответствующем объеме охлажденного льдом 5% метилцеллюлозы (желательно общий объем - объемОсадок клеток), чтобы получить нужное количество клеток / мкл.
    13. Поместите клетки на льду до инъекции.
    14. Поместите 250 мкл стеклянный шприц в повторяющуюся антигена Диспенсер затем поместить тупой 18 G иглу на шприц.
    15. Вывод на поршень медленно с иглой в корковой астроцитов ходовой части; будет пузырьков воздуха над клетками, которые должны быть удалены, поскольку пузырьки воздуха будет сжимать и уменьшить объем фактически впрыскивается в головном мозге.
    16. Держите кончик иглы чуть выше коркового астроцитов подвески и толкать поршень в быстро. Воздушный пузырь будет двигаться быстрее, чем суспензии клеток и в основном будет выслан.
    17. Повторите шаг 3.2.16, пока все пузырьки воздуха удаляются из иглы.
    18. Заполните шприц к о ~ 200 мкл, а затем, удерживая иглу и вытяните поршень назад до упора. Маленькие пузырьки воздуха могут быть удалены путем проведения Наконечник иглы вверх и быстро толкает поршень в приблизительно 50 мкл затем медленно снятия на полную мощность.
    19. Держите кончик в вертикальном положении и повторите шаг 3.2.18 4-5x.
    20. Выбросьте иглу 18 калибра и соответствовать 27 G иглу на шприц.
    21. Нажмите кнопку на антиген дозатора до жидкость не будет выливаться из иглы. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 линии астроцитов клеток, шаги 3.2.1-3.2.21 займет ~ 60 мин.
  3. Подготовка НСК для инъекций
    1. Когда нейросферы> 100 мкм в диаметре, трансфер в 15 мл пробирки и пусть нейросферы поселиться под действием силы тяжести для> 5 мин.
    2. Удалить супернатант и диссоциируют нейросферы с нежным диссоциации реагента, например раствора диссоциации стволовых клеток или Accutase соответствии с инструкциями изготовителя или с% 0,05 трипсин-ЭДТА, как описано 42.
    3. Запрет диссоциации реагентов в соответствии с инструкциями изготовителя, не подвергая НСК в сыворотке. Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин.
    4. Количество клеток с использованием гемоцитометра или другого соответствующего счетчика клеток для определения количества клеток / мкл.
    5. Передача требуемое количество NSC к новому 15 мл коническую пробирку. Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин.
    6. Ресуспендируют клеток в 800 мкл 37 ° C HBSS. Определить объем клеточного осадка (общий объем клеточной суспензии - 800 мкл). ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для достижения точной концентрации клеток для инъекций. Таким образом, объем клеточного осадка должен быть определен на этом этапе для того, чтобы рассчитать объем 5% метилцеллюлозы, чтобы добавить в шаге 3.3.9.
    7. Передача клеток в стерильную 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем центрифугируют при 100 х г в течение 5 мин.
    8. Аспирируйте супернатант и завершить подготовку клетки для ортотопического инъекции как в 3.2.12-3.2.21. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 НБК клеточной линии, шаги 3.3.1-3.3.9 будет ~ 60 мин.
  4. Подготовка Mouse для инъекций
    1. Обезболить животного-реципиента с помощью инъекций IP 250 мг / кг Avertin (2,2,2 Tribromoethanol) или 100 мг / кг кетамина плюс 10 мг / кг ксилазина, в институциональных принципов IACUC. ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь являются мыши в 3-6 месячном возрасте в качестве аллотрансплантата хозяев. Мыши в разном возрасте могут быть использованы для изучения влияния микросреды развивающего возрасте мозга на туморогенеза.
    2. Бритье головы над разреза с садовыми ножницами или ножницами.
    3. Стерилизовать места операции с 3 чередующихся смывах 70% этанола и бетадином.
    4. Применить глазной мази для глаз, чтобы предотвратить любые повреждения, вызванные потерей мигательного рефлекса.
    5. Оцените глубину анестезии педаль отмены (пальца щепоткой) рефлекса. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 3.4.1-3.4.5 займет ~ 15 мин.
  5. Ортотопическая Имплантация
    1. Безопасность животных в стереотаксической рамы.
    2. Макэлектронной надрез над сагиттального шва длиной около 0,5 см между ушами и глазами.
    3. Найдите пересечение фронтальной и сагиттальной швов (брегмы), а также пересечение ламбдовидного и сагиттальной швов (лямбда). Убедитесь, что темени и лямбда находится в одной горизонтальной плоскости.
    4. Прикрепите шприц, содержащий клеточной суспензии и повторяющийся антиген дозатор для стереотаксической рамы над головой. Принесите кончик 27 G иглы в контакт с брегмы. Это источник, который будет использоваться для манипуляций с трехмерными координатами.
    5. Поднимите иглу немного от поверхности черепа и переместить 2 мм боковые и 1 мм рострально от брегмы.
    6. Осторожно опустите иглу через череп к месту назначения 4 мм от брюшного брегмы. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали эти стереотаксические координаты целевой базальных ганглиев. Различные стереотаксических координаты могут быть использованы для изучения влияния микросреды различныхучастки мозга на туморогенеза.
    7. Введите 5 мкл клеточной суспензии путем активации повторного набора антигена раздаточном время. Оставьте иглу на месте в течение 2 мин, чтобы позволить внутричерепное давление, чтобы уравновесить.
    8. Вывести иглы медленно в течение 30 сек. Используйте ватный тампон, чтобы оказать давление на любое кровотечение, что может произойти.
    9. Приблизительная краев раны и закрыть разрез с помощью клея ткани. Администрирование 20 мкл Лидокаин подкожно в месте разреза. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 5 мышей, шаги 3.5.1-3.5.9 займет ~ 50 мин. UNC IACUC одобрил послеоперационную использование только местной анестезии. Консультации с местных институциональных IACUC рекомендуется в отношении требований к послеоперационной анальгетиков после этой процедуры.
  6. Послеоперационный уход
    1. Поместите животных в чистой, теплой клетке, чтобы оправиться. Животные не должны быть размещены непосредственно в постельных принадлежностях, как может произойти случайно стремление.
    2. Соблюдайтеживотные для возобновления нормального поведения, такие как уход, ел, и дефекации. ПРИМЕЧАНИЕ: Возобновление нормального поведения может занять ~ 60 мин.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы разработали модель системы nGEM с корковых астроциты и НСК найденным новорожденных GEM укрывательство floxed условные онкогенные аллели, которые могут быть фенотипически характеризующиеся в пробирке и в естественных (Рисунок 1). Для того чтобы исследовать последствия онкогенных мутаций специально корковой астроцитов в пробирке, очень важно, чтобы сначала обогащения астроцитов. Кортикальные астроцитов урожаи содержат смесь микроглии, астроциты, олигодендроциты, OPC, и нейронов, но механические и генетические методы могут помочь в обогащении астроцитов. В то время как нейроны умирают при нормальных условиях культивирования, микроглии и олигодендроциты могут быть удалены путем встряхивания в течение ночи 41,43. Кроме того, генетическая рекомбинация floxed, онкогенных аллелей, направленных на GFAP + астроциты с использованием Ad5GFAPCre может обогатить для астроцитов. Мы использовали этот метод, чтобы заразить корковых урожаи от Rb1 LoxP / LoxP GEM щенков с флофиксированная Nf1 LoxP / LoxP и / или Pten LoxP / LoxP аллели. Ad5GFAPCre инфекция, вызванная пролиферативного преимущество в рекомбинированного GFAP + астроцитов, что увеличило чистоту астроцитов с 59% до> 90% через 5 - 9 мест в культуре (2А и 2В). Кроме того, мы обогащенные для астроцитов путем экспрессии T 121 под контролем промотора GFAP, чтобы индуцировать пролиферативное преимущество в астроцитах найденным TgGZT 121 мышей (фиг.2С). В то время как астроциты коры растут прилегает к культуральной чашке (фиг.2С), НСК расти, как неадгезивных нейросферах в пробирке (фиг.3А). Оба WT НСК и НСК с рекомбинации, floxed онкогенные аллели - TgGZT 121 (T), Крас G12D (R), и гомозиготной Pten делеционные (P - / -), называют ГТО- / - - Выразить маркера Sox2 НСК, в то время как только НСК собирают из GEM, содержащей TgGZT 121 выразить T 121 после Cre-опосредованной рекомбинации (Рисунок 3В).

Чтобы определить, как G 1 / S (Rb), МАРК и / или пути PI3K изменения повлиять на рост GFAP + астроциты в пробирке, распространение исследовали с помощью двух методов. МТС и подсчет клеток показал, что экспрессия Т 121 и Крас G12D увеличена пролиферацию кортикальных астроцитов (фиг.4А и 4В). Аналогичным образом, гомозиготные Rb1 (Rb) и Nf1 (Н), удаление в сочетании с гетерозиготной Pten (P +/-) удаление также повышенную пролиферацию астроцитов коры головного мозга (фиг.4С). Трансформированные клетки имеют неограниченный способность к пролиферации. Трансформирующей эффекты мутаций может быть измерена в пробирке с помощью ColONY анализы образования. Поэтому мы протестировали трансформирующие эффекты T 121 и Крас G12D выражения и гомозиготной Pten удаления в ГТО - / - корковых астроцитов на формирование анализе колонии, как описано выше 44. В то время как WT астроциты не образуют колоний, T астроциты формируется колонии на эффективности 1,03%. Следует отметить, что ГТО - / - астроциты были наивысшей эффективности образования колоний на 6,40% (Таблица 1). Для того, чтобы быть пригодным для доклинических испытаний лекарственных средств, важно, чтобы в пробирке моделях опухолей легко манипулировать генетически. Дополнительные генетические изменения могут быть стабильно введена в кортикальных астроцитов плазмидой или вирусных векторов. В качестве примера, мы стабильно трансдуцированных ген люциферазы в ГТО - / - астроциты (ГТО - / - Luc) с использованием VSV-pseudotyped pMSCV ретровирусный вектор. Экспрессия люциферазы увеличена люминесценции ~ 1000 раз по сравнению с родительскими клетками ( в пробирке. Ранее нами было показано, что лечение с низкой дозы PI-103, ингибитора двойного МРМ / PI3K, ингибирует PI3K сигнализацию, не затрагивая жизнеспособность клеток 30. Тем не менее, цитостатические / цитотоксические эффекты высших ПИ-103 доз не были определены. Таким образом, мы проверили, может ли PI-103 снизить ГТО - рост астроцитов в пробирке - /. PI-103 вызвало максимальное снижение 88% в ГТО - роста астроцитов (Рисунок 4E) - /. Ранее мы уже использовали Ортотопическая аллотрансплантаты из ГТО - / - астроциты, чтобы проверить другие клинически значимых терапевтических в естественных условиях (Шмид и др, рукопись представлена.) 45,46. Эти данные позволяют предположить, что трансформированные корковых астроциты, полученные из условного GEM может обеспечить гибкую модель системы, в которой для выполнения доклинических испытаний препарата в иммунной компетентным микрофономэ.

Ксенотрансплантаты из установленных клеточных линий и PDX человека требуют иммунодефицитом. В отличие от PDX, многие известные клеточные линии человека GBM не Повторим гистологические особенности GBM. Например, U87MG Ортотопическая ксенотрансплантаты формируется ограниченных опухолей, которые не вторгаются нормального мозга (Рисунок 5A). В противоположность этому, введение ГТО - / - астроциты в мозгах иммунокомпетентных, сингенных мышей дали инвазивных опухолей, которые перечислил гистологические особенности и их человеческие аналоги, в частности вторжения нормального мозга (Рисунок 5Б). Для количественной оценки ГТО в продольном направлении - / - рост аллотрансплантата, мышей умерщвляли через каждые 5 дней после инъекции клеток опухоли и нагрузка была определена путем количественного области опухоли на Н & Е-окрашенных срезов головного мозга. Опухоль площадь увеличивается экспоненциально с течением времени (Рисунок 5C). Ортотопическая введения 10 5 ГТО - / - астроциты на гecipient мозги привело к неврологическим заболеваемости, с медианой выживаемости 22 дней (Рисунок 5D). В дополнение к корковых астроцитов, мы провели Ортотопическая инъекции, используя TRP - / - НСК. TRP - / - NSC-производные опухоли были Т 121 положительный, пролиферативной, и поддерживается экспрессию маркера Sox2 NSC (фиг.6). Следует отметить, что инъекции кортикальных астроцитов и НСК найденным WT мышей C57BL / 6, а также фенотипически дикого типа корковых астроцитов или NSC с непрорекомбинировавших, floxed онкогенные аллели от условной GEM не вызывали образование опухолей в течение этого периода времени (данные не показаны). Продольный изображения в естественных был использован для контроля кинетики роста опухоли в ответ на медикаментозного лечения 40. Таким образом, ГТО - / - LUC астроциты были введены в мозг иммунокомпетентных сингенных помета и роста опухоли определяли путем серийного изображений биолюминесценции. Биолюминесценция увеличился в 15 раз в течение 16 дней(7А и 7В). Мы показали, что корковых астроциты и НСК, собранные с условной GEM может быть генетически модифицированы и фенотипически отличается в пробирке и в естественных условиях для определения генетики и клеточной биологии астроцитому патогенезе и могут быть использованы для доклинической разработки лекарств.

Рисунок 1
Рис.1 Схема корковой астроцитов и урожая НСК от nGEM. Фенотипически WT корковых астроциты и НСК собирали из GEM с условными онкогенных аллелей. Генетической рекомбинации индуцировали в пробирке с вектором AdCre. Трансформированные клетки фенотипически отличается в пробирке с помощью различных методов и в естественных условиях по ортотопического инъекции в мозг иммунокомпетентных,сингенные помета.

Рисунок 2
Рисунок 2 Обогащение GFAP + астроциты от серийного пассирования в пробирке. Представительства иммунофлуоресцентные изображения, показывающие GFAP + астроциты найденным Rb1 LoxP / LoxP GEM щенки с НФ1 LoxP / LoxP и / или Pten LoxP / LoxP в котором генетическая рекомбинация индуцировали Ad5GFAPCre и клетки пассированные раз X (PX) (A). Количественное определение обогащения GFAP + астроцитов в панели A. Столбцы показывают стандартную ошибку из 3-24 повторов (B). Представитель иммунофлюоресценции (сверху) и фазового контраста (внизу) изображения прилипшие корковых астроцитов найденным TgGZT 121 GEM щенков, которые выражают T 121 от GFAP промоутер в проходе9 лет после рекомбинации с Ad5CMVCre в пробирке (C). Астроциты были количественно как количество GFAP + (зеленый) клеток, деленное на общее количество DAPI-окрашенных ядер (синий) в любом другом прохода. Изображения были приняты на 10-кратным оригинальной увеличении (A, C). Шкала баров представляют 100 мкм (A, C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3 WT и рекомбинации НСК собирают из ГТО - / - GEM. Представительства фазового контраста изображения фенотипически WT (вверху) и ГТО - / - (внизу) НСК выросла как нейросферы в пробирке (). Представитель иммунофлюоресценции окрашивание на Т 121 (зеленый) и Sox2(Красный) выражение в WT (верхней) и ГТО - / - (нижней) нейросферы (B). Шкала баров представляют 100 мкм (A, B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Характеристика корковых астроцитов в пробирке. Рост WT и TR кортикальных астроцитов была определена путем подсчета клеток на 1-7 дней (A). Относительная оптической плотности (ОП) и WT TR кортикальных астроцитов была определена МТС (B). Относительная рост WT и рекомбинации Rb1 - / -; Nf1 - / -; Pten +/- (РЗУ +/-) астроциты определялась МТС (C). Свечение родительской ГТО - / - и Люциферомазы выражая ГТО - / - астроциты (ГТО - / - Люк) (D). Относительная ОП ГТО - / - астроциты, обработанные PI103 в течение 5 дней, как определено МТС (E). Пролиферация и доза ответ была рассчитана с использованием показательного уравнения роста в GraphPad Prism 5. Бары представляют стандартную ошибку от 6 повторов в состоянии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5 В естественных условиях gliomagenesis. Представитель Н & Е окрашивали сечение U87MG ксенотрансплантата показывает дискретные краев опухоли (а). Представитель H & E окрашенных сечение ГТО - / - аллотрансплантата показывает диффузное вторжение нормального мозга (Б). Шкала баров в левой и правой H & E изображений представляют 1 мм и 100 мкм соответственно. Опухоль площадь была определена путем анализа H & E окрашенных срезах, фиксированных формалином, парафин мозги от иммунокомпетентных, сингенным помета, которым вводили 10 5 ГТО - / - астроциты и пожертвовал на 5-дневными интервалами после инъекции. (С). Анализ Каплана-Мейера выживание ГТО - / - Аллотрансплантация мышей в возрасте до заболеваемости показывает среднюю выживаемость 22 дней (D).

Рисунок 6
Рисунок 6 Иммунофлуоресценции ГТО аллотрансплантатов +/- НБК. Представительства иммунофлуоресцентные снимках видно, что ГТО +/- НСК вводили в мозг иммунокомпетентных, сингенным помета выразить T 121 (зеленый) и Sox2 (белый) и размножаются, как определяется Эду (красный) включения. Мышей озарен EDU и пожертвовал 6 недель после инъекции и свои мозги озарен параформальдегида. Шкала бар представляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7 Продольная томография ГТО - / - LUC аллотрансплантаты. Представительства биолюминесценции изображения (A) и количественное люциферазной потока с течением времени (B) показывает рост ГТО - / - аллотрансплантаты в иммунокомпетентных, сингенных мышей вводили 10 5 ГТО - / - Люк корковых астроцитов и отображаемого при указанных дней пост впрыска.г "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Генотип Покрытие эффективность (%) SEM
WT 0 0
Т 1.03 0.15
ГТО - / - 6.40 0.83

Таблица 1 Colony формирование корковых астроцитов. WT, T и ГТО - / - корковых астроциты высевали в трех экземплярах в 4000, 2000, и 250 клеток / лунку соответственно. Колонии окрашивали кристаллическим фиолетовым через 14 дней после посева, отображаемого, и соunted использованием ImageJ. Покрытие эффективность рассчитывали как число колоний, деленная на количество посеянных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наиболее важные шаги для обеспечения надлежащего урожай и культуру корковых астроциты 1), чтобы вырезать кору, не принимая ткани ниже мозолистого тела, 2) для удаления оболочки мозга, 3), чтобы тщательно отделить клетки, и 4) для обогащения GFAP + астроциты. Хотя мы использовали механический (встряхивания) и генетический (ограничение генетической рекомбинации с вектором Ad5GFAPCre или использования доминирующего преобразующей трансгена (TgGZT 121) под контролем промотора GFAP) методов для обогащения GFAP + астроцитов, другие методы были использованы для очистки кортикальные астроциты. Например, загрязняя микроглии может быть удалена путем обработки сливной культур с митотической ингибитора с последующим L-лейцина метилового сложного эфира 47. Морфологии и профили экспрессии астроцитов механически очищенных и культивируемых в присутствии сыворотки СМИ отличаются от остро изолированных астроцитов, с бывшим гипотетическиZed представлять либо более незрелые астроцитов клетки или реактивный астроцитов фенотип 48,49. Совсем недавно, метод immunopanning была разработана для перспективно очистить корковых астроциты грызунов и их профили экспрессии более тесно передразнил обладающих острым очищенные астроцитов при культивировании в фактор роста-дополнить, бессывороточную среду 49. Воздействие обычного, механическим способом корковой обогащения и культуры астроцитов по сравнению с недавно разработанного метода immunopanning на фенотипов исследуемых здесь остаются неясными. Независимо от метода, используемого, важно, чтобы обогатить для GFAP + кортикальных астроцитов, чтобы определить фенотипические последствия онкогенных мутаций в частности, в рамках этого типа клеток.

Критические шаги для уборки НСК являются 1), чтобы точно определить местонахождение SVZ, 2), чтобы минимизировать ущерб СВЗ во время вскрытия, и 3) для фильтрации клеток следующее диссоциации перед посевом. PreciТехника рассечение себе НСК необходимо найти и выловить SVZ. Поскольку НСК расти в суспензионной культуре, важно, чтобы фильтровать суспензии клеток после диссоциации, чтобы уменьшить количество плавающего мусора. Хотя мы использовали рост СКМ, чтобы выбрать для НСК, НСК может быть перспективно выделяют флуоресценции активированных сортировки клеток гомогената ткани SVZ 50. После индукции генетической рекомбинации в пробирке, важно контролировать клеточные характеристики кортикальной астроцитов и культуры NSC через проходы. Потому что мы не перспективно обогащения астроцитов или НСК во время сбора урожая ткани, мы последовательно контролироваться обогащение и количественных чистоту типа клеток, представляющих интерес иммунофлуоресцентньш окрашивания специфических маркеров известных камерного типа (GFAP для астроцитов, Sox2 для НСК). Кроме того, мы рекомендуем систематического мониторинга ожидаемых последствий сигнальные онкогенных мутаций как до, так и на каждого прохода после Cre-посредникомд рекомбинации иммуноблоттингом и фенотипически характеризующие клетки при первой прохождения, при котором чистота является максимальным и мутации индуцированные изменения сигнализации стабилизации.

Важным фактором при использовании первичных клеточных культур является их присуща способность к репликации и фенотипический воздействие индуцированных мутаций. Фенотипически WT мышиные астроциты ограничили способность к репликации и может быть пассировать только 3 - 4 раза в культуре, прежде чем они подвергаются репликативного старения 31. Более того, многие рак мутации, связанные, в частности, в МАРК генов пути, причиной онкогенов, вызванной старением в пробирке 51. Таким образом, если индуцированные мутации не могут увековечить клетки и защитить их от онкогенов, вызванных старением, они не могут быть последовательно пассируют на фенотипические характеристики в пробирке. Вирусные онкобелки такие как ВПЧ Е6 / E7 и SV40 большой Т-антиген широко используется, чтобы увековечить многих человеческих и мютипы Rine клеток в культуре, в том числе астроцитов 13,26,30. Ранее мы показали, что абляции G1 / S клеточного цикла контрольно-пропускном пункте с T было достаточно, чтобы увековечить корковых астроцитов, но не достаточно, чтобы вызвать смертельные астроцитомы в естественных условиях. В отличие от этого, активацию MAPK и PI3K сигнализации в ГТО - / - астроциты привело к образованию GBM в системе 30 модели ортотопической аллотрансплантата. Таким образом, эффекты T, R, и P мутаций на мышиной трансформации астроцитов в пробирке, как определено с помощью анализов, образование колоний коррелирует с туморогенеза в естественных условиях в ортотопических аллотрансплантатов.

Как и все модели, которые требуют хирургической имплантации опухолевых клеток, ортотопического инъекции трансформированных, nGEM клеток сингенным мозга мышей вызовет острую реакцию раны, называют реактивной глиоз. Во время этой реакции, нервные клетки, в том числе астроцитов, олигодендроцитов прародителя (NG2 +) глии и микроглии, proliferели и приобретают более примитивный состояние дифференциации, в основном в ответ на секретируемых белков, таких как ежик Соник 52,53. Тем не менее, пролиферативная фаза реактивного глиозом в ответ на ранение колотой является относительно коротким, как правило, одна неделя 53. Ранее мы показали, что инъекция ГТО - / - астроциты эффективно индуцирует образование опухолей в течение этого времени, уступая низкосортные астроцитомы, что часто прогресса в высокосортных астроцитом, в том числе GBM. В противоположность этому, инъекция Т или ТП - / - астроциты нечасто перерасти в низкосортных астроцитом на 1-3 недели после инъекции и этих опухолей не в прогрессировать до полноценного астроцитом 30. Кроме того, инъекции фенотипически дикого типа корковых астроцитов и НСК только не может вызывать образование опухолей (данные не показаны). Мы обнаружили, что ГТО - / - аллотрансплантата рост в геометрической прогрессии увеличивает 2-3 недели после инъекции, временные рамки, в течение которого пролиферативная фаза реагироватьив глиоз завершит свою работу (5 и 7). Для учета возможных влияний микроокружения на туморогенеза при инжекции трансформированных, nGEM клеток сингенным мозга мышей, особенно во время фазы пролиферации реактивной глиозом, мы рекомендуем выполнять контрольные инъекции фенотипически дикого корковых астроцитов или НСК когда следственного новые комбинации непрорекомбинировавших, floxed онкогенными аллели. Мы также рекомендуем мониторинга эффективности туморогенеза обеих фенотипически дикого и трансформированных (рекомбинированных) клеток с интервалом в неделю в течение первого месяца после инъекции, как мы уже описано 30.

Через генетической манипуляции либо инжектированных клеток или самого хоста аллотрансплантата, астроцитома модель системы nGEM могут быть использованы для моделирования многие аспекты патогенеза астроцитома, в том числе опухоли стромы-взаимодействий. В качестве примера, мы инженерии ГТО - / - корковой astrocyTES выразить люциферазу определить кинетики роста опухоли в естественных условиях (рисунок 7). Кроме того, nGEM клетки могут быть генетически модифицированы, чтобы выразить флуоресцентный белок и ортотопически вводили в мозг GEM с флуоресцентно меченных нейронов или сосудистой определить взаимодействие между опухолевыми клетками и нормальными клетками головного мозга 54. Влияние микросреды области мозга и возраста с развитием на gliomagenesis может быть определена путем инъекций ортотопически nGEM клеток в разных местах или в разных старых мышей. Хотя короткие опухолевые задержки и выживание выгодно для доклинических испытаний препарата, быстрое развитие опухоли не может быть идеальным, чтобы моделировать некоторые аспекты астроцитому патогенезе, в том числе злокачественной прогрессии, вторжения, и опухоль-стомы взаимодействий. Выживание nGEM Аллотрансплантация хозяев можно легко манипулировать, изменяя количество клеток вводили и систематического мониторинга пенетрантность опухоли и задержка 30.

Человека астроцитомы геномно комплекс и демонстрируют обширные внутрирегиональной и межрегиональных опухоли неоднородность 5-7,55,56. Потенциальные источники этой неоднородности включают соматические мутации, которые инициируют образование опухолей, мутации, полученные во время эволюционного процесса злокачественной прогрессии, и потенциал развития клеток, в которых происходят эти мутации. Крупномасштабные секвенирования проекты выявили много Астроцитома мутации, связанные и их закономерности совместной встречаемости 7. Эти исследования, на которые ссылается биоинформатики алгоритмов для выявления часто возникающие мутации и выдвинуть мутации, которые могут онкогенными, т.е.. "мутации драйверов", инициирующие образование опухолей или диска, злокачественную прогрессию. Тем не менее, онкогенные потенциал многих из этих мутаций, и их потенциального типа клеток специфики, систематически не изучены в модельных системах. Мы полагаем, что модели nGEM Utilizing корковых астроцитов и NSC, как описано здесь, а также другие нервные типы клеток, которые могут быть очищены и выращенные в культуре, обеспечивают универсальную систему для выполнения таких исследований. Достаточность и необходимость трансформации новых мутаций кандидатов, выявленных в ходе крупных проектов шкала секвенирования может быть систематически исследованы с использованием обычного генетического амплитудно и с потерей функции приближается с конкретные виды nGEM сотовые укрывательство общих сопутствующих мутаций в ключевых GBM путей, для которых условная GEM существует 5. Кроме того, мы полагаем, что панели nGEM, несущие различные комбинации мутаций в нескольких нейронных типов клеток будет полезно при моделировании геномной гетерогенности человека астроцитомы. Кроме того, модели астроцитома nGEM с корковых астроциты и НСК, полученных из условного GEM может обеспечить послушный модель для доклинической разработки лекарств, потому что первоначальное тестирование в пробирке обоих моно и комбинированной терапии можетвыполняться в этих клетках, чтобы направить более эффективным в естественных условиях тестирования на наркотики в иммунокомпетентных, сингенных мышей. Кроме того, иммуномодулирующего и строме ориентированные виды терапии могут быть проверены в моделях nGEM астроцитомы с иммунокомпетентных, сингенным Аллотрансплантация хозяев. Таким образом, модели астроцитома nGEM с трансформированных кортикальных астроцитов и НСК представляют собой ценный модель системы для определения функциональных последствий комбинаций онкогенных мутаций в определенных типах клеток, и могут быть полезны в доклинических испытаний лекарственных средств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Tags

Neuroscience выпуск 90 астроцитома корковых астроциты генной инженерии мышей глиобластома нервные стволовые клетки ортотопическая аллотрансплантата
Моделирование Астроцитома Патогенез<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, … More

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter