Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering Astrocytoma Pathogenesis Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Astrocytom är den vanligaste primära hjärntumör och glioblastom (GBM), en klass IV astrocytom, är den vanligaste och aggressiva subtyp med en medianöverlevnad på 12-15 månader 1,2. Invasion av diffusa astrocytom, särskilt GBM, utesluter komplett kirurgisk resektion, begränsar effektiviteten av adjuvant terapi, och oundvikligen leder till efterbehandling återfall 3. Patienter som ursprungligen före antingen med de novo (primär) GBM eller med lägre kvalitet astrocytom som oundvikligen utvecklas till (sekundär) GBM 4. GBM är genomiskt heterogen och präglas av ömsesidigt uteslutande och samarbete förekommer mutationer i gener som styr tre centrala signalvägar: G 1 / S (Rb) cellcykel checkpoint, receptor (RTK) och TP53 spridningsvägar 5-7. GBM består av fyra genomiska subtyper med skilda uttryck profiler som liknar olika hjärncelltyper, vilket tyder på att GBM subtyp är influpåverkades av dess cellursprungs 6,8,9. Bättre astrocytom modeller krävs för att definiera rollen av specifika kombinationer av mutationer i specifika celltyper under astrocytom patogenes. Utnyttja dessa modeller för effektivare preklinisk läkemedelsutveckling kommer i slutändan bidra till att förbättra behandlingsresultat. Nuvarande astrocytom modeller har etablerat humana cellinjer, patient härledda xenotransplantat (PDX), genmodifierade normala mänskliga astrocyter och neurala stamceller (NSC) och genetiskt modifierade möss (GEM) 10-14. Vi utvecklade ett alternativt, icke-könsceller GEM (nGEM) modell 15 som använder primära hjärnceller - kortikala astrocyter och NSC - skördas från GEM hyser olika kombinationer av floxed onkogena alleler. Målet var att skapa astrocytom modeller med genetiskt definierade celler som kan fenotypiskt kännetecknas både in vitro och in vivo och potentiellt utnyttjas för preklinisk läkemedelsutveckling i immune kompetenta möss.

Etablerade humana cellinjer är den vanligast använda modellen av astrocytom patogenes och läkemedelssvar in vitro och in vivo. De är tekniskt rakt framåt, allmänt tillgängliga, och har definierat kinetik och tumorigenicitet upon orthotopic xenografting i immundefekta möss 10,11,16-18 . Deras nackdelar inkluderar oförmåga att generera etablerade cellinjer från låggradig astrocytom, begränsar studien endast höggradig astrocytom; Avsaknaden av en definierad cell ursprungs; förekomsten av komplexa genomiska avvikelser, ofta med genomiska profiler som skiljer sig markant från det ursprungliga patientprovet; och känslighet för fenotypisk och genotypisk Avvikelsen under seriekulturen i serum 11,17,19-22. De fenotypiska konsekvenserna av enskilda onkogena mutationer i etablerade humana GBM cellinjer kan maskeras av de många avvikelser som faktiskt före, som ofta utesluter elucsolideringen av direkta genotyp-fenotyp konsekvenser.

PDX genereras genom subkutan passage av patient isolerade astrocytomceller i immundefekta möss eller genom sin kultur som icke-vidhäftande sfäroider i definierat, serumfritt medium före orthotopic injektion i hjärnan hos immundefekta möss 12,23. PDX behålla mer exakt genom-landskap av mänskliga astrocytom, men liknar etablerade humana cellinjer, kan den fenotypiska effekten av enskilda onkogena mutationer maskeras på grund av deras genomiska komplexitet 19,24. För att definiera de fenotypiska konsekvenserna av specifika onkogena mutationer, i synnerhet som svar på nya terapier, är paneler av etablerade humana cellinjer eller PDX ofta utnyttjas för att fastställa genotyp-fenotyp korrelationer, visar generaliserbarhet, och minimera sannolikheten för cell-linjespecifika effekter. Medan PDX exakt rekapitulera de histopatologiska kännetecken mänsklig astrocytom, including invasion, orthotopic xenografter av etablerade humana cellinjer i allmänhet inte 21,23,25. Dessutom normala mänskliga astrocyter och NSC har genetiskt engineered med definierade onkogena mutationer att modellera astrocytom tumörigenes in vitro och in vivo 13,14,26. Dessa celler saknar den genomiska komplexiteten av etablerade humana cellinjer och PDX och noggrant rekapitulera humant astrocytom histopatologi, men kräver xenografting i immundefekta gnagare in vivo. Eftersom alla humana cellmodeller kräver immunodeficienta gnagare värdar för att förhindra immunmedierad xenograftavstötning, dessa modeller inte rekapitulera de infödda tumör-stroma interaktioner av ett syngent systemet och saknar ett intakt immunsystem, vilket begränsar preklinisk undersökning av stroma inriktade och immunmodulerande terapier 10,11.

GEM tillåter granskning av de fenotypiska konsekvenserna av förutbestämda kombinationer av onkogen mutationer in vivo under in situ tumorigenes. Icke-villkorlig GEM har mutationer i alla vävnader i hela utveckling, har villkorat GEM floxed onkogena alleler som möjliggör inriktning av mutationer genom att begränsa Cre-medierad rekombination till specifika celltyper genom att använda cell typspecifika promotorer 10,11,15,18. Villkorlig astrocytom GEM har använts för att belysa de funktionella roller onkogena mutationer i olika celltyper inom en intakt hjärna 11. Den prekliniska användbarheten av in situ gliomagenesis använder villkorad GEM är begränsad av ett antal faktorer, inklusive en) avsaknaden av en in vitro-korrelat, 2) svårigheten att generera stora kohorter av möss med komplexa genotyper, 3) lång latens på in situ-tumörutveckling , 4) och stokastisk tumörprogression. För i situ tumorigenes saknar en motsvarande in vitro-modell, inte kan utföras drogtestning in vitro wITH konventionella villkor GEM modeller. I motsats till andra typer av cancer, är villkorade GEM modeller av astrocytom sällan inducerad av enkel onkogena mutationer 11. Således är komplexa avelsprogram krävs för att generera villkor GEM med flera onkogena mutationer. Dessutom sker astrocytom initiering med variabel penetrans efter en lång latensperiod i dessa modeller, medan progression till höggradig astrocytom uppträder i allmänhet i en icke-enhetlig, stokastisk sätt och i slutändan ger upphov till tumörer med komplexa genomiska landskap och snabb tillväxt kinetik 27, 28. Den rörliga penetrans och stokastiska natur malign progression i villkor GEM modeller kräver att enskilda möss screenas genom radiografisk avbildning för att påvisa förekomst och lokalisering av hög kvalitet astrocytom innan de är inregistrerade i prekliniska läkemedelsprövningar. Sammantaget ger dessa begränsningar hindrar produktion och testning av de stora kohorter av villkor GEM krävs för preclinical drogtestning.

Den RCAS-TVA GEM-systemet, som utnyttjar avian retrovirala (RCAS) vektorer för att infektera GEM konstruerad för att uttrycka den virala receptorn (TVA) på specifika neuronala celltyper, har i stor utsträckning används för att modellera astrocytom tumorigenes 11. I motsats till villkorlig GEM möjliggör detta modellsystem införa multipla onkogena mutationer i specifika celltyper utan krav på komplexa avelsprogram. Det är dock begränsad av variabel penetrans, kravet på att aktivt delande celler för att uppnå viral integration och den slumpmässiga införande av transgener i värdgenomet 29.

Icke nedärvda GEM (nGEM) modeller, som använder celler som skördats från GEM, blir allt viktigare eftersom de övervinna många av de begränsningar av andra modellsystem 15. Den roll som initiativ celltyp och samarbete förekommer mutationer i astrocytom patogenes är svåra att avskräckagruvan med hjälp av etablerade humana GBM cellinjer eller PDX eftersom de kommer från slutstegs tumörer som har ackumulerats omfattande genetiska mutationer i odefinierade celltyper under malign progression. Däremot kan alla kvaliteter av astrocytom modelleras med hjälp nGEM genom att inducera definierad genetiska mutationer i specifika renade hjärnan celltyper 11,30. Således kan påverkan av specifika genetiska mutationer och celltyp om cellulära och molekylära fenotyper bestämmas in vitro och in vivo. Liknar etablerade humana GBM cellinjer, kan initialt in vitro drogtestning med hjälp nGEM användas för att prioritera läkemedel för in vivo-testning som använder samma celler. Tumorigenesis in vivo kan sedan bestämmas genom allografting nGEM celler ortotopiskt in i hjärnorna på immunkompetenta syngeniska kullsyskon 30. Dessa orthotopic transplantationsmodeller tillåter därmed in vivo-testning inte bara av konventionella cytotoxiska and inriktade terapier, men immunmodulerande och stroma inriktade terapier också. Slutligen kan den roll som mikromiljön på tumör initiering och progression bestämmas genom att jämföra resultaten mellan nGEM och konventionella GEM modeller med användning av samma mutationer i samma celltyper.

Vi och andra har utvecklat astrocytom nGEM använder primära celler - astrocyter, NSC, eller oligodendrocyt prekursorceller (OPC) - skördas från GEM 30-34. Logiken bakom utvecklingen av en astrocytom nGEM var att skapa en modell för att bestämma de fenotypiska konsekvenserna av onkogena mutationer i specifika celltyper som potentiellt skulle kunna användas för preklinisk drogtester in vitro och in vivo i immunkompetenta djur. Vi skördade fenotypiskt WT kortikala astrocyter och NSC från icke-Cre uttrycker, villkor GEM upprätthålls på en> 94% C57 / BL6 bakgrund med floxed RB vägen - Rb1 loxP / loxP eller TgGZT121 - och floxed RTK / RAS / PI3K vägen - NF1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP - gener i olika kombinationer 35-39. Vi framkallade genetisk rekombination in vitro med användning av adenovirusvektorer kodar Crerekombinas. Eftersom kortikala astrocyternas skördar innehåller en blandning av celltyper, använde vi Ad5GFAPCre vektorer eller dominerande onkogena transgener, såsom TgGZT 121 drivs från den mänskliga GFAP promotor, att anrika GFAP + kortikala astrocyter i dessa kulturer. Vi definierade de fenotypiska konsekvenserna av G 1 / S (Rb), MAPK, och PI3K pathway mutationer i kortikala astrocyter och NSC in vitro och in vivo. MAPK och PI3K vägen aktiverad G1 / S-defekta astrocyter molekylärt härmade mänskliga proneural GBM och vid orthotopic injektion, bildade tumörer i en fördefinierad plats med enhetliga tillväxt kinetik, korta latenser och histopatologiskaal kännetecken human GBM 30. Längsgående övervakning av tumörtillväxt in vivo hjälpmedel prekliniska drogtestning genom normalisering av behandlings kohorter och kvantitativ analys av tumörtillväxt som svar på behandling 40. Vi bestämde tumörtillväxt kinetik med längd mareld avbildning av möss som injicerats med luciferas uttrycker kortikala astrocyter. Därför kortikala astrocyter och NSC härrör från villkor GEM ger en lätthanterlig modellsystem för definition av funktionella konsekvenserna av astrocytom associerade mutationer och en potentiell systemmodell för preklinisk läkemedelsutveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Samtliga djurstudier godkändes av University of North Carolina Institutional Animal Care och användning kommittén.

1 Odling Kortikal Astrocyter från Neonatal Möss

  1. Framställning
    1. Crumple 2-3 grannlaga uppgift vävnader och placera in i botten av en kolv innehållande 70% etanol. Placera dissekera sax, böjda pincett och 2 par raka mikro pincett i denna kolv. Vävnaderna används för att undvika böjning mikro pincett.
    2. Tillsätt 1 ml HBSS till en 60 mm vävnadsodlingsskål. Förbered en separat skål för varje djur och bibehålla rätter på is.
    3. Söva djur per institutionella regler.
    4. Varm 7 ml DMEM med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin (fullständigt DMEM) för varje djur i en 37 ° C vattenbad. OBS: För fem möss, steg 1.1.1-1.1.4 tar ~ 15 min.
  2. Tissue Harvest
    1. Sacrifice neonatal mus (dag 1-3) per Institutional föreskrifter.
    2. Ta bort dissekera sax från etanol, låta dem dropptorka, och göra en sagittal snitt i huden över kraniet från ryggmärgen till näsan.
    3. Gör ett snitt i kraniet längs sagittal sutur, från ryggmärgen och sträcker sig förbi de lukt glödlampor. Var noga med att hålla sax tips nära den inre ytan av kraniet att minimera hjärnvävnadsskada.
    4. Med hjälp av böjda pincett, försiktigt skal varje hemisfär av kraniet sidled bort från hjärnan.
    5. Använda raka mikro pincett försiktigt nypa bort ryggdelen av varje kortikal halvklotet och placera den i vävnadsodlingsskål innehållande HBSS. Undvik att lillhjärnan och luktbulben. Ta inte alla vävnader under corpus callosum.
    6. Med hjälp av en dissekera mikroskop och 2 par mikro pincett, försiktigt bort hjärnhinnorna från varje kortikal halvklotet. Returnera vävnadsodlingsskål till is tills början vävnads homogenization.
    7. Upprepa steg 1.2.1 till 1.2.6 för varje ytterligare djur. OBS: För fem möss, steg 1.2.1-1.2.7 tar ~ 30 min.
  3. Tissue Homogenisering
    1. Med hjälp av en ren rakblad, fint tärna kortikala hemisfärerna och flytta plattan till en vävnadskultur huva.
    2. Överför den tärnade vävnaden i ett sterilt 15 ml koniskt rör. Tvätta plattan med 1 ml iskall HBSS och överföra till rör innehållande vävnad.
    3. Vänta tills vävnaden sedimenterar till botten av röret, därefter försiktigt avlägsna överskott av HBSS med användning av en pipett.
    4. Tillsätt 2 ml rumstemperatur trypsin / EDTA. Pipett ~ 10x med en 1 ml pipett för att ytterligare separera celler.
    5. Inkubera cellsuspensionen vid 37 ° C under 15-20 min. Blanda försiktigt genom att vända var 5 min.
    6. Lägg 3 ml fullständigt DMEM för att inhibera trypsin. Pipett ~ 10x med en 1 ml pipett för att blanda lösningen.
    7. Centrifugera vid 200 xg under 5 min vid rumstemperatur.
    8. Ta bortsupernatanten med en 1 ml pipett. Inte aspirera mediet eftersom pelleten kan vara lös.
    9. Återsuspendera pelleten i 4 ml 37 ° C fullständigt DMEM. Överför cellsuspensionen till en 75 cm med skruvlock vävnadsodlingskolv. OBS: För fem möss, steg 1.3.1-1.3.9 tar ~ 50 min.
    10. Cirka 16 timmar efter astrocyternas skörd, tvätta kolven med 4 ml 37 ° C HBSS, tillsätt sedan 4 ml 37 ° C slutföra DMEM. Behåll de kortikala astrocyter vid 37 ° C i 5% CO2. OBS: Den tvättsteget är viktigt för att avlägsna icke-adherenta celler och skräp från odlingsskålen.
    11. När kulturen är ~ 95% sammanflytande, skaka över natten vid 37 ° C i 5% CO2, ta bort materialet som innehåller de lösgjorda cellerna, sedan tvätta kolven med 4 ml 37 ° C HBSS. Tillsätt 4 ml av 37 ° C fullständigt DMEM och bibehålla cellerna vid 37 ° C i 5% CO2. OBS: Detta steg är viktigt för att berika kulturer för kortikala astrocyter, som kontamine mikroglia ocholigodendrocyt progenitorceller loss med denna procedur och tas bort från kulturen 41.
    12. Upprepa steg 1.3.1-1.3.11 för varje djur.
  4. Induktion av genetisk rekombination
    1. 24 timmar efter steg 1.3.11, ersätta mediet med 2 ml 37 ° C slutföra DMEM. Tillsätt 1 ml 37 ° C SCM innehåller en fil av> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre eller Ad5GFAPCre. Inkubera i 6 timmar vid 32 ° C i 5% CO2 .CAUTION: Använd BSL2 säkerhetsåtgärder vid hantering av rekombinant adenovirus.
    2. Ta bort virus som innehåller media och tillsätt 37 ° C komplett DMEM utan virus till de kortikala astrocyter. OBSERVERA: Använd BSL2 säkerhetsåtgärder vid hantering av rekombinanta adenovirus och släng virusinnehållande medier per institutionella regler. OBS: För fem astrocyternas kulturer, steg 1.4.1 - 1.4.3 tar ~ 15 min exklusive 6 timmars inkubering.
    3. Expandera kortikala astrocyternas kulturer för ivitro och in vivo karakterisering. OBSERVERA: bestämma närvaron av mutationer efter Cre-rekombination genom PCR med primrar som är specifika för den rekombinerade genen eller genom immunoblotting för antingen den specifika muterade proteinet eller dess signalerings konsekvenser. Den tid som krävs för fenotypisk stabilisering av kortikala astrocyternas kulturer efter Cre-rekombination kommer att vara beroende av mutationerna som används och måste bestämmas empiriskt (Figur 2).

2. Odling neurala stamceller från Neonatal Möss

  1. Framställning
    1. Innan dissektionen, förbereda 4 ml digerelösning per hjärna genom att tillsätta 3,1 mg papain och 1,3 mg cystein till 4 ml dissociation mediet - 98 mM Na 2 SO 4, 30 mM K 2 SO 4, 5,8 mM MgCl2, 0,25 mM CaCl2 , 1 mM HEPES (från 1 M HEPES pH 7,4 lager) 20 mM glukos, 0,001% fenolrött, och 0,125 mM NaOH. Tillsats av papainoch cystein till dissociationen mediet blir lösningen gul.
    2. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 15 min. Blanda regelbundet av inversion.
    3. Lägg 0,1 M NaOH droppvis tills matsmältningen lösning återgår till ljusröd färg.
    4. I en vävnadskultur huva, sterilt filter uppslutningslösningen med användning av ett sprutfilter (0,22 | am porstorlek). Håll digere lösningen på is.
    5. Bered 50 ml stamcellmedium (SCM) genom att blanda 44,5 ml NSC Basal Medium, 5 ml NSC komplettera, 0,5 ml penicillin-streptomycin, 50 | il 0,2% heparin, 10 | il 100 ^ g / ml EGF, och 10 | il 100 ^ g / ml bFGF. SCM är stabil i 1 vecka vid förvaring vid 4 ° C.
    6. Förbered komplett HBSS (cHBSS) genom att blanda 50 ml 10x HBSS, 1,25 ml 1 M HEPES (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glukos, 5 ml 100 mM CaCl2, 5 ml 100 mM MgSO 4, och 2 ml 1 M NaHCOs 3. Ta den totala volymen till 500 ml med DDH 2 O.
    7. Filtrera sterilisera cHBSS witha 0,2 um porstorlek filter och förvara vid 4 ° C.
    8. Crumple 2-3 grannlaga uppgift vävnader och placera in i botten av en kolv innehållande 70% etanol. Placera dissekera sax, böjda pincett och 2 par raka mikro pincett i denna kolv. Vävnaderna används för att undvika böjning mikro pincett. OBS: För fem möss, steg 2.1.1-2.1.8 tar ~ 45 min.
  2. Tissue Harvest
    1. Sacrifice neonatal (dag 1-3) möss per institutionella regler.
    2. Ta bort dissekera sax från 70% etanol, låta dem dropptorka, och göra en sagittal snitt i huden över kraniet från ryggmärgen till näsan.
    3. Gör ett snitt i kraniet längs sagittal sutur, från ryggmärgen och sträcker sig förbi de lukt glödlampor. Var noga med att hålla sax tips nära den inre ytan av kraniet att minimera hjärnvävnadsskada.
    4. Med hjälp av böjda pincett, skala försiktigt varje hemisfär av kraniet sidled bort frånhjärnan.
    5. Ta försiktigt bort hela hjärnan och placera i iskall cHBSS.
    6. Med hjälp av en dissektion mikroskop, försiktigt bort hjärnhinnorna från hjärnan med fina dissektion verktyg.
    7. Placera hjärnan på sin bottenyta och ta bort lillhjärnan / bakhjäman och luktloben / frontala cortex med vertikal (koronal) skär med en storlek 11 skalpell.
    8. Vrid resterande hjärnan 90 ° för att placera den på svansdelen, vilket genererar en frontal bild av hjärnan. Leta reda på de laterala ventriklarna.
    9. Klipp ut en kubisk avsnitt innehåller subventrikulära zonen (SVZ).
    10. Överför SVZ-innehållande vävnad till en 60 mm vävnadsodlingsskål med färsk iskall cHBSS och finhacka vävnad med storlek 11 skalpell.
    11. Överför den malda vävnaden i ett sterilt 15 ml rör. Placera röret på is.
    12. Tvätta petriskål med 1-2 ml iskall cHBSS. Överför tvättlösningen till röret innehållande vävnad.
    13. Upprepa steg 2.2.1-2.2.12 med ytterligare neonatal möss vid behov. Överför alla 15 ml rör till en vävnadsodling huva för återstoden av protokollet. OBS: För fem möss, steg 2.2.1 - 2.2.13 tar ~ 45 min.
  3. Tissue Homogenisering
    1. Placera matsmältningen lösning (framställd i steg 2.1.1) i en 37 ° C vattenbad i 5 min. Också, varm 2 ml SCM per hjärna i ett 37 ° C vattenbad.
    2. Ta försiktigt bort supernatanten det malda vävnaden med en 1 ml pipett. Inte aspirera.
    3. Tillsätt 2 ml 37 ° C matsmältningen lösning per 15 ml tub och blanda försiktigt genom inversion.
    4. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 15 min. Blanda genom att vända var 5 min.
    5. Lägg ytterligare 2 ml av 37 ° C matsmältningen lösning till varje rör och upprepar steg 2.3.4.
    6. Låt cellerna att sjunka till botten av röret med självtryck, avlägsna supernatanten från digervävnad med hjälp av en 1 ml pipett.
    7. Tillsätt 2 ml 10 iM E-64 utspädd i cHBSS och blanda försiktigt genom inversion.
    8. Låt cellerna att sjunka till botten av röret med självtryck, avlägsna supernatanten från smält vävnad.
    9. Tillsätt 1 ml 37 ° C cHBSS och homogenisera med en 1 ml pipettspets (~ 20 slag). Undvik att injicera luftbubblor under vävnads homogenisering.
    10. Passera vävnadshomogenatet genom en 40 pm porstorlek cell sil och skölj sedan silen med 5 ml 37 ° C cHBSS.
    11. Centrifugera vävnad homogenatet vid 125 xg under 5 min.
    12. Ta bort 95% av supernatanten med en 1 ml pipett utan att störa cellpelleten. Noggrant återsuspendera cellpelleten i 200 | il 37 ° C SCM med en 200 mikroliter pipettspets.
    13. Lägg 1,8 ml 37 ° C SCM och överföra cellsuspensionen till en brunn i en steril 6 brunnar. OBS: För fem möss, steg 2.3.1-2.3.14 tar ~ 75 min.
  4. Neural Stem Cell Culture
    1. Fyll mediet efter 3 dagar genom att lägga till ytterligare 2 ml 37 °C SCM.
    2. Efter 7 dagar, överföra neurospheres till ett 15 ml rör och låt neurospheres nöja av tyngdkraften för> 5 min.
    3. Avlägsna supernatanten och tillsätt 2 ml 37 ° C SCM.
    4. Överför neurosfärerna till en ny brunn i en 6-brunnsplatta.
    5. Tillsätt 2 ml 37 ° C SCM var 3-4 dag, och ändra mediet helt var 7 dagar.
    6. Om neurospheres är> 100 nm i diameter, försiktigt dissociera med stamcells dissociationslösning och förnyad utbredning NSC vid önskad celltäthet.
  5. Induktion av genetisk rekombination
    1. Tillsätt 1 ml 37 ° C SCM innehållande 1 pl av> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre eller Ad5GFAPCre till 2 ml SCM närvarande på cellerna. OBSERVERA: Använd BSL2 säkerhetsåtgärder vid hantering av rekombinant adenovirus.
    2. Inkubera under 6 h vid 32 ° C i 5% CO2.
    3. Överför SCM med neurosfärer i en 15 ml tub och låt sfärer sedimentera genom gravitation efter 5 min.
    4. Avlägsna supernatanten först med en 1 ml pipett, sedan med en 200 l pipett. OBSERVERA: Använd BSL2 säkerhetsåtgärder vid hantering av rekombinanta adenovirus och släng virusinnehållande medier per institutionella regler.
    5. Tillsätt 2 ml 37 ° C SCM utan virus till NSC, sedan överföra till en 6 brunnar. OBS: För fem NSC kulturer, steg 2.5.1-2.5.5 tar ~ 15 min exklusive 6 timmars inkubering.
    6. Nästa dag, upprepar du steg 2.5.1-2.5.5, följt av neurosphere aging vid behov. Sfärerna kan nu utökas för 2-3 passager före in vitro karakterisering och orthotopic injektion i mushjärna in vivo. OBSERVERA: bestämma närvaron av mutationer efter Cre-rekombination genom PCR med primrar som är specifika för den rekombinerade genen eller genom immunoblotting för antingen den specifika muterade proteinet eller dess signalerings konsekvenser. Den tid som krävs för fenotypisk stabilisering av NSC kulturer efter Cre-rekombination kommer att vara beroendepå mutation utnyttjade och måste bestämmas empiriskt (figur 2 och 3).

3. Orthotopic Injektion av rekombinerade celler in i hjärnan av Mottagarens Iimmunocompetent Möss

  1. Framställning av 5% metylcellulosa
    1. Lös upp 5 g av 15 cPs metylcellulosa i avjoniserat vatten till en slutlig volym av 50 ml i en 100 ml skruvlock flaska. Lägg pulvret långsamt under omröring vid 4 ° C för att förhindra klumpning. Det kan ta upp till 24 h av omröring vid 4 ° C under hela metylcellulosa ange lösning.
    2. Väg flaskan och notera vikten.
    3. Autoklav metylcellulosalösning på 5%. När autoklaveras kommer metylcellulosa bli en halvfast gel.
    4. Väg flaskan och beräkna vikten förlorade under autoklavering.
    5. Tillsätt aseptiskt 1 ml sterilt vatten för varje gram vikt förlorade.
    6. Placera på is och tillsätt 50 ml iskall 2x DMEM. </ Li>
    7. Blanda över natten med användning av en magnetisk omrörare vid 4 ° C. Använd steril teknik för att dela metylcellulosalösning på 5% till 20 ml portioner. Förvara alikvoter vid 4 ° C i upp till sex månader eller tills 2x DMEM löper ut. OBS: Framställning av 5% metylcellulosa lösning i steg 3.1.1-3.1.7 tar ~ 2,5 dagar.
  2. Beredning av kortikal Astrocyter för injektion
    1. Harvest kortikala astrocyter när ~ 90% sammanflytande.
    2. Att skörda, aspirera komplett DMEM och tvätta plattorna med en lika stor volym av 37 ° C HBSS.
    3. Tillsätt tillräckligt med trypsin för att täcka plattan. Försiktigt luta och peka på plattan tills cellerna börjar lossna.
    4. Inaktivera trypsin med en lika stor volym av 37 ° C slutföra DMEM.
    5. Överför celler till en 50 ml koniska rör och tvätta plattan med samma volym av 37 ° C komplett DMEM används i 3.2.4.
    6. Överför tvättmedia till röret som innehåller celler. Centrifugera vid 200 xg under 3 min.
    7. Aspirera arupernatant och återsuspendera cellerna i 1 ml 37 ° C fullständigt DMEM.
    8. Räkna cellsuspension med användning av en hemocytometer eller en annan lämplig cellräknare för att bestämma antalet celler / | il.
    9. Överför det önskade antalet celler i ett annat 15 ml koniska rör. Centrifugera vid 200 xg under 3 min.
    10. Återsuspendera cellerna i 800 | il av 37 ° C fullständigt DMEM. Bestäm volymen av cellpelleten (totala volymen av cellsuspension - 800 pl). OBS: Det är viktigt att uppnå en korrekt cellkoncentrationen för injektion. Sålunda måste volymen av cellpelleten bestämmas i detta steg för att beräkna den volym av 5% metylcellulosa för att lägga till i steg 3.2.12.
    11. Överför cellerna till en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera sedan vid 200 xg under 3 min.
    12. Sug ut supernatant från cellpellet och suspendera kortikala astrocyter i lämplig volym av iskall 5% metylcellulosa (önskad total volym - volym påcellpelleten) för att erhålla det önskade antalet celler / | il.
    13. Placera cellerna på is tills injektion.
    14. Placera en glasspruta 250 ^ i en Upprepande Antigen Dispenser sedan placera en trubbig 18 G nål på sprutan.
    15. Dra ut kolven långsamt med nålen i kortikala astrocyternas fjädring; kommer det att finnas en luftbubbla ovanför cellerna som måste tas bort, eftersom luftbubblor kommer komprimera och minska volymen faktiskt injiceras i hjärnan.
    16. Håll nålspetsen precis ovanför kortikala astrocyternas fjädring och skjut in kolven snabbt. Den luftbubbla kommer att gå snabbare än cellsuspensionen och kommer mestadels utvisas.
    17. Upprepa steg 3.2.16 tills alla luftbubblor avlägsnas från nålen.
    18. Fyll sprutan till ca ~ 200 l, håll nålen upp och dra tillbaka kolven tills det tar stopp. Little luftbubblor kan avlägsnas genom att hålla nålspetsen upp och snabbt trycka på kolven om 50 il sedan långsamt dra tillbaka till full kapacitet.
    19. Håll spetsen upprätt och upprepa steg 3.2.18 4-5x.
    20. Kassera 18 gauge nål och montera en 27 G-nål på sprutan.
    21. Tryck på knappen på antigen dispenser tills vätska drivs ut från nålen. OBS: För 1 astrocyt cellinje, steg 3.2.1-3.2.21 tar ~ 60 min.
  3. Beredning av NSC för injektion
    1. När neuro är> 100 nm i diameter, transfer till 15 ml rör och låt neuro reglera genom gravitation för> 5 min.
    2. Avlägsna supernatanten och dissociera neurosfärerna med en mild dissociation reagens, såsom stamcells dissociation lösning eller Accutase enligt tillverkarens anvisningar eller% 0,05 trypsin-EDTA som beskrivits 42.
    3. Hämmar dissociation reagens enligt tillverkarens instruktioner utan att utsätta NSC till serum. Centrifugera vid 100 xg under 5 min.
    4. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer eller en annan lämplig cellräknare för att bestämma antalet celler / | il.
    5. Överför önskat antal NSC till en ny 15 ml koniska rör. Centrifugera vid 100 xg under 5 min.
    6. Resuspendera cellerna i 800 | il av 37 ° C HBSS. Bestäm volymen av cellpelleten (totala volymen av cellsuspension - 800 pl). OBS: Det är viktigt att uppnå en korrekt cellkoncentrationen för injektion. Således måste volymen av cellpellet bestämmas i detta steg för att beräkna volymen på 5% metylcellulosa att lägga i steg 3.3.9.
    7. Överför cellerna till en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera sedan vid 100 xg under 5 min.
    8. Aspirera supernatanten och avsluta förbereda celler för orthotopic injektion som i 3.2.12-3.2.21. OBS: För 1 NSC cellinje, steg 3.3.1-3.3.9 tar ~ 60 min.
  4. Beredning av mus för injektion
    1. Bedöva mottagardjuret via en IP-injektion av 250 mg / kg Avertin (2,2,2 Tribromoethanol) eller 100 mg / kg ketamin plus 10 mg / kg xylazin, per institutionella IACUC riktlinjer. OBS: Utnyttjat häri är möss vid 3-6 månaders ålder som allograft värdar. Möss i olika åldrar kan användas för att undersöka microenvironmental effekterna av utvecklingshjärnåldern på tumörbildning.
    2. Raka hårbotten över snittet platsen med Clippers eller sax.
    3. Sterilisera den kirurgiska platsen med tre alternerande bomullstoppar av 70% etanol och Betadine.
    4. Applicera oftalmologiska salva till ögonen för att förhindra skador på grund av förlust av blinkreflex.
    5. Utvärdera anestesidjup genom pedal uttag (tå nypa) reflex. OBS: För fem möss, steg 3.4.1-3.4.5 tar ~ 15 min.
  5. Orthotopic Implantation
    1. Säkra djuret i stereotaktisk ram.
    2. Make ett snitt över sagittal sutur ca 0,5 cm långt mellan öronen och ögonen.
    3. Leta reda på skärningspunkten mellan de koronala och sagittal suturer (Bregma), liksom skärningen mellan lambdoid och sagittal suturer (Lambda). Säkerställ att Bregma och lambda är i samma horisontalplan.
    4. Sätt sprutan innehåller cellsuspensionen och upprepa antigen dispenser för stereotaktisk ram över huvudet. Bring spets 27 G nål i kontakt med Bregma. Detta är ursprunget som kommer att användas för manipulering av tre dimensionella koordinater.
    5. Höj nålen något från skallen ytan och flytta 2 mm i sidled och 1 mm rostral från Bregma.
    6. Sänk ner nålen försiktigt genom skallen till sin destination 4 mm ventralt från Bregma. OBS: Vi utnyttjade dessa stereotaktiska koordinater för att rikta de basala ganglierna. Olika stereotaktiska koordinater kan användas för att undersöka microenvironmental inverkan av olikahjärnan på tumorigenes.
    7. Injicera 5 pl av cellsuspensionen genom att aktivera den återkommande antigen dispensern en gång. Låt nålen på plats under 2 minuter för att tillåta det intrakraniella trycket till jämvikt.
    8. Dra ut nålen långsamt under en period av 30 sek. Använd en bomullspinne för att utöva tryck på blödning som kan uppstå.
    9. Ungefärlig sårkanterna och stänga snittet med hjälp av vävnadslim. Administrera 20 pl Lidocaine subkutant vid snittet platsen. OBS: För fem möss, steg 3.5.1-3.5.9 tar ~ 50 min. UNC IACUC godkände postoperativ användning av endast lokalbedövning. Samråd med lokala institutionella IACUC rekommenderas om krav för postoperativ smärtstillande användning efter denna procedur.
  6. Post-kirurgisk vård
    1. Placera djuren i en ren, varm bur för att återhämta sig. Djur bör inte placeras direkt i sängkläder, eftersom oavsiktlig aspiration kan förekomma.
    2. Observeradjur för återupptagande av normala beteenden som trimning, äta och avföring. OBS: Ett återupptagande av normalt beteende kan ta ~ 60 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi utvecklade ett nGEM modellsystem med kortikala astrocyter och NSC skördas från neonatal GEM hyser floxed villkor onkogena alleler som kan fenotypiskt kännetecknas in vitro och in vivo (Figur 1). För att undersöka konsekvenserna av onkogena mutationer specifikt i kortikala astrocyter in vitro, är det viktigt att först anrika astrocyter. Kortikala astrocyternas skördar innehålla en blandning av mikroglia, astrocyter, oligodendrocyter OPC och nervceller, men mekaniska och genetiska metoder kan stöd i astrocyt anrikning. Av följande skäl nervceller dör under normala odlingsbetingelser, kan mikroglia och oligodendrocyter avlägsnas genom skakning över natten 41,43. Dessutom kan genetisk rekombination av floxed, onkogena alleler riktade till GFAP + astrocyter som använder en Ad5GFAPCre anrika astrocyter. Vi använde denna metod för att infektera kortikala skördar från Rb1 loxP / loxP GEM valpar med floxed NF1 loxP / loxP och / eller PTEN loxP / loxP alleler. Ad5GFAPCre infektioner orsakade en proliferativ fördel i kombin GFAP + astrocyter, som ökade astrocyternas renhet från 59% till> 90% efter 5-9 passager i kultur (Figur 2A och 2B). Alternativt anrikade vi för astrocyter genom att uttrycka T 121 under styrning av GFAP-promotor för att inducera en proliferativ fördel i astrocyter som skördats från TgGZT 121 möss (figur 2C). Medan kortikala astrocyter växer vidhäftande till odlingsskål (figur 2C), NSC växa som icke-vidhäftande neurospheres in vitro (Figur 3A). Både WT NSC och NSC med rekombineras, floxed onkogena alleler - TgGZT 121 (T), Kras G12D (R), och homozygot PTEN radering (P - / -), kallad TRP- / - - Uttrycka NSC markör Sox2, medan endast NSC skördas från GEM innehåller TgGZT 121 uttrycker T 121 efter Cre-medierad rekombination (figur 3B).

För att avgöra hur G 1 / S (Rb), MAPK och / eller PI3K pathway förändringar påverkar tillväxten av GFAP + astrocyter in vitro, proliferation undersöktes med hjälp av två metoder. MTS och cellräkning visade att uttryck av T 121 och Kras G12D ökade proliferationen av kortikala astrocyter (fig 4A och 4B). Likaså homozygot Rb1 (Rb) och NF1 (N), radering kombination med heterozygot PTEN (P +/-) deletion också ökat kortikal astrocyternas spridning (Figur 4C). Transformerade celler har obegränsad fortplantningsförmågan. De transformerande effekter av mutationer kan mätas in vitro med användning colony bildningsanalyser. Vi testade därför de transformerande effekter av T 121 och Kras G12D uttryck och homozygot PTEN deletion i TRP - / - kortikala astrocyter genom kolonibildningsanalys som tidigare beskrivits 44. Av följande skäl: WT astrocyter inte bilda kolonier, t astrocyter bildade kolonier på 1,03% verkningsgrad. Notably TRP - / - astrocyter hade den högsta kolonibildning verkningsgrad vid 6,40% (tabell 1). För att vara lämplig för preklinisk drogtester, är det viktigt att in vitro tumörmodeller lätt manipuleras genetiskt. Ytterligare genetiska förändringar kan stabilt införas i kortikala astrocyter genom plasmid eller virala vektorer. Som ett exempel, som stabilt transducerade vi luciferasgenen i TRP - / - astrocyter (TRP - / - luc) under användning av en VSV-pseudotypad pMSCV retroviral vektor. Uttryck av luciferas ökad luminiscens ~ 1000 gånger jämfört med moderceller ( in vitro. Vi har visat tidigare att behandling med låg dos PI-103, en dubbel mTOR / PI3K hämmare, hämmade PI3K signalering utan att påverka cellernas livskraft 30. Emellertid var de cytostatika / cytotoxiska effekterna av högre PI-103 doser ej bestämd. Således, testade vi huruvida PI-103 kan minska TRP - / - astrocyt tillväxt in vitro. PI-103 orsakade en maximal 88% minskning av TRP - / - astrocyternas tillväxt (Figur 4E). Vi har tidigare utnyttjat orthotopic allotransplantat av TRP - / - astrocyter att testa andra kliniskt relevanta terapeutiska in vivo (Schmid et al, manuskript in.) 45,46. Dessa data tyder på att trans kortikala astrocyter skördas från villkor GEM kan ge en flexibel modellsystem där utföra prekliniska drogtestning i immun kompetent mikrofone.

Xenografter av etablerade humana cellinjer och PDX kräver immundefekta värdar. I motsats till PDX, många etablerade humana GBM cellinjer inte rekapitulera de histopatologiska funktionerna i GBM. Exempelvis U87MG orthotopic xenografter bildade avgränsade tumörer som inte invadera normal hjärna (figur 5A). Däremot injektion av TRP - / - astrocyter i hjärnan hos immunkompetenta, syngena möss gav invasiva tumörer som rekapituleras de histologiska särdragen i deras mänskliga motsvarigheter, särskilt invasion av normal hjärna (figur 5B). Till longitudinellt kvantifiera TRP - / - allograft tillväxt avlivades mössen var 5 dagar efter cellinjektion och tumörbörda bestämdes genom att kvantifiera tumörområdet på H & E-infärgade hjärnsektioner. Tumörområdet ökat exponentiellt över tiden (figur 5C). Orthotopic injektion av 10 5 TRP - / - astrocyter i recipient hjärnor ledde till neurologisk sjuklighet, med en medianöverlevnad på 22 dagar (Figur 5D). Förutom kortikala astrocyter, utförde vi orthotopic injektioner använder TRP - / - NSC. TRP - / - NSC-härledda tumörer var T 121 positiva, proliferativa, och underhålls expression av NSC markör Sox2 (Figur 6). Notera injektion av kortikala astrocyter och NSC skördas från WT C57Bl / 6 möss samt fenotypiskt WT kortikala astrocyter eller NSC med icke rekombinerad, floxed onkogena alleler från villkor GEM misslyckades med att framkalla tumörbildning under denna tidsram (data visas ej). Längs avbildning in vivo har använts för att övervaka tumörtillväxt kinetik som svar på läkemedelsbehandling 40. Sålunda TRP - / - luc astrocyter injicerades i hjärnan hos immunkompetenta syngeniska kullsyskon och tumörtillväxt bestämdes genom serie bioluminescens avbildning. Bioluminescens ökade 15 gånger under 16 dagar(Figurerna 7A och 7B). Vi har visat att kortikala astrocyter och NSC skördas från villkor GEM kan modifieras genetiskt och fenotypiskt präglas in vitro och in vivo för definition av genetik och cellbiologi av astrocytom patogenes och potentiellt användas för preklinisk läkemedelsutveckling.

Figur 1
Figur 1 Schematisk bild av kortikal astrocyt och NSC skörd från nGEM. Fenotypiskt WT kortikala astrocyter och NSC skördades från GEM med villkor onkogena alleler. Genetisk rekombination inducerades in vitro med en AdCre vektor. Transformerade celler fenotypiskt kännetecknas in vitro genom olika metoder och in vivo genom orthotopic injektion i hjärnan hos immunkompetenta,syngena kullsyskon.

Figur 2
Figur 2 Anrikning av GFAP + astrocyter efter seriepassage in vitro. Representativa immunofluorescens bilder som visar GFAP + astrocyter skördats från Rb1 loxP / loxP GEM valpar med NF1 loxP / loxP och / eller PTEN loxP / loxP där genetisk rekombination inducerades med Ad5GFAPCre och cellerna passe X gånger (PX) (A). Kvantifiering av anrikning av GFAP + astrocyter i panel A. Bars representerar standardfel 3-24 replikat (B). Representant immunofluorescens (överst) och fas kontrast (nederst) bilder av vidhäftande kortikala astrocyter skördats från TgGZT 121 GEM valpar som uttrycker T 121 från GFAP promotor vid pass9 års ålder efter rekombination med Ad5CMVCre in vitro (C). Astrocyter kvantifierades som antal GFAP + (grön) celler dividerat med det totala antalet DAPI-färgade kärnor (blå) vid varannan passage. Bilder togs vid 10X ursprunglig förstoring (A, C). Skalstrecken representerar 100 nm (A, C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3 WT och återförenas NSC skördas från TRP - / - GEM. Representativa faskontrast bilder av fenotypiskt WT (överst) och TRP - / - (botten) NSC odlas som neurosfärer in vitro (A). Representant immunofluorescensfärgning för T 121 (grön) och Sox2(Röd) expression i WT (överst) och TRP - / - (botten) neurosfärer (B). Skalstrecken representerar 100 pm (A, B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4 Karakterisering av kortikala astrocyter in vitro. Tillväxt av WT och TR kortikala astrocyter bestämdes genom att räkna celler på dag 1-7 (A). Relativ optisk densitet (OD) av WT och TR kortikala astrocyter bestämdes genom MTS (B). Relativ tillväxt WT och modifierat Rb1 - / -; NF1 - / -; PTEN +/- (RbNP +/-) astrocyter bestämdes av MTS (C). Luminiscens föräldra TRP - / - och luciferase uttrycka TRP - / - astrocyter (TRP - / - luc) (D). Relativ OD av TRP - / - astrocyter behandlade med PI103 för fem dagar såsom bestämts genom MTS (E). Spridning och dos respons beräknades med den exponentiella tillväxten ekvationen i GraphPad Prism 5. Bars representerar standardfel från 6 replikat per tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5 In vivo gliomagenesis. Representant H & E färgade snitt av en U87MG xenograft visar diskreta tumörmarginaler (A). Representant H & E färgade delen av en TRP - / - allograft visar diffus invasion av normal hjärna (B). Skala barer i vänster och höger H & E bilderna representerar 1 mm och 100 pm, respektive. Tumörområdet bestämdes genom analys av H & E-färgade sektioner av formalinfixerade, paraffininbäddade hjärnor från immunkompetenta, syngena kullsyskon som injicerats med 10 5 TRP - / - astrocyter och offrades vid fem dagars intervaller efter injektion. (C). Kaplan-Meier överlevnadsanalys av TRP - / - transplanterade möss åldern till sjuklighet visar en medianöverlevnad på 22 dagar (D).

Figur 6
Figur 6 Immunfluorescens av TRP +/- NSC allografter. Representativa immunofluorescens bilder visar att TRP +/- NSC injiceras i hjärnan hos immunkompetenta, syngena kullsyskon uttrycker T 121 (grön) och Sox2 (vit) och föröka sig, bestämt med EDU (röd) inkorporering. Möss perfusion med EDU och avlivades 6 veckor efter injektion och deras hjärnor perfusion med paraformaldehyd. Skala stapel representerar 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7 Längs avbildning av TRP - / - luc allografter. Representativa mareld bilder (A) och kvantifiering av luciferas flöde över tiden (B) visar tillväxt för TRP - / - allografter i immun kompetenta, syngena möss injicerades med 10 5 TRP - / - luc kortikala astrocyter och avbildas på de angivna dagarna post injektion.g "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Genotyp Plating effektivitet (%) SEM
WT 0 0
T 1,03 0,15
TRP - / - 6,40 0,83

Tabell 1 Kolonibildning av kortikala astrocyter. WT, T och TRP - / - kortikala astrocyter ströks i tre exemplar på 4,000, 2,000 och 250 celler / brunn respektive. Kolonier färgades med kristallviolett 14 dagar efter plätering, avbildas, och coUnted med ImageJ. Plating effektivitet beräknades som antalet kolonier dividerat med antalet celler utstrukna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest kritiska stegen för att säkerställa korrekt skörd och odling av kortikala astrocyter är 1) för att skära ut kortex utan att ta vävnad nedan corpus callosum, 2) för att avlägsna hjärnhinnorna, 3) att grundligt dissociera cellerna, och 4) för att anrika för GFAP + astrocyter. Även om vi använde mekanisk (skakningar) och genetisk (begränsning av genetisk rekombination med en Ad5GFAPCre vektor eller utnyttjande av en dominerande trans transgen (TgGZT 121) under GFAP promotor kontroll) metoder för att anrika GFAP + astrocyter har andra metoder använts för att rena kortikala astrocyter. Till exempel kan kontaminerande mikroglia avlägsnas genom att behandla konfluenta kulturer med en mitotisk inhibitor följt av L-leucin-metylester 47. Morfologi och uttrycksprofiler astrocyter mekaniskt renade och odlade i seruminnehållande medier skiljer sig från akut isolerade astrocyter, med före detta hypotetisktzed att representera antingen mer omogna astrocytiska celler eller en reaktiv astrocyt fenotyp 48,49. På senare tid har en immunopanning metod utvecklats för att prospektivt rena kortikala gnagare astrocyter och deras uttryck profiler närmare härmade akut renade astrocyter vid odling i tillväxtfaktorsupple, serumfritt medium 49. Effekterna av den konventionella, mekaniska metod för kortikal astrocyternas anrikning och kultur kontra mer nyligen utvecklad immunopanning metod på fenotyper undersökta häri fortfarande oklara. Oavsett vilken metod används, är det viktigt att anrika GFAP + kortikala astrocyter att fastställa de fenotypiska konsekvenserna av onkogena mutationer specifikt inom denna celltyp.

Kritiska steg för att skörda NSC är 1) att exakt lokalisera SVZ, 2) för att minimera skador på SVZ under dissektion, och 3) att filtrera cellerna efter dissociation innan plattor. Precise NSC dissektion teknik är nödvändiga för att lokalisera och skörda SVZ. Eftersom NSC växa i suspensionskultur, är det viktigt att filtrera cellsuspensionen efter dissociation för att minska mängden flytande skräp. Även om vi utnyttjas tillväxten i SCM för att selektera för NSC kan NSC att prospektivt isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering av SVZ vävnadshomogenatet 50. Efter induktion av genetisk rekombination in vitro, är det viktigt att övervaka de cellulära egenskaperna hos det kortikala astrocyter och NSC kulturer över passagerna. Eftersom vi inte prospektivt anrika astrocyter eller NSC under vävnads skörd, vi seriellt övervakas anrikning och kvantifierad renhet av celltypen av intresse genom immunofluorescensfärgning med kända celltyp specifika markörer (GFAP för astrocyter, Sox2 för NSC). Dessutom rekommenderar vi systematiskt övervaka de förväntade signalerings konsekvenserna av onkogena mutationer både före och vid varje passage efter Cre-förmedlard rekombination genom immun och fenotypiskt karakterisera celler tidigast passage där renhet är maximerad och mutations inducerade signalerings förändringar stabiliseras.

En viktig faktor i att utnyttja primära cellkulturer är deras inneboende replikationsförmåga och fenotypiska effekterna av inducerade mutationer. Fenotypiskt WT murina astrocyter har begränsad replikationsförmåga och kan bara passe 3-4 gånger i odling innan de genomgår replika åldrande 31. Dessutom har många cancerassocierade mutationer, i synnerhet i MAPK pathway gener orsakar onkogen-inducerad åldrande in vitro 51. Således, om de inducerade mutationer inte föreviga cellerna och skydda dem från onkogen-inducerad åldrande, kan de inte seriepasse för fenotypisk karaktärisering in vitro. Virus onkoproteiner såsom HPV E6 / E7 och SV40 stort T-antigen har i stor utsträckning används för att föreviga många människor och murine celltyper i kultur, inklusive astrocyter 13,26,30. Vi har tidigare visat att ablation av G1 / S cellcykelkontrollpunkten med T var tillräcklig för att odödliggöra kortikala astrocyter, men inte tillräcklig för att orsaka letala astrocytom in vivo. Däremot aktivering av MAPK och PI3K signalering i TRP - / - astrocyter ledde till bildandet av GBM i orthotopic allograft modellsystemet 30. Sålunda effekterna av T, R, och P-mutationer på murin astrocyt transformation in vitro som definieras av kolonibildningsanalyser korrelerade med in vivo-tumörgenes i orthotopic allotransplantat.

Liksom alla modeller som kräver kirurgisk implantation av tumörceller, orthotopic injektion av transformerade, nGEM celler i syngena mus hjärnor kommer att framkalla en akut sår svar, kallas reaktiv glios. Under detta svar, neurala celler, inklusive astrocyter oligodendrocyt progenitorceller (NG2 +) glia och mikroglia, proliferåt och få en mer primitiv differentieringstillstånd, till stor del som svar på utsöndrade proteiner som sonic hedgehog 52,53. Emellertid är den proliferativa fasen av reaktiv glios som svar på hugg sårskada relativt kort, typiskt en vecka 53. Vi har tidigare visat att injektion av TRP - / - astrocyter inducerar effektivt tumörbildning under denna tid, vilket ger låggradiga astrocytom som ofta kommer fram med hög kvalitet astrocytom, inklusive GBM. Däremot injektion av T eller TP - / - astrocyter sällan utvecklas till låggradiga astrocytom vid 1-3 veckor efter injektion och dessa tumörer inte vidare till höggradig astrocytom 30. Dessutom injektion av fenotypiskt vildtyp kortikala astrocyter och NSC ensamma misslyckas med att framkalla tumörgenes (data ej visade). Vi fann att TRP - / - allograft tillväxt exponentiellt ökar 2-3 veckor efter injektion, en tid under vilken proliferativa fas reagerarive glios har upphört (fig 5 och 7). För att ta hänsyn till eventuella microenvironmental påverkan på tumörbildning vid injektion av transformerade, nGEM celler i syngena mushjärnor, särskilt under den proliferativa fasen av reaktiv glios rekommenderar vi att utföra kontroll injektioner av fenotypiskt WT kortikala astrocyter eller NSC vid utredning nya kombinationer av icke rekombinerad, floxed onkogen alleler. Vi rekommenderar även att övervaka effektiviteten i tumörbildning i både fenotypiskt WT och transformerade (rekombinerade) celler med en veckas mellanrum under den första månaden efter injektion, som vi tidigare har beskrivit 30.

Genom genetisk manipulation av antingen de injicerade cellerna eller allograft värd i sig, kan den nGEM astrocytom modellsystem kan användas för att modellera många aspekter av astrocytom patogenes, inklusive tumör-stroma interaktioner. Som ett exempel kan vi engineered TRP - / - kortikal astrocytes att uttrycka luciferas att definiera tumörtillväxt kinetik in vivo (Figur 7). Alternativt kunde nGEM celler modifieras genetiskt för att uttrycka ett fluorescerande protein och ortotopiskt injiceras i hjärnan hos GEM med fluorescerande nervceller eller kärl att definiera samspelet mellan tumörceller och normala hjärnceller 54. Den microenvironmental inflytande hjärn region eller utvecklingsålder på gliomagenesis kan bestämmas genom ortotopiskt injicera nGEM celler på olika platser eller i olika äldre möss. Även korta tumör latenser och överlevnad är bra för preklinisk drogtester, kan snabba tumörutveckling inte vara perfekt för att modellera vissa aspekter av astrocytom patogenes, inklusive malignt progression, invasion, och tumör stomi interaktioner. Överlevnad av nGEM allograft värdar lätt kan manipuleras genom att ändra antalet celler injicerade och systematiskt övervaka tumör penetrans och latens 30.

Mänskliga astrocytom är genomiskt komplexa och uppvisar omfattande intra och intertumör heterogenitet 5-7,55,56. Potentiella källor för denna heterogenitet inkluderar de somatiska mutationer som initierar tumörbildning, mutationerna som förvärvats under den evolutionära processen för malign progression och utvecklingspotential av cellerna i vilka dessa mutationer uppstår. Storskaliga sekvenseringsprojekt har identifierat många astrocytom associerade mutationer och deras mönster av samtidig förekomst 7. Dessa studier har åberopat bioinformatiska algoritmer för att identifiera vanligt förekommande mutationer och att nominera mutationer som sannolikt onkogen, dvs. "förarens mutationer" som initierar tumörbildning eller kör malign progression. Men, har inte undersökts på onkogen potential hos många av dessa mutationer, och deras potentiella celltyp specificitet systematiskt i modellsystem. Vi föreslår att nGEM modeller utilizing kortikala astrocyter och NSC som beskrivs här, liksom andra neurala celltyper som kan renas och odlas i kultur, tillhandahålla ett mångsidigt system för att utföra sådana undersökningar. Kan sedan undersökas systematiskt tillräcklighet och nödvändighet för transformation av nya kandidatmutationer som identifierats genom storskaliga sekvenseringsprojekt med konventionell genetisk GAIN- och förlust av funktion närmar sig med specifika nGEM celltyper hyser gemensamma samarbete förekommer mutationer i kärn GBM vägar där villkor GEM finns 5. Vi föreslår vidare att paneler av nGEM hyser olika kombinationer av mutationer i flera neurala celltyper kommer att vara användbart för modellering av den genomiska heterogenitet mänskliga astrocytom. Dessutom kan nGEM astrocytom modeller med kortikala astrocyter och NSC härrör från villkor GEM ger en lätthanterlig modell för preklinisk läkemedelsutveckling eftersom inledande in vitro-test av både mono-och kombinationsterapier kanutföras i dessa celler för att styra mer effektivt in vivo drogtestning i immunkompetenta, syngena möss. Dessutom kan immunmodulerande och stroma inriktade terapier testas i nGEM astrocytom modeller med immunkompetenta, syngena allograft värdar. Således nGEM astrocytom modeller med transforme kortikala astrocyter och NSC är ett värdefullt modellsystem för att fastställa de funktionella konsekvenserna av kombinationer av onkogena mutationer i specifika celltyper och kan vara användbar i preklinisk drogtestning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Tags

Neurovetenskap astrocytom kortikala astrocyter genetiskt modifierade möss glioblastom neurala stamceller orthotopic allograft
Modellering Astrocytoma Pathogenesis<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em&gt; Använda Kortikal Astrocyter eller neurala stamceller från Villkorlig, Genmanipulerade möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, … More

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter