Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modeling astrocytom Patogenese Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Astrocytomer er den mest almindelige primær hjernesvulst og glioblastom (GBM), en grad IV astrocytoma, er den mest almindelige og aggressiv undertype med en median overlevelse på 12-15 måneder 1,2. Invasion af diffuse astrocytomer, især GBM, er til hinder for komplet kirurgisk resektion, begrænser effektiviteten af adjuverende behandlinger, og uundgåeligt fører til efterbehandling gentagelse 3. Patienter oprindeligt til stede enten med de novo (primære) GBM eller med lavere lønklasse astrocytomer der uundgåeligt udvikler sig til (sekundær) GBM 4. GBM er genomisk heterogen og præget af gensidigt udelukkende og co forekommende mutationer i gener, der styrer tre centrale signalveje: G 1 / S (RB) cellecyklus checkpoint, receptor (RTK) og TP53 veje 5-7. GBM består af fire genomiske undertyper med særskilte udtryk profiler, der ligner forskellige hjerne celletyper, hvilket tyder på, at GBM subtype Influket af sin celle af oprindelse 6,8,9. Bedre astrocytom modeller er forpligtet til at definere den rolle, specifikke kombinationer af mutationer i bestemte celletyper under astrocytom patogenese. Udnyttelse af disse modeller for en mere effektiv præklinisk udvikling lægemiddel vil i sidste ende bidrage til at forbedre patienternes resultater. Aktuelle astrocytom modeller omfatter etablerede humane cellelinjer, patient afledt xenografter (PDX), genetisk modificerede normale humane astrocytter og neurale stamceller (NSC), og genetisk modificerede mus (GEM) 10-14. Vi udviklede et alternativ, ikke-germline GEM (nGEM) model 15 udnytte primære hjerneceller - kortikale astrocytter og NSC - høstet fra GEM huser forskellige kombinationer af floxet onkogene alleler. Målet var at skabe astrocytom modeller med genetisk definerede celler, der kan fænotypisk karakteriseret både in vitro og in vivo og potentielt udnyttes til præklinisk udvikling af lægemidler i jegmmune-kompetente mus.

Etablerede humane cellelinjer er de mest almindeligt anvendte model af astrocytoma patogenese og lægemiddelrespons in vitro og in vivo. De er teknisk set ligetil, bredt tilgængelige, og har defineret kinetik og tumorigenicitet upon orthotopisk xenografting i immunsvækkede mus 10,11,16-18 . Deres ulemper indbefatter den manglende evne til at generere etablerede cellelinjer fra lav kvalitet astrocytomer, begrænser undersøgelsen kun high-grade astrocytomer; Manglen på en defineret celle oprindelse; tilstedeværelsen af ​​komplekse genomiske abnormiteter, ofte med genomiske profiler, som afviger markant fra den oprindelige patientprøve; og modtagelighed for fænotypiske og genotypiske respons må i løbet seriel kultur i serum 11,17,19-22. De fænotypiske konsekvenser af de enkelte onkogene mutationer i etablerede humane GBM cellelinjer kan maskeres ved de mange abnormiteter, der faktisk er til stede, hvilket ofte er til hinder elucsering af direkte genotype-fænotype konsekvenser.

PDX genereres gennem subkutan passage af patient-isolerede astrocytomceller i immunsvækkede mus eller gennem deres kultur som ikke-klæbende sphæroider i defineret, serum-frit medium forud for orthotopisk injektion i hjernerne hos immunsvækkede mus 12,23. PDX mere præcist opretholde genomisk landskab af menneskelige astrocytomer, men magen til etablerede humane cellelinjer, kan den fænotypiske effekt af de enkelte onkogene mutationer være maskeret på grund af deres genomiske kompleksitet 19,24. At definere de fænotypiske konsekvenser af specifikke onkogene mutationer, især som reaktion på nye behandlingsformer, er paneler af etablerede humane cellelinjer eller PDX ofte udnyttes til at etablere genotype-fænotype korrelationer viser generaliserbarhed, og minimere sandsynligheden for cellelinje-specifikke effekter. Mens PDX nøjagtigt rekapitulere de histopatologiske kendetegnende for menneskelig astrocytomer, including invasion, ortotopisk xenotransplantater af etablerede humane cellelinjer generelt ikke 21,23,25. Derudover normale humane astrocytter og NSC er blevet genetisk manipuleret med definerede onkogene mutationer at modellere astrocytom tumorigenese in vitro og in vivo 13,14,26. Disse celler mangler det genomiske kompleksitet etablerede humane cellelinjer og PDX og præcist rekapitulere menneskelige astrocytom histopatologi, men kræver xenografting i immunsvækkede gnavere in vivo. Fordi alle menneskelige celle modeller kræver immundefekte gnaver værter til at forhindre immunmedieret xenotransplantatafstødning, disse modeller undlader at rekapitulere de native tumor-stroma interaktioner af et syngen system, og mangler et intakt immunsystem, begrænsning præklinisk undersøgelse af stroma-målrettet og immun-modulerende terapier 10,11.

GEM tillader undersøgelse af fænotypiske konsekvenser af forudbestemte kombinationer af onkogene mutationer in vivo under in situ tumorigenese. Mens ikke-betinget GEM har mutationer i alle væv i hele udvikling, har betinget GEM floxet onkogene alleler, der muliggør målretning af mutationer ved at begrænse Cre-medieret rekombination til specifikke celletyper ved anvendelse af celletype-specifikke promotorer 10,11,15,18. Betinget astrocytom GEM er blevet anvendt til at belyse de funktionelle roller onkogene mutationer i forskellige celletyper i en intakt hjerne 11. Den prækliniske nytte af in situ gliomagenesis brug af betinget GEM er begrænset af en række faktorer, herunder 1) manglen på en in vitro-korrelat, 2) svært ved at generere store grupper af mus med komplekse genotyper, 3) lang latenstid in situ tumor udvikling , 4) og stokastisk tumorprogression. Fordi in situ tumorgenese mangler en tilsvarende in vitro-model, kan narkotika-test in vitro ikke udføres wed konventionelle betingede GEM modeller. I modsætning til andre kræftformer, er betingede GEM modeller af astrocytomer sjældent fremkaldt af enkelte onkogene mutationer 11. Således er komplekse avlsplaner skal generere betinget PERLE med flere onkogene mutationer. Desuden forekommer astrocytoma initiering med variabel penetrans efter en lang latensperiode i disse modeller, mens progression til high-grade astrocytomer generelt sker i en ikke-ensartet, stokastisk måde og i sidste ende giver anledning til tumorer med komplekse genomiske landskaber og hurtige vækstkinetik 27, 28. Den variable penetrans og stokastiske natur malign progression i betingede GEM-modeller kræver, at de enkelte mus screenes ved radiografisk billeddannelse til at detektere tilstedeværelsen og placeringen af ​​high-grade astrocytomer før deres indskrivning i prækliniske lægemiddelforsøg. Tilsammen disse begrænsninger hindrer generering og test af de store kohorter af betinget GEM kræves for PReClinical narkotika testning.

Den RCAS-TVA GEM system, som udnytter aviær retrovirale (RCAS) vektorer at inficere GEM manipuleret til at udtrykke den virale receptor (TVA) på specifikke neurale celletyper, er blevet ekstensivt anvendt til at modellere astrocytom tumorigenese 11. I modsætning til betinget GEM dette modelsystem, gør indførelsen af ​​flere onkogene mutationer i specifikke celletyper uden behov for komplekse avlsplaner. Det er imidlertid begrænset af variabel penetrans, kravet om aktivt delende celler for at opnå viral integration, og tilfældig indsættelse af transgener i værtsgenomet 29.

Ikke-kimlinie GEM (nGEM) modeller, der anvender celler høstes fra GEM, bliver mere og mere vigtige, fordi de overvinde mange af de begrænsninger af andre modelsystemer 15. Rolle indlede celletype og co forekommende mutationer i astrocytoma patogenese er vanskelige at afskrækkeminen ved anvendelse af etablerede humane GBM cellelinjer eller PDX, fordi de stammer fra slutstadiet tumorer, der har akkumuleret omfattende genetiske mutationer i udefinerede celletyper i løbet af malign progression. I modsætning hertil kan alle kvaliteter af astrocytomer modelleres ved hjælp nGEM ved at inducere definerede genetiske mutationer inden for specifikke oprensede hjerne celletyper 11,30. Således kan bestemmes indflydelsen af specifikke genetiske mutationer og celletype på cellulære og molekylære fænotyper in vitro og in vivo. Svarende til etablerede humane GBM-cellelinjer kan indledende in vitro test af lægemidler i at bruge nGEM anvendes til at prioritere lægemidler til in vivo-test, der anvender de samme celler. Tumorigenese in vivo kan derefter bestemmes ved allografting nGEM celler orthotopisk i hjernen på immun-kompetente syngene kuld 30. Disse ortotopisk allotransplantat modellerne tillader derfor in vivo-test ikke kun af konventionel cytotoksisk ennd målrettede behandlinger, men immun-modulerende og stroma målrettede behandlinger så godt. Endelig kan rolle mikromiljøet på tumorinitiering og progression bestemmes ved at sammenligne resultaterne mellem nGEM og konventionelle GEM modeller under anvendelse af de samme mutationer i de samme celletyper.

Vi og andre har udviklet astrocytoma nGEM med primære celler - astrocytter, NSC eller oligodendrocyt prækursorceller (OPC) - høstet fra GEM 30-34. Rationalet bag udviklingen af en astrocytoma nGEM var at skabe en model til at bestemme de fænotypiske konsekvenser af onkogene mutationer i specifikke celletyper, der potentielt kan bruges til præklinisk test af lægemidler in vitro og in vivo i immun-kompetente dyr. Vi høstede fænotypisk WT kortikale astrocytter og NSC fra ikke-Cre udtrykker, betinget GEM vedligeholdes på en> 94% C57 / BL6 baggrund med floxet RB vej - RB1 loxP / loxP eller TgGZT121 - og floxet RTK / RAS / PI3K vej - NF1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP - generne i forskellige kombinationer 35-39. Vi induceret genetisk rekombination in vitro ved anvendelse adenovirale vektorer, der koder Cre-rekombinase. Fordi kortikale astrocyt høst indeholder en blanding af celletyper, vi anvendte Ad5GFAPCre vektorer eller dominerende onkogene transgener, såsom TgGZT 121 drevet fra den humane GFAP promotor, at berige for GFAP + corticale astrocytter i disse kulturer. Vi definerede fænotypiske konsekvenser af G 1 / S (Rb), MAPK, og PI3K pathway mutationer i corticale astrocytter og NSC in vitro og in vivo. MAPK og PI3K-forløb-aktiveret G1 / S-defekte astrocytter molekylært efterlignede menneskelige proneural GBM og efter orthotopisk injektion, dannet tumorer i en foruddefineret placering med ensartede vækstkinetik, korte latenstider og histopatologiskeal kendetegnende for human GBM 30. Longitudinal overvågning af tumorvækst in vivo hjælpemidler præklinisk stof gennem normalisering af behandlingsmuligheder kohorter og kvantitativ analyse af tumorvækst i respons på behandlingen 40. Vi fast tumor vækstkinetik af langsgående bioluminescens billeddannelse af mus injiceret med luciferase udtrykke corticale astrocytter. Derfor kortikale astrocytter og NSC afledt betinget PERLE give en medgørlig model system til definition af funktionelle konsekvenser af astrocytom-associerede mutationer og en mulig model for præklinisk lægemiddeludvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of North Carolina Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Dyrkningen kortikal Astrocyter fra neonatale mus

  1. Forberedelse
    1. Krølle 2-3 vanskelige opgave væv og anbringes i bunden af ​​en kolbe indeholdende 70% ethanol. Placer dissekere saks, buede pincet og 2 par lige mikro pincet i denne kolbe. Vævene anvendes for at undgå bøjning mikro pincet.
    2. Tilsæt 1 ml HBSS til en 60 mm vævskulturskål. Forbered en separat skål for hvert dyr, og vedligeholde retter på is.
    3. Bedøver dyr pr institutionelle regler.
    4. Varm 7 ml DMEM med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (komplet DMEM) for hvert dyr i et 37 ° C vandbad. BEMÆRK: 5 mus, trin 1.1.1-1.1.4 vil tage ~ 15 min.
  2. Tissue Harvest
    1. Sacrifice neonatal mus (dag 1-3) pr institutter iOnal forskrifter.
    2. Fjern dissekere saks fra ethanol, lade dem dryppe af, og gøre en sagittal snit i huden over kraniet fra rygmarven til næsen.
    3. Lav et snit i baghovedet langs sagittale sutur, startende fra rygmarven og strækker sig forbi de olfaktoriske pærer. Pas at holde saksens tip nær den indre overflade af kraniet for at minimere skade på hjernevæv.
    4. Ved hjælp af buet pincet, skræl forsigtigt hver halvkugle af kraniet sideværts væk fra hjernen.
    5. Brug lige mikro pincet, forsigtigt klemme væk den dorsale del af hver kortikale halvkugle og læg det i vævsdyrkningsskål indeholder HBSS. Vær omhyggelig med at undgå lillehjernen og olfaktoriske pære. Tag ikke nogen væv under hjernebjælken.
    6. Ved hjælp af en dissektionsmikroskop og 2 par mikro pincet, forsigtigt fjerne meninges fra hver kortikale halvkugle. Retur vævsdyrkningsskål til is indtil begyndelsen væv homogenization.
    7. Gentag trin 1.2.1 gennem 1.2.6 For hvert yderligere dyr. BEMÆRK: 5 mus, trin 1.2.1-1.2.7 vil tage ~ 30 min.
  3. Tissue Homogenisering
    1. Brug en ren barberblad, fint skær dem i tern kortikale halvkugle og flytte pladen til en vævskultur hætte.
    2. Overfør hakkede væv i en steril 15 ml konisk rør. Vask pladen med 1 ml iskold HBSS og overføre til rør indeholdende væv.
    3. Vent væv afregner til bunden af ​​røret, derefter forsigtigt fjerne overskydende HBSS ved hjælp af en pipette.
    4. Tilsæt 2 ml stuetemperatur trypsin / EDTA. Pipette ~ 10x med en 1 ml pipette til yderligere dissociere celler.
    5. Inkubér cellesuspensionen ved 37 ° C i 15 - 20 min. Bland forsigtigt ved inversion hver 5 min.
    6. Tilsæt 3 ml komplet DMEM til at hæmme trypsin. Pipette ~ 10x med en 1 ml pipette for at blande opløsningen.
    7. Centrifugeres ved 200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
    8. Fjernsupernatanten med en 1 ml pipette. Aspirér ikke mediet, fordi pillen kan være løs.
    9. Pellet resuspenderes i 4 ml på 37 ° C fuldføre DMEM. Overfør cellesuspensionen til en 75 cm skruelåg vævskulturkolbe. BEMÆRK: 5 mus, trin 1.3.1-1.3.9 vil tage ~ 50 min.
    10. Omkring 16 timer efter astrocyt høst, kolben vaskes med 4 ml 37 ° C HBSS, tilsæt derefter 4 ml 37 ° C fuldføre DMEM. Oprethold de corticale astrocytter ved 37 ° C i 5% CO2. BEMÆRK: vasketrinnet er vigtigt for fjernelse af ikke-adhærente celler og rester fra dyrkningsskålen.
    11. Når kulturen er ~ 95% sammenflydende, rystes natten over ved 37 ° C i 5% CO2, fjern medier indeholdende de løsrevne celler, kolben og vask derefter med 4 ml 37 ° C HBSS. Tilsæt 4 ml 37 ° C fuldføre DMEM og opretholde cellerne ved 37 ° C i 5% CO2. BEMÆRK: Dette trin er vigtigt at berige kulturer til kortikale astrocytter, som forurener mikroglia ogoligodendrocyt progenitorceller løsnes med denne procedure, og fjernes fra kulturen 41.
    12. Gentag trin 1.3.1-1.3.11 for hvert dyr.
  4. Induktion af genetisk rekombination
    1. 24 timer efter afslutning af trin 1.3.11, erstatte mediet med 2 ml 37 ° C fuldføre DMEM. Der tilsættes 1 ml 37 ° C SCM indeholder 1 ml af> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre eller Ad5GFAPCre. Der inkuberes i 6 timer ved 32 ° C i 5% CO2 .CAUTION: Brug BSL2 sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering af rekombinant adenovirus.
    2. Fjern virus indeholdende medier og tilsæt 37 ° C komplet DMEM uden virus til de corticale astrocytter. FORSIGTIG: Brug BSL2 sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering af rekombinante adenovira og kassér virus-holdige medier pr institutionelle regler. BEMÆRK: 5 astrocyt kulturer, trin 1.4.1 - 1.4.3 vil tage ~ 15 min eksklusive 6 timers inkubation.
    3. Udvid corticale astrocyt kulturer til iin vitro og in vivo karakterisering. BEMÆRK: bestemme tilstedeværelsen af ​​mutationer efter Cre-rekombination ved PCR med primere specifikke for rekombineret gen eller ved immunoblots for enten specifikke muterede protein eller dets signalering konsekvenser. Den nødvendige tid til fænotypisk stabilisering af corticale astrocyt kulturer efter Cre-rekombination vil være afhængig af de anvendte mutationer og skal bestemmes empirisk (figur 2).

2. Dyrkning neurale stamceller fra neonatale mus

  1. Forberedelse
    1. Før du starter dissektion, forberede 4 ml fordøjelse opløsning pr hjerne ved at tilsætte 3,1 mg papain og 1,3 mg cystein til 4 ml dissociation medium - 98 mM Na 2 SO 4, 30 mM K 2 SO 4, 5,8 mM MgCl2, 0,25 mM CaCl2 , 1 mM HEPES (fra 1 M HEPES pH 7,4 lager) 20 mM glucose, 0,001% Phenolrødt, og 0.125 mM NaOH. Tilsætning af papainog cystein til dissociation mediet vil dreje løsningen gul.
    2. Inkuberes i 37 ° C vandbad i 15 min. Bland periodisk ved inversion.
    3. Tilføj 0,1 M NaOH dråbevis indtil fordøjelsen løsning vender tilbage til lys rød farve.
    4. I en vævskultur hætte, sterilfilter fordøjelse med en sprøjte-filter (0,22 um porestørrelse). Hold fordøjelsen løsning på is.
    5. Forbered 50 ml stamcellemedium (SCM) ved at blande 44,5 ml NSC basismedium 5 ml NSC tillæg, 0,5 ml penicillin-streptomycin, 50 ul 0,2% heparin, 10 pi 100 mikrogram / ml EGF, og 10 pi 100 mikrogram / ml bFGF. SCM er holdbar i 1 uge, når de opbevares ved 4 ° C.
    6. Forbered komplet HBSS (cHBSS) ved at blande 50 ml 10x HBSS, 1,25 ml 1 M HEPES (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glucose, 5 ml 100 mM CaCl2, 5 ml 100 mM MgSO4, og 2 ml 1 M NaHCO3. Bring det samlede volumen til 500 ml med Hedeselskabet 2 O.
    7. Filtersteriliser cHBSS witha 0,2 um porestørrelse-filter og opbevares ved 4 ° C.
    8. Krølle 2-3 vanskelige opgave væv og anbringes i bunden af ​​en kolbe indeholdende 70% ethanol. Placer dissekere saks, buede pincet og 2 par lige mikro pincet i denne kolbe. Vævene anvendes for at undgå bøjning mikro pincet. BEMÆRK: 5 mus, trin 2.1.1-2.1.8 vil tage ~ 45 min.
  2. Tissue Harvest
    1. Sacrifice neonatal (dag 1-3) mus pr institutionelle regler.
    2. Fjern dissekere saks fra 70% ethanol, og give dem mulighed for at dryppe, og gøre en sagittal snit i huden over kraniet fra rygmarven til næsen.
    3. Lav et snit i baghovedet langs sagittale sutur, startende fra rygmarven og strækker sig forbi de olfaktoriske pærer. Pas at holde saksens tip nær den indre overflade af kraniet for at minimere skade på hjernevæv.
    4. Ved hjælp af buet pincet, skræl forsigtigt hver halvkugle af kraniet sideværts væk frahjerne.
    5. Fjern forsigtigt hele hjernen og sted i iskold cHBSS.
    6. Ved hjælp af en dissektion mikroskop, forsigtigt fjerne meninges fra hjernen med fine dissektion værktøjer.
    7. Placer hjernen på sin bundflade og fjerne lillehjernen / baghjerne og olfaktoriske pære / frontale cortex med lodret (koronalt) skærer med en størrelse 11 skalpel.
    8. Drej resterende hjerne ved 90 ° for at placere den på den caudale del, hvorved der genereres en koronal visning af hjernen. Find de laterale ventrikler.
    9. Klip et kubisk del indeholdende subventrikulære zone (SVZ).
    10. Overførsel SVZ-holdige væv til et 60 mm vævsdyrkningsskål med frisk iskold cHBSS og hakkekød væv med størrelse 11 skalpel.
    11. Overfør det hakkede væv i et sterilt 15 ml rør. Glasset anbringes på is.
    12. Vask petriskål med 1-2 ml iskold cHBSS. Overfør vaskeopløsningen til rør indeholdende væv.
    13. Gentag trin 2.2.1-2.2.12 med ekstra neonatal mus hvis det er nødvendigt. Overfør alle 15 ml rør til en vævskultur hætte for den resterende del af protokollen. BEMÆRK: 5 mus, trin 2.2.1 - 2.2.13 vil tage ~ 45 min.
  3. Tissue Homogenisering
    1. Placer fordøjelse opløsning (fremstillet i trin 2.1.1) i et 37 ° C vandbad i 5 min. Også varm 2 ml SCM pr hjernen i et 37 ° C vandbad.
    2. Fjern forsigtigt supernatanten fra hakket væv med en 1 ml pipette. Aspirér ikke.
    3. Tilsæt 2 ml 37 ° C fordøjelse opløsning pr 15 ml rør og blandes omhyggeligt ved at vende.
    4. Inkuberes i 37 ° C vandbad i 15 min. Bland ved at vende hver 5 min.
    5. Tilføj yderligere 2 ml 37 ° C fordøjelse opløsning til hvert rør, og gentag trin 2.3.4.
    6. Lade cellerne sig på bunden af ​​røret ved hjælp af tyngdekraften og derefter fjerne supernatanten fra fordøjet væv under anvendelse af en 1 ml pipette.
    7. Tilsæt 2 ml 10 uM E-64 fortyndet i cHBSS og blandes omhyggeligt ved at vende.
    8. Lade cellerne sig på bunden af ​​røret ved hjælp af tyngdekraften og derefter fjerne supernatanten fra fordøjet væv.
    9. Der tilsættes 1 ml 37 ° C cHBSS og homogeniseres med en 1 ml pipettespids (~ 20 slag). Undgå at injicere luftbobler under væv homogenisering.
    10. Pass vævshomogenatet gennem en 40 um porestørrelse cellefilter, skyl sien med 5 ml 37 ° C cHBSS.
    11. Centrifugeres vævshomogenatet ved 125 xg i 5 minutter.
    12. Fjern 95% af supernatanten med en 1 ml pipette uden at forstyrre cellepelleten. Forsigtigt resuspender cellepelleten i 200 ul 37 ° C SCM med en 200 ul pipettespids.
    13. Tilføj 1,8 ml 37 ° C SCM og overføre cellesuspensionen til en brønd af en steril 6 brønde. BEMÆRK: 5 mus, trin 2.3.1-2.3.14 vil tage ~ 75 min.
  4. Neural stamcelle Kultur
    1. Efterfyld mediet efter 3 dage ved at tilføje yderligere 2 ml 37 °C SCM.
    2. Efter 7 dage overføre neurosfærerne til et 15 ml rør og lade neurosfærerne afregne ved tyngdekraft i> 5 minutter.
    3. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 2 ml 37 ° C SCM.
    4. Overfør neurosfærerne til en ny brønd i en 6-brønds plade.
    5. Tilsæt 2 ml 37 ° C SCM hver 3-4 dage, og ændre mediet helt hver 7 dage.
    6. Hvis neurosfærer er> 100 um i diameter, omhyggeligt dissociere med stilk celledissocieringsopløsning og replate NSC ved den ønskede celletæthed.
  5. Induktion af genetisk rekombination
    1. Der tilsættes 1 ml 37 ° C SCM indeholdende 1 pi> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre eller Ad5GFAPCre til 2 ml SCM øjeblikket på cellerne. FORSIGTIG: Brug BSL2 sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering af rekombinant adenovirus.
    2. Der inkuberes i 6 timer ved 32 ° C i 5% CO2.
    3. Overførsel SCM med neurosfærer i en 15 ml rør og lade kugler afregne ved tyngdekraft i 5 min.
    4. Fjern supernatanten først med en 1 ml pipette, og derefter med en 200 pi pipette. FORSIGTIG: Brug BSL2 sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering af rekombinante adenovira og kassér virus-holdige medier pr institutionelle regler.
    5. Tilsæt 2 ml 37 ° C SCM uden virus til NSC, derefter overføre til en 6-brønds plade. BEMÆRK: 5 NSC kulturer, trin 2.5.1-2.5.5 vil tage ~ 15 min eksklusive 6 timers inkubation.
    6. Den næste dag, skal du gentage trin 2.5.1-2.5.5, efterfulgt af neurosfæren passage når det er nødvendigt. Kuglerne kan nu udvides til 2-3 passager før in vitro karakterisering og ortotopisk injektion i musehjerner in vivo. BEMÆRK: bestemme tilstedeværelsen af ​​mutationer efter Cre-rekombination ved PCR med primere specifikke for rekombineret gen eller ved immunoblots for enten specifikke muterede protein eller dets signalering konsekvenser. Den nødvendige tid til fænotypisk stabilisering af NSC kulturer efter Cre-rekombination vil være afhængigpå de anvendte mutationer og skal bestemmes empirisk (figur 2 og 3).

3. ortotopisk Injektion af rekombineret celler ind i hjernen på Modtager Iimmunocompetent Mus

  1. Fremstilling af 5% Methylcellulose
    1. 5 g 15 cPs methylcellulose i deioniseret vand opløses til et slutvolumen på 50 ml i en 100 ml skruelåg flaske. Tilføj pulveret langsomt under omrøring ved 4 ° C for at forhindre klumpning. Det kan tage op til 24 timer under omrøring ved 4 ° C for alle methylcellulose at indtaste opløsning.
    2. Flasken vejes, og massen noteres.
    3. Autoklaveres methylcelluloseopløsning 5%. Når autoklaveret, vil methylcellulose blive en halvfast gel.
    4. Flasken vejes og beregne tabt under autoklavering vægt.
    5. Tilsættes aseptisk 1 ml sterilt vand til hvert gram vægt tabt.
    6. Placer på is, og der tilsættes 50 ml iskold 2x DMEM. </ Li>
    7. Bland natten over under anvendelse af en magnetisk omrører ved 4 ° C. Anvend steril teknik til at opdele methylcelluloseopløsning 5% i 20 ml alikvoter. Store portioner ved 4 ° C i op til seks måneder eller indtil 2x DMEM udløber. BEMÆRK: Fremstilling af 5% methylcelluloseopløsning i trin 3.1.1-3.1.7 vil tage ~ 2,5 dage.
  2. Forberedelse af Kortikal Astrocyter til injektion
    1. Harvest corticale astrocytter når ~ 90% sammenflydende.
    2. At høste, aspireres komplet DMEM og vaske tallerkener med en tilsvarende mængde på 37 ° C HBSS.
    3. Tilføj nok trypsin til at dække pladen. Forsigtigt vippe og trykke på pladen, indtil cellerne begynder at løsne sig.
    4. Inaktivere trypsin med et lige volumen af ​​37 ° C fuldføre DMEM.
    5. Overfør celler til en 50 ml konisk rør og vask pladen med det samme volumen på 37 ° C komplet DMEM anvendt i 3.2.4.
    6. Overførsel vask medier til røret indeholdende celler. Centrifugeres ved 200 x g i 3 minutter.
    7. Aspirer supernatant og resuspender cellerne i 1 ml 37 ° C fuldføre DMEM.
    8. Tæl cellesuspensionen ved hjælp af et hæmocytometer eller en anden passende celle tæller for at bestemme antallet af celler / ul.
    9. Overfør det ønskede antal af celler til en ny 15 ml konisk rør. Centrifugeres ved 200 x g i 3 minutter.
    10. Resuspender cellerne i 800 ul 37 ° C fuldføre DMEM. Bestem mængden af ​​cellepelleten (totalt volumen cellesuspension - 800 ul). BEMÆRK: Det er vigtigt at opnå en nøjagtig koncentration celle til injektion. Således skal mængden af ​​cellepelletten bestemmes i dette trin for at beregne mængden af ​​5% methylcellulose at tilføje i trin 3.2.12.
    11. Overfør celler til en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 200 x g i 3 minutter.
    12. Aspirer supernatanten fra cellebundfaldet og resuspender kortikale astrocytter i passende volumen af ​​iskold 5% methylcellulose (ønsket samlet volumen - volumencellepelleten) for at opnå det ønskede antal celler / ul.
    13. Placer celler på is, indtil injektion.
    14. Placer en 250 ul glas sprøjten i en Gentagelse Antigen Dispenser derefter placere en stump 18 G kanyle på sprøjten.
    15. Træk stemplet langsomt med nålen i kortikale astrocyt suspension; der vil være en luftboble over de celler, der skal fjernes, idet luftbobler komprimere og mindske mængden faktisk injiceres ind i hjernen.
    16. Hold spidsen af ​​nålen lige over den kortikale astrocyt suspension og skub stemplet ind hurtigt. Luftboblen bevæger sig hurtigere end cellesuspensionen og vil hovedsagelig blive udvist.
    17. Gentag trin 3.2.16, indtil alle luftbobler er fjernet fra nålen.
    18. Fyld sprøjten til omkring ~ 200 ul, derefter holde nålen op og trække stemplet tilbage, indtil den stopper. Små luftbobler kan fjernes ved at holde nålespidsen og hurtigt at trykke stemplet i omkring 50 ul derefter langsomt trække sig tilbage til fuld kapacitet.
    19. Hold spidsen oprejst og gentag trin 3.2.18 4-5x.
    20. Kassér 18 gauge nål og passer til en 27 G kanyle på sprøjten.
    21. Tryk på knappen på antigenet dispenseren, indtil væsken er bortvist fra nålen. BEMÆRK: For 1 astrocyt cellelinje, trin 3.2.1-3.2.21 vil tage ~ 60 min.
  3. Forberedelse af NSC til injektion
    1. Når neurosfærer er> 100 um i diameter, overføres til 15 ml rør og lad neurosfærerne afregne ved tyngdekraft i> 5 min.
    2. Supernatanten fjernes, og dissociere neurosfærer med en blid dissociation reagens, såsom stamceller dissociation opløsning eller Accutase i henhold til producentens anvisninger eller med% 0,05 trypsin-EDTA som beskrevet 42.
    3. Inhibit dissociation reagenser ifølge producentens instruktioner uden at udsætte NSC til serum. Centrifugeres ved 100 xg i 5 minutter.
    4. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer eller en anden passende celle tæller for at bestemme antallet af celler / ul.
    5. Overfør det ønskede antal NSC til en ny 15 ml konisk rør. Centrifugeres ved 100 xg i 5 minutter.
    6. Resuspender celler i 800 ul 37 ° C HBSS. Bestem mængden af ​​cellepelleten (totalt volumen cellesuspension - 800 ul). BEMÆRK: Det er vigtigt at opnå en nøjagtig koncentration celle til injektion. Således skal mængden af ​​cellepelletten bestemmes i dette trin for at beregne mængden af ​​5% methylcellulose at tilføje i trin 3.3.9.
    7. Overfør cellerne til en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 100 xg i 5 minutter.
    8. Aspirere supernatanten og afslutte udarbejdelsen af ​​celler til orthotopisk injektion som i 3.2.12-3.2.21. BEMÆRK: For 1 NSC cellelinie, trin 3.3.1-3.3.9 vil tage ~ 60 min.
  4. Udarbejdelse af Mouse til injektion
    1. Anesthetize recipientdyret via en IP-injektion af 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribromethanol) eller 100 mg / kg ketamin plus 10 mg / kg xylazin pr institutionelle IACUC retningslinjer. BEMÆRK: Udnyttet heri er mus ved 3-6 måneders alderen som allotransplantat værter. Mus på forskellige alderstrin kan anvendes til at undersøge microenvironmental virkningen af ​​udviklingsmæssige hjerne alder på tumorigenese.
    2. Barbere hovedbunden over incisionssted med neglesaks eller saks.
    3. Sterilisere kirurgiske sted med 3 skiftende podninger af 70% ethanol og betadine.
    4. Påfør oftalmologiske salve til øjnene for at forebygge eventuelle skader som følge af tab af blink refleks.
    5. Vurdere anæstesidybden ved tilbagetrækning pedalen (tå knivspids) refleks. BEMÆRK: 5 mus, trin 3.4.1-3.4.5 vil tage ~ 15 min.
  5. Ortotopisk implantering
    1. Fastgør dyr i stereotaktisk ramme.
    2. Make et snit over sagittale sutur ca. 0,5 cm lang mellem ørerne og øjnene.
    3. Find skæringspunktet mellem koronale og sagittale suturer (Bregma), såvel som skæringspunktet for lambdoid og sagittale suturer (lambda). Sørg for at Bregma og lambda er i samme vandrette plan.
    4. Fastgør sprøjten med cellesuspensionen og gentage antigen dispenser til stereotaktisk ramme over hovedet. Bring spidsen af ​​27 G kanyle i kontakt med Bregma. Dette er oprindelsen, der vil blive anvendt til manipulation af tredimensionale koordinater.
    5. Hæv nålen lidt væk fra kraniet overflade og flytte 2 mm laterale og 1 mm rostralt fra Bregma.
    6. Sænk nålen forsigtigt gennem kraniet til bestemmelsesstedet 4 mm ventralt fra Bregma. BEMÆRK: Vi udnyttet disse stereotaktiske koordinater for at målrette basalganglierne. Forskellige stereotaktiske koordinater kan anvendes til at undersøge microenvironmental virkningen af ​​forskelligeområder af hjernen på tumorigenese.
    7. Injicer 5 pi af cellesuspensionen ved at aktivere gentagende antigen dispenseren én gang. Lad nålen på plads for 2 minutter for at tillade intrakranielt tryk i ligevægt.
    8. Træk kanylen langsomt over en periode på 30 sek. Brug en vatpind til at lægge pres på nogen blødning, som kan forekomme.
    9. Tilnærme sårkanterne og lukke snittet ved hjælp af væv lim. Indgiv 20 ul Lidocain subkutant på incisionssted. BEMÆRK: 5 mus, trin 3.5.1-3.5.9 vil tage ~ 50 min. UNC IACUC godkendte den postoperative brug af kun lokalbedøvelse. Anbefales høring af lokale institutionelle IACUC vidt angår kravene vedrørende postoperativ smertestillende brug efter denne procedure.
  6. Post-kirurgisk behandling
    1. Placer dyrene i en ren, varm bur at komme sig. Dyrene må ikke placeres direkte i strøelse, som utilsigtet aspiration kan forekomme.
    2. Observerdyr til genoptagelse af normal adfærd såsom grooming, spise og afføring. BEMÆRK: Genoptagelse af normal adfærd kan tage ~ 60 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi udviklede et nGEM modelsystem med corticale astrocytter og NSC høstet fra neonatal GEM skjult floxet betingede onkogene alleler, der kan fænotypisk karakteriseret in vitro og in vivo (figur 1). For at undersøge konsekvenserne af onkogene mutationer specifikt i kortikale astrocytter in vitro, er det vigtigt først at berige for astrocytter. Kortikale astrocyt høst indeholder en blanding af mikroglia, astrocytter, oligodendrocytter, OPC, og neuroner, men mekaniske og genetiske metoder kan støtte i astrocyt berigelse. Betragtninger neuroner dør under normale dyrkningsbetingelser kan mikroglia og oligodendrocytter fjernes ved omrystning natten 41,43. Derudover kan genetisk rekombination af floxet, onkogene alleler målrettet mod GFAP + astrocytter anvendelse af et Ad5GFAPCre berige for astrocytter. Vi brugte denne metode til at inficere kortikale høst fra RB1 loxP / loxP GEM hvalpe med floXED NF1 loxP / loxP-og / eller PTEN loxP / loxP alleler. Ad5GFAPCre infektion forårsaget en proliferativ fordel i rekombinerede GFAP + astrocytter, hvilket øgede astrocyt renhed fra 59% til> 90% efter 5-9 passager i kultur (figur 2A og 2B). Alternativt beriget til astrocytter ved at udtrykke T 121 under styring af GFAP promotor til at inducere en proliferativ fordel i astrocytter høstet fra TgGZT 121 mus (figur 2C). Mens corticale astrocytter vokse klæbende til dyrkningsskålen (figur 2C) NSC vokse som ikke-adhærente neurosfærer in vitro (figur 3A). Både WT NSC og NSC med rekombineret, floxet onkogene alleler - TgGZT 121 (T), Kras G12D (R) og homozygote PTEN sletning (P - / -), kaldet TRP- / - - Udtrykke NSC markør Sox2, mens kun NSC høstet fra GEM indeholdende TgGZT 121 udtrykker T 121 efter Cre-medieret rekombination (figur 3B).

At bestemme hvor G 1 / S (Rb), MAPK og / eller PI3K pathway ændringer påvirker væksten af GFAP + astrocytter in vitro, blev proliferation undersøgt ved anvendelse af to metoder. MTS og celletælling viste, at ekspression af T 121 og Kras G12D øget spredning af kortikale astrocytter (figur 4A og 4B). Tilsvarende homozygot RB1 (Rb) og NF1 (N), sletning kombineret med heterozygot PTEN (P +/-) udgår også steget kortikale astrocyt proliferation (figur 4C). Transformerede celler ubegrænset proliferativ kapacitet. Kan måles transformerende virkninger af mutationer in vitro under anvendelse colony dannelse assays. Vi har derfor testet transformerende virkninger af T-121 og Kras G12D ekspression og homozygot PTEN deletion i TRP - / - corticale astrocytter af kolonidannelse assayet som tidligere beskrevet 44. Betragtninger WT astrocytter ikke danne kolonier, T astrocytter dannede kolonier på 1,03% effektivitet. Især TRP - / - astrocytter havde den højeste kolonidannelse effektivitet på 6,40% (tabel 1). For at være egnet til præklinisk testning lægemiddel, er det vigtigt, at in vitro-tumormodeller nemt manipuleres genetisk. Yderligere genetiske ændringer stabilt kan indføres i corticale astrocytter efter plasmid eller virale vektorer. Som et eksempel har vi stabilt transducerede luciferasegenet i TRP - / - astrocytter (TRP - / - luc) med en VSV-pseudotype pMSCV retroviral vektor. Ekspression af luciferase øget luminescens ~ 1.000 gange sammenlignet med forældrenes celler ( in vitro. Vi har tidligere vist, at behandling med lavdosis PI-103, en dobbelt mTOR / PI3K-inhibitor, inhiberede PI3K-signalering uden at påvirke cellelevedygtigheden 30. Imidlertid blev de cytostatiske / cytotoksiske virkninger af højere PI-103 doser ikke bestemt. Således testede vi, om PI-103 kan reducere TRP - / - astrocyt vækst in vitro. PI-103 forårsagede en maksimal reduktion af 88% i TRP - / - astrocyt vækst (figur 4E). Vi har tidligere udnyttet ortotopisk allotransplantater af TRP - / - astrocytter til at teste andre klinisk relevante lægemidler in vivo (Schmid m.fl., manuskript indsendt.) 45,46. Disse data tyder på, at transformerede kortikale astrocytter høstet betinget GEM kan give en fleksibel model system, hvor at udføre præklinisk stof i immun kompetent mikrofone.

Xenotransplantater af etablerede humane cellelinjer og PDX kræver immundefekte værter. I modsætning til PDX, at mange etablerede humane GBM cellelinjer ikke rekapitulere de histopatologiske funktioner i GBM. For eksempel U87MG ortotopisk xenotransplantater dannet afgrænset tumorer, som ikke invaderer normal hjerne (figur 5A). I modsætning hertil injektion af TRP - / - astrocytter i hjernen hos immunkompetente, syngene mus viste invasive tumorer, der sammenfattet de histologiske karakteristika ved deres humane modstykker, især invasion af normal hjerne (figur 5B). Til længderetningen kvantificere TRP - / - allotransplantat vækst blev musene aflivet hver 5 dage efter celleinjektion og tumorbyrde blev bestemt ved at kvantificere tumorområde på H & E-farvede hjernesnit. Tumor område steget eksponentielt over tid (figur 5C). Ortotopisk injektion af 10 5 TRP - / - astrocytter til Recipient hjerner førte til neurologisk sygelighed, med en median overlevelse på 22 dage (figur 5d). Ud over corticale astrocytter, udførte vi ortotopisk injektioner anvender TRP - / - NSC. TRP - / - NSC-afledte tumorer, var T 121 positiv proliferativ og vedligeholdes ekspression af NSC markør Sox2 (figur 6). Notatet injektion af kortikale astrocytter og NSC høstet fra WT C57BI / 6 mus samt fænotypisk WT corticale astrocytter eller NSC med ikke-rekombinerede, floxet onkogene alleler fra betinget PERLE undladt at fremkalde tumorgenese løbet af denne tidsramme (data ikke vist). Langsgående billeddannelse in vivo er blevet anvendt til at overvåge tumor vækstkinetik reaktion på lægemiddelbehandlinger 40. Således TRP - / - luc astrocytter blev injiceret i hjerner immunkompetente syngene kuld og tumorvækst blev bestemt ved seriel bioluminescens billeddannelse. Bioluminescens øget 15 gange i løbet af 16 døgn(Figur 7A og 7B). Vi har vist, at kortikale astrocytter og NSC høstet betinget GEM kan genetisk modificeret, og fænotypisk karakteriseret in vitro og in vivo for definition af genetik og cellebiologi af astrocytoma patogenese og potentielt bruges til præklinisk lægemiddeludvikling.

Figur 1
Figur 1. Skematisk af kortikal astrocyt og NSC høst fra nGEM. Fænotypisk WT kortikale astrocytter og NSC blev høstet fra GEM med betingede onkogene alleler. Genetisk rekombination blev induceret in vitro med en AdCre vektor. Transformerede celler blev fænotypisk karakteriseret in vitro ved forskellige fremgangsmåder og in vivo af orthotopisk injektion i hjernerne af immun-kompetent,syngene kuldsøskende.

Figur 2
Figur 2. Tilsætning af GFAP + astrocytter efter seriepassage in vitro. Repræsentative immunofluorescens billeder, der viser GFAP + astrocytter høstet fra RB1 loxP / loxP GEM hvalpe med NF1 loxP / loxP og / eller PTEN loxP- / loxP hvor genetisk rekombination blev induceret med Ad5GFAPCre og celler passeret X gange (PX) (A). Kvantificering af berigelse af GFAP + astrocytter i panel A. Barer repræsenterer standardafvigelsen 3-24 gentagelser (B). Repræsentant immunofluorescens (øverst) og fase kontrast (nederst) billeder af vedhængende corticale astrocytter høstet fra TgGZT 121 GEM hvalpe som udtrykker T 121 fra GFAP promotoren ved aflevering9 år efter rekombination med Ad5CMVCre in vitro (C). Astrocytter blev kvantificeret som antallet af GFAP + (grønne) celler divideret med det samlede antal af DAPI-farvede kerner (blå) på hver anden passage. Billeder blev taget ved 10X oprindelige forstørrelse (A, C). Skalapanelerne repræsenterer 100 um (A, C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. WT og rekombineret NSC høstet fra TRP - / - GEM. Repræsentative fasekontrast billeder af fænotypisk WT (øverst) og TRP - / - (nederst) NSC dyrket som neurosfærer in vitro (A). Repræsentant immunfluorescensfarvning til T 121 (grøn) og Sox2(Rød) ekspression i WT (øverst) og TRP - / - (nederst) neurosfærer (B). Skalapanelerne repræsenterer 100 um (A, B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Karakterisering af corticale astrocytter in vitro. Vækst af WT og TR kortikale astrocytter blev bestemt ved at tælle celler på dag 1-7 (A). Relativ optiske densitet (OD) af WT og TR kortikale astrocytter blev bestemt ved MTS (B). Relativ vækst i WT og rekombineret RB1 - / -; NF1 - / -; PTEN +/- (RbNP +/-) astrocytter blev bestemt af MTS (C). Luminescens af forældremyndighed TRP - / - og Luciferase udtrykker TRP - / - astrocytter (TRP - / - luc) (D). Relativ OD af TRP - / - astrocytter behandlet med PI103 i 5 dage som bestemt ved MTS (E). Spredning og dosis-respons blev beregnet ved hjælp af den eksponentielle vækst ligning i GraphPad Prism 5. Barer repræsenterer standardafvigelsen fra 6 gentagelser pr tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. In vivo-gliomagenesis. Repræsentant H & E farvet sektion af en U87MG xenograft viser diskrete tumor margener (A). Repræsentant H & E farvet sektion af en TRP - / - allotransplantat viser diffus invasion af normal hjerne (B). Skalapanelerne i venstre og højre H & E billeder udgør 1 mm og 100 um, hhv. Tumor blev bestemt ved analyse af H & E farvede sektioner af formalinfikserede, paraffinindlejrede hjerner fra immun-kompetente, syngene kuld injiceret med 10 5 TRP - / - astrocytter og aflivet ved 5 dages intervaller efter injektion. (C). Kaplan-Meier-overlevelse analyse af TRP - / - allotransplantat mus i alderen morbiditet viser en median overlevelse på 22 dage (D).

Figur 6
Figur 6. Immunofluorescens af TRP +/- NSC allografter. Repræsentative immunofluorescens billeder viser, at TRP +/- NSC injiceret i hjerner af immun-kompetente, syngene kuld udtrykker T 121 (grøn) og Sox2 (hvid) og formere sig, som bestemt ved Edu (rød) inkorporering. Mus blev gennemskyllet med Edu og aflivet 6 uger efter injektion, og deres hjerner perfunderet med paraformaldehyd. Målestokken repræsenterer 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. Langsgående billeddannelse af TRP - / - Luc allotransplantater. Repræsentative bioluminescens billeder (A) og kvantificering af luciferase flux over tid (B) viser væksten af TRP - / - allotransplantater i immun-kompetente, syngene mus injiceret med 10 5 TRP - / - luc corticale astrocytter og afbildes på de angivne dage post injektion.g "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Genotype Udpladningseffektivitet (%) SEM
WT 0 0
T 1.03 0.15
TRP - / - 6.40 0.83

Tabel 1. Kolonidannelse af corticale astrocytter. WT T og TRP - / - corticale astrocytter blev udpladet i tre eksemplarer på 4.000, 2.000 og 250 celler / brønd hhv. Kolonier blev farvet med krystalviolet 14 dage efter udpladning, afbildes, og counted hjælp ImageJ. Udpladningseffektivitet blev beregnet som antallet af kolonier divideret med antallet af udpladede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest kritiske trin for at sikre korrekt høst og dyrkning af corticale astrocytter er 1) at udskære cortex uden at væv under corpus callosum, 2) at fjerne meninges, 3) til grundigt at adskille celler, og 4) for at berige for GFAP + astrocytter. Selvom vi brugte mekanisk (rysten) og genetiske (begrænsning af genetisk rekombination med en Ad5GFAPCre vektor eller udnyttelse af en dominerende transformerende transgen (TgGZT 121) under GFAP promotor kontrol) metoder til at berige for GFAP + astrocytter, har andre teknikker blevet anvendt til at oprense kortikale astrocytter. For eksempel kan kontaminerende mikroglia fjernes ved at behandle konfluente kulturer med en mitotisk inhibitor efterfulgt af L-leucin-methylester 47. Morfologi og udtryk profiler af astrocytter mekanisk rensede og dyrket i serum-holdige medier adskiller sig fra akut isolerede astrocytter med den tidligere hypotetiskZed at repræsentere enten mere umodne astrocytiske celler eller en reaktiv astrocyt fænotype 48,49. For nylig er en immunopanning metode blevet udviklet til prospektivt rense kortikale gnaver astrocytter og deres udtryk profiler tættere efterlignede akut oprensede astrocytter, når de dyrkes i vækstfaktor-suppleret, serum-frie medier 49. Virkningen af ​​den konventionelle, mekaniske metode kortikal astrocyt berigelse og kultur versus mere nyligt udviklede immunopanning metode på fænotyperne undersøgte heri fortsat er uklare. Uanset den anvendte metode er det vigtigt at berige for GFAP + corticale astrocytter at fastlægge de fænotypiske konsekvenser af onkogene mutationer specifikt inden for denne celletype.

Kritiske trin til høst NSC er 1) til præcist lokalisere SVZ, 2) for at minimere skader på SVZ under dissektion, og 3) at filtrere celler efter dissociation før plating. PreciSE NSC dissektion teknik er nødvendig for at finde og høste SVZ. Fordi NSC vokse i suspension kultur, er det vigtigt at filtrere cellesuspensionen efter dissociation at reducere mængden af ​​flydende rester. Selvom vi udnyttet vækst i SCM at selektere for NSC kan NSC være fremadrettet isoleres ved fluorescens-aktiveret cellesortering af SVZ vævshomogenat 50. Efter induktion af genetisk rekombination in vitro, er det vigtigt at overvåge cellulære karakteristika kortikale astrocyt og NSC kulturer tværs passager. Fordi vi ikke fremadrettet berige for astrocytter eller NSC under væv høst, vi serielt overvåget berigelse og kvantificeret renhed celletype af interesse ved immunfluorescensfarvning med kendt celletypespecifik markører (GFAP for astrocytter, Sox2 til NSC). Derudover anbefaler vi systematisk overvågning af de forventede signalsystemer konsekvenser af onkogene mutationer både før og ved hver passage efter Cre-mægled rekombination ved immunoblotting og fænotypisk karakterisering celler tidligst passage, hvor renhed er maksimeret og mutation induceret signalering ændringer stabiliseres.

En vigtig overvejelse i at udnytte primære cellekulturer er deres iboende replikativ kapacitet og den fænotypiske virkning af de inducerede mutationer. Fænotypisk WT murine astrocytter har begrænset replikationskapacitet og kan kun passeres 3 - 4 gange i kultur før de undergår replikation ældning 31. Desuden har mange cancer associeret mutationer, især i MAPK pathway-gener, årsag onkogen-induceret degeneration in vitro 51. Således, hvis de inducerede mutationer ikke udødeliggøre celler og beskytte dem mod onkogen-induceret aldring, kan de ikke seriel passage til fænotypisk karakterisering in vitro. Virale oncoproteiner såsom HPV E6 / E7 og SV40-stort T-antigen er blevet ekstensivt anvendt til at udødeliggøre mange menneskers og muRine celletyper i kultur, herunder astrocytter 13,26,30. Vi har tidligere vist, at fjernelse af G1 / S cellecyklus checkpoint med T var tilstrækkelig til at udødeliggøre corticale astrocytter, men ikke tilstrækkelig til at forårsage dødelige astrocytomer in vivo. I modsætning hertil aktivering af MAPK og PI3K-signalering TRP - / - astrocytter førte til dannelsen af GBM i ortotopisk allotransplantat modelsystem 30. Således virkningerne af T, R, og P mutationer på murin astrocyt transformation in vitro som defineret i kolonidannelse assays korrelerede med in vivo tumorigenese i ortotopisk allotransplantater.

Ligesom alle modeller, som kræver kirurgisk implantation af tumorceller, orthotopisk injektion af transformerede, nGEM celler i syngene mus hjerner vil fremkalde et akut sår respons, betegnet reaktiv gliose. I løbet af denne reaktion, neurale celler, herunder astrocytter, oligodendrocyt stamfader (NG2 +) glia, og mikroglia, proliferspiste og få en mere primitiv differentiering tilstand, hovedsagelig som reaktion på udskilte proteiner som Sonic pindsvin 52,53. Men den proliferative fase af reaktiv gliose i respons på stikke sårdannelse er relativt kort, typisk en uge 53. Vi har tidligere vist, at injektion af TRP - / - astrocytter effektivt inducerer tumorgenese løbet af denne tidsramme, hvilket giver lav kvalitet astrocytomer der ofte kommer frem til at high-grade astrocytomer, herunder GBM. I modsætning hertil injektion af T eller TP - / - astrocytter sjældent udvikle sig til lav-grade astrocytomer på 1-3 uger efter injektion, og disse tumorer ikke at gå videre til high-grade astrocytomer 30. Desuden injektion af fænotypisk vildtype corticale astrocytter og NSC alene ikke fremkalde tumorigenese (data ikke vist). Vi fandt, at TRP - / - allotransplantat- vækst eksponentielt stiger 2-3 uger efter injektion, en tid, i hvilken den proliferative fase reagereive gliose er ophørt (figur 5 og 7). At redegøre for potentielle microenvironmental indflydelse på tumorgenese efter injektion af transformerede, nGEM celler i syngene mus hjerner, især i den proliferative fase af reaktiv gliose, anbefaler vi udfører kontrol injektioner af fænotypisk WT kortikale astrocytter eller NSC, når de efterforsker nye kombinationer af ikke-rekombinerede, floxet onkogene alleler. Vi anbefaler også overvåge effektiviteten af tumorigenese af både fænotypisk WT og transformerede (rekombineret) celler med ugentlige intervaller i løbet af den første måned efter injektionen, som vi tidligere har beskrevet 30.

Gennem genmanipulation af enten de injicerede celler eller allotransplantat værten selv kan nGEM astrocytom modelsystem anvendes til at modellere mange aspekter af astrocytoma patogenese, herunder tumor-stroma interaktioner. Som et eksempel, vi manipuleret TRP - / - kortikal astrocytes til at udtrykke luciferase at definere tumor vækstkinetik in vivo (figur 7). Alternativt kunne nGEM celler genetisk modificeret til at udtrykke et fluorescerende protein og orthotopisk injiceret i hjerner af perle med fluorescens-mærkede neuroner eller vaskulatur at definere samspillet mellem tumorceller og normale hjerneceller 54. Den microenvironmental indflydelse hjerne region eller udviklingsmæssige alder på gliomagenesis kan bestemmes ved orthotopisk injicere nGEM celler på forskellige steder eller i forskellige ældre mus. Selv korte tumor ventetid og overlevelse er til gavn for præklinisk test af lægemidler, kan hurtige udvikling tumor ikke være ideelt at modellere nogle aspekter af astrocytoma patogenese, herunder malign progression, invasion, og tumor-stomi interaktioner. Overlevelse af nGEM allotransplantat værter let kan manipuleres ved at ændre antallet af injicerede celler og systematisk overvågning af tumor penetrans og ventetid 30.

Menneskelige astrocytomer er genomisk komplekse og udviser omfattende intra og inter-tumor heterogenitet 5-7,55,56. Potentielle kilder til denne forskellighed omfatter somatiske mutationer, som initierer tumorigenesis, mutationerne erhvervet under den evolutionære proces af malign progression, og det udviklingsmæssige potentiale i de celler, hvori disse mutationer forekomme. Stor skala sekventering projekter har identificeret mange astrocytom-associerede mutationer og deres mønstre af samtidig forekomst 7. Disse undersøgelser har påberåbt bioinformatiske algoritmer til at identificere hyppigt forekommende mutationer og til at udpege mutationer, som sandsynligvis onkogenisk, dvs. "førerens mutationer", som initierer tumorgenese eller køre malign progression. Men den onkogene potentiale mange af disse mutationer, og deres potentielle celletype specificitet, er ikke blevet systematisk undersøgt i modelsystemer. Vi foreslår, at nGEM modeller utilizing kortikale astrocytter og NSC som beskrevet her, såvel som andre neurale celletyper, der kan oprenses og dyrkes i kultur, giver et alsidigt system til at udføre sådanne undersøgelser. Tilstrækkelighed og nødvendighed for omdannelse af nye ansøgerlande mutationer identificeret gennem store skala sekventering projekter kan derefter systematisk undersøgt ved anvendelse af traditionel genetisk GAIN- og tab af funktion tilgange med specifikke nGEM celletyper huser fælles co-forekommende mutationer i centrale GBM veje, for hvilke betinget GEM eksisterer 5. Vi foreslår desuden, at paneler af nGEM huser forskellige kombinationer af mutationer i flere neurale celletyper vil være nyttig i modellering af genomisk heterogenitet af menneskelige astrocytomer. Derudover kan nGEM astrocytom modeller med kortikale astrocytter og NSC afledt betinget PERLE give en medgørlig model for præklinisk udvikling af lægemidler, fordi indledende in vitro-test af både mono- og kombinationsbehandlinger kanudføres i disse celler til at dirigere mere effektiv in vivo-test af lægemidler i immunkompetente, syngene mus. Desuden kan immunmodulerende og stroma-rettede laegemidler afprøves i nGEM astrocytom modeller med immunkompetente, syngene allotransplantat værter. Således nGEM astrocytom modeller med transformerede kortikale astrocytter og NSC er en værdifuld model for at fastslå de funktionelle konsekvenser af kombinationer af onkogene mutationer i specifikke celletyper og kan være nyttig i prækliniske forsøg lægemiddel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Tags

Neuroscience astrocytom kortikale astrocytter gensplejsede mus glioblastom neurale stamceller ortotopisk allograft
Modeling astrocytom Patogenese<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em&gt; Brug Kortikal Astrocyter eller neurale stamceller fra Betinget, gensplejset Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, … More

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter