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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Modellierung Astrozytom Pathogenese Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Astrozytome sind die häufigsten primären Hirntumoren und Glioblastom (GBM), ein Astrozytom Grad IV, ist die häufigste und aggressive Subtyp mit einer medianen Überlebensrate von 12-15 Monaten 1,2. Invasion diffuse Astrozytome, insbesondere GBM, schließt die vollständige chirurgische Resektion, begrenzt die Wirksamkeit der adjuvanten und führt zwangsläufig zu Nachbehandlung Wiederholung 3. Patienten, die ursprünglich vorhanden entweder mit de novo (primären) GBM oder mit niedrigeren Astrozytomen, die unweigerlich fortschreitet, um (sekundär) 4 GBM. GBM ist genomisch heterogen und durch sich gegenseitig ausschließende und Co-vorkommende Mutationen in Genen, die drei Hauptsignalwege geregelt gekennzeichnet: der G 1 / S (Rb) Zellzyklus-Kontrollpunkt, Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) und TP53 Pfade 5-7. GBM besteht aus vier Subtypen mit unterschiedlichen genomischen Expressionsprofile, die verschiedenen Hirnzelltypen ähneln, was darauf hindeutet, dass GBM-Subtyp ist beeindurch seine Ursprungszelle 6,8,9 beeinflusst. Besser Astrozytom Modelle erforderlich sind, um die Rolle von spezifischen Kombinationen von Mutationen in bestimmten Zelltypen während Astrozytom Pathogenese definieren. Nutzt diese Modelle für effizientere präklinischen Arzneimittelentwicklung wird letztlich helfen, Patienten zu verbessern. Aktuelle Astrozytom Modelle zählen etablierte humane Zelllinien, Patienten abgeleitet Xenografts (PDX), gentechnisch veränderte normalen menschlichen Astrozyten und neuronalen Stammzellen (NSC), und gentechnisch veränderte Mäuse (GEM) 10-14. Wir entwickelten eine alternative, nicht-Keimbahn-GEM (Ngem) Modell 15 Nutzung von Primärgehirnzellen - kortikalen Astrozyten und NSC - von GEM beherbergen verschiedene Kombinationen von floxed onkogenen Allele geerntet. Das Ziel war, Astrozytom Modelle mit genetisch definierten Zellen, die phänotypisch sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt charakterisiert werden konnte und möglicherweise für die präklinische Entwicklung von Arzneimitteln in i erzeugenmmune kompetenten Mäusen.

Etablierten humanen Zelllinien sind die am häufigsten verwendete Modell der Pathogenese Astrozytom und Drogenantwort in vitro und in vivo. Sie sind technisch unkompliziert, überall verfügbar und wurden Kinetik und Tumorbildung bei orthotopen xenografting in immundefizienten Mäusen 10,11,16-18 definiert . Ihre Nachteile sind die Unfähigkeit, etablierte Zelllinien von Low-grade-Astrozytome erzeugen, die Begrenzung Studie nur auf High-Astrozytome; Mangels einer definierten Ursprungszelle; die Anwesenheit von komplexer genomischer Anomalien, häufig mit genomischen Profile, die sich deutlich von der ursprünglichen Patientenprobe unterscheiden; und die Anfälligkeit für phänotypische und genotypische Drift während Serienkultur in Serum 11,17,19-22. Die phänotypische Folgen der einzelnen onkogenen Mutationen in etablierten humanen Zelllinien können GBM durch die Vielzahl von Anomalien, die tatsächlich vorhanden sind, die oft entgegensteht eluc maskiert werdendierung der direkten Genotyp-Phänotyp-Folgen.

PDX durch subkutane Gang von Patienten isoliert Astrozytomzellen in immundefizienten Mäusen oder durch die Kultur als nichthaft Sphäroide in definierten, serumfreien Medium vor der orthotopen Injektion in das Gehirn von immundefizienten Mäusen 12,23 erzeugt. PDX genauer Aufrechterhaltung der genomischen Landschaft der menschlichen Astrozytomen, aber ähnlich etablierten humanen Zelllinien kann die phänotypische Wirkung einzelner onkogenen Mutationen aufgrund ihrer genomischen Komplexität 19,24 maskiert werden. Um die phänotypischen Auswirkungen von spezifischen Mutationen onkogenen insbesondere als Reaktion auf neue Therapien zu definieren, werden Platten aus etablierten humanen Zelllinien oder PDX häufig verwendet, um Genotyp-Phänotyp-Korrelationen zu etablieren, zeigen Generalisierbarkeit und die Wahrscheinlichkeit von Zelllinie spezifische Effekte zu minimieren. Während PDX genau rekapitulieren die histopathologische Kennzeichen der menschlichen Astrozytomen, incLuding Invasion orthotopen Xenografts von etablierten humanen Zelllinien in der Regel nicht 21,23,25. Zusätzlich normalen menschlichen Astrozyten und NSC wurden mit definierten onkogenen Mutationen gentechnisch zu Astrozytom Tumorgenese in vitro und in vivo 13,14,26 modellieren. Diesen Zellen fehlt die genomische Komplexität der etablierten humanen Zelllinien und PDX und Menschen Astrozytom Histopathologie genau rekapitulieren, erfordern aber xenografting in immundefizienten Nagern in vivo. Da alle menschlichen Zellmodelle erfordern immundefiziente Nager Hosts immunvermittelte Abstoßung von Xenotransplantaten zu verhindern, sind diese Modelle nicht den nativen Tumor-Stroma-Interaktionen einer syngenen System rekapitulieren und es fehlt ein intaktes Immunsystem Begrenzungs präklinischen Untersuchung von Stroma-bezogenen und immunmodulatorischen Therapien 10,11.

GEM Genehmigung Untersuchung der phänotypischen Folgen der vorgegebenen Kombinationen von onkogenen mutagen in vivo während der Tumorgenese in situ. Während nicht-bedingten GEM Mutationen in allen Geweben während der Entwicklung haben bedingten GEM onkogenen Allele, die Targeting von Mutationen durch Beschränkung Cre-vermittelte Rekombination an spezifische Zelltypen durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren 10,11,15,18 ermöglichen floxed. Bedingte Astrozytom GEM wurden verwendet, um die funktionelle Rolle von onkogenen Mutationen in verschiedenen Zelltypen in einer intakten Gehirn 11 zu erläutern. Das präklinische Nützlichkeit in situ gliomagenesis mit bedingtem GEM wird durch eine Anzahl von Faktoren, einschließlich 1) das Fehlen eines in vitro-Korrelat, 2) Schwierigkeiten bei der Erzeugung von großen Kohorten von Mäusen mit komplexen Genotypen, 3) mit langer Latenzzeit von in situ Tumorentwicklung limitiert , 4) und stochastische Tumorprogression. Da in situ Tumorentstehung fehlt eine entsprechende in-vitro-Modell, können Drogentests in vitro nicht w durchgeführt werdenit herkömmlichen bedingten GEM-Modelle. Im Gegensatz zu anderen Krebsarten, sind bedingte GEM-Modelle von Astrozytomen selten von einzelnen onkogenen Mutationen 11 induziert. So werden komplexe Systeme benötigt, um Zucht bedingte GEM mit mehreren onkogenen Mutationen zu erzeugen. Darüber hinaus tritt Astrozytom Initiierung mit variabler Penetranz nach einer langen Latenzzeit in diesen Modellen, während das Fortschreiten zu hohen Astrozytomen erfolgt in der Regel in einer nicht gleichmäßigen, stochastische Weise und führt zu Tumoren mit komplexen genomischen Landschaften und das schnelle Wachstum Kinetik 27 letztlich 28. Die variable Penetranz und stochastische Natur der malignen Progression in bedingten GEM Modelle erfordert, dass einzelne Mäuse durch Röntgenaufnahmen untersucht, um das Vorhandensein und die Lage von hochwertigen Astrozytome vor ihrer Einschreibung in präklinischen Studien nachzuweisen. Zusammengenommen sind diese Einschränkungen behindern die Erzeugung und Prüfung der großen Kohorten von bedingten GEM für PR erforderlicheClinical Drogentests.

Die RCAS-TVA GEM-System, das Vogelgrippe retroviralen (RCAS)-Vektoren verwendet, um GEM entwickelt, um die viralen Rezeptor (TVA) auf bestimmten neuronalen Zelltypen infizieren auszudrücken, wurde ausgiebig genutzt, um die Tumorgenese Astrozytom 11 zu modellieren. Im Gegensatz zu bedingten GEM, ermöglicht dieses Modell die Systemeinführung von mehreren onkogenen Mutationen in bestimmten Zelltypen ohne das Erfordernis für komplexe Systeme Zucht. Es wird jedoch durch variable Penetranz der Anforderung aktiv teilenden Zellen, die virale Integration zu erreichen, und die zufällige Insertion von Transgenen in das Wirtsgenom 29 begrenzt.

Nicht-Keimbahn-GEM (Ngem) Modelle, die Zellen von GEM geerntet zu nutzen, werden immer wichtiger, weil sie zu überwinden viele der Einschränkungen von anderen Modellsystemen 15. Die Rolle der Einleitung Zelltyp und Co-auftretende Mutationen in Astrozytom Pathogenese sind schwer davon abhaltenMine verwendet etablierten humanen Zelllinien oder GBM PDX, weil sie aus im Endstadium Tumoren, die umfangreichen genetischen Mutationen in undefinierten Zelltypen während des Verlaufs der malignen Progression angesammelt haben, abgeleitet. Im Gegensatz dazu können alle Sorten von Astrozytomen mit Ngem durch Induzieren definierten genetischen Mutationen in spezifischen gereinigten Gehirnzelltypen 11,30 modelliert werden. Somit kann der Einfluss der spezifischen genetischen Mutationen und Zelltyp auf zelluläre und molekulare Phänotypen in vitro und in vivo bestimmt werden. Ähnlich etablierten humanen GBM-Zelllinien, können erste in-vitro-Wirkstoffprüfung mit Ngem verwendet werden, um Medikamente für in vivo-Tests unter Verwendung der gleichen Zellen zu priorisieren. Tumorentstehung in vivo kann dann durch Allotransplantation Ngem Zellen orthotopisch in die Gehirne von immunkompetenten syngenen Wurf 30 bestimmt werden. Diese orthotopen Allograft-Modelle in-vivo-Tests nicht nur von konventionellen zytotoxischen eine Genehmigung dahernd zielgerichtete Therapien, aber immunmodulatorischen und Stroma-zielgerichtete Therapien auch. Schließlich kann die Rolle der Mikroumgebung auf Tumor Initiation und Progression durch den Vergleich der Ergebnisse zwischen Ngem und GEM herkömmlichen Modellen unter Verwendung der gleichen Mutationen in den gleichen Zelltypen bestimmt werden.

Wir und andere haben Astrozytom Ngem entwickelt unter Verwendung von primären Zellen - Astrozyten, NSC oder Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) - von GEM 30-34 geerntet. Der Grund für die Entwicklung von einem Astrozytom Ngem war es, ein Modell, um die phänotypischen Folgen von onkogenen Mutationen in spezifischen Zelltypen, die möglicherweise für präklinischen Tests in vitro und in vivo in immunkompetenten Tieren verwendet werden könnte, zu bestimmen, zu erstellen. Wir ernteten phänotypisch WT kortikalen Astrozyten und NSC aus Nicht-Cre exprimieren, bedingte GEM auf einem> 94% C57 / Bl6 Hintergrund mit floxed RB Weg gepflegt - Rb1 loxP / loxP oder TgGZT121 - und floxed RTK / RAS / PI3K-Weg - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP - Gene in verschiedenen Kombinationen 35-39. Wir induzierte genetische Rekombination in vitro unter Verwendung von adenoviralen Vektoren, die Cre-Rekombinase codiert. Da kortikalen Astrozyten Ernten ein Gemisch von Zelltypen, verwendeten wir Ad5GFAPCre Vektoren oder dominant onkogenen Transgene, wie TgGZT 121 von der menschlichen GFAP-Promotor angetrieben wird, um für GFAP + kortikalen Astrozyten in diesen Kulturen zu bereichern. Wir definierten die phänotypischen Auswirkungen der G 1 / S (Rb), MAPK und PI3K Mutationen in kortikalen Astrozyten und NSC in vitro und in vivo. MAPK und PI3K-Weg-Aktiv G1 / S-defekt Astrozyten molekular nachgeahmten menschlichen proneurale GBM und auf orthotope Injektion gebildet Tumoren in einer vordefinierten Stelle mit einheitlichen Wachstumskinetik, kurze Latenzzeiten und der histopathologischenal Markenzeichen der menschlichen GBM 30. Längs Überwachung von Tumorwachstum in vivo unterstützt präklinischen Drogentests durch Normalisierung der Behandlung Kohorten und quantitative Analyse von Tumorwachstum in Reaktion auf die Behandlung 40. Wir bestimmten Tumorwachstum Kinetik durch Längs Biolumineszenz-Bildgebung von Mäusen mit Luciferase kortikalen Astrozyten injiziert. Daher kortikalen Astrozyten und NSC aus bedingtem GEM abgeleitet eine gefügig Modellsystem für die Definition der funktionellen Konsequenzen Astrozytom-assoziierte Mutationen und einem potenziellen Modellsystem für die präklinische Wirkstoffentwicklung.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden von der Universität von North Carolina Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Die Züchtung kortikale Astrozyten von neugeborenen Mäusen

  1. Vorbereitung
    1. Zerknittern 2-3 heikle Aufgabe Gewebe aufnehmen und in den Boden eines Kolbens gegeben, enthaltend 70% Ethanol. Zeigen Dissektionsscheren, gebogenen Pinzette und 2 Paar gerade Mikropinzette in diesen Kolben. Die Gewebe werden verwendet, um zu vermeiden, das Biegen der Mikropinzette.
    2. 1 ml HBSS auf eine 60 mm-Gewebekulturschale. Bereiten Sie eine separate Schüssel für jedes Tier und pflegen Gerichte auf Eis.
    3. Betäuben Tiere pro institutionelle Regelungen.
    4. Warm 7 ml DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin (komplettem DMEM) für jedes Tier in einem 37 ° C Wasserbad. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 1.1.1-1.1.4 dauert ~ 15 min.
  2. Gewebe Ernte
    1. Opfern neonatalen Maus (Tag 1-3) pro Institutionalen Vorschriften.
    2. Entfernen Dissektionsscheren aus Ethanol, damit sie abtropfen, und machen einen sagittalen Schnitt in der Haut über dem Schädel aus dem Rückenmark in die Nase.
    3. Einen Schnitt im Schädel entlang der Pfeilnaht ausgehend von dem Rückenmark und an den Riechkolben erstreckt. Achten Sie darauf, die Scherenspitzen in der Nähe der Innenfläche des Schädels zu halten, um Hirngewebe Schaden zu minimieren.
    4. Verwendung einer gebogenen Pinzette vorsichtig abziehen jeder Hemisphäre des Schädels seitlich vom Gehirn.
    5. Verwendung von geraden Mikro Pinzette vorsichtig entfernt kneifen die dorsale Teil jeder kortikalen Hemisphäre und legen Sie sie in die Gewebekulturschale enthält HBSS. Achten Sie darauf, das Kleinhirn und Riechkolben zu vermeiden. Nehmen Sie keine Gewebe unterhalb des Corpus callosum.
    6. Mit einem Binokular und 2 Paar Mikropinzette, entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute von jeder kortikalen Hemisphäre. Liefert die Gewebekulturschale zu Eis bis Anfang Gewebe homogenization.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.6 für jedes zusätzliche Tier. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 1.2.1-1.2.7 dauert ~ 30 min.
  3. Gewebehomogenisierung
    1. Mit einem sauberen Rasierklinge fein würfeln kortikalen Hemisphären und bewegen Sie die Platte an einer Gewebekultur Kapuze.
    2. Übertragen Sie die gewürfelte Gewebe in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit 1 ml eiskaltem HBSS und Transfer zum Rohrgewebe enthalten.
    3. Warten Sie, bis Gewebe setzt sich am Boden der Röhre, dann vorsichtig überschüssige HBSS mit einer Pipette.
    4. 2 ml Raumtemperatur Trypsin / EDTA. Pipette ~ 10x mit einer 1 ml Pipette weiter distanzieren Zellen.
    5. Inkubieren der Zellsuspension bei 37 ° C für 15 - 20 min. Sorgfältig durch Umdrehen mischen alle 5 min.
    6. 3 ml komplettem DMEM Trypsin zu hemmen. Pipette ~ 10x mit einer 1 ml-Pipette, um die Lösung zu mischen.
    7. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    8. Entfernender Überstand wurde mit einer 1 ml Pipette. Sie saugen das Medium nicht, weil das Pellet kann locker sein.
    9. Das Pellet in 4 ml 37 ° C DMEM abzuschließen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 75 cm Schraubverschluss Zellkulturflasche. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 1.3.1-1.3.9 dauert ~ 50 min.
    10. Etwa 16 Stunden nach der Ernte Astrozyten, waschen Sie die Kolben mit 4 ml 37 ° C HBSS, dann 4 ml 37 ° C DMEM abzuschließen. Pflegen Sie die kortikale Astrozyten bei 37 ° C in 5% CO 2. HINWEIS: Der Reinigungsschritt ist wichtig für die Entfernung von nicht-adhärenten Zellen und Zelltrümmer aus dem Kulturschale.
    11. Wenn die Kultur ist ~ 95% konfluent, schütteln über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2, entfernen Sie die Medien mit den abgelösten Zellen, dann die Kolben mit 4 ml 37 ° C HBSS waschen. 4 ml von 37 ° C auf 37 ° C zu vervollständigen und zu halten DMEM Zellen in 5% CO 2. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um Kulturen für kortikale Astrozyten zu bereichern, wie gefährdend Mikroglia undOligodendrozyten-Vorläuferzellen zu trennen, und mit diesem Verfahren aus der Kultur 41 entfernt.
    12. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.11 für jedes Tier.
  4. Induktion der genetische Rekombination
    1. 24 Stunden nach Abschluss von Schritt 1.3.11, ersetzen Sie das Medium mit 2 ml 37 ° C DMEM abzuschließen. 1 ml 37 ° C SCM mit 1 ul> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre oder Ad5GFAPCre. Inkubation für 6 Stunden bei 32 ° C in 5% CO 2 .CAUTION: Verwenden BSL2- Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit rekombinanten Adenovirus.
    2. Entfernen Sie den Virus enthaltenden Medien und fügen 37 ° C komplett DMEM ohne Virus zu den kortikalen Astrozyten. ACHTUNG: Verwenden Sie BSL2- Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit rekombinanten Adenoviren und entsorgen Sie die virushaltige Medien pro institutionelle Regelungen. HINWEIS: Für 5 Astrozytenkulturen Schritte 1.4.1 - 1.4.3 dauert ~ 15 min mit Ausnahme des 6-stündigen Inkubation.
    3. Erweitern kortikalen Astrozyten Kulturen invitro und in-vivo-Charakterisierung. HINWEIS: Bestimmen Sie die Anwesenheit von Mutationen nach Cre-Rekombination durch PCR mit spezifischen Gen für die rekombiniert oder durch Immunoblots entweder für die spezifische mutierte Protein oder seine Signal Folgen Primer. Die phänotypische Stabilisierung kortikalen Astrocytenkulturen nach Cre-Rekombination benötigte Zeit hängt von den verwendeten Mutationen sein und muss empirisch (Figur 2) bestimmt werden.

2. Kultivierung Neuronale Stammzellen aus neugeborenen Mäusen

  1. Vorbereitung
    1. Vor dem Start der Präparation herzustellen 4 ml Aufschlußlösung pro Gehirn durch Zugabe von 3,1 mg Papain und 1,3 mg Cystein zu 4 ml Dissoziation Medium - 98 mM Na 2 SO 4, 30 mM K 2 SO 4, 5,8 mM MgCl 2, 0,25 mM CaCl 2 , 1 mM HEPES (von 1 M HEPES pH 7,4 Lager) 20 mM Glukose, 0,001% Phenol rot, und 0,125 mM NaOH. Zugabe von Papainund Cystein der Dissoziation Medium wird die Lösung gelb.
    2. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 15 min. Regelmäßig mischen durch Umdrehen.
    3. Mit 0,1 M NaOH tropfenweise, bis die Verdauung wieder in Lösung rot leuchten.
    4. In einem Gewebekulturabzug, Sterilfilter der Aufschlußlösung mit einem Spritzenfilter (0,22 um Porengrße). Halten Sie die Aufschlusslösung auf Eis.
    5. Vorbereitung 50 ml Stammzellmedium (SCM) durch Mischen von 44,5 ml NSC Basal Medium, 5 ml NSC ergänzen, 0,5 ml Penicillin-Streptomycin, 50 ul 0,2% Heparin, 10 ul 100 ug / ml EGF und 10 ul 100 ug / ml bFGF. SCM für 1 Woche stabil, wenn bei 4 ° C gelagert.
    6. Vorbereitung abgeschlossen HBSS (cHBSS) durch Mischen von 50 ml 10x HBSS, 1,25 ml 1 M HEPES (pH 7,4), 15 ml 1 M D-Glucose, 5 ml 100 mM CaCl 2, 5 ml 100 mM MgSO 4, 2 ml 1 M NaHCO 3. Bringen des Gesamtvolumens auf 500 ml mit ddH 2 O.
    7. Filter sterilisieren cHBSS Witzha 0,2 um Porengröße Filter und bei 4 ° C.
    8. Zerknittern 2-3 heikle Aufgabe Gewebe aufnehmen und in den Boden eines Kolbens gegeben, enthaltend 70% Ethanol. Zeigen Dissektionsscheren, gebogenen Pinzette, und 2 Paar gerade Mikropinzette in diesen Kolben. Die Gewebe werden verwendet, um zu vermeiden, das Biegen der Mikropinzette. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 2.1.1-2.1.8 dauert ~ 45 min.
  2. Gewebe Ernte
    1. Opfern Neugeborenen (Tag 1-3) Mäuse pro institutionelle Regelungen.
    2. Entfernen Dissektionsscheren aus dem 70% Ethanol, damit sie abtropfen, und machen einen sagittalen Schnitt in der Haut über dem Schädel aus dem Rückenmark in die Nase.
    3. Einen Schnitt im Schädel entlang der Pfeilnaht ausgehend von dem Rückenmark und an den Riechkolben erstreckt. Achten Sie darauf, die Scherenspitzen in der Nähe der Innenfläche des Schädels zu halten, um Hirngewebe Schaden zu minimieren.
    4. Verwendung einer gebogenen Pinzette, löst sanft jeder Hemisphäre des Schädels seitlich vomGehirn.
    5. Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Gehirn und in eiskaltem cHBSS.
    6. Mit Hilfe eines Dissektionsmikroskop, entfernen Sie vorsichtig Hirnhäute aus dem Gehirn mit feinen Sezierung Werkzeuge.
    7. Legen Sie das Gehirn auf seiner Bodenfläche und entfernen Kleinhirn / Hinterhirn und Riechkolben / frontalen Kortex mit vertikalen (koronalen) schneidet mit einer Größe 11 Skalpell.
    8. Drehen die verbleibende Gehirn um 90 °, um es auf dem Schwanzabschnitt zu platzieren, sodass eine koronare Ansicht des Gehirns. Suchen Sie die lateralen Ventrikel.
    9. Schneiden Sie ein würfelförmigen Abschnitt, der die Subventrikularzone (SVZ).
    10. Übertragen SVZ haltigen Gewebe bis zu einer 60-mm-Gewebekulturschale mit frischem eiskaltem cHBSS und Hackfleisch Gewebe mit Größe 11 Skalpell.
    11. Übertragen Sie die zerkleinerte Gewebe in eine sterile 15-ml-Tube. Das Röhrchen auf Eis.
    12. Waschen Sie die Petrischale mit 1-2 ml eiskaltem cHBSS. Übertragen Sie die Waschlösung in das Röhrchen Gewebe enthält.
    13. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1-2.2.12 mit zusätzlichen neonatal Mäusen, falls erforderlich. Übertragen Sie alle 15-ml-Röhrchen zu einer Gewebekultur Haube für den Rest des Protokolls. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 2.2.1 - 2.2.13 dauert ~ 45 min.
  3. Gewebehomogenisierung
    1. Legen Sie die Aufschlusslösung (in Schritt 2.1.1 vorbereitet) in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. Auch, warm 2 ml pro SCM Gehirn in einem 37 ° C Wasserbad.
    2. Den Überstand des zerkleinerten Gewebes entfernen Sie vorsichtig mit einer 1 ml Pipette. Aspirieren nicht.
    3. 2 ml 37 ° C Aufschlusslösung pro 15 ml Tube und vorsichtig mischen durch Umdrehen.
    4. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 15 min. Mischen durch Umdrehen alle 5 min.
    5. Fügen Sie eine weitere 2 ml 37 ° C Aufschlusslösung in jedes Röhrchen und wiederholen Sie Schritt 2.3.4.
    6. Lassen Sie die Zellen auf den Boden des Röhrchens durch die Schwerkraft zu regeln, dann entfernen Sie den Überstand aus verdauten Gewebe unter Verwendung einer 1 ml Pipette.
    7. 2 ml 10 uM E-64 in cHBSS verdünnt und vorsichtig mischen durch Umdrehen.
    8. Lassen Sie die Zellen auf den Boden des Röhrchens durch die Schwerkraft zu regeln, dann entfernen Sie den Überstand aus verdauten Gewebe.
    9. 1 ml 37 ° C cHBSS und homogenisieren mit einer 1 ml-Pipettenspitze (~ 20 Schläge). Vermeiden Sie Luftblasen beim Injizieren Gewebehomogenisierung.
    10. Übergeben Sie die Gewebehomogenat durch ein 40 um Porengröße Zelle Sieb, dann spülen Sie das Sieb mit 5 ml 37 ° C cHBSS.
    11. Zentrifugieren Gewebehomogenat bei 125 × g für 5 min.
    12. Entfernen Sie 95% der Überstand mit einer 1 ml Pipette ohne das Zellpellet zu stören. Sorgfältig resuspendieren Zellpellet in 200 ul 37 ° C SCM mit einer 200 ul Pipettenspitze.
    13. Fügen Sie 1,8 ml 37 ° C SCM und übertragen die Zellsuspension auf eine Vertiefung einer sterilen 6-Well-Platte. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 2.3.1-2.3.14 dauert ~ 75 min.
  4. Neural Stem Cell Culture
    1. Wieder aufzufüllen das Medium nach 3 Tagen durch Zugabe noch 2 ml 37 °C SCM.
    2. Nach 7 Tagen, übertragen Sie die Neurosphären zu einem 15-ml-Tube und lassen Sie die Neurosphären nieder durch die Schwerkraft> 5 min.
    3. Entfernen Sie den Überstand und 2 ml 37 ° C SCM.
    4. Übertragen Sie die Neurosphären zu einer neuen Vertiefung einer 6-Well-Platte.
    5. 2 ml 37 ° C SCM alle 3-4 Tage, und ändern Medium vollständig alle 7 Tage.
    6. Wenn Neurosphären sind> 100 um Durchmesser, sorgfältig distanzieren mit Stamm Zelldissoziationslösung und Ausstrich das NSC bei der gewünschten Zelldichte.
  5. Induktion der genetische Rekombination
    1. 1 ml 37 ° C SCM mit 1 ul> 10 10 pfu / ml Ad5CMVCre oder Ad5GFAPCre zu dem 2 ml SCM aktuell den Zellen. ACHTUNG: Verwenden Sie BSL2- Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit rekombinanten Adenovirus.
    2. Inkubation für 6 h bei 32 ° C in 5% CO 2.
    3. Übertragen SCM mit Neurosphären in einen 15-ml-Tube und lassen Kugeln nieder durch die Schwerkraft für 5 min.
    4. Entfernen des Überstandes zunächst mit einer 1 ml Pipette, dann mit einer 200 ul-Pipette. ACHTUNG: Verwenden Sie BSL2- Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit rekombinanten Adenoviren und entsorgen Sie die virushaltige Medien pro institutionelle Regelungen.
    5. 2 ml 37 ° C SCM ohne Virus an die NSC, dann übertragen auf eine 6-Well-Platte. HINWEIS: Für 5 NSC Kulturen, die Schritte 2.5.1-2.5.5 dauert ~ 15 min mit Ausnahme des 6-stündigen Inkubation.
    6. Am nächsten Tag, wiederholen Sie die Schritte 2.5.1-2.5.5, gefolgt von Neurosphäre Passagieren, wenn notwendig. Die Kugeln können nun für 2-3 Passagen vor In-vitro-Charakterisierung und orthotope Injektion in Mäusegehirnen in vivo erweitert werden. HINWEIS: Bestimmen Sie die Anwesenheit von Mutationen nach Cre-Rekombination durch PCR mit spezifischen Gen für die rekombiniert oder durch Immunoblots entweder für die spezifische mutierte Protein oder seine Signal Folgen Primer. Die phänotypische Stabilisierung der NSC Kulturen nach Cre-Rekombination benötigte Zeit hängt seinvon den verwendeten Mutationen und muß empirisch ermittelt werden (2 und 3).

3. Orthotope Injektion von Zellen Rekombinierte in das Gehirn des Empfängers Iimmunocompetent Mäuse

  1. Herstellung von 5% Methylcellulose
    1. Man löst 5 g 15 cPs Methylcellulose in vollentsalztem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml in einem 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss. Das Pulver langsam unter Rühren bei 4 ° C, um ein Verklumpen zu verhindern. Es kann bis zu 24 Stunden Rühren bei 4 ° C für alle Methylcelluloselösung zu treten, zu berücksichtigen.
    2. Wiegen Sie die Flasche und das Gewicht aufgezeichnet.
    3. Autoklavieren von 5% Methylcellulose-Lösung. Sobald autoklaviert wird die Methylcellulose ein halbfestes Gel geworden.
    4. Wiegen Sie die Flasche und berechnen das Gewicht beim Autoklavieren verloren.
    5. Aseptisch 1 ml sterilem Wasser für jedes Gramm Gewicht verloren.
    6. Auf Eis und 50 ml eiskaltem 2x DMEM. </ Li>
    7. Mischungs über Nacht mit einem Magnetrührer wurden bei 4 ° C ist. Sterile Technik, um die 5% Methylcellulose-Lösung in 20 ml Aliquots aufteilen. Shop Aliquots bei 4 ° C für bis zu sechs Monaten oder bis die 2x DMEM abläuft. HINWEIS: Herstellung von 5% Methylcelluloselösung in Schritten 3.1.1-3.1.7 wurden, 2,5 Tage in Anspruch nehmen ~.
  2. Vorbereitung der kortikalen Astrozyten zur Injektion
    1. Ernte kortikalen Astrozyten bei ~ 90% konfluent.
    2. Zu ernten, absaugen kompletten DMEM und Waschplatten mit dem gleichen Volumen von 37 ° C HBSS.
    3. Fügen Sie genug Trypsin, um die Platte zu bedecken. Vorsichtig kippen und tippen Sie auf die Platte, bis die Zellen beginnen zu lösen.
    4. Trypsin zu inaktivieren, mit einem gleichen Volumen von 37 ° C DMEM abzuschließen.
    5. Übertragungszellen zu einem 50 ml konischen Röhrchen und Waschen der Platte mit dem gleichen Volumen von 37 ° C in vollständigem DMEM 3.2.4 verwendet.
    6. Übertragen Waschmedium in das Röhrchen enthaltenden Zellen. Zentrifuge bei 200 xg für 3 min.
    7. Absaugen supernatant und Zellen in 1 ml 37 ° C zu vervollständigen DMEM.
    8. Zählen Sie die Zellsuspension mit einer Zählkammer oder einem anderen geeigneten Zellzähler, um zu bestimmen Anzahl von Zellen / ul.
    9. Übertragen der gewünschten Anzahl von Zellen in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 200 xg für 3 min.
    10. Die Zellen in 800 ul von 37 ° C zu vervollständigen DMEM. Bestimmen Sie das Volumen des Zellpellets (Gesamtvolumen der Zellsuspension - 800 ul). HINWEIS: Es ist wichtig, um eine genaue Zellkonzentration für die Injektion zu erzielen. Daher muß das Volumen des Zellpellets in diesem Schritt um das Volumen von 5% Methylcellulose zu berechnen, den Schritt 3.2.12 hinzuzufügen bestimmt werden.
    11. Übertragen Zellen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und dann bei 200 xg zentrifugieren für 3 min.
    12. Absaugen Überstand aus dem Zellpellet resuspendieren und kortikalen Astrozyten in dem entsprechenden Volumen eiskalter 5% Methylcellulose (gewünschte Volumen - Volumendas Zellpellet), um die gewünschte Anzahl von Zellen / ul zu erhalten.
    13. Zellen auf Eis legen, bis der Injektion.
    14. Legen Sie eine 250 ul Glasspritze in einem wiederholenden Antigen Spender dann einen stumpfen 18 G Nadel auf die Spritze.
    15. Ziehen Sie den Kolben langsam mit der Nadel in den kortikalen Astrozyten Suspension; Es wird eine Luftblase über den Zellen, die entfernt werden müssen, da Luftblasen komprimiert und vermindern die tatsächlich in das Gehirn eingespritzte Volumen.
    16. Halten Sie die Spitze der Nadel knapp über dem kortikalen Astrozyten Federung und drücken Sie den Kolben in schnell. Die Luftblase wird schneller sein als der Zellsuspension bewegen und wird meist ausgeschlossen werden.
    17. Wiederholen Sie Schritt 3.2.16, bis alle Luftblasen von der Nadel entfernt.
    18. Füllen Sie die Spritze auf etwa ~ 200 ul, dann halten Sie die Nadel und ziehen Sie den Kolben bis zum Anschlag. Kleine Luftblasen kann durch Halten der Nadelspitze und schnelles Drücken der Kolben in etwa 5 entfernt werden0 ul dann langsam zieh die volle Kapazität.
    19. Halten Sie die Spitze aufrecht und wiederholen Sie Schritt 3.2.18 4-5x.
    20. Entsorgen Sie die 18-Gauge-Nadel und passen eine 27 G-Nadel auf die Spritze.
    21. Drücken Sie die Taste auf dem Antigen Spender, bis die Flüssigkeit aus der Nadel ausgestoßen. HINWEIS: Für 1 Astrozyten-Zelllinie, die Schritte 3.2.1-3.2.21 dauert ~ 60 min.
  3. Vorbereitung der NSC zur Injektion
    1. Wenn Neurosphären sind> 100 um im Durchmesser, Transfer zum 15-ml-Röhrchen und lassen Sie die Neurosphären nieder durch die Schwerkraft> 5 min.
    2. Entfernen des Überstandes und distanzieren die Neurosphären mit einer leichten Dissoziation Reagens, wie Stammzellen Dissoziation Lösung oder Accutase nach den Anweisungen des Herstellers oder mit 0,05% Trypsin-EDTA, wie beschrieben 42.
    3. Hemmen die Dissoziation Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers, ohne den NSC zu Serum. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min.
    4. Zähle die Zellen mit einer Zählkammer oder einem anderen geeigneten Zellzähler, um die Anzahl der Zellen / ul zu bestimmen.
    5. Übertragen der gewünschten Anzahl von NSC in eine neue 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min.
    6. Die Zellen in 800 ul von 37 ° C HBSS. Bestimmen Sie das Volumen des Zellpellets (Gesamtvolumen der Zellsuspension - 800 ul). HINWEIS: Es ist wichtig, um eine genaue Zellkonzentration für die Injektion zu erzielen. Daher muß das Volumen des Zellpellets in diesem Schritt um das Volumen von 5% Methylcellulose Berechnung in Schritt 3.3.9 hinzuzufügen bestimmt werden.
    7. Übertragen der Zellen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und dann bei 100 xg für 5 Minuten zentrifugiert werden.
    8. Saugen Sie den Überstand und beenden die Vorbereitung der Zellen für die orthotope Injektion als in 3.2.12-3.2.21. HINWEIS: Für 1 NSC-Zelllinie, die Schritte 3.3.1-3.3.9 dauert ~ 60 min.
  4. Vorbereitung der Maus zur Injektion
    1. Betäuben Empfängertier über eine IP-Injektion von 250 mg / kg Avertin (2,2,2 Tribromethanol) oder 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin pro institutionellen IACUC Richtlinien. HINWEIS: Verwendetes hier sind Mäuse in 3-6 Monaten als Allograft Gastgeber. Mäuse in verschiedenen Altersstufen können verwendet werden, um die Auswirkungen der Mikroumgebungsentwicklungs Gehirn Alter auf die Tumorentstehung zu untersuchen.
    2. Rasur der Kopfhaut über der Einschnittstelle mit Klipper oder einer Schere.
    3. Sterilisieren der chirurgischen Stelle mit 3 abwechselnden Tupfer aus 70% Ethanol und Betadin.
    4. Bewerben Augensalbe für die Augen, um Schäden durch den Verlust von Blinkreflex verhindern.
    5. Beurteilen Narkosetiefe durch Pedal Rücktritt (toe Prise) Reflex. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 3.4.1-3.4.5 dauert ~ 15 min.
  5. Orthotopen Implantation
    1. Sichern Sie das Tier in der stereotaktischen Rahmen.
    2. MakE einen Schnitt über die Pfeilnaht ca. 0,5 cm lang zwischen den Ohren und Augen.
    3. Suchen Sie den Schnittpunkt der koronalen und sagittalen Nähten (Bregma), sowie den Schnittpunkt der Lambda und sagittalen Nähten (Lambda). Sicherzustellen, dass Bregma und Lambda sind in der gleichen horizontalen Ebene.
    4. Befestigen Sie die Spritze mit der Zellsuspension und Wiederholen Antigen Spender an der stereotaktischen Rahmen über den Kopf. Bringen Sie die Spitze des 27 G-Nadel in Kontakt mit Bregma. Dies ist der Ursprung, die für die Manipulation von dreidimensionalen Koordinaten verwendet wird.
    5. Heben Sie die Nadel etwas abseits der Schädeloberfläche und bewegen 2 mm und 1 mm Seiten rostral von Bregma.
    6. Senken Sie die Nadel vorsichtig durch den Schädel an seinen Bestimmungsort zu 4 mm ventralen von Bregma. HINWEIS: Wir verwendeten diese stereotaktischen Koordinaten, um die Basalganglien Ziel. Verschiedenen stereotaktischen Koordinaten verwendet werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Mikroumgebung zu untersuchenHirnregionen auf der Tumorgenese.
    7. Injizieren 5 ul der Zellsuspension durch die Aktivierung des sich wiederholenden Antigen Spender einmal. Lassen Sie die Nadel in Platz für 2 min, damit Hirndruck ins Gleichgewicht.
    8. Ziehen Sie die Nadel über einen Zeitraum von 30 Sekunden langsamer. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um Druck auf jede Blutung, die auftreten können gelten.
    9. Nähern die Wundränder und schließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber. Verwaltung 20 ul Lidocain subkutan an der Einschnittstelle. HINWEIS: Für 5 Mäuse, die Schritte 3.5.1-3.5.9 dauert ~ 50 min. Der UNC-IACUC genehmigt die postoperative Verwendung von nur Lokalanästhesie. Absprache mit lokalen institutionellen IACUC wird hinsichtlich der Anforderungen für die postoperative Analgesie nach dieser Prozedur empfohlen.
  6. Post-OP-Pflege
    1. Legen Sie die Tiere in einer sauberen, warmen Käfig zu erholen. Die Tiere sollten nicht direkt in Betten aufgestellt werden, als zufällig Aspiration auftreten.
    2. Beachten Sie dieTiere für die Wiederaufnahme des normalen Verhaltens wie Pflege, Essen und Stuhlgang. HINWEIS: Wiederaufnahme der normalen Verhalten kann ~ 60 min dauern.

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Representative Results

Wir entwickelten ein Modellsystem mit Ngem kortikalen Astrozyten und NSC von Neugeborenen GEM Beherbergung geerntet floxed bedingten onkogenen Allele, die phänotypisch in vitro und in vivo charakterisiert werden können (Abbildung 1). Um die Folgen von onkogenen Mutationen insbesondere in kortikalen Astrozyten in vitro zu untersuchen, ist es wichtig, zunächst anreichern Astrozyten. Kortikalen Astrozyten Ernten enthalten eine Mischung von Mikrogliazellen, Astrozyten, Oligodendrozyten, OPC, und Neuronen, aber mechanische und genetischer Methoden in Astrozyten Anreicherung unterstützen. Wohingegen Neuronen sterben unter normalen Kulturbedingungen können Mikroglia und Oligodendrozyten durch Schütteln über Nacht 41,43 entfernt werden. Darüber hinaus können genetische Rekombination von floxed, onkogene Allele GFAP + Astrozyten gezielt mit einem Ad5GFAPCre für Astrozyten zu bereichern. Wir nutzten diese Methode, um kortikale Ernten von Rb1 loxP / loxP GEM Welpen mit flo infizierenfesten Nf1 loxP / loxP und / oder Pten loxP / loxP-Allele. Ad5GFAPCre Infektion einer proliferativen Vorteil rekombinierten GFAP + Astrozyten, die Astrozyten-Reinheit von 59% auf> 90% nach 5 erhöht - 9 Passagen in Kultur (2A und 2B). Alternativ kann für Astrozyten angereicherte wir durch Expression T 121 unter der Steuerung der GFAP-Promotor, einen proliferativen Vorteil in Astrozyten aus TgGZT 121 Mäusen (2C) geerntet induzieren. Während kortikalen Astrozyten wachsen adhärent der Kulturschale (2C), NSC wachsen nicht haftNeuroSphären in vitro (3A). Sowohl WT NSC und NSC mit rekombiniert floxed onkogenen Allele - TgGZT 121 (T), Kras G12D (R), und homozygote Deletion Pten (P - / -), die als TRP- / - - Drücken die NSC-Marker Sox2, während nur NSC von GEM enthält TgGZT 121 geerntet ausdrücken T 121 nach Cre-vermittelte Rekombination (3B).

Um festzustellen, wie G 1 / S (Rb), MAPK und / oder PI3K Signalweg Veränderungen beeinflussen das Wachstum von GFAP + Astrozyten in vitro-Proliferation wurde mit zwei Methoden untersucht. MTS und Zellzählung ergab, dass die Expression von T-121 und K-ras G12D die Proliferation der kortikalen Astrozyten (4A und 4B). Ebenso homozygot Rb1 (Rb) und Nf1 (N), verbunden mit heterozygote Deletion Pten (P +/-) Löschen erhöht kortikalen Astrozytenproliferation (4C). Transformierten Zellen haben unbegrenzte Teilungsfähigkeit. Die Umwandlung Auswirkungen von Mutationen in vitro mit col gemessen werdenony Bildungstests. Wir testeten daher die transformierende Wirkung von T 121 und Kras G12D Ausdruck und homozygote Deletion in Pten TRP - / - kortikalen Astrozyten durch Kolonie-Bildungstest, wie zuvor beschrieben 44. Wohingegen WT Astrozyten nicht Kolonien zu bilden, gebildet T Astrozyten Kolonien mit 1,03% Wirkungsgrad. Bemerkenswert ist, TRP - / - Astrozyten die höchste Koloniebildungseffizienz bei 6,40% (Tabelle 1). Um für präklinische Arzneimitteltests zu sein, ist es wichtig, dass in vitro Tumormodellen leicht genetisch manipuliert werden. Zusätzliche genetische Veränderungen stabil in kortikalen Astrozyten von Plasmid oder viralen Vektoren eingeführt werden. Als Beispiel haben wir stabil transduziert das Luciferasegen in TRP - / - Astrozyten (TRP - / - luc) unter Verwendung eines VSV-pseudotypisierten retroviralen Vektor pMSCV. Expression von Luciferase erhöhte Lumineszenz ~ 1.000-fache im Vergleich zu Elternzellen ( in vitro zu bestimmen. Wir haben früher, dass die Behandlung mit niedrig dosiertem PI-103, einem Dual-mTOR / PI3K-Inhibitor, gehemmt PI3K Signal, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen 30 gezeigt. Allerdings waren die cytostatische / cytotoxische Effekte höherer PI-103 Dosen nicht festgestellt. So haben wir getestet, ob PI-103 kann TRP reduzieren - / - Astrozyten Wachstum in vitro. PI-103 führte zu einer maximalen 88% ige Reduktion der TRP - / - Astrozyten Wachstum (4E). Wir haben früher genutzt orthotopen Allografts von TRP - / - Astrozyten zu anderen klinisch relevanten Therapeutika in vivo zu testen (Schmid et al, Manuskript eingereicht.) 45,46. Diese Daten legen nahe, dass kortikale Astrozyten verwandelt aus bedingtem GEM geerntet kann einen flexiblen Modellsystem, in dem die präklinische Arzneimitteltests in immunkompetenten mic wahrnehmen könnene.

Xenografts von etablierten humanen Zelllinien und PDX erfordern immungeschwächten Gastgeber. Im Gegensatz zu PDX, viele etablierte humane GBM-Zelllinien nicht rekapitulieren die histopathologischen Merkmale der GBM. Zum Beispiel, gebildet U87MG orthotopen Xenotransplantate umschriebene Tumoren, die normalen Gehirn (5A) nicht eindringen wollte. Im Gegensatz dazu Injektion von TRP - / - Astrozyten in das Gehirn von immunkompetenten, syngenen Mäusen ergab invasive Tumoren, die die histologischen Eigenschaften ihrer menschlichen Gegenstücke, insbesondere Invasion der normalen Gehirn (5B) rekapituliert. In Längsrichtung zu quantifizieren TRP - / - Allograft-Wachstum wurden die Mäuse alle 5 Tage nach der Zellinjektion getötet und Tumorlast wurde durch Quantifizierung Tumorbereich auf H & E-gefärbten Hirnschnitten bestimmt. Tumorbereich exponentiell über die Zeit (5C). Orthotope Injektion von 10 5 TRP - / - r in Astrozytenecipient Gehirn führte zu neurologischen Morbidität, mit einer medianen Überlebens von 22 Tagen (5D). Neben der kortikalen Astrozyten, führten wir orthotopen Injektionen mit TRP - / - NSC. TRP - / - NSC-abgeleitete Tumoren waren 121 T positiv, proliferative und gewartet Ausdruck der NSC-Marker Sox2 (Abbildung 6). Zu beachten ist, Injektion von kortikalen Astrozyten und NSC von WT C57BL / 6 Mäusen als auch phänotypisch WT kortikalen Astrozyten oder NSC mit nichtrekombinierter geerntet, floxed onkogenen Allele aus bedingtem GEM versäumt, die Tumorgenese in diesem Zeitraum zu entlocken (Daten nicht gezeigt). Längs Bildgebung in vivo verwendet worden, um Tumorwachstumskinetiken in Reaktion auf Arzneimittelbehandlungen 40 überwachen. Somit TRP - / - luc Astrozyten wurden in den Gehirnen von immunkompetenten syngenen Wurf und das Tumorwachstum wurde durch serielle Biolumineszenz-Bildgebung bestimmt injiziert. Biolumineszenz erhöht 15-fach über 16 Tage hinweg(Figuren 7A und 7B). Wir haben gezeigt, dass kortikale Astrozyten und NSC aus bedingtem GEM geerntet werden, können gentechnisch verändert sein und phänotypisch in vitro und in vivo zur Definition der Genetik und Zellbiologie der Astrozytom Pathogenese gekennzeichnet und möglicherweise für die präklinische Entwicklung von Medikamenten verwendet.

Figur 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der kortikalen Astrozyten und NSC Ernte von Ngem. Phänotypisch WT kortikalen Astrozyten und NSC wurden von GEM mit bedingten onkogenen Allele geerntet. Genetische Rekombination in vitro mit einem Vektor AdCre induziert. Transformierten Zellen phänotypisch in vitro durch verschiedene Verfahren und in vivo durch Injektion in orthotopen Gehirn von immunkompetenten gekennzeichnet,syngenen Wurfgeschwister.

Figur 2
Abbildung 2. Anreicherung von GFAP + Astrozyten auf serielle Passagen in vitro. Repräsentative Immun Bilder die GFAP + Astrozyten aus Rb1 loxP geerntet / loxP GEM Welpen mit Nf1 loxP / loxP-und / oder Pten loxP / loxP in denen eine genetische Rekombination mit Ad5GFAPCre induziert und die Zellen passagiert, X-mal (PX) (A). Quantifizierung der Anreicherung von GFAP + Astrozyten in Tafel A. Die Balken stellen die Standardfehler 3-24 Wiederholungen (B). Vertreter Immunfluoreszenz (oben) und Phasenkontrast (unten) Bilder von adhärenten kortikalen Astrozyten aus TgGZT 121 GEM Welpen geerntet, die T 121 von der GFAP-Promotor auf der Pass ausdrücken9 Jahre nach der Rekombination mit Ad5CMVCre in vitro (C). Astrozyten wurden als die Zahl von GFAP + (grün) die Zellen bei jeder andere Kanal, geteilt durch die Gesamtzahl der DAPI-gefärbten Zellkernen (blau) quantifiziert. Bilder wurden bei 10X Originalvergrößerung (A, C) aufgenommen. Maßstabsbalken repräsentieren 100 um (A, C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
- / - GEM Abbildung 3. WT und rekombiniert NSC von TRP geerntet. Vertreter Phasenkontrastbilder von phänotypisch WT (oben) und TRP - / - (unten) NSC als Neurosphären in vitro (A) gewachsen. Vertreter Immunfluoreszenzfärbung für T 121 (grün) und Sox2(Rot)-Expression in WT (oben) und TRP - / - (unten) Neurosphären (B). Maßstabsbalken repräsentieren 100 um (A, B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Charakterisierung der kortikalen Astrozyten in vitro. Wachstum von WT und TR kortikalen Astrozyten wurde durch Zählen Zellen an den Tagen 1-7 (A) ermittelt. Relative optische Dichte (OD) von WT und TR kortikalen Astrozyten wurde von MTS (B) bestimmt. Relative Wachstum der WT und rekombiniert Rb1 - / -; Nf1 - / -; Pten +/- (RbNP +/-) Astrozyten wurde von MTS (C) bestimmt. Lumineszenz der elterlichen TRP - / - und Luziferase ausdrücken TRP - / - Astrozyten (TRP - / - luc) (D). Relative OD von TRP - / - Astrozyten mit PI103 für 5 Tage behandelt wie von MTS (E) bestimmt. Proliferation und Dosis-Wirkungs-Wert wurde nach dem exponentiellen Wachstumsgleichung in GraphPad Prism 5. Balken stellen Standardfehler von 6 Wiederholungen pro Bedingung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. In vivo gliomagenesis. Repräsentative H & E gefärbten Schnitt einer U87MG Xenotransplantat zeigt diskrete Tumorränder (A). Vertreter von H & E gefärbten Abschnitt einer TRP - / - Allograft zeigt diffuse Invasion von normalen Gehirn (B). Maßstabsbalken in linke und rechte H & E-Bilder repräsentieren 1 mm und 100 um betragen. - / - Tumorbereich wurde durch die Analyse von H & E gefärbten Schnitten von Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Gehirnen von immunkompetenten, syngenen Geschwistern mit 10 5 TRP injiziert bestimmt Astrozyten und opferte bei 5-Tages-Intervallen nach der Injektion. (C). Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von TRP - / - Mäuse Allograft Morbidität im Alter zeigt eine mediane Überlebenszeit von 22 Tagen (D).

Figur 6
Abbildung 6. Immunfluoreszenz von TRP +/- NSC Allografts. Vertreter Immunfluoreszenz-Bilder zeigen, dass TRP +/- NSC injiziert in die Gehirne von immunkompetenten, syngenen Geschwistern ausdrücken T 121 (grün) und Sox2 (weiß) und sich vermehren, wie von Edu (rot)-Einbau bestimmt. Mäuse wurden mit EdU perfundiert und geopfert 6 Wochen nach der Injektion und ihre Gehirne mit Paradurchblutet. Maßstab repräsentiert 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7. Längs Bildgebung von TRP - / - luc Allografts. Repräsentative Biolumineszenz Bilder (A) und Quantifizierung der Luciferase Flusses über die Zeit (B) zeigt das Wachstum von TRP - / - / - - Allotransplantaten in immunkompetenten syngene Mäuse, die mit 10 5 TRP injiziert luc kortikalen Astrozyten und an den angegebenen Tagen post abzubildenden Injektion.g "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Genotyp Plattieren Wirkungsgrad (%) SEM
WT 0 0
T 1,03 0,15
TRP - / - 6,40 0,83

Tabelle 1 Koloniebildung der kortikalen Astrozyten. WT, T und TRP - / - kortikalen Astrozyten wurden in dreifacher Ausfertigung bei 4.000, 2.000 und 250 Zellen / Well ausplattiert. Kolonien wurden mit Kristallviolett 14 Tage nach Plattierung gebeizt, abgebildet und Counted mit ImageJ. Plattierungseffizienz wurde als Anzahl der Kolonien, geteilt durch die Anzahl der Zellen plattiert berechnet.

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Discussion

Die wichtigsten Maßnahmen zur Gewährleistung der Ernte und Kultur der kortikalen Astrozyten 1) sicherzustellen, um den Kortex ohne Gewebe unterhalb des Balkens herauszuschneiden, 2), um die Hirnhaut zu entfernen, 3) vollständig zu dissoziieren, die Zellen, und 4), die für GFAP bereichern + Astrozyten. Obwohl wir verwendet mechanische (Zittern) und genetische (Einschränkung der genetischen Rekombination mit einem Ad5GFAPCre Vektor oder Nutzung einer beherrschenden Transformation Transgen (TgGZT 121) unter GFAP-Promotor-Kontrolle) Methoden, um für GFAP + Astrozyten zu bereichern, haben andere Techniken verwendet worden, um kortikale reinigen Astrozyten. Zum Beispiel können kontaminierende Mikroglia durch Behandeln konfluente Kulturen mit einer mitotischen Inhibitor, gefolgt von L-Leucin-Methylester 47 entfernt werden. Die Morphologie und die Expressionsprofile von Astrozyten mechanisch gereinigt und in serumhaltigen Medien unterscheiden sich von akut isolierten Astrozyten mit der ehemaligen hypothesiZed, um entweder mehr unreife Astrozyten Zellen oder eine reaktive Astrozyten Phänotyp 48,49 darzustellen. In jüngerer Zeit wurde ein Verfahren entwickelt, Immunopanning prospektiv reinigen kortikalen Nagetier Astrozyten und deren Expressionsprofile akut gereinigten Astrozyten genauer nachgeahmt bei Kultivierung in Wachstumsfaktor ergänzt, serumfreien Medien 49. Die Auswirkungen der konventionellen, mechanischen Verfahren der kortikalen Astrozyten Bereicherung und Kultur gegenüber dem kürzlich entwickelte Methode Immunopanning auf den Phänotypen untersucht hier unklar. Unabhängig von dem verwendeten Verfahren ist es wesentlich, für GFAP + kortikalen Astrozyten, die phänotypischen Folgen von onkogenen Mutationen spezifisch in diesem Zelltyp bestimmen, zu bereichern.

Kritische Schritte zum Ernten NSC 1) genau zu lokalisieren SVZ, 2) bei der Präparation Beschädigung des SVZ zu minimieren, und 3), um die Zellen zu filtern folgenden Dissoziation vor dem Plattieren. Precise NSC Dissektionstechnik ist notwendig, zu lokalisieren und zu ernten die SVZ. Da NSC wachsen in Suspensionskultur, ist es wichtig, die Zellsuspension nach der Dissoziation zu filtern, um die Menge der Treibgut zu reduzieren. Obwohl wir genutzt, um das Wachstum in SCM für NSC wählen, können NSC prospektiv durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung der SVZ Gewebehomogenat 50 isoliert werden. Nach Induktion der genetischen Rekombination in vitro ist es wichtig, um die zellulären Eigenschaften der kortikalen Astrozyten und NSC Kulturen über Durchlässe überwachen. Weil wir nicht prospektiv für Astrozyten oder NSC bereichern während der Gewebe Ernte, wir seriell überwacht Bereicherung und quantifizierten Reinheit des Zelltyp von Interesse durch Immunfluoreszenzfärbung mit bekannten Zelltyp-spezifischer Marker (GFAP für Astrozyten, Sox2 für NSC). Zusätzlich empfehlen wir eine konsequente Überwachung der erwarteten Folgen der onkogenen Signal Mutationen vor und bei jedem Durchgang nach Cre-schend Rekombination durch Immun-und phänotypisch Charakterisierung der Zellen frühestens Durchgang, bei dem die Reinheit maximiert und Mutation induzierten Signaländerungen zu stabilisieren.

Eine wichtige Überlegung bei der Verwendung primärer Zellkulturen ist ihre inhärente Replikationsfähigkeit und die phänotypischen Auswirkungen der induzierten Mutationen. Phänotypisch WT murinen Astrozyten haben Replikationskapazität beschränkt und kann nur 3 agiert werden - 4 mal in der Kultur, bevor sie replikativen Seneszenz 31 zu unterziehen. Darüber hinaus sind viele Krebs assoziierten Mutationen, insbesondere im MAPK-Gene Ursache Onkogen-induzierte Seneszenz in vitro 51. Wenn daher die induzierten Mutationen nicht an Zellen unsterblich machen und sie von Onkogen-induzierte Seneszenz zu schützen, können sie nicht seriell für phänotypische Charakterisierung in vitro agiert werden. Viral Onkoproteinen wie HPV E6 / E7 und SV40 large T-Antigen wurden ausgiebig genutzt, um viele menschliche und mu verewigenrine Zelltypen in Kultur, einschließlich Astrozyten 13,26,30. Wir haben früher gezeigt, dass die Ablation der G1 / S Kontrollpunkt im Zellzyklus mit T ausreicht, um kortikale Astrozyten unsterblich, aber nicht ausreicht, um letale Astrozytomen in vivo führen. Im Gegensatz, die Aktivierung von MAPK und PI3K Signal in TRP - / - Astrozyten führte zur Bildung von GBM in der orthotopen Allograft-Modellsystem 30. Somit sind die Wirkungen von T, R und P-Mutationen auf murine Astrozyten Transformation in vitro, wie durch Koloniebildungstests mit in vivo Tumorgenese in orthotopen Allotransplantate korreliert definiert.

Wie alle Modelle, die chirurgische Implantation von Tumorzellen, orthotope Injektion von transformierten, Ngem Zellen in syngene Maus Gehirn erfordern eine akute Wunde Reaktion hervorzurufen, bezeichnet als reaktive Gliose. Während dieser Reaktion, Nervenzellen, einschließlich Astrozyten, Oligodendrozyten-Vorläufer (NG2 +) Glia und Mikroglia, proliferaß und erwerben ein primitiver Differenzierungszustand, weitgehend als Reaktion auf sezernierte Proteine ​​wie Sonic Hedgehog 52,53. Jedoch ist die proliferative Phase der reaktiven Gliose in Antwort auf Verwundung stab relativ kurz, typischerweise eine Woche 53. Wir haben bereits gezeigt, dass die Injektion von TRP - / - Astrozyten effizient induziert Tumorgenese in diesem Zeitraum, was Low-grade-Astrozytome, die häufig zu hochwertigen Astrozytome, einschließlich GBM Fortschritt. Im Gegensatz dazu Injektion von T oder TP - / - Astrozyten selten in low-grade Astrozytomen entwickeln sich 1-3 Wochen nach der Injektion und diese Tumoren nicht zu hohe Astrozytomen 30 voran. Darüber hinaus Injektion von phänotypisch Wildtyp kortikale Astrozyten und NSC allein nicht die Tumorgenese zu entlocken (Daten nicht gezeigt). Wir fanden, dass TRP - / - Allograft Wachstum exponentiell 2-3 Wochen nach der Injektion, eine Zeitspanne, während der die proliferative Phase reagierenive Gliose beendet (5 und 7). Um für mögliche Mikroumgebungseinflüsse auf die Tumorentstehung bei der Injektion von transformierten, Ngem Zellen in syngene Gehirn der Maus zu berücksichtigen, insbesondere während der Proliferationsphase der reaktiven Gliose, empfehlen wir die Durchführung Steuer Injektionen von phänotypisch WT kortikalen Astrozyten oder NSC bei der Untersuchung von neuen Kombinationen nichtrekombinierter, floxed onkogenen Allele. Wir empfehlen auch die Überwachung der Effizienz der Tumorgenese der beiden phänotypisch WT und verwandelte (rekombiniert) Zellen in wöchentlichen Abständen im ersten Monat nach der Injektion, wie wir zuvor beschrieben 30.

Durch genetische Manipulation entweder der injizierten Zellen oder Allotransplantat Host selbst kann die Ngem Astrozytom Modellsystem verwendet werden, um viele Aspekte der Pathogenese Astrozytom, einschließlich Tumor-Stroma-Interaktionen zu modellieren. Als Beispiel haben wir entwickelt TRP - / - kortikalen astrocyTES-Luciferase exprimieren, das Tumorwachstum in vivo-Kinetik (Figur 7) definieren. Alternativ könnte Ngem Zellen gentechnisch verändert, um ein Fluoreszenzprotein exprimieren, und orthotopisch in die Gehirne von GEM mit fluoreszierend markierten Neuronen oder Gefäßsystem injiziert wird, um die Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und normalen Gehirnzellen 54 definieren. Der Einfluss der Mikroumgebung Hirnregion oder Entwicklungsalter auf gliomagenesis kann durch Einspritzen orthotopisch Ngem Zellen an verschiedenen Standorten oder in verschiedenen alten Mäusen bestimmt werden. Obwohl kurze Latenzzeiten und Überlebens Tumor ist von Vorteil für die präklinische Drogentests, kann eine schnelle Tumorentwicklung nicht ideal, einige Aspekte der Pathogenese Astrozytom, einschließlich maligner Progression, Invasion und Tumor-Stoma-Interaktionen zu modellieren. Überleben Ngem Allograft-Hosts kann leicht durch Ändern der Anzahl von Zellen injiziert und systematische Überwachung Tumor Penetranz und Latenz 3 manipuliert werden0.

Menschlichen Astrozytomen sind genomisch komplex und weisen umfangreiche inner und interTumorHeterogenität 5-7,55,56. Mögliche Quellen für diese Heterogenität sind die somatischen Mutationen, die die Tumorgenese einleiten, die während des Entwicklungsprozesses der malignen Progression erworbene Mutationen und das Entwicklungspotential der Zellen, in denen diese Mutationen auftreten. Groß angelegte Sequenzierungsprojekte haben viele Astrozytom-assoziierte Mutationen und ihre Muster von Co-Vorkommen 7 identifiziert. Diese Studien haben auf bioinformatische Algorithmen verlassen, um häufig auftretende Mutationen zu identifizieren und zu Mutationen, die wahrscheinlich onkogenen sind zu benennen, dh. "Treiber-Mutationen", die Tumorgenese zu initiieren oder fahren malignen Progression. Jedoch die onkogenen Potential vieler dieser Mutationen, und ihre potenziellen Zelltyp-Spezifität, nicht systematisch in Modellsystemen untersucht. Wir schlagen vor, dass Ngem Modelle utilizing kortikalen Astrozyten und NSC, wie hier beschrieben, sowie andere neuronale Zelltypen, die gereinigt und in Kultur gezüchtet werden können, stellen ein vielseitiges System, solche Untersuchungen durchzuführen. Die Hinlänglichkeit und Notwendigkeit zur Transformation von Roman Kandidat Mutationen durch Sequenzierung Großprojekte identifiziert werden, können dann systematisch untersucht mit herkömmlichen genetischen GAIN- und loss-of-function-Ansätze mit spezifischen Zelltypen beherbergen Ngem gemeinsame Zusammenarbeit auftretenden Mutationen in Kern GBM Wege, für die bedingte GEM existieren 5. Wir schlagen vor, dass weitere Panels Ngem beherbergen vielfältige Kombinationen von Mutationen in mehreren neuronalen Zelltypen, die in der Modellierung der genomischen Heterogenität der menschlichen Astrozytomen sein. Zusätzlich kann Ngem Astrozytom Modelle mit kortikalen Astrozyten und NSC aus bedingtem GEM abgeleitet eine gefügig Modell für die präklinische Wirkstoffentwicklung bieten, da anfängliche In-vitro-Tests beider Mono-und Kombinationstherapien kannin diesen Zellen durchgeführt werden, um direkt effizienter in vivo Drogentests in immunkompetenten, syngenen Mäusen. Darüber hinaus können immunmodulierende und Stroma-zielgerichtete Therapien in Ngem Astrozytom Modelle mit immunkompetenten, syngenen Allograft-Hosts getestet werden. So Ngem Astrozytom Modelle mit transformierten kortikalen Astrozyten und NSC sind ein wertvolles Modellsystem, um die funktionellen Konsequenzen der Kombinationen von onkogenen Mutationen in bestimmten Zelltypen zu bestimmen, und kann bei der präklinischen Drogentests sein.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

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References

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Neuroscience Ausgabe 90 Astrozytom kortikale Astrozyten gentechnisch veränderte Mäuse Glioblastom neurale Stammzellen orthotopen Allograft
Modellierung Astrozytom Pathogenese<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt; Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse
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McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

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