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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Modellazione Astrocitoma Patogenesi Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Astrocitomi sono il tumore cerebrale primario più comune e glioblastoma (GBM), un astrocitoma di grado IV, è il sottotipo più comune e aggressivo, con una sopravvivenza mediana di 12-15 mesi 1,2. Invasione di astrocitomi diffusi, in particolare GBM, preclude la resezione chirurgica completa, limita l'efficacia delle terapie adiuvanti, e porta inevitabilmente alla post-trattamento recidiva 3. I pazienti inizialmente presenti sia con de novo (primario) GBM o con astrocitoma di grado inferiore che progredisce inevitabilmente (secondaria) GBM 4. GBM è genomicamente eterogeneo e caratterizzato da mutazioni si escludono a vicenda e co-si verificano in geni che governano tre principali vie di segnalazione: G 1 / S (Rb) checkpoint del ciclo cellulare, il recettore tirosin chinasi (RTK), e TP53 Percorsi di 5-7. GBM è composto da quattro sottotipi genomiche con profili di espressione distinti che assomigliano a diversi tipi di cellule del cervello, suggerendo che GBM sottotipo è influenfluenzati dalla sua cella di origine 6,8,9. Modelli di astrocitoma migliori sono tenuti a definire il ruolo di specifiche combinazioni di mutazioni in particolari tipi di cellule durante astrocitoma patogenesi. Sfruttando questi modelli per lo sviluppo di farmaci più efficaci preclinico in ultima analisi, contribuire a migliorare i risultati dei pazienti. Modelli di astrocitoma correnti comprendono stabilite linee cellulari umane, paziente derivante xenotrapianti (PDX), normali astrociti umani geneticamente modificati e cellule staminali neurali (NSC), e topi geneticamente ingegnerizzati (GEM) 10-14. Abbiamo sviluppato una alternativa, GEM non germinali (NGEM) modello 15 che utilizza cellule cerebrali primari - astrociti corticali e NSC - raccolti da GEM ospitare diverse combinazioni di alleli floxed oncogeni. L'obiettivo era quello di generare modelli di astrocitoma con cellule geneticamente definite che potrebbero essere caratterizzati fenotipicamente sia in vitro che in vivo e potenzialmente utilizzabili per lo sviluppo di farmaci in preclinico itopi mmune-competenti.

Linee cellulari umane Fondata sono il modello più comunemente usato di astrocitoma patogenesi e la risposta ai farmaci in vitro e in vivo. Essi sono tecnicamente semplice, ampiamente disponibile, e hanno definito cinetica e cancerogenicità su ortotopico xenotrapianto in topi immunodeficienti 10,11,16-18 . I loro svantaggi includono l'incapacità di generare linee cellulari stabilizzate da astrocitomi di basso grado, limitando studio solo per astrocitoma di alta qualità; mancanza di una cella definita di origine; la presenza di anomalie genomiche complesse, spesso con profili genomici che si differenziano notevolmente dal campione del paziente originale; e suscettibilità fenotipica e genotipica deriva durante la cultura di serie nel siero 11,17,19-22. Le conseguenze fenotipiche delle singole mutazioni oncogene in linee cellulari GBM umani stabiliti possono essere mascherati dalla moltitudine di anomalie che sono effettivamente presenti, che spesso preclude elucidation delle conseguenze dirette genotipo-fenotipo.

PDX sono generati attraverso il passaggio sottocutanea di cellule di astrocitoma-isolati di pazienti in topi immunodeficienti o attraverso la loro cultura come sferoidi non aderenti a definito, terreno privo di siero prima dell'iniezione ortotopico nel cervello di topi immunodeficienti 12,23. PDX mantenere più accuratamente il paesaggio genomico di astrocitoma umano, ma simile a linee cellulari umane stabilite, l'effetto fenotipico di singole mutazioni oncogene può essere mascherato a causa della loro complessità genomica 19,24. Per definire le conseguenze fenotipiche di specifiche mutazioni oncogene, in particolare in risposta alle nuove terapie, i pannelli di linee cellulari umane stabiliti o PDX sono spesso utilizzati per stabilire correlazioni genotipo-fenotipo, mostrare generalizzabilità, e ridurre al minimo la probabilità di effetti specifiche della linea di cellule. Mentre PDX ricapitolare con precisione le caratteristiche istopatologiche di astrocitoma umano, incLuding invasione, xenotrapianti ortotopici di linee cellulari umane stabiliti in genere non 21,23,25. Inoltre, normali astrociti umani e NSC sono stati geneticamente ingegnerizzato con mutazioni oncogene definite per modellare astrocitoma tumorigenesi in vitro e in vivo 13,14,26. Queste cellule non hanno la complessità genomica delle linee cellulari umane consolidate e PDX e ricapitolano accuratamente istopatologia astrocitoma umano, ma richiedono xenotrapianto nei roditori immunodeficienti in vivo. Poiché tutti i modelli cellulari umani richiedono host roditori immunodeficienti per evitare immuno-mediata rifiuto xenotrapianto, questi modelli non riescono a ricapitolare le interazioni tumore-stroma nativi di un sistema singeniche e mancano di un sistema immunitario intatto, limitando indagine preclinica di stroma-mirata e immuno-modulazione terapie 10,11.

GEM permesso di esame delle conseguenze fenotipiche di combinazioni predeterminate di muta oncogenozioni in vivo durante la tumorigenesi in situ. Considerando che la GEM non-condizionale hanno mutazioni all'interno di tutti i tessuti durante lo sviluppo, GEM condizionale hanno floxed alleli oncogeni che consentono il targeting di mutazioni limitando ricombinazione Cre-mediata di specifici tipi cellulari attraverso l'uso di specifici del tipo di cellule promotori 10,11,15,18. Condizionale astrocitoma GEM sono stati utilizzati per chiarire i ruoli funzionali di mutazioni in oncogeni tipi cellulari distinti all'interno di un cervello intatto 11. L'utilità di preclinico in situ gliomagenesis usando GEM condizionale è limitato da una serie di fattori, tra cui 1) la mancanza di una correlazione in vitro, 2) la difficoltà nel generare grandi coorti di topi con genotipi complessi, 3) tempi di latenza delle nello sviluppo del tumore in situ , 4) e stocastico progressione tumorale. Perché in situ tumorigenesi manca un modello corrispondente in vitro, test anti-droga in vitro non può essere eseguita wesima modelli GEM condizionali convenzionali. A differenza di altri tipi di tumore, modelli GEM condizionali di astrocitoma sono raramente indotti da singole mutazioni oncogeniche 11. Pertanto, i regimi di allevamento complessi sono necessari per generare GEM condizionale con più mutazioni oncogene. Inoltre, astrocitoma iniziazione si verifica con penetranza variabile, dopo un lungo periodo di latenza in questi modelli, mentre la progressione di astrocitomi di alto grado si verifica in genere in modo non uniforme, stocastico modo e dà infine origine a tumori con complessi paesaggi genomiche e cinetica di crescita rapida 27, 28. La penetranza variabile e la natura stocastica della progressione maligna nei modelli GEM condizionale richiede che i singoli topi proiettati da radiografie per rilevare la presenza e la posizione di astrocitomi di alto grado prima del loro arruolamento negli studi preclinici di droga. Nel loro insieme, queste limitazioni ostacolano la generazione e la sperimentazione di grandi coorti di GEM condizionale necessario per prtest eClinical droga.

Il sistema GEM RCAS-TVA, che utilizza retrovirali aviaria (RCA) vettori per infettare GEM ingegnerizzato per esprimere il recettore virale (TVA) su specifici tipi di cellule neurali, è stato ampiamente utilizzato per modellare astrocitoma tumorigenesi 11. In contrasto con GEM condizionale, questo sistema modello permette l'introduzione di mutazioni multiple oncogeni in tipi specifici di cellule, senza la necessità di sistemi di allevamento complessi. Tuttavia, è limitato da penetranza variabile, il requisito per dividere attivamente le cellule per ottenere l'integrazione virale, e l'inserimento casuale di transgeni nel genoma dell'ospite 29.

GEM (NGEM) Modelli non germinali, che utilizzano le cellule raccolte da GEM, stanno diventando sempre più importanti perché superare molte delle limitazioni degli altri sistemi modello 15. Il ruolo di avvio tipo di cellula e mutazioni co-occorrenti in astrocitoma patogenesi sono difficili da scoraggiareminiera utilizzando stabilito linee cellulari umane GBM o PDX perché derivano da tumori allo stadio terminale che hanno accumulato ampi mutazioni genetiche in tipi cellulari non definiti nel corso della progressione maligna. Al contrario, tutti i tipi di astrocitoma possono essere modellati utilizzando NGEM inducendo definite mutazioni genetiche all'interno di specifici tipi di cellule cerebrali purificate 11,30. Così, l'influenza di mutazioni genetiche specifiche e tipo cellulare su fenotipi cellulari e molecolari può essere determinata in vitro e in vivo. Simile a linee di cellule GBM umani stabiliti, in vitro test iniziale in droga utilizzando NGEM può essere utilizzato per dare priorità farmaci per la sperimentazione in vivo che utilizzano le stesse cellule. Tumorigenesi in vivo può essere determinato da allotrapianto di cellule NGEM ortotopicamente nel cervello dei fratellini singeniche immuno-competente 30. Questi modelli trapianto allogenico ortotopici permettono quindi nei test in vivo non solo convenzionali citotossici unnd terapie mirate, ma immuno-modulante e terapie stroma mirate pure. Infine, il ruolo del microambiente sulla iniziazione tumorale e la progressione può essere determinata confrontando i risultati tra NGEM e modelli GEM convenzionali utilizzando le stesse mutazioni negli stessi tipi cellulari.

Noi e altri abbiamo sviluppato astrocitoma NGEM utilizzando cellule primarie - astrociti, NSC, o cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) - raccolte da GEM 30-34. La logica alla base dello sviluppo di un astrocitoma NGEM era quello di creare un modello per determinare le conseguenze fenotipiche delle mutazioni in oncogeni specifici tipi cellulari che potrebbero essere utilizzati per la sperimentazione preclinica dei farmaci in vitro e in vivo in animali immuno-competenti. Abbiamo raccolto astrociti fenotipicamente WT corticali e NSC da non esprimono Cre, GEM subordinata mantenuto su un 94% C57 / BL6 sfondo> con floxed RB percorso - Rb1 loxP / loxP, o TgGZT121 - e floxed RTK / RAS / PI3K pathway - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP - geni in varie combinazioni 35-39. Siamo indotti ricombinazione genetica in vitro utilizzando vettori adenovirali codificanti Cre ricombinasi. Perché raccolti astrociti corticali contengono una miscela di tipi di cellule, abbiamo utilizzato vettori Ad5GFAPCre o transgeni oncogeni dominanti, come TgGZT 121 guidato dal promotore GFAP umana, per arricchire di GFAP + astrociti corticali in queste culture. Abbiamo definito le conseguenze fenotipiche della G 1 / S (Rb), MAPK, e mutazioni di PI3K pathway in astrociti corticali e NSC in vitro e in vivo. MAPK e PI3K pathway attivato G1 / S-difettosi astrociti molecolarmente imitato GBM umano proneurale e, a seguito di iniezione ortotopico, tumori formate in una posizione pre-definita con cinetica di crescita uniformi, brevi latenze, e la istopatologiciAL caratteristiche di GBM umano 30. Monitoraggio longitudinale della crescita tumorale in vivo aiuta droga test preclinici attraverso la normalizzazione delle coorti di trattamento e analisi quantitativa della crescita tumorale in risposta al trattamento 40. Abbiamo determinato cinetica di crescita tumorale da parte longitudinale bioluminescenza imaging topi iniettati con luciferasi che esprimono astrociti corticali. Pertanto, astrociti corticali e NSC derivate da GEM condizionale forniscono un sistema modello trattabili per la definizione delle conseguenze funzionali di mutazioni astrocitoma associate e di un sistema di potenziale modello per lo sviluppo di farmaci preclinico.

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Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla University of North Carolina Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Coltura corticale astrociti da topi neonati

  1. Preparazione
    1. Crumple 2-3 tessuti compito delicato e posizionare sul fondo di un pallone contenente etanolo al 70%. Posizionare forbici dissezione, pinze curve e 2 coppie di rette micro pinze in questo fiasco. I tessuti sono utilizzati per evitare di piegare le micro pinze.
    2. Aggiungere 1 ml di HBSS ad un piatto di coltura di tessuto di 60 mm. Preparare un piatto separato per ogni animale e mantenere piatti sul ghiaccio.
    3. Anestetizzare gli animali per i regolamenti istituzionali.
    4. Caldo 7 ml di DMEM con 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina (completo DMEM) per ciascun animale in un bagno d'acqua a 37 °. NOTA: Per i 5 topi, i punti 1.1.1-1.1.4 prenderà ~ 15 min.
  2. Tissue Harvest
    1. Sacrifice topo neonatale (giorno 1-3) per institutiregolamenti onal.
    2. Rimuovere le forbici dissezione da etanolo, permettere loro di sgocciolare, e fare un taglio sagittale della pelle sopra il cranio dal midollo spinale al naso.
    3. Fare un taglio nel cranio, lungo la sutura sagittale, partendo dal midollo spinale e si estende oltre i bulbi olfattivi. Fare attenzione a tenere le punte delle forbici vicino alla superficie interna del cranio per ridurre al minimo i danni ai tessuti cerebrali.
    4. Utilizzando pinze curve, buccia delicatamente ogni emisfero del cranio lateralmente lontano dal cervello.
    5. Utilizzando dritto micro pinze, pizzicare delicatamente via la porzione dorsale di ogni emisfero corticale e metterlo nel piatto di coltura tissutale contenente HBSS. Fare attenzione ad evitare il cervelletto e il bulbo olfattivo. Non prendere qualsiasi tessuto al di sotto del corpo calloso.
    6. Utilizzando un microscopio da dissezione e 2 paia di micro pinze, rimuovere delicatamente le meningi da ciascun emisfero corticale. Ritorna il piatto coltura di tessuti in ghiaccio fino al inizio homogenizatio tessuton.
    7. Ripetere i passaggi da 1.2.1 tramite 1.2.6 per ogni animale. NOTA: Per i 5 topi, i punti 1.2.1-1.2.7 prenderà ~ 30 min.
  3. Tissue Omogeneizzazione
    1. Utilizzando una lama di rasoio pulito, finemente a dadini gli emisferi corticali e spostare la piastra ad una cappa coltura tissutale.
    2. Trasferire il tessuto tagliato a dadini in un tubo da 15 ml sterile. Lavare la piastra con 1 ml di ghiaccio freddo HBSS e trasferire nella provetta contenente tessuti.
    3. Attendere fino a quando il tessuto si deposita sul fondo della provetta, quindi rimuovere con cautela l'eccesso HBSS con una pipetta.
    4. Aggiungere 2 ml di temperatura ambiente tripsina / EDTA. Deporre circa 10x con una pipetta 1 ml di dissociare ulteriormente le cellule.
    5. Incubare la sospensione cellulare a 37 ° C per 15 - 20 min. Mescolare accuratamente capovolgendo ogni 5 min.
    6. Aggiungere 3 ml di DMEM completo per inibire la tripsina. Deporre circa 10x con una pipetta 1 ml per mescolare la soluzione.
    7. Centrifugare a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    8. Rimuovereil surnatante con una pipetta 1 ml. Non aspirare il terreno perché il pellet potrebbe essere allentato.
    9. Risospendere il pellet in 4 ml di 37 ° C completare DMEM. Trasferire la sospensione cellulare a 75 cm vite superiore pallone di coltura tissutale. NOTA: Per i 5 topi, i punti 1.3.1-1.3.9 prenderà ~ 50 min.
    10. Circa 16 ore dopo la raccolta astrociti, lavare il pallone con 4 ml di 37 ° C HBSS, poi aggiungere 4 ml di 37 ° C completare DMEM. Mantenere gli astrociti corticali a 37 ° C in 5% di CO 2. NOTA: La fase di lavaggio è importante per la rimozione delle cellule non aderenti e detriti dalla cultura piatto.
    11. Quando la cultura è ~ 95% confluenti, agitare una notte a 37 ° C in 5% di CO 2, rimuovere i supporti contenenti le cellule staccate, quindi lavare il pallone con 4 ml di 37 ° C HBSS. Aggiungere 4 ml di 37 ° C completare DMEM e mantenere le cellule a 37 ° C in 5% CO 2. NOTA: Questo passaggio è importante per arricchire le culture di astrociti corticali, come contaminanti microglia ecellule progenitrici degli oligodendrociti si staccano con questa procedura e vengono rimossi dalla cultura 41.
    12. Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.11 per ogni animale.
  4. Induzione di ricombinazione genetica
    1. 24 ore dopo aver completato il punto 1.3.11, sostituire il supporto con 2 ml di 37 ° C completare DMEM. Aggiungere 1 ml di 37 ° C SCM contenenti 1 ml di> 10 10 pfu / ml di Ad5CMVCre o Ad5GFAPCre. Incubare per 6 ore a 32 ° C in 5% di CO 2 .CAUTION: precauzioni di sicurezza Usa BSL2 durante la manipolazione adenovirus ricombinante.
    2. Rimuovere i supporti contenenti virus e aggiungere 37 ° C DMEM completo senza virus agli astrociti corticali. ATTENZIONE: precauzioni di sicurezza Usa BSL2 durante la manipolazione adenovirus ricombinanti e scartare il supporto contenente il virus per i regolamenti istituzionali. NOTA: Per 5 colture di astrociti, i punti 1.4.1 - 1.4.3 prenderà ~ 15 min escludendo l'incubazione 6 ore.
    3. Espandere colture di astrociti corticali per avitro e in vivo caratterizzazione. NOTA: Determinare la presenza di mutazioni in seguito Cre-ricombinazione mediante PCR con primer specifici per il gene ricombinato o da immunoblots sia per la proteina mutata specifico o delle sue conseguenze segnalazione. Il tempo necessario per la stabilizzazione fenotipica di colture di astrociti corticali dopo Cre-ricombinazione sarà dipendente da mutazioni utilizzati e deve essere determinata empiricamente (Figura 2).

2. Coltura neurali Cellule Staminali da topi neonatale

  1. Preparazione
    1. Prima di iniziare la dissezione, preparare 4 ml di soluzione di digestione al cervello con l'aggiunta di 3,1 mg di papaina e 1,3 mg di cisteina 4 ml di mezzo di dissociazione - 98 mM Na 2 SO 4, 30 mM K 2 SO 4, 5.8 mM MgCl 2, 0,25 mM CaCl 2 , 1 HEPES mM (da 1 M HEPES pH 7,4 magazzino) glucosio 20 mM, 0,001% di rosso fenolo, e NaOH 0,125 mm. Aggiunta di papainae cisteina al mezzo dissociazione diventa la soluzione di colore giallo.
    2. Incubare a 37 ° C bagnomaria per 15 min. Mescolare periodicamente per inversione.
    3. Aggiungere 0,1 M NaOH goccia a goccia fino a soluzione di digestione torna alla luce di colore rosso.
    4. In una cappa di coltura di tessuti, filtro sterile la soluzione di digestione utilizzando un filtro siringa (0,22 micron dimensione dei pori). Conservare la soluzione di digestione su ghiaccio.
    5. Preparare 50 ml di Stem Cell Media (SCM) mescolando 44,5 ml NSC Basal Medium, 5 ml NSC supplemento, 0,5 ml di penicillina-streptomicina, 50 ml 0,2% eparina, 10 ml 100 mg / ml di EGF, e 10 ml 100 mcg / ml bFGF. SCM è stabile per 1 settimana se conservato a 4 ° C.
    6. Preparare completa HBSS (cHBSS) mescolando 50 ml di HBSS 10x, 1,25 ml di 1 M HEPES (pH 7.4), 15 ml di 1 M D-glucosio, 5 ml 100 mM CaCl 2, 5 ml 100 MgSO mm 4, e 2 ml di 1 M NaHCO3. Portare il volume totale di 500 ml con DDH 2 O.
    7. Filtro sterilizzare cHBSS witha 0,2 micron pori del filtro dimensioni e conservare a 4 ° C.
    8. Crumple 2-3 tessuti compito delicato e posizionare sul fondo di un pallone contenente etanolo al 70%. Posizionare forbici dissezione, pinze curve, e 2 paia di rette micro pinze in questo fiasco. I tessuti sono utilizzati per evitare di piegare le micro pinze. NOTA: Per i 5 topi, i punti 2.1.1-2.1.8 prenderà ~ 45 min.
  2. Tissue Harvest
    1. Sacrifice neonatale (giorno 1-3) topi per i regolamenti istituzionali.
    2. Rimuovere le forbici dissezione dal etanolo al 70%, consentono loro di sgocciolare, e fare un taglio sagittale della pelle sopra il cranio dal midollo spinale al naso.
    3. Fare un taglio nel cranio, lungo la sutura sagittale, partendo dal midollo spinale e si estende oltre i bulbi olfattivi. Fare attenzione a tenere le punte delle forbici vicino alla superficie interna del cranio per ridurre al minimo i danni ai tessuti cerebrali.
    4. Utilizzando pinze curve, buccia delicatamente ogni emisfero del cranio lateralmente dallacervello.
    5. Rimuovere delicatamente l'intero cervello e mettere in ghiaccio cHBSS freddo.
    6. Utilizzando un microscopio dissezione, rimuovere con attenzione meningi dal cervello con strumenti di dissezione sottili.
    7. Posizionare il cervello sulla sua superficie inferiore e rimuovere cervelletto / romboencefalo e bulbo olfattivo / corteccia frontale con verticale (coronale) taglia con un bisturi taglia 11.
    8. Ruotare il cervello residuo di 90 ° per posizionarlo sulla porzione caudale, generando così una vista coronale del cervello. Individuare i ventricoli laterali.
    9. Tagliare una sezione cubica contenente la zona subventricolare (SVZ).
    10. Trasferimento SVZ contenenti tessuti per un piatto di coltura di tessuti 60 millimetri con ghiaccio fresco cHBSS freddo e il tessuto trito con taglia 11 bisturi.
    11. Trasferire il tessuto tritato in una provetta sterile da 15 ml. Posizionare il tubo in ghiaccio.
    12. Lavare la capsula di Petri con 1-2 ml di ghiaccio cHBSS freddo. Trasferire la soluzione di lavaggio al tubo contenente tessuti.
    13. Ripetere i punti 2.2.1-2.2.12 con la neonata supplementarel topi se necessario. Trasferire tutte le provette da 15 ml di una cappa coltura tissutale per il resto del protocollo. NOTA: Per i 5 topi, i punti 2.2.1 - 2.2.13 prenderà ~ 45 min.
  3. Tissue Omogeneizzazione
    1. Posizionare la soluzione di digestione (preparata al punto 2.1.1) in un bagno d'acqua a 37 ° per 5 min. Inoltre, caldo 2 ml di SCM per il cervello in un bagno di 37 ° C Acque.
    2. Rimuovere con attenzione il surnatante del tessuto tritato con una pipetta 1 ml. Non aspirare.
    3. Aggiungere la soluzione di digestione 2 ml di 37 ° C per 15 ml provetta e miscelare accuratamente per inversione.
    4. Incubare a 37 ° C bagnomaria per 15 min. Mescolare capovolgendo ogni 5 min.
    5. Aggiungere altri 2 ml di soluzione di digestione 37 ° C in ogni provetta e ripetere il punto 2.3.4.
    6. Lasciare le cellule di depositarsi sul fondo della provetta per gravità, quindi rimuovere il supernatante dal tessuto digerito con una pipetta 1 ml.
    7. Aggiungere 2 ml di 10 mM E-64 diluito in cHBSS e mescolare accuratamente per inversione.
    8. Lasciare le cellule di depositarsi sul fondo della provetta per gravità, quindi rimuovere il supernatante dal tessuto digerito.
    9. Aggiungere 1 ml di 37 ° C cHBSS e omogeneizzare con una pipetta punta 1 ml (~ 20 colpi). Evitare di iniettare bolle d'aria durante l'omogeneizzazione dei tessuti.
    10. Passare il tessuto omogenato attraverso un filtro 40 micron cella dimensione dei pori, poi sciacquare il filtro con 5 ml di 37 ° C cHBSS.
    11. Centrifugare l'omogeneizzato di tessuto a 125 xg per 5 min.
    12. Togliere il 95% di surnatante con una pipetta 1 ml senza disturbare il pellet di cellule. Pellet cellulare con cautela risospendere in 200 ml 37 ° C SCM con una punta di pipetta 200 microlitri.
    13. Aggiungere 1,8 ml 37 ° C SCM e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra ben 6 sterile. NOTA: Per i 5 topi, i punti 2.3.1-2.3.14 prenderà ~ 75 min.
  4. Neural Stem Cell Culture
    1. Rifornire il mezzo dopo 3 giorni con l'aggiunta di altri 2 ml 37 °C SCM.
    2. Dopo 7 giorni, trasferire i neurosfere ad una provetta da 15 ml e lasciare che le neurosfere si depositano per gravità per> 5 min.
    3. Rimuovere il surnatante e aggiungere 2 ml di 37 ° C SCM.
    4. Trasferire le neurosfere di un nuovo pozzo di una piastra ben 6.
    5. Aggiungere 2 ml di 37 ° C SCM ogni 3-4 giorni, e cambiare completamente media ogni 7 giorni.
    6. Se neurosfere sono> 100 micron di diametro, dissociare accuratamente con soluzione di dissociazione di cellule staminali e replate la NSC alla densità cella desiderata.
  5. Induzione di ricombinazione genetica
    1. Aggiungere 1 ml di 37 ° C SCM contenenti 1 ml di> 10 10 pfu / ml di Ad5CMVCre o Ad5GFAPCre al 2 ml di SCM attualmente sulle cellule. ATTENZIONE: precauzioni di sicurezza Usa BSL2 nel maneggiare adenovirus ricombinante.
    2. Incubare per 6 ore a 32 ° C in 5% di CO 2.
    3. Trasferimento SCM con neurosfere in una provetta da 15 ml e lasciare che le sfere si depositano per gravità per 5 min.
    4. Rimuovere il surnatante prima con una pipetta 1 ml, poi con una pipetta 200 microlitri. ATTENZIONE: precauzioni di sicurezza Usa BSL2 durante la manipolazione adenovirus ricombinanti e scartare il supporto contenente il virus per i regolamenti istituzionali.
    5. Aggiungere 2 ml di 37 ° C SCM, senza virus al NSC, poi trasferire in un piatto ben 6. NOTA: Per 5 culture NSC, i punti 2.5.1-2.5.5 prenderà ~ 15 min escludendo l'incubazione 6 ore.
    6. Il giorno successivo, ripetere i punti 2.5.1-2.5.5, seguita da neurosfere passaging quando necessario. Le sfere possono essere ampliati per 2-3 passaggi prima caratterizzazione in vitro e iniezione ortotopico nel cervello di topo in vivo. NOTA: Determinare la presenza di mutazioni in seguito Cre-ricombinazione mediante PCR con primer specifici per il gene ricombinato o da immunoblots sia per la proteina mutata specifico o delle sue conseguenze segnalazione. Il tempo necessario per la stabilizzazione fenotipica delle culture NSC dopo Cre-ricombinazione sarà dipendentesulle mutazioni utilizzati e deve essere determinato empiricamente (figure 2 e 3).

3 Iniezione ortotopico di cellule ricombinato nel cervello di topi destinatario Iimmunocompetent

  1. Preparazione del 5% metil cellulosa
    1. Sciogliere 5 g di 15 cPs metilcellulosa in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml in 100 ml bottiglia tappo a vite. Aggiungere la polvere lentamente sotto agitazione a 4 ° C per evitare grumi. Si può richiedere fino a 24 ore di agitazione a 4 ° C per tutta la metilcellulosa per entrare in soluzione.
    2. Pesare il pallone e registrare il peso.
    3. Autoclave la soluzione di metilcellulosa 5%. Una volta autoclave, la metilcellulosa diventerà un gel semisolido.
    4. Pesare il pallone e calcolare il peso perso durante la sterilizzazione in autoclave.
    5. Aggiungere asetticamente 1 ml di acqua sterile per ogni grammo di peso perso.
    6. Mettere in ghiaccio e aggiungere 50 ml di ghiaccio freddo 2x DMEM. </ Li>
    7. Mescolare durante la notte con un agitatore magnetico a 4 ° C. Utilizzare una tecnica sterile per dividere la soluzione di metilcellulosa 5% in 20 ml aliquote. Conservare aliquote a 4 ° C per un massimo di sei mesi o fino alla 2x DMEM scadenza. NOTA: Preparazione della soluzione di metilcellulosa 5% a passi 3.1.1-3.1.7 richiederà ~ 2,5 giorni.
  2. Preparazione della corticale astrociti per iniezione
    1. Astrociti corticali Harvest quando ~ 90% confluenti.
    2. Per raccogliere, aspirare DMEM completo e lavare i piatti con un uguale volume di 37 ° C HBSS.
    3. Aggiungere abbastanza tripsina per coprire il piatto. Inclinare delicatamente e toccare la piastra fino a quando le cellule iniziano a staccarsi.
    4. Inattivare la tripsina con un uguale volume di 37 ° C completare DMEM.
    5. Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml e lavare la piastra con lo stesso volume di 37 ° C DMEM completo usato in 3.2.4.
    6. Media Transfer lavaggio alla provetta contenente cellule. Centrifugare a 200 xg per 3 min.
    7. Aspirare scellule upernatant e risospendere in 1 ml di 37 ° C completano DMEM.
    8. Conta la sospensione cellulare con un emocitometro o un altro contatore cella appropriata per determinare il numero di cellule / ml.
    9. Trasferire il numero desiderato di cellule in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 200 xg per 3 min.
    10. Risospendere le cellule in 800 microlitri di 37 ° C completano DMEM. Determinare il volume del pellet di cellule (volume totale della sospensione cellulare - 800 microlitri). NOTA: E 'essenziale per ottenere una concentrazione di cellule preciso per l'iniezione. Pertanto, il volume del pellet cellulare deve essere determinata in questa fase per calcolare il volume del 5% metilcellulosa aggiungere nel passaggio 3.2.12.
    11. Trasferire le cellule ad una sterile da 1,5 ml provetta e centrifugare a 200 xg per 3 min.
    12. Aspirare il surnatante dal pellet e risospendere le astrociti corticali nel volume appropriato di ghiaccio-freddo 5% metil cellulosa (desideravano volume totale - volume diil pellet cellulare) per ottenere il numero desiderato di cellule / ml.
    13. Posizionare le cellule in ghiaccio fino iniezione.
    14. Posizionare una siringa di vetro da 250 ml in un dispenser Antigen Ripetendo poi posto un ottuso G 18 ago sulla siringa.
    15. Ritirare lo stantuffo lentamente con l'ago nella sospensione astrociti corticale; ci sarà una bolla d'aria sopra le celle che devono essere rimosse, poiché le bolle d'aria si comprime e diminuire il volume effettivamente iniettata nel cervello.
    16. Tenere la punta dell'ago appena sopra la sospensione astrociti corticali e spingere il pistone in fretta. La bolla d'aria si muove più veloce della sospensione cellulare e principalmente sarà espulso.
    17. Ripetere il punto 3.2.16 fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimossi dal ago.
    18. Riempire la siringa a circa ~ 200 microlitri, quindi tenere l'ago e tirare lo stantuffo fino all'arresto. Piccole bolle d'aria possono essere rimosse tenendo l'ago punta e rapidamente spingendo lo stantuffo in circa 50 microlitri poi lentamente ritirando a piena capacità.
    19. Tenere la punta in posizione verticale e ripetere il punto 3.2.18 4-5x.
    20. Gettare l'ago 18 gauge e inserire un ago 27 G sulla siringa.
    21. Premere il pulsante sul dispenser dell'antigene finché il liquido viene espulso dal ago. NOTA: Per 1 linea cellulare astrociti, i punti 3.2.1-3.2.21 prenderà ~ 60 min.
  3. Preparazione del NSC per iniezione
    1. Quando neurosfere sono> 100 micron di diametro, trasferimento in provette da 15 ml e lasciare che le neurosfere si depositano per gravità per> 5 min.
    2. Rimuovere il surnatante e dissociare le neurosfere con un reagente di dissociazione dolce, come la soluzione di dissociazione di cellule staminali o accutase secondo le istruzioni del costruttore o con il 0,05% tripsina-EDTA come descritto 42.
    3. Inibire i reagenti di dissociazione secondo le istruzioni del produttore, senza esporre il NSC al siero. Centrifugare a 100 xg per 5 min.
    4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un altro contatore cella appropriata per determinare il numero di cellule / ml.
    5. Trasferire il numero desiderato di NSC per un nuovo tubo da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 5 min.
    6. Risospendere le cellule in 800 ml di 37 ° C HBSS. Determinare il volume del pellet di cellule (volume totale della sospensione cellulare - 800 microlitri). NOTA: E 'essenziale per ottenere una concentrazione di cellule preciso per l'iniezione. Pertanto, il volume del pellet cellulare deve essere determinata in questa fase per calcolare il volume del 5% metilcellulosa aggiungere nel passaggio 3.3.9.
    7. Trasferire le cellule ad una provetta sterile da 1,5 ml e centrifugare a 100 xg per 5 min.
    8. Aspirare il surnatante e finire di preparare le cellule per l'iniezione ortotopico come in 3.2.12-3.2.21. NOTA: Per 1 linea cellulare NSC, i passaggi 3.3.1-3.3.9 si terrà ~ 60 min.
  4. Preparazione del mouse per iniezione
    1. Anestetizzare il destinatario degli animali tramite una iniezione IP di 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribromoethanol) o 100 mg / kg di ketamina oltre 10 mg / kg xilazina, secondo le linee guida istituzionali IACUC. NOTA: Utilizzato nel presente documento sono topi a 3-6 mesi di età, come ospiti trapianto allogenico. I topi in età diverse può essere utilizzato per studiare l'impatto microambientali dell'età evolutiva del cervello su tumorigenesi.
    2. Shave il cuoio capelluto sopra il sito di incisione con tagliaunghie o forbici.
    3. Sterilizzare il sito chirurgico con 3 alternati tamponi di etanolo al 70% e betadine.
    4. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi per prevenire eventuali danni dovuti a perdita del riflesso corneale.
    5. Valutare profondità dell'anestesia con il ritiro pedale (pizzico tep) reflex. NOTA: Per i 5 topi, i punti 3.4.1-3.4.5 prenderà ~ 15 min.
  5. Impianto ortotopico
    1. Fissare l'animale nel telaio stereotassico.
    2. Makposta un'incisione sopra la sutura sagittale lungo circa 0,5 cm tra le orecchie e gli occhi.
    3. Individuare l'intersezione delle suture coronali e sagittali (bregma), così come l'intersezione delle suture lambdoid e sagittali (Lambda). Assicurarsi che Bregma e Lambda sono sullo stesso piano orizzontale.
    4. Attaccare la siringa contenente la sospensione cellulare e ripetendo dispenser antigene al telaio stereotassico sulla testa. Portare la punta dell'ago 27 G a contatto con Bregma. Questa è l'origine che verrà utilizzato per la manipolazione di tre coordinate tridimensionali.
    5. Sollevare l'ago leggermente la superficie del cranio e muovere di 2 mm lateralmente e di 1 mm rostrale da Bregma.
    6. Abbassare con cautela l'ago attraverso il cranio alla sua destinazione 4 millimetri ventrale da Bregma. NOTA: Abbiamo utilizzato queste coordinate stereotassica per indirizzare i gangli della base. Diversi coordinate stereotassica possono essere utilizzati per studiare l'impatto microambientali di diversoregioni cerebrali su tumorigenesi.
    7. Iniettare 5 ml di sospensione cellulare attivando l'erogatore antigene ripetuta una volta. Lasciare l'ago in posizione per 2 minuti per consentire la pressione intracranica equilibrare.
    8. Estrarre l'ago lentamente in un periodo di 30 sec. Usare un batuffolo di cotone per applicare la pressione di qualsiasi sanguinamento che possono verificarsi.
    9. Approssimare i bordi della ferita e chiudere l'incisione con adesivo tissutale. Somministrare 20 ml di lidocaina per via sottocutanea al sito di incisione. NOTA: Per i 5 topi, i punti 3.5.1-3.5.9 prenderà ~ 50 min. L'UNC IACUC approvato l'uso post-operatorio di soli anestesia locale. Si raccomanda un consulto IACUC istituzionale locale in materia di requisiti per l'uso analgesico postoperatorio dopo questa procedura.
  6. Cura post-chirurgica
    1. Mettere gli animali in un ambiente pulito, gabbia calda per recuperare. Gli animali non devono essere collocati direttamente nella biancheria da letto, come l'aspirazione accidentale può verificarsi.
    2. Osservare ilanimali per la ripresa di un comportamento normale, come governare, mangiare, e la defecazione. NOTA: Ripresa di un comportamento normale può prendere ~ 60 min.

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Representative Results

Abbiamo sviluppato un sistema modello NGEM con astrociti corticali e NSC raccolte da neonatale GEM l'ospitare floxed condizionali alleli oncogeni che possono essere caratterizzati fenotipicamente in vitro e in vivo (Figura 1). Al fine di indagare le conseguenze delle mutazioni oncogeniche specificamente in astrociti corticali in vitro, è fondamentale per arricchire la prima per astrociti. Raccolti astrociti corticali contengono una miscela di microglia, astrociti, oligodendrociti, OPC, e neuroni, ma metodi meccanici e genetici possono aiutare nella astrociti arricchimento. Considerando che i neuroni muoiono in normali condizioni di coltura, microglia e oligodendrociti possono essere rimosse agitando pernottamento 41,43. Inoltre, la ricombinazione genetica di floxed, alleli oncogeni mirati per GFAP + astrociti utilizzando un Ad5GFAPCre può arricchire di astrociti. Abbiamo usato questo metodo per infettare i raccolti corticali da cuccioli Rb1 loxP / loxP GEM con flossa Nf1 loxP / loxP e / o Pten loxP alleli / loxP. Ad5GFAPCre infezione ha causato un vantaggio proliferativo in GFAP ricombinato + astrociti, che ha aumentato astrociti purezza dal 59% al> 90% dopo 5-9 passaggi in coltura (figure 2A e 2B). In alternativa, abbiamo arricchito per astrociti esprimendo T 121 sotto il controllo del promotore GFAP per indurre un vantaggio proliferativo in astrociti raccolte da TgGZT 121 topi (Figura 2C). Mentre astrociti corticali crescono aderente al piatto di coltura (Figura 2C), NSC crescere come neurosfere non aderenti in vitro (Figura 3A). Sia WT NSC e NSC con ricombinato, floxed alleli oncogenici - TgGZT 121 (T), Kras G12D (R), e cancellazione Pten omozigote (P - / -), denominato TRP- / - - Esprimono il marcatore Sox2 NSC, mentre solo NSC raccolto da GEM contenente TgGZT 121 express T 121 dopo ricombinazione Cre-mediata (Figura 3B).

Per determinare come G 1 / S (Rb), MAPK e / o PI3K pathway alterazioni influenzano la crescita di GFAP + astrociti in vitro, la proliferazione è stata esaminata utilizzando due metodi. MTS e il conteggio delle cellule hanno dimostrato che l'espressione di T 121 e Kras G12D ha aumentato la proliferazione degli astrociti corticali (figure 4a e 4b). Allo stesso modo, omozigote Rb1 (Rb) e Nf1 (N), delezione combinata con eterozigoti Pten (P +/-) la cancellazione anche un aumento della proliferazione degli astrociti corticali (Figura 4C). Cellule trasformate hanno illimitata capacità proliferativa. Gli effetti di trasformazione delle mutazioni possono essere misurati in vitro utilizzando colsaggi di formazione ony. Abbiamo quindi testato gli effetti di trasformazione del T 121 e Kras G12D espressione e omozigote delezione Pten in TRP - / - astrociti corticali dalla colonia saggio di formazione come descritto in precedenza 44. Considerando che gli astrociti WT non formano colonie, T astrociti formano colonie presso efficienza 1,03%. In particolare, TRP - / - astrociti hanno avuto la più alta efficienza di formazione di colonie al 6,40% (Tabella 1). Per essere adatto per droga test preclinici, è importante che nei modelli tumorali in vitro essere facilmente manipolato geneticamente. Ulteriori alterazioni genetiche possono essere stabilmente introdotte in astrociti corticali di plasmidi o vettori virali. Come esempio, abbiamo stabilmente trasdotte il gene della luciferasi in TRP - / - astrociti (TRP - / - luc) utilizzando un VSV-pseudotyped pMSCV vettore retrovirale. L'espressione di luciferasi aumentato luminescenza ~ 1.000 volte rispetto alle cellule parentali ( in vitro. Abbiamo dimostrato in precedenza che il trattamento con basse dosi PI-103, un inibitore doppio mTOR / PI3K, ha inibito la segnalazione PI3K senza compromettere la vitalità cellulare 30. Tuttavia, gli effetti citotossici / citostatici di maggiori PI-103 dosi non sono state determinate. Così, abbiamo testato se PI-103 può ridurre TRP - crescita astrociti in vitro - /. PI-103 ha causato una riduzione del 88% massimo in TRP - crescita astrociti (Figura 4E) - /. Abbiamo già utilizzato trapianti ortotopici di TRP - / - astrociti per testare altre terapie clinicamente rilevanti in vivo (Schmid et al, manoscritto presentato.) 45,46. Questi dati suggeriscono che gli astrociti corticali trasformato raccolte da GEM condizionale possono fornire un modello di sistema flessibile in cui eseguire test antidroga preclinici in immune mic competentee.

Xenotrapianti di linee cellulari umane consolidate e PDX richiedono host immunodeficienti. A differenza di PDX, molte linee di cellule GBM umani stabiliti non ricapitolano le caratteristiche istopatologiche di GBM. Ad esempio, U87MG xenotrapianti ortotopici formano tumori circoscritti che non invadono il cervello normale (Figura 5A). Al contrario, l'iniezione di TRP - / - astrociti nel cervello di topi immuno competenti, singenici ha prodotto tumori invasivi che ricapitolato le caratteristiche istologiche delle loro controparti umane, in particolare l'invasione del cervello normale (Figura 5B). Per longitudinalmente quantificare TRP - / - crescita allotrapianto, i topi sono stati sacrificati ogni 5 giorni dopo l'iniezione di cellule e massa tumorale è stata determinata quantificando zona tumorale su sezioni di cervello H & E-colorati. Zona del tumore è aumentata esponenzialmente nel tempo (Figura 5C). Iniezione ortotopico di 10 5 TRP - / - astrociti in rcervelli ecipient portato alla morbilità neurologica, con una sopravvivenza mediana di 22 giorni (Figura 5D). Oltre a astrociti corticali, abbiamo effettuato iniezioni ortotopici con TRP - / - NSC. TRP - / - tumori NSC-derivati ​​sono stati T 121 positivi, proliferativa, e mantenuti espressione del marcatore Sox2 NSC (Figura 6). Da notare, l'iniezione di astrociti corticali e NSC raccolte da WT C57Bl / 6 topi così come astrociti corticali fenotipicamente WT o NSC con unrecombined, floxed alleli oncogenici da GEM condizionale non è riuscito a suscitare tumorigenesi durante questo lasso di tempo (dati non riportati). Imaging longitudinale in vivo è stato usato per monitorare cinetica di crescita tumorale in risposta a trattamenti farmacologici 40. Così, TRP - / - astrociti Luc sono state iniettate nel cervello di immunitari fratellini singeniche competenti e la crescita del tumore è stata determinata l'imaging bioluminescenza seriale. Bioluminescenza è aumentata 15 volte più di 16 giorni(Figure 7A e 7B). Abbiamo dimostrato che gli astrociti corticali e NSC raccolte da GEM condizionale possono essere modificati geneticamente e fenotipicamente caratterizzate in vitro e in vivo per la definizione della genetica e della biologia delle cellule di astrocitoma patogenesi e potenzialmente utilizzati per lo sviluppo di farmaci preclinico.

Figura 1
Figura 1 Schema di astrociti corticali e raccolto NSC da NGEM. Fenotipicamente WT astrociti corticali e NSC sono state raccolte da GEM con alleli oncogenici condizionali. Ricombinazione genetica è stata indotta in vitro con un vettore AdCre. Cellule trasformate sono stati caratterizzati fenotipicamente in vitro con vari metodi e in vivo per iniezione ortotopico nel cervello di immuno-competente,cucciolata singenici.

Figura 2
Figura 2 Arricchimento di GFAP + astrociti su passaging seriale in vitro. Immagini di immunofluorescenza rappresentative che mostrano GFAP + astrociti raccolte da Rb1 loxP / cuccioli loxP GEM con NF1 loxP / loxP e / o Pten loxP / loxP in cui la ricombinazione genetica è stata indotta con Ad5GFAPCre e le cellule diversi passaggi X volte (PX) (A). Quantificazione di arricchimento di GFAP + astrociti nel pannello A. barre rappresentano l'errore standard 3-24 replicati (B). Immunofluorescenza Rappresentante (in alto) e contrasto di fase (in basso) le immagini di astrociti corticali aderenti raccolte da TgGZT 121 cuccioli GEM che esprimono T 121 dal promotore GFAP al passaggio9 anni dopo ricombinazione con Ad5CMVCre in vitro (C). Gli astrociti sono stati quantificati come il numero di GFAP + (verde), le cellule diviso per il numero totale di nuclei DAPI-colorati (blu) in ogni altro passaggio. Le immagini sono state scattate a 10X di ingrandimento originale (A, C). Barre di scala rappresentano 100 micron (A, C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 WT e ricombinato NSC raccolte da TRP - / - GEM. Immagini a contrasto di fase rappresentative della fenotipicamente WT (in alto) e TRP - / - (basso) NSC coltivate come neurosfere in vitro (A). Rappresentante colorazione immunofluorescenza per T 121 (verde) e Sox2(Rosso) espressione in WT (in alto) e TRP - / - (in basso) neurosfere (B). Barre di scala rappresentano 100 micron (A, B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4 Caratterizzazione di astrociti corticali in vitro. La crescita di WT e TR astrociti corticali è stata determinata mediante conteggio delle cellule nei giorni 1-7 (A). Densità ottica relativa (OD) di astrociti corticali WT e TR è stata determinata da MTS (B). Crescita relativa di WT e Rb1 ricombinato - / -; Nf1 - / -; Pten +/- (RbNP +/-) astrociti è stato determinato da MTS (C). Luminescence di TRP genitoriale - / - e Luciferoase esprimendo TRP - / - astrociti (TRP - / - luc) (D). OD relativa del TRP - / - astrociti trattati con PI103 per 5 giorni come determinato da MTS (E). Proliferazione e la dose di risposta è stato calcolato utilizzando l'equazione crescita esponenziale in GraphPad Prism 5. bar rappresentano errore standard da 6 repliche per condizione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5 In vivo gliomagenesis. Rappresentante sezione H & E macchiato di un xenotrapianto U87MG mostra margini del tumore discreti (A). Rappresentante H & E sezione macchiato di un TRP - / - allotrapianto mostra invasione diffusa del cervello normale (B). Bar Scala in H & E immagini sinistra e destra rappresentano 1 mm e 100 micron, rispettivamente. Zona del tumore è stata determinata analizzando le sezioni H & E macchiato di fissati in formalina, inclusi in paraffina cervelli da immuno-competenti, fratellini singeniche iniettati con 10 5 TRP - / - astrociti e sacrificato alle 5 del giorno a intervalli dopo l'iniezione. (C). Kaplan-Meier analisi di sopravvivenza di TRP - / - mice trapianto allogenico di età alla morbilità mostra una sopravvivenza mediana di 22 giorni (D).

Figura 6
Figura 6 immunofluorescenza di TRP +/- allotrapianti NSC. Immagini di immunofluorescenza rappresentativi mostrano che TRP +/- NSC iniettato nel cervello di immuno-competenti, fratellini singeniche esprimere T 121 (verde) e Sox2 (bianco) e proliferare, come determinato da Edu (rosso) l'incorporazione. I topi sono stati perfusi con EdU e sacrificati sei settimane dopo l'iniezione e il loro cervello perfusi con paraformaldeide. Barra della scala rappresenta 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7 l'imaging longitudinale di TRP - / - trapianti Luc. Immagini rappresentative bioluminescenza (A) e la quantificazione dei flussi luciferasi nel tempo (B) mostra una crescita del TRP - / - trapianti in immuno-competenti, topi singenici iniettati con 10 5 TRP - / - astrociti corticali Luc e ripreso ai giorni indicati post iniezione.g "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Genotipo Placcatura di efficienza (%) SEM
WT 0 0
T 1.03 0.15
TRP - / - 6.40 0.83

Tabella 1 Colony formazione di astrociti corticali. WT, T e TRP - / - astrociti corticali sono state piastrate in triplicato a 4.000, 2.000 e 250 cellule ben rispettivamente /. Le colonie sono state colorate con cristal violetto 14 giorni dopo la placcatura, esposte, e coUnted utilizzando ImageJ. Placcatura efficienza è stata calcolata come il numero di colonie diviso per il numero di cellule piastrate.

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Discussion

I passaggi più critici per assicurare la corretta raccolta e la cultura di astrociti corticali sono 1) di asportare la corteccia senza prendere il tessuto al di sotto del corpo calloso, 2) per togliere le meningi, 3) per dissociare completamente le cellule, e 4) per arricchire di GFAP + astrociti. Anche se abbiamo usato meccanica (scuotimento) e genetico (limitazione di ricombinazione genetica con un vettore Ad5GFAPCre o l'utilizzo di una trasformazione transgene dominante (TgGZT 121) sotto il controllo del promotore GFAP) metodi per arricchire per GFAP + astrociti, altre tecniche sono state utilizzate per purificare corticale astrociti. Ad esempio, contaminando microglia può essere rimosso trattando colture confluenti con un inibitore mitotico seguita da l-leucina metil estere 47. I profili di morfologia e di espressione di astrociti meccanicamente purificate e coltivate in mezzi di siero contenenti diverse da astrociti acutamente isolate, con la prima ipotesiZed di rappresentare sia le cellule astrociti più immature o di un reattivo astrociti fenotipo 48,49. Più di recente, un metodo immunopanning è stata sviluppata per purificare prospettico astrociti corticali roditori e dei loro profili di espressione più strettamente imitato acutamente astrociti purificati quando coltivate in crescita, mezzi di informazione liberi-siero fattore-integrato 49. L'impatto del convenzionale, metodo meccanico di corticale arricchimento e cultura astrociti rispetto al metodo immunopanning più sviluppata di recente sui fenotipi studiati nel presente documento restano poco chiare. Indipendentemente dal metodo utilizzato, è essenziale per arricchire per GFAP + astrociti corticali per determinare le conseguenze fenotipiche delle mutazioni oncogene specificamente all'interno di questo tipo di cellule.

Passaggi critici per la raccolta NSC sono 1) per individuare con precisione la SVZ, 2) per minimizzare i danni alla SVZ durante la dissezione, e 3) per filtrare le celle seguenti dissociazione prima della placcatura. Precise NSC tecnica di dissezione è necessaria per individuare e raccogliere la SVZ. Poiché NSC crescere in coltura in sospensione, è essenziale per filtrare la sospensione cellulare dopo dissociazione per ridurre la quantità di detriti galleggianti. Anche se abbiamo utilizzato una crescita in SCM selezionare per la NSC, NSC può essere prospetticamente isolato mediante fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule del tessuto omogenato SVZ 50. Dopo l'induzione di ricombinazione genetica in vitro, è importante monitorare le caratteristiche cellulari di astrociti corticali e culture NSC attraverso passaggi. Perché noi non abbiamo modo prospettico per arricchire astrociti o NSC durante la raccolta dei tessuti, abbiamo monitorato in serie arricchimento e la purezza quantificata del tipo di cellula di interesse mediante immunofluorescenza colorazione con marcatori specifici delle cellule di tipo noto (GFAP per gli astrociti, Sox2 per NSC). Inoltre, si consiglia di monitorare sistematicamente le conseguenze di segnalazione attesi di mutazioni oncogene sia prima che ad ogni passaggio dopo Cre-mediatad ricombinazione mediante immunoblotting e fenotipicamente che caratterizza le cellule al più presto il passaggio in cui purezza è massimizzato e mutazione indotta alterazioni segnalazione stabilizzare.

Una considerazione importante in utilizzando colture cellulari primarie è la loro capacità replicativa intrinseca e l'impatto fenotipica delle mutazioni indotte. Fenotipicamente WT astrociti murini hanno limitato la capacità replicativa e possono essere diversi passaggi solo 3 - 4 volte nella cultura prima che subiscono senescenza replicativa 31. Inoltre, molti di cancro associato mutazioni, in particolare nei geni pathway MAPK, causa senescenza oncogene-indotta in vitro 51. Così, se le mutazioni indotte non riescono ad immortalare le cellule e proteggerli da senescenza oncogene-indotta, non possono essere in serie diversi passaggi per la caratterizzazione fenotipica in vitro. Oncoproteine ​​virali come l'HPV E6 / E7 e SV40 antigene T grande sono stati ampiamente utilizzati per immortalare molti mu umana etipi di cellule rine nella cultura, inclusa astrociti 13,26,30. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'ablazione del G1 / S del ciclo cellulare checkpoint con T era sufficiente per immortalare astrociti corticali, ma non sufficiente a causare astrocitomi letali in vivo. Al contrario, l'attivazione di MAPK e PI3K segnalazione in TRP - / - astrociti ha portato alla formazione del GBM nel sistema modello di allotrapianto ortotopico 30. Pertanto, gli effetti delle mutazioni T, R, P e sulla trasformazione astrociti murini in vitro come definiti mediante saggi di formazione di colonie correlati con tumorigenesi in vivo in allotrapianti ortotopiche.

Come tutti i modelli che richiedono l'impianto chirurgico di cellule tumorali, iniezione ortotopico di cellule trasformate, NGEM nel cervello singeniche mouse suscitare una risposta acuta ferita, chiamato gliosi reattiva. In questa risposta, le cellule neurali, tra cui gli astrociti, oligodendrociti progenitore (NG2 +) glia e microglia, prolifermangiato e acquisire uno stato di differenziazione più primitivo, soprattutto in risposta alle proteine ​​secrete quali Sonic hedgehog 52,53. Tuttavia, la fase proliferativa di gliosi reattiva in risposta al ferimento pugnalata è relativamente breve, in genere una Settimana 53. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'iniezione di TRP - / - astrociti induce efficiente tumorigenesi durante questo lasso di tempo, ottenendo astrocitomi di basso grado che spesso progrediscono di astrocitoma di alta qualità, tra cui GBM. Al contrario, l'iniezione di T o TP - / - astrociti sviluppano di rado in astrocitomi di basso grado in 1-3 settimane post-iniezione e questi tumori non riescono a progredire verso alto grado astrocitomi 30. Inoltre, l'iniezione di fenotipicamente wild-type astrociti corticali e NSC da solo non riesce a suscitare tumorigenesi (dati non riportati). Abbiamo trovato che TRP - / - crescita allotrapianto aumenta in modo esponenziale di 2-3 settimane dopo l'iniezione, un periodo di tempo durante il quale la fase proliferativa di reagireive gliosi è terminato (figure 5 e 7). Per tener conto di potenziali influenze del microambiente sulla tumorigenesi a seguito di iniezione di cellule trasformate, NGEM nel cervello di topi singenici, in particolare durante la fase proliferativa di gliosi reattiva, si consiglia di eseguire iniezioni di controllo di astrociti corticali fenotipicamente WT o NSC quando studiando nuove combinazioni di unrecombined, floxed oncogeno alleli. Noi raccomandiamo anche monitorare l'efficienza delle tumorigenesi di entrambi (ricombinati), le cellule fenotipicamente WT e trasformati a intervalli settimanali durante la post-iniezione primo mese, come abbiamo descritto in precedenza 30.

Attraverso la manipolazione genetica di entrambi le cellule iniettate o la stessa accoglienza allotrapianto, il sistema modello astrocitoma NGEM può essere usato per modellare molti aspetti di astrocitoma patogenesi, comprese le interazioni tumore-stroma. Come esempio, abbiamo progettato TRP - / - astrocy corticaleTES per esprimere luciferasi definire cinetica di crescita tumorale in vivo (Figura 7). In alternativa, le cellule NGEM potrebbero essere geneticamente modificati per esprimere una proteina fluorescente e ortotopicamente iniettato nel cervello di GEM con neuroni o vascolarizzazione fluorescente per definire le interazioni tra cellule tumorali e normali cellule cerebrali 54. L'influenza microambientali della regione del cervello o età evolutiva su gliomagenesis può essere determinato da ortotopicamente iniettando cellule NGEM in luoghi diversi o in differenti topi anziani. Anche se latenze breve tumore e la sopravvivenza è benefico per il test della droga preclinica, sviluppo tumorale rapida potrebbe non essere l'ideale per modellare alcuni aspetti di astrocitoma patogenesi, tra cui la progressione maligna, invasione, e le interazioni tumore-stoma. La sopravvivenza del trapianto allogenico NGEM host può essere facilmente manipolato alterando il numero di cellule iniettate e il monitoraggio sistematico penetranza del tumore e la latenza 30.

Astrocitomi umani sono genomicamente complesse e presentano ampie intra e inter-tumore eterogeneità 5-7,55,56. Potenziali fonti di questa eterogeneità includono le mutazioni somatiche che avviano tumorigenesi, le mutazioni acquisite durante il processo evolutivo di progressione maligna, e il potenziale di sviluppo delle cellule in cui si verificano queste mutazioni. Progetti di sequenziamento su larga scala hanno identificato molte mutazioni astrocitoma-associate e dei loro modelli di co-occorrenza 7. Questi studi si sono basati su algoritmi di bioinformatica per identificare le mutazioni che si verificano di frequente e di nominare mutazioni che potrebbero oncogeno, cioè. "mutazioni driver" che avviano tumorigenesi o guidano la progressione maligna. Tuttavia, il potenziale oncogeno di molte di queste mutazioni, e il loro potenziale tipo di cellula specificità, non è stato sistematicamente studiato in sistemi modello. Proponiamo che i modelli NGEM urazie astrociti corticali e NSC come qui descritto, così come altri tipi di cellule neurali che possono essere purificate e coltivate in cultura, fornire un sistema versatile per eseguire tali indagini. La sufficienza e necessità di trasformazione di mutazioni nuovi candidati individuati attraverso progetti di sequenziamento su larga scala possono poi essere sistematicamente studiati usando GAIN- genetico convenzionale e la perdita-di-funzione si avvicina con specifici tipi di cellule NGEM ospitare mutazioni concomitanti comuni in base percorsi GBM per i quali GEM condizionale esiste 5. Abbiamo inoltre proponiamo che i pannelli di NGEM nascondevano diverse combinazioni di mutazioni in diversi tipi di cellule neurali sarà utile nel modellare l'eterogeneità genomica di astrocitoma umano. Inoltre, i modelli di astrocitoma NGEM con astrociti corticali e NSC derivate da GEM condizionale possono fornire un modello per lo sviluppo di farmaci trattabili preclinico perché i test iniziali in vitro di entrambe le terapie di combinazione mono e puòessere eseguita in queste cellule per dirigere più efficace nei test in vivo della droga in immunitarie competenti, topi singenici. Inoltre, immunomodulante e terapie stroma-targeting possono essere analizzati in modelli astrocitoma NGEM con immunitarie competenti, singeniche host trapianto allogenico. Così, i modelli di astrocitoma NGEM con astrociti corticali trasformati e NSC sono un sistema modello valido per determinare le conseguenze funzionali di combinazioni di mutazioni in oncogeni specifici tipi cellulari e possono essere utili in fase di test della droga preclinica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

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References

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Neuroscienze astrocitoma astrociti corticali topi geneticamente ingegnerizzati glioblastoma le cellule staminali neurali allotrapianto ortotopico
Modellazione Astrocitoma Patogenesi<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati
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McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, … More

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

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