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Neuroscience

मॉडलिंग तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Astrocytomas सबसे आम प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर और ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), एक ग्रेड चतुर्थ तारिकाकोशिकार्बुद हैं, 12-15 महीने 1,2 के एक औसत अस्तित्व के साथ सबसे आम और आक्रामक उप प्रकार है. फैलाना astrocytomas, विशेष रूप से जीबीएम के आक्रमण, पूरा शल्य लकीर precludes सहायक उपचार की प्रभावशीलता को सीमित करता है, और अनिवार्य रूप से उपचार के बाद पुनरावृत्ति 3 की ओर जाता है. डी नोवो (प्राथमिक) जीबीएम साथ या अनिवार्य रूप से (माध्यमिक) जीबीएम 4 की प्रगति कि कम ग्रेड astrocytomas साथ या तो शुरू में उपस्थित मरीजों. जीबीएम genomically विषम और तीन कोर संकेत दे रास्ते को नियंत्रित करने वाले जीन में परस्पर अनन्य और सह होने वाली म्यूटेशन की विशेषता है: जी 1 / एस (आरबी) सेल चक्र जांच की चौकी, रिसेप्टर tyrosine kinase (RTK), और TP53 5-7 रास्ते. जीबीएम जीबीएम उप influ है, सुझाव है कि विभिन्न मस्तिष्क कोशिका प्रकार के सदृश कि विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ चार जीनोमिक उपप्रकार होते हैंमूल 6,8,9 के अपने सेल द्वारा enced. बेहतर तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन दौरान विशेष प्रकार की कोशिकाओं में उत्परिवर्तन के विशिष्ट संयोजन की भूमिका को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं. अधिक कुशल पूर्व नैदानिक ​​दवा के विकास के लिए इन मॉडलों का इस्तेमाल अंततः रोगी परिणामों में सुधार करने में मदद करेगा. वर्तमान तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल मानव कोशिका लाइनों, रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDX), आनुवंशिक रूप से संशोधित सामान्य मानव astrocytes और तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी), और अनुवांशिक इंजीनियर चूहों (मणि) 10-14 स्थापित करना शामिल है. कॉर्टिकल astrocytes और एनएससी - - floxed oncogenic alleles के विभिन्न संयोजनों को शरण देने मणि से काटा हम प्राथमिक मस्तिष्क की कोशिकाओं के उपयोग के लिए एक वैकल्पिक, गैर germline मणि (nGEM) मॉडल 15 विकसित की है. लक्ष्य phenotypically मैं में पूर्व नैदानिक ​​दवा के विकास के लिए इन विट्रो में और vivo में दोनों की विशेषता है और संभावित उपयोग किया जा सकता है कि आनुवंशिक रूप से परिभाषित कोशिकाओं के साथ तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल उत्पन्न करने के लिए किया गया थाmmune-सक्षम चूहों.

स्थापित मानव कोशिका लाइनों वे सीधे आगे, तकनीकी रूप से व्यापक रूप से उपलब्ध हैं. तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन और इन विट्रो में और vivo में दवा प्रतिक्रिया का सबसे अधिक इस्तेमाल मॉडल हैं, और immunodeficient चूहों 10,11,16-18 में Orthotopic xenografting पर कैनेटीक्स और tumorigenicity परिभाषित किया है . उनके नुकसान केवल उच्च ग्रेड astrocytomas के लिए अध्ययन सीमित कम ग्रेड astrocytomas से स्थापित सेल लाइनों उत्पन्न करने में असमर्थता शामिल हैं; मूल के एक परिभाषित सेल की कमी; अक्सर मूल रोगी नमूना से स्पष्ट रूप से भिन्न है कि जीनोमिक प्रोफाइल के साथ जटिल जीनोमिक असामान्यताएं, की उपस्थिति; और संवेदनशीलता सीरम 11,17,19-22 में सीरियल संस्कृति दौरान प्ररूपी और genotypic बहाव को. स्थापित मानव जीबीएम सेल लाइनों में व्यक्तिगत oncogenic परिवर्तन के प्ररूपी परिणाम अक्सर eluc precludes जो वास्तव में उपस्थित हैं कि असामान्यताएं, की भीड़ द्वारा नकाबपोश जा सकता हैप्रत्यक्ष जीनोटाइप-phenotype के परिणामों की idation.

PDX immunodeficient चूहों में या immunodeficient चूहों 12,23 के दिमाग में orthotopic इंजेक्शन से पहले परिभाषित, सीरम मुक्त माध्यम में गैर पक्षपाती spheroids के रूप में अपनी संस्कृति के माध्यम से रोगी पृथक तारिकाकोशिकार्बुद कोशिकाओं के चमड़े के नीचे पारित होने के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं. PDX अधिक सही मानव astrocytomas के जीनोमिक परिदृश्य को बनाए रखने, लेकिन स्थापित मानव कोशिका लाइनों के लिए इसी तरह, व्यक्तिगत oncogenic परिवर्तन के प्ररूपी प्रभाव उनके जीनोमिक जटिलता 19,24 के कारण नकाबपोश जा सकता है. विशेष रूप से उपन्यास के उपचारों के जवाब में, विशिष्ट oncogenic परिवर्तन के प्ररूपी परिणामों को परिभाषित करने के लिए, स्थापित मानव कोशिका लाइनों या PDX के पैनल अक्सर, जीनोटाइप-phenotype सहसंबंध स्थापित generalizability दिखाने के लिए, और सेल लाइन विशेष प्रभाव की संभावना को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है. PDX सही मानव astrocytomas, इंक के histopathological पहचान पुनरावृत्ति जबकिआक्रमण luding, स्थापित मानव कोशिका लाइनों के Orthotopic xenografts आम तौर पर नहीं 21,23,25 करते हैं. साथ ही, सामान्य मानव astrocytes और एनएससी इन विट्रो में और vivo 13,14,26 में तारिकाकोशिकार्बुद tumorigenesis मॉडल को परिभाषित oncogenic परिवर्तन के साथ अनुवांशिक इंजीनियर किया गया है. इन कोशिकाओं को स्थापित मानव कोशिका लाइनों और PDX के जीनोमिक जटिलता की कमी है और इसे सही मानव तारिकाकोशिकार्बुद ऊतकविकृतिविज्ञानी पुनरावृत्ति, लेकिन विवो में immunodeficient कृन्तकों में xenografting की आवश्यकता है. सभी मानव कोशिका मॉडल प्रतिरक्षा की मध्यस्थता xenograft अस्वीकृति को रोकने के लिए immunodeficient कृंतक मेजबान की आवश्यकता होती है, क्योंकि इन मॉडलों स्ट्रोमा से लक्षित और प्रतिरक्षा modulatory के पूर्व नैदानिक ​​जांच सीमित, एक syngeneic प्रणाली की देशी ट्यूमर स्ट्रोमा बातचीत पुनरावृत्ति करने में विफल और एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी 10,11 उपचारों.

Oncogenic Muta के पूर्व निर्धारित संयोजन के प्ररूपी परिणामों के मणि परमिट परीक्षासीटू tumorigenesis में दौरान vivo में माहौल. गैर सशर्त मणि विकास भर में सभी ऊतकों के भीतर म्यूटेशन जबकि, सशर्त मणि सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों 10,11,15,18 के उपयोग के माध्यम से विशेष प्रकार की कोशिकाओं को Cre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन सीमित द्वारा म्यूटेशन की लक्ष्यीकरण कि सक्षम oncogenic alleles floxed है. सशर्त तारिकाकोशिकार्बुद मणि एक अक्षुण्ण मस्तिष्क 11 के भीतर अलग प्रकार की कोशिकाओं में oncogenic परिवर्तन के कार्यात्मक भूमिका स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया गया है. सशर्त मणि का उपयोग सीटू gliomagenesis में की preclinical उपयोगिता 1) इन विट्रो सहसंबंधी की कमी, जटिल जीनोटाइप के साथ सीटू ट्यूमर के विकास में की, 3) लंबे विलंबता चूहों की बड़ी साथियों को पैदा करने में 2) कठिनाई सहित कारकों की एक संख्या से सीमित है 4) और स्टोकेस्टिक ट्यूमर प्रगति. बगल में tumorigenesis एक इसी में इन विट्रो मॉडल का अभाव है, क्योंकि इन विट्रो में औषधि परीक्षण डब्ल्यू नहीं किया जा सकताith पारंपरिक सशर्त मणि मॉडल. अन्य कैंसर के विपरीत, astrocytomas की सशर्त मणि मॉडल मुश्किल से ही एकल oncogenic म्यूटेशनों 11 द्वारा प्रेरित कर रहे हैं. इस प्रकार, जटिल प्रजनन योजनाओं कई oncogenic परिवर्तन के साथ सशर्त मणि उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं. उच्च ग्रेड astrocytomas को प्रगति आम तौर पर एक गैर वर्दी, स्टोकेस्टिक तरीके से होती है और अंत में जटिल जीनोमिक परिदृश्य और तेजी से विकास कैनेटीक्स 27 से ट्यूमर को जन्म देता है, जबकि इसके अलावा, तारिकाकोशिकार्बुद दीक्षा, इन मॉडलों में एक लंबे विलंबता अवधि के बाद चर penetrance के साथ होता है, 28. सशर्त मणि मॉडल में चर अंतर्वेधन और घातक प्रगति की स्टोकेस्टिक प्रकृति व्यक्तिगत चूहों preclinical दवा परीक्षणों में उनके नामांकन से पहले उच्च ग्रेड astrocytomas की उपस्थिति और स्थान का पता लगाने के लिए रेडियो ग्राफिक इमेजिंग द्वारा जांच की आवश्यकता है. साथ में ले ली, इन सीमाओं के जनसंपर्क के लिए आवश्यक पीढ़ी और सशर्त मणि की बड़ी साथियों के परीक्षण में बाधाeclinical औषधि परीक्षण.

विशिष्ट तंत्रिका कोशिका प्रकार पर वायरल रिसेप्टर (TVA) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर मणि को संक्रमित करने एवियन रेट्रोवायरल (RCAs) वैक्टर का इस्तेमाल करता है जो RCAs-TVA मणि प्रणाली, बड़े पैमाने पर तारिकाकोशिकार्बुद tumorigenesis 11 मॉडल के लिए उपयोग किया गया है. सशर्त मणि के विपरीत, इस मॉडल प्रणाली जटिल प्रजनन योजनाओं के लिए आवश्यकता के बिना विशिष्ट कोशिकाओं प्रकार में कई oncogenic म्यूटेशन की शुरूआत के लिए सक्षम बनाता है. हालांकि, यह चर अंतर्वेधन, सक्रिय रूप से वायरल एकीकरण को प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं के विभाजन के लिए आवश्यकता है, और मेजबान जीनोम 29 में transgenes की यादृच्छिक प्रविष्टि के द्वारा सीमित है.

वे अन्य मॉडल प्रणाली 15 की सीमाओं के कई दूर क्योंकि रत्न से काटा कोशिकाओं का उपयोग जो गैर germline मणि (nGEM) मॉडल, तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं. तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन में सेल प्रकार और सह होने वाली म्यूटेशन की शुरुआत की भूमिका रोकते मुश्किल हो जाता हैवे घातक प्रगति के दौरान अपरिभाषित प्रकार की कोशिकाओं में व्यापक आनुवंशिक परिवर्तन जमा किया है कि अंतिम चरण के ट्यूमर से प्राप्त कर रहे हैं क्योंकि मेरा मानव जीबीएम सेल लाइनों या PDX स्थापित का उपयोग कर. इसके विपरीत, astrocytomas की सभी ग्रेड विशिष्ट शुद्ध मस्तिष्क कोशिका प्रकार 11,30 के भीतर आनुवंशिक परिवर्तन परिभाषित उत्प्रेरण द्वारा nGEM का उपयोग कर मॉडलिंग की जा सकती है. इस प्रकार, विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन और सेलुलर और आणविक phenotypes पर सेल प्रकार का प्रभाव इन विट्रो में और vivo में निर्धारित किया जा सकता है. स्थापित मानव जीबीएम सेल लाइनों के लिए इसी प्रकार, nGEM का उपयोग प्रारंभिक इन विट्रो औषधि परीक्षण एक ही कोशिकाओं का उपयोग vivo में परीक्षण के लिए दवाओं को प्राथमिकता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विवो में tumorigenesis तो orthotopically प्रतिरक्षा सक्षम syngeneic littermates 30 के दिमाग में nGEM कोशिकाओं allografting द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. ये Orthotopic allograft मॉडल इसलिए न केवल पारंपरिक साइटोटॉक्सिक एक की विवो परीक्षण में अनुमतिएन डी उपचारों को निशाना बनाया, लेकिन प्रतिरक्षा modulatory और स्ट्रोमा-लक्षित चिकित्सा के रूप में अच्छी तरह से. अंत में, ट्यूमर दीक्षा और प्रगति पर microenvironment की भूमिका में एक ही प्रकार की कोशिकाओं में एक ही म्यूटेशन का उपयोग nGEM और पारंपरिक मणि मॉडलों के बीच परिणामों की तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.

हम और दूसरों प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग तारिकाकोशिकार्बुद nGEM विकसित किया है - astrocytes, एनएससी, या oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPC) - मणि 30-34 से काटा. एक तारिकाकोशिकार्बुद nGEM के विकास के पीछे तर्क संभावित प्रतिरक्षा सक्षम जानवरों में इन विट्रो में पूर्व नैदानिक ​​दवा परीक्षण के लिए और इन विवो में इस्तेमाल किया जा सकता है कि विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में oncogenic परिवर्तन के प्ररूपी परिणाम निर्धारित करने के लिए एक मॉडल तैयार करना था. Rb1 loxP / loxP, या TgGZT - हम व्यक्त phenotypically गुम्मट कॉर्टिकल astrocytes और गैर Cre से एनएससी, floxed आरबी मार्ग के साथ एक> 94% C57 / BL6 पृष्ठभूमि पर बनाए रखा सशर्त मणि काटा121 - विभिन्न संयोजनों 35-39 में जीन - NF1 loxP / loxP, क्रास G12D, PTEN loxP / loxP - और RTK / रास / PI3K मार्ग floxed. हम Cre recombinase एन्कोडिंग adenoviral वैक्टर का उपयोग विट्रो में आनुवंशिक पुनर्संयोजन प्रेरित किया. कॉर्टिकल astrocyte फसल प्रकार की कोशिकाओं का एक मिश्रण होते हैं, इसलिए हम इन संस्कृतियों में GFAP + कॉर्टिकल astrocytes के लिए समृद्ध करने के लिए, ऐसे TgGZT मानव GFAP प्रमोटर से संचालित 121 के रूप में Ad5GFAPCre वैक्टर या प्रमुख oncogenic transgenes का उपयोग किया था. हम इन विट्रो में और vivo में cortical astrocytes और एनएससी में प्ररूपी जी 1 / एस के परिणामों (आरबी), MAPK, और PI3K मार्ग म्यूटेशन परिभाषित किया. MAPK और PI3K मार्ग सक्रिय G1 / एस दोषपूर्ण astrocytes molecularly मजाक उड़ाया मानव proneural जीबीएम और, Orthotopic इंजेक्शन पर, वर्दी विकास कैनेटीक्स, कम सुप्तावस्था साथ एक पूर्व निर्धारित स्थान में गठित ट्यूमर, और histopathologicमानव जीबीएम 30 के अल पहचान. Vivo में ट्यूमर के विकास के अनुदैर्ध्य निगरानी उपचार 40 के जवाब में उपचार साथियों और ट्यूमर के विकास की मात्रात्मक विश्लेषण को सामान्य बनाने के माध्यम से पूर्व नैदानिक ​​दवा परीक्षण एड्स. हम luciferase कॉर्टिकल astrocytes व्यक्त इंजेक्शन के साथ चूहों के अनुदैर्ध्य bioluminescence इमेजिंग से ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स निर्धारित की. इसलिए, सशर्त रत्न से व्युत्पन्न cortical astrocytes और एनएससी तारिकाकोशिकार्बुद जुड़े म्यूटेशन के कार्य परिणामों और पूर्व नैदानिक ​​दवा के विकास के लिए एक संभावित मॉडल प्रणाली की परिभाषा के लिए एक विनयशील मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं.

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Protocol

सभी जानवरों के अध्ययन उत्तरी केरोलिना संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.

नवजात चूहों से 1 संवर्धन Cortical Astrocytes

  1. तैयारी
    1. 2-3 नाजुक कार्य ऊतकों पड़ना और 70% इथेनॉल युक्त एक कुप्पी के तल में जगह है. विदारक कैंची, घुमावदार संदंश और इस फ्लास्क में सीधे सूक्ष्म संदंश के 2 जोड़े रखें. ऊतकों सूक्ष्म संदंश झुकने से बचने के लिए किया जाता है.
    2. एक 60 मिमी टिशू कल्चर डिश HBSS के 1 मिलीलीटर जोड़ें. प्रत्येक पशु के लिए एक अलग पकवान तैयार है और बर्फ पर व्यंजन बनाए रखें.
    3. संस्थागत नियमों के अनुसार जानवरों anesthetize.
    4. गर्म 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूरा DMEM) एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में प्रत्येक पशु के लिए साथ DMEM के 7 मिलीलीटर. नोट: 5 चूहों के लिए, 1.1.1-1.1.4 ~ 15 मिनट का समय लगेगा कदम.
  2. ऊतक फसल
    1. Instituti प्रति नवजात माउस (दिन 1-3) बलिदानonal नियमों.
    2. इथेनॉल से विदारक कैंची निकालें उन्हें सूखी ड्रिप करने की अनुमति, और नाक के लिए रीढ़ की हड्डी से कपाल पर त्वचा में एक बाण के समान कटौती करने.
    3. रीढ़ की हड्डी से शुरू करने और घ्राण बल्ब पिछले विस्तार, बाण के समान सिवनी साथ कपाल में एक कटौती करें. मस्तिष्क के ऊतकों की क्षति को कम करने के कपाल की अंदरूनी सतह के पास कैंची सुझावों रखने के लिए ध्यान रखना.
    4. घुमावदार संदंश का प्रयोग, धीरे पार्श्व दूर मस्तिष्क से कपाल की प्रत्येक गोलार्द्ध छील.
    5. सीधे सूक्ष्म संदंश का प्रयोग, धीरे प्रत्येक कॉर्टिकल गोलार्द्ध के पृष्ठीय भाग दूर चुटकी और HBSS युक्त टिशू कल्चर पकवान में जगह. सेरिबैलम और घ्राण बल्ब से बचने के लिए ध्यान रखना. महासंयोजिका नीचे किसी भी ऊतक मत लो.
    6. एक विदारक माइक्रोस्कोप और सूक्ष्म संदंश के 2 जोड़े का प्रयोग, धीरे प्रत्येक कॉर्टिकल गोलार्द्ध से तानिका हटा दें. ऊतक homogenizatio शुरुआत तक बर्फ को टिशू कल्चर पकवान लौटेंएन.
    7. दोहराएँ प्रत्येक अतिरिक्त पशु के लिए 1.2.6 के माध्यम से 1.2.1 कदम. नोट: 5 चूहों के लिए, 1.2.1-1.2.7 ~ 30 मिनट का समय लगेगा कदम.
  3. ऊतक homogenization
    1. एक साफ रेजर ब्लेड का प्रयोग, पतले कॉर्टिकल गोलार्द्धों पासा और एक टिशू कल्चर हुड के लिए थाली चाल है.
    2. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में diced ऊतक स्थानांतरण. बर्फ के ठंडे HBSS के 1 मिलीलीटर के साथ प्लेट धो लें और ऊतक युक्त ट्यूब को हस्तांतरण.
    3. ऊतक ट्यूब के नीचे करने के लिए मिलता है, जब तक तो ध्यान से एक पिपेट का उपयोग अतिरिक्त HBSS हटाने रुको.
    4. कमरे के तापमान / trypsin EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें. एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ पिपेट ~ 10x आगे कोशिकाओं को अलग कर देना.
    5. 20 मिनट - 15 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन सेते हैं. ध्यान से उलटा द्वारा हर 5 मिनट मिश्रण.
    6. Trypsin को बाधित करने के लिए पूरा DMEM के 3 मिलीलीटर जोड़ें. एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ पिपेट ~ 10x समाधान मिश्रण करने के लिए.
    7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र.
    8. निकालेंएक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला. गोली ढीला हो सकता है, क्योंकि मध्यम महाप्राण न करें.
    9. DMEM पूरा सी 37 डिग्री के 4 मिलीलीटर में गोली Resuspend. एक 75 सेमी सेल निलंबन स्थानांतरण शीर्ष टिशू कल्चर कुप्पी पेंच. नोट: 5 चूहों के लिए, 1.3.1-1.3.9 ~ 50 मिनट का समय लगेगा कदम.
    10. लगभग astrocyte कटाई के बाद 16 घंटा, तो DMEM पूरा C 4 मिलीलीटर की 37 ° जोड़ने, 37 डिग्री सेल्सियस HBSS के 4 मिलीलीटर के साथ कुप्पी धो लो. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कॉर्टिकल astrocytes बनाए रखें. नोट: धो कदम संस्कृति पकवान से गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने और मलबे के लिए महत्वपूर्ण है.
    11. संस्कृति है जब ~ 95% मिला हुआ, 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात हिला सीओ 2, अलग कोशिकाओं से युक्त मीडिया, फिर 37 डिग्री सेल्सियस HBSS के 4 मिलीलीटर के साथ कुप्पी धोने को हटा दें. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं DMEM पूरा करने और बनाए रखने के सी 37 डिग्री के 4 मिलीलीटर जोड़ें. नोट: इस कदम कॉर्टिकल astrocytes के लिए संस्कृतियों को समृद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण है, microglia contaminating के रूप में औरoligodendrocyte पूर्वज कोशिकाओं को इस प्रक्रिया से अलग और संस्कृति 41 से हटा रहे हैं.
    12. दोहराएँ प्रत्येक पशु के लिए 1.3.1-1.3.11 कदम.
  4. आनुवंशिक पुनर्संयोजन की प्रेरण
    1. 24 घंटा कदम 1.3.11 पूरा करने के बाद, DMEM पूरा सी 37 डिग्री के 2 मिलीलीटर के साथ मध्यम जगह. Ad5CMVCre या Ad5GFAPCre के> 10 10 pfu / मिलीलीटर की 1 μl युक्त 37 डिग्री सेल्सियस एससीएम के 1 मिलीलीटर जोड़ें. उपयोग BSL2 सुरक्षा सावधानियों से निपटने जब ​​पुनः संयोजक ADENOVIRUS: 5% सीओ 2 .CAUTION में 32 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए सेते हैं.
    2. वायरस युक्त मीडिया निकालें और cortical astrocytes को वायरस के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पूरा DMEM जोड़ें. चेतावनी: उपयोग BSL2 सुरक्षा सावधानियों पुनः संयोजक एडिनोवायरस निपटने और संस्थागत नियमों के अनुसार वायरस युक्त मीडिया त्यागने जब. नोट: - ~ 6 घंटा ऊष्मायन छोड़कर 15 मिनट का समय लगेगा 1.4.3 5 astrocyte संस्कृतियों के लिए, 1.4.1 कदम.
    3. में लिए कॉर्टिकल astrocyte संस्कृतियों का विस्तारइन विट्रो और इन विवो लक्षण वर्णन में. नोट: recombined जीन के लिए या विशिष्ट उत्परिवर्तित प्रोटीन या इसके संकेत परिणामों के लिए या तो immunoblots द्वारा विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर द्वारा Cre-पुनर्संयोजन निम्नलिखित म्यूटेशन की उपस्थिति निर्धारित. Cre-पुनर्संयोजन के बाद कॉर्टिकल astrocyte संस्कृतियों के प्ररूपी स्थिरीकरण के लिए आवश्यक समय का उपयोग किया म्यूटेशन पर निर्भर हो जाएगा और अनुभव से (चित्रा 2) निर्धारित किया जाना चाहिए.

नवजात चूहों से 2 संवर्धन तंत्रिका स्टेम सेल

  1. तैयारी
    1. 98 मिमी ना 2 अतः 4, 30 मिमी कश्मीर 2 अतः 4, 5.8 मिमी 2 MgCl, 0.25 मिमी 2 CaCl - विच्छेदन शुरू करने से पहले, 3.1 मिलीग्राम papain और 4 मिलीलीटर हदबंदी मध्यम 1.3 मिलीग्राम सिस्टीन जोड़कर मस्तिष्क प्रति 4 मिलीलीटर पाचन समाधान तैयार , 1 मिमी HEPES 20 मिमी ग्लूकोज, 0.001% लाल Phenol, और 0.125 मिमी NaOH (1 एम HEPES 7.4 पीएच स्टॉक से). Papain के अलावाऔर हदबंदी मध्यम करने के लिए सिस्टीन समाधान पीला हो जाएगा.
    2. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. उलटा द्वारा समय समय मिलाएं.
    3. पाचन समाधान लाल रंग हल्का करने के लिए देता है जब तक 0.1 एम NaOH बूंद बुद्धिमान जोड़ें.
    4. एक टिशू कल्चर हुड में, बाँझ फिल्टर एक सिरिंज फिल्टर (0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार) का उपयोग पाचन समाधान. बर्फ पर पाचन समाधान रखें.
    5. 44.5 मिलीलीटर एनएससी बेसल मध्यम, 5 एमएल एनएससी पूरक, 0.5 मिलीलीटर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, 50 μl 0.2% हेपरिन, 10 μl 100 माइक्रोग्राम / एमएल EGF, और 10 μl 100 माइक्रोग्राम / एमएल मिश्रण से स्टेम सेल मध्यम (एससीएम) की 50 मिलीलीटर की तैयारी bFGF. 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब एससीएम 1 सप्ताह के लिए स्थिर है.
    6. पूरा HBSS (cHBSS) 10x HBSS के 50 मिलीलीटर, 1.25 मिलीग्राम 1 एम HEPES (7.4 पीएच), मिश्रण से तैयार 15 मिलीलीटर 1 एम डी ग्लूकोज, 5 एमएल 100 मिमी 2 CaCl, 5 एमएल 100 मिमी MgSO 4, और 2 मिलीलीटर 1 एम 3 NaHCO. DDH 2 ओ के साथ 500 मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा लाओ
    7. CHBSS बुद्धि बाँझ फ़िल्टर4 डिग्री सेल्सियस पर हा 0.2 माइक्रोन ताकना आकार फिल्टर और दुकान.
    8. 2-3 नाजुक कार्य ऊतकों पड़ना और 70% इथेनॉल युक्त एक कुप्पी के तल में जगह है. विदारक कैंची, घुमावदार संदंश, और इस फ्लास्क में सीधे सूक्ष्म संदंश के 2 जोड़े रखें. ऊतकों सूक्ष्म संदंश झुकने से बचने के लिए किया जाता है. नोट: 5 चूहों के लिए, 2.1.1-2.1.8 ~ 45 मिनट का समय लगेगा कदम.
  2. ऊतक फसल
    1. संस्थागत नियमों के अनुसार नवजात (दिन 1-3) चूहों बलिदान.
    2. , 70% इथेनॉल से विदारक कैंची निकालें उन्हें सूखी ड्रिप करने की अनुमति, और नाक के लिए रीढ़ की हड्डी से कपाल पर त्वचा में एक बाण के समान कटौती करने.
    3. रीढ़ की हड्डी से शुरू करने और घ्राण बल्ब पिछले विस्तार, बाण के समान सिवनी साथ कपाल में एक कटौती करें. मस्तिष्क के ऊतकों की क्षति को कम करने के कपाल की अंदरूनी सतह के पास कैंची सुझावों रखने के लिए ध्यान रखना.
    4. घुमावदार संदंश का प्रयोग, धीरे पार्श्व दूर से कपाल की प्रत्येक गोलार्द्ध छीलमस्तिष्क.
    5. धीरे बर्फ के ठंडे cHBSS में पूरे मस्तिष्क और जगह को हटा दें.
    6. एक विच्छेदन खुर्दबीन का प्रयोग, ध्यान ठीक विच्छेदन उपकरणों के साथ मस्तिष्क से तानिका हटा दें.
    7. इसके नीचे की सतह पर दिमाग रखें और एक आकार 11 स्केलपेल के साथ कटौती खड़ी (राज्याभिषेक) के साथ सेरिबैलम / पश्चमस्तिष्क और घ्राण बल्ब / ललाट प्रांतस्था हटा दें.
    8. इस प्रकार मस्तिष्क की एक राज्याभिषेक देखें पैदा करने, दुम भाग पर जगह 90 डिग्री से शेष मस्तिष्क घुमाएँ. पार्श्व ventricles जानें.
    9. Subventricular क्षेत्र (SVZ) युक्त एक क्यूबिकल अनुभाग काट दिया.
    10. आकार 11 स्केलपेल के साथ ताजा बर्फ के ठंडे cHBSS और कीमा ऊतक के साथ एक 60 मिमी टिशू कल्चर डिश ऊतक SVZ युक्त स्थानांतरण.
    11. एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण. बर्फ पर ट्यूब रखें.
    12. 1-2 मिलीलीटर बर्फ ठंड cHBSS साथ पेट्री डिश धो लें. ऊतक युक्त ट्यूब को धोने के समाधान स्थानांतरण.
    13. दोहराएँ अतिरिक्त neonata साथ 2.2.1-2.2.12 कदमएल चूहों यदि आवश्यक हो तो. प्रोटोकॉल के शेष के लिए एक टिशू कल्चर हुड के लिए सभी 15 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण. नोट: - ~ 45 मिनट का समय लगेगा 2.2.13 5 चूहों के लिए, 2.2.1 कदम.
  3. ऊतक homogenization
    1. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पाचन समाधान (चरण 2.1.1 में तैयार) रखें. इसके अलावा, एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मस्तिष्क प्रति हार्दिक 2 मिलीलीटर एससीएम.
    2. ध्यान से एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक की सतह पर तैरनेवाला हटायें. महाप्राण न करें.
    3. 15 मिलीलीटर ट्यूब प्रति 2 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस पाचन समाधान जोड़ें और उलटा द्वारा ध्यान से मिश्रण.
    4. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. उलटा द्वारा हर 5 मिनट मिश्रण.
    5. प्रत्येक ट्यूब और दोहराने कदम 2.3.4 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पाचन समाधान का एक और 2 मिलीलीटर जोड़ें.
    6. कोशिकाओं गंभीरता से ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, तो एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग पचा ऊतक से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
    7. CHBSS में पतला 10 माइक्रोन ई -64 के 2 मिलीलीटर जोड़ें और उलटा द्वारा ध्यान से मिश्रण.
    8. कोशिकाओं गंभीरता से ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, तो पचा ऊतक से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
    9. 37 डिग्री सेल्सियस cHBSS के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप (~ 20 स्ट्रोक) के साथ homogenize. ऊतक homogenization के दौरान हवाई बुलबुले इंजेक्शन लगाने से बचें.
    10. फिर 37 डिग्री सेल्सियस cHBSS के 5 एमएल के साथ झरनी कुल्ला, एक 40 माइक्रोन ताकना आकार सेल झरनी के माध्यम से ऊतक homogenate गुजरती हैं.
    11. 5 मिनट के लिए 125 XG पर ऊतक homogenate अपकेंद्रित्र.
    12. सेल गोली परेशान बिना एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला के 95% निकालें. एक 200 μl विंदुक टिप के साथ 200 μl 37 डिग्री सेल्सियस एससीएम में सावधानी resuspend सेल गोली.
    13. 1.8 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस एससीएम जोड़ें और एक बाँझ 6 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण. नोट: 5 चूहों के लिए, 2.3.1-2.3.14 ~ 75 मिनट का समय लगेगा कदम.
  4. तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति
    1. एक और 2 मिलीलीटर 37 डिग्री जोड़कर 3 दिनों के बाद मध्यम पुनर्भरणसी एससीएम.
    2. 7 दिनों के बाद, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब neurospheres हस्तांतरण और neurospheres> 5 मिनट के लिए गंभीरता से व्यवस्थित करते हैं.
    3. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 2 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस एससीएम जोड़ें.
    4. एक 6 अच्छी तरह से थाली का एक नया अच्छी तरह से करने के लिए neurospheres स्थानांतरण.
    5. हर 3-4 दिनों 37 डिग्री सेल्सियस एससीएम के 2 मिलीलीटर जोड़ें, और हर 7 दिन मध्यम पूरी तरह से बदल जाते हैं.
    6. Neurospheres व्यास में> 100 माइक्रोन हैं, तो ध्यान से स्टेम सेल हदबंदी समाधान के साथ अलग कर देना और वांछित सेल घनत्व पर एनएससी replate.
  5. आनुवंशिक पुनर्संयोजन की प्रेरण
    1. वर्तमान में कोशिकाओं पर एससीएम के 2 मिलीलीटर Ad5CMVCre या Ad5GFAPCre के> 10 10 pfu / मिलीलीटर की 1 μl युक्त 37 डिग्री सेल्सियस एससीएम के 1 मिलीलीटर जोड़ें. चेतावनी: उपयोग BSL2 सुरक्षा सावधानियों पुनः संयोजक adenovirus जब हैंडलिंग.
    2. 5% सीओ 2 में 32 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए सेते हैं.
    3. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में neurospheres साथ एससीएम स्थानांतरण और क्षेत्रों 5 मिनट के लिए गंभीरता से व्यवस्थित करते हैं.
    4. फिर एक 200 μl विंदुक के साथ, एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ पहली बार सतह पर तैरनेवाला निकालें. चेतावनी: उपयोग BSL2 सुरक्षा सावधानियों पुनः संयोजक एडिनोवायरस निपटने और संस्थागत नियमों के अनुसार वायरस युक्त मीडिया त्यागने जब.
    5. एक 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण तो, एनएससी को वायरस के बिना 37 डिग्री सेल्सियस एससीएम के 2 मिलीलीटर जोड़ें. नोट: 5 एनएससी संस्कृतियों के लिए, 2.5.1-2.5.5 ~ 6 घंटा ऊष्मायन छोड़कर 15 मिनट का समय लगेगा कदम.
    6. अगले दिन, दोहराने आवश्यक जब neurosphere passaging द्वारा पीछा किया, 2.5.1-2.5.5 कदम. क्षेत्रों अब इन विट्रो लक्षण वर्णन और vivo में माउस दिमाग में orthotopic इंजेक्शन से पहले 2-3 मार्ग के लिए विस्तारित किया जा सकता है. नोट: recombined जीन के लिए या विशिष्ट उत्परिवर्तित प्रोटीन या इसके संकेत परिणामों के लिए या तो immunoblots द्वारा विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर द्वारा Cre-पुनर्संयोजन निम्नलिखित म्यूटेशन की उपस्थिति निर्धारित. Cre-पुनर्संयोजन के बाद एनएससी संस्कृतियों के प्ररूपी स्थिरीकरण के लिए आवश्यक समय निर्भर हो जाएगा(आंकड़े 2 और 3) का उपयोग किया म्यूटेशन पर और अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए.

प्राप्तकर्ता Iimmunocompetent चूहे के मस्तिष्क में recombined कोशिकाओं के 3 Orthotopic इंजेक्शन

  1. 5% मिथाइल सेलूलोज की तैयारी
    1. एक 100 मिलीलीटर में 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए विआयनीकृत पानी में 15 सीपीएस मिथाइल सेलुलोज की 5 ग्राम भंग टोपी बोतल पेंच. रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सरगर्मी जबकि धीरे धीरे पाउडर जोड़ें. यह समाधान में प्रवेश करने के सभी मिथाइल सेलुलोज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सरगर्मी से 24 घंटे तक का समय लग सकता है.
    2. बोतल वजन और वजन रिकॉर्ड.
    3. 5% मिथाइल सेलुलोज समाधान आटोक्लेव. Autoclaved एक बार, मिथाइल सेलुलोज एक अर्ध जेल हो जाएगा.
    4. बोतल वजन और autoclaving के दौरान खो वजन की गणना.
    5. Aseptically खो वजन के प्रत्येक ग्राम के लिए बाँझ पानी के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
    6. बर्फ पर रखें और 50 बर्फ की मिलीलीटर ठंड 2x DMEM जोड़ें. </ ली>
    7. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर मिलाएं. 20 मिलीलीटर aliquots में 5% मिथाइल सेलुलोज समाधान विभाजित करने के लिए बाँझ तकनीक का प्रयोग करें. अप करने के लिए छह महीने के लिए या 2x DMEM समाप्त हो रहा है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots. नोट: चरणों में 5% मिथाइल सेलुलोज समाधान की तैयारी 3.1.1-3.1.7 2.5 दिनों ~ ले जाएगा.
  2. इंजेक्शन के लिए Cortical astrocytes की तैयारी
    1. हार्वेस्ट कॉर्टिकल astrocytes जब ~ 90% मिला हुआ.
    2. , फसल महाप्राण पूरा DMEM और 37 डिग्री सेल्सियस HBSS के एक बराबर मात्रा के साथ प्लेटें धोने के लिए.
    3. थाली को कवर करने के लिए पर्याप्त trypsin जोड़ें. धीरे झुकाव और कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू जब तक थाली नल.
    4. DMEM पूरा सी 37 डिग्री के एक बराबर मात्रा के साथ trypsin निष्क्रिय.
    5. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और 3.2.4 में इस्तेमाल 37 डिग्री सेल्सियस पूरा DMEM का एक ही मात्रा के साथ प्लेट धो लो.
    6. कोशिकाओं से युक्त ट्यूब को धोने मीडिया स्थानांतरण. 3 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र.
    7. महाप्राण है1 मिलीलीटर की 37 ° में upernatant और resuspend कोशिकाओं DMEM पूरा सी.
    8. कोशिकाओं / μl की संख्या निर्धारित करने के लिए एक hemocytometer या अन्य उपयुक्त सेल काउंटर का उपयोग सेल निलंबन गणना.
    9. एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं की वांछित संख्या स्थानांतरण. 3 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र.
    10. 37 डिग्री के 800 μl में Resuspend कोशिकाओं DMEM पूरा सी. सेल गोली की मात्रा (- 800 μl सेल निलंबन की कुल मात्रा) निर्धारित करते हैं. नोट: यह इंजेक्शन के लिए एक सटीक सेल एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इस प्रकार, सेल गोली की मात्रा कदम 3.2.12 में जोड़ने के लिए 5% मिथाइल सेलुलोज की मात्रा की गणना करने के लिए इस कदम में निर्धारित किया जाना चाहिए.
    11. एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और फिर 3 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र.
    12. महाप्राण सेल गोली से सतह पर तैरनेवाला और ठंडा 5% मिथाइल सेलुलोज की उचित मात्रा में कॉर्टिकल astrocytes resuspend (कुल मात्रा वांछित - मात्रा कीसेल गोली) कोशिकाओं / μl की वांछित संख्या प्राप्त करने के लिए.
    13. इंजेक्शन जब तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें.
    14. तो सिरिंज पर एक कुंद 18 जी सुई जगह एक दोहरा एंटीजन मशीन में एक 250 μl कांच सिरिंज रखें.
    15. कॉर्टिकल astrocyte निलंबन में सुई के साथ धीरे धीरे सवार वापस ले; हवाई बुलबुले सेक और वास्तव में मस्तिष्क में इंजेक्शन की मात्रा कम हो जाएगा, के बाद से हटा दिया जाना चाहिए कि कोशिकाओं के ऊपर एक हवाई बुलबुले नहीं होगा.
    16. बस कॉर्टिकल astrocyte निलंबन ऊपर सुई की नोक पकड़ो और जल्दी में सवार धक्का. हवा बुलबुला तेजी से सेल निलंबन से कदम होगा और ज्यादातर निष्कासित कर दिया जाएगा.
    17. सभी हवाई बुलबुले जब तक दोहराएँ कदम 3.2.16 सुई से हटा रहे हैं.
    18. के बारे में ~ 200 μl के लिए सिरिंज भरें, फिर सुई पकड़ और यह बंद हो जाता है जब तक वापस सवार खींच. छोटे हवाई बुलबुले सुई टिप को पकड़े और तेजी से लगभग 5 में सवार धक्का द्वारा हटाया जा सकता है0 μl फिर धीरे धीरे पूरी क्षमता से वापस लेने.
    19. ईमानदार टिप रखें और कदम 3.2.18 4-5x दोहराएँ.
    20. 18 गेज सुई त्यागें और सिरिंज पर एक 27 जी सुई फिट.
    21. तरल पदार्थ सुई से निष्कासित कर दिया है जब तक प्रतिजन मशीन पर बटन दबाएँ. नोट: 1 astrocyte सेल लाइन के लिए, 3.2.1-3.2.21 ~ 60 मिनट का समय लगेगा कदम.
  3. इंजेक्शन के लिए एनएससी की तैयारी
    1. Neurospheres व्यास में> 100 माइक्रोन हैं, तो 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण और neurospheres> 5 मिनट के लिए गंभीरता से व्यवस्थित करते हैं.
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और ऐसे स्टेम सेल हदबंदी समाधान या 42 के रूप में वर्णित निर्माता के निर्देशों के या% 0.05 trypsin-EDTA के साथ अनुसार Accutase के रूप में एक कोमल हदबंदी अभिकर्मक साथ neurospheres, अलग कर देना.
    3. सीरम के लिए एनएससी उजागर बिना निर्माता के निर्देशों के अनुसार हदबंदी अभिकर्मकों रोकते हैं. 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र.
    4. कोशिकाओं / μl की संख्या निर्धारित करने के लिए एक hemocytometer या अन्य उपयुक्त सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
    5. एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब एनएससी की वांछित संख्या स्थानांतरण. 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र.
    6. 37 डिग्री सेल्सियस HBSS के 800 μl में कोशिकाओं Resuspend. सेल गोली की मात्रा (- 800 μl सेल निलंबन की कुल मात्रा) निर्धारित करते हैं. नोट: यह इंजेक्शन के लिए एक सटीक सेल एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इस प्रकार, सेल गोली की मात्रा कदम 3.3.9 में जोड़ने के लिए 5% मिथाइल सेलुलोज की मात्रा की गणना करने के लिए इस कदम में निर्धारित किया जाना चाहिए.
    7. एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और फिर 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र.
    8. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 3.2.12-3.2.21 में के रूप में orthotopic इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं की तैयारी खत्म. नोट: 1 एनएससी सेल लाइन के लिए, 3.3.1-3.3 कदम.9 ~ 60 मिनट का समय लगेगा.
  4. इंजेक्शन के लिए माउस की तैयारी
    1. संस्थागत IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार 250 मिलीग्राम / किग्रा Avertin (2,2,2 Tribromoethanol) या 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine प्लस 10 मिलीग्राम / किलो xylazine के एक आईपी इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्तकर्ता पशु anesthetize. नोट: इस्तेमाल के साथ साथ allograft मेजबान के रूप में उम्र के 3-6 महीने में चूहों हैं. अलग अलग उम्र में चूहे tumorigenesis पर विकासात्मक मस्तिष्क उम्र के microenvironmental प्रभाव की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.
    2. कतरनी या कैंची से चीरा साइट पर खोपड़ी दाढ़ी.
    3. 70% इथेनॉल और betadine के 3 बारी swabs के साथ शल्य साइट जीवाणुरहित.
    4. झपकी पलटा के नुकसान की वजह से किसी भी नुकसान को रोकने के लिए आंखों को नेत्र मरहम लागू करें.
    5. पेडल वापसी (पैर की अंगुली चुटकी) पलटा द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें. नोट: 5 चूहों के लिए, 3.4.1-3.4.5 ~ 15 मिनट का समय लगेगा कदम.
  5. Orthotopic आरोपण
    1. Stereotaxic फ्रेम में पशु सुरक्षित.
    2. पहुंचकान और आंखों के बीच लगभग 0.5 सेमी लंबे बाण के समान सीवन पर एक चीरा ई.
    3. राज्याभिषेक और बाण के समान टांके (शीर्षस्थान) के चौराहे, साथ ही lambdoid और बाण के समान टांके (लैम्ब्डा) के मिलन का पता लगाएँ. शीर्षस्थान और लैम्ब्डा एक ही क्षैतिज प्लेन में हैं सुनिश्चित करें.
    4. सिरिंज सेल निलंबन युक्त और सिर पर stereotaxic फ्रेम करने के प्रतिजन औषधि दोहरा देते हैं. शीर्षस्थान के साथ संपर्क में 27 जी सुई की नोक लाओ. इस तीन आयामी निर्देशांक के हेरफेर के लिए उपयोग किया जाएगा जो मूल है.
    5. खोपड़ी की सतह से थोड़ा सुई उठाएँ और 2 मिमी पार्श्व और शीर्षस्थान से 1 मिमी व्याख्यान चबूतरे वाला चाल है.
    6. शीर्षस्थान से अपने गंतव्य 4 मिमी उदर को खोपड़ी के माध्यम से ध्यान से सुई लोअर. नोट: हम बेसल गैन्ग्लिया लक्षित करने के लिए इन स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक का उपयोग किया. विभिन्न स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक अलग से microenvironmental प्रभाव की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता हैtumorigenesis पर मस्तिष्क क्षेत्रों.
    7. दोहरा प्रतिजन मशीन एक बार सक्रिय द्वारा सेल निलंबन के 5 μl इंजेक्षन. 2 मिनट intracranial दबाव संतुलित करने की अनुमति देने के लिए के लिए जगह में सुई छोड़ दें.
    8. धीरे धीरे 30 सेकंड की अवधि में सुई वापस ले लें. हो सकता है कि किसी भी खून बह रहा करने के लिए दबाव लागू करने के लिए एक कपास झाड़ू का प्रयोग करें.
    9. घाव किनारों लगभग और ऊतक चिपकने का उपयोग चीरा बंद करें. चीरा साइट पर Lidocaine subcutaneously के 20 μl प्रशासन. नोट: 5 चूहों के लिए, 3.5.1-3.5.9 ~ 50 मिनट का समय लगेगा कदम. UNC IACUC केवल स्थानीय संज्ञाहरण के पश्चात उपयोग को मंजूरी दे दी. स्थानीय संस्थागत IACUC साथ परामर्श इस प्रक्रिया के बाद पश्चात एनाल्जेसिक उपयोग के लिए आवश्यकताओं के बारे में सिफारिश की है.
  6. शल्य चिकित्सा के बाद की देखभाल
    1. ठीक करने के लिए एक साफ, गर्म पिंजरे में जानवरों रखें. आकस्मिक आकांक्षा उत्पन्न हो सकती है के रूप में पशु, सीधे बिस्तर में नहीं रखा जाना चाहिए.
    2. निरीक्षणइस तरह के सौंदर्य, खाने, और शौच के रूप में सामान्य व्यवहार की बहाली के लिए पशुओं. नोट: सामान्य व्यवहार की बहाली ~ 60 मिनट लग सकते हैं.

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Representative Results

हम phenotypically इन विट्रो में और vivo में लक्षण वर्णन किया जा सकता है कि सशर्त oncogenic alleles (चित्रा 1) floxed नवजात मणि को शरण देने से काटा कॉर्टिकल astrocytes और एनएससी के साथ एक nGEM मॉडल प्रणाली विकसित की है. विशेष रूप से इन विट्रो में कॉर्टिकल astrocytes में oncogenic परिवर्तन के परिणामों की जांच के लिए आदेश में, यह पहली astrocytes के लिए समृद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण है. Cortical astrocyte फसल microglia, astrocytes, oligodendrocytes, OPC, और न्यूरॉन्स के एक मिश्रण होते हैं, लेकिन यांत्रिक और आनुवंशिक तरीकों astrocyte संवर्धन में सहायता कर सकते हैं. न्यूरॉन्स सामान्य संस्कृति परिस्थितियों में मर जाते हैं, जबकि microglia और oligodendrocytes रातोंरात 41,43 झटकों से हटाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, एक Ad5GFAPCre का उपयोग GFAP + astrocytes के लिए लक्षित floxed, oncogenic alleles की आनुवंशिक पुनर्संयोजन astrocytes के लिए समृद्ध कर सकते हैं. हम फ़्लो साथ Rb1 loxP / loxP मणि पिल्ले से कॉर्टिकल फसल को संक्रमित करने के लिए इस विधि का इस्तेमालxed NF1 loxP / loxP और / या PTEN loxP / loxP alleles. Ad5GFAPCre संक्रमण 59% 5 के बाद> ​​90% से astrocyte पवित्रता की वृद्धि हुई जो recombined GFAP + astrocytes, में एक proliferative लाभ के कारण - संस्कृति में 9 अंश (आंकड़े 2A और 2 बी). वैकल्पिक रूप से, हम TgGZT 121 चूहों (चित्रा -2) से काटा astrocytes में एक proliferative लाभ प्रेरित करने के लिए GFAP प्रमोटर के नियंत्रण के तहत टी 121 व्यक्त astrocytes के लिए समृद्ध. कॉर्टिकल astrocytes संस्कृति पकवान (चित्रा -2) के अनुयायी हो जाना, वहीं एनएससी विट्रो (चित्रा 3 ए) में गैर पक्षपाती neurospheres के रूप में विकसित. टीआरपी के रूप में भेजा, TgGZT 121 (टी), क्रास G12D (आर), और समयुग्मक PTEN विलोपन (पी - - - /) recombined साथ गुम्मट एनएससी और एनएससी दोनों oncogenic alleles floxed- / - केवल - एनएससी TgGZT 121 युक्त रत्न से काटा Cre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन (3B चित्रा) के बाद टी 121 व्यक्त करते हुए, एनएससी मार्कर Sox2 व्यक्त करते हैं.

जी 1 / एस (आरबी), MAPK और / या PI3K मार्ग परिवर्तन GFAP के विकास को प्रभावित कैसे निर्धारित करने के लिए + astrocytes में इन विट्रो, प्रसार दो तरीकों का उपयोग कर जांच की गई थी. एमटीएस और सेल गिनती टी 121 और क्रास G12D की अभिव्यक्ति कॉर्टिकल astrocytes (आंकड़े -4 ए और 4 बी) के प्रसार में वृद्धि हुई है कि पता चला है. इसी तरह, समयुग्मक Rb1 (आरबी) और NF1 (एन), विषमयुग्मजी PTEN (पी +/-) विलोपन भी बढ़ कॉर्टिकल astrocyte प्रसार (चित्रा 4C) के साथ संयुक्त विलोपन. बदल कोशिकाओं असीमित proliferative क्षमता है. म्यूटेशन के बदलने प्रभाव कर्नल का उपयोग कर इन विट्रो में मापा जा सकता हैony गठन assays. पहले 44 में वर्णित के रूप में कॉलोनी गठन परख द्वारा कॉर्टिकल astrocytes - / - इसलिए हम टीआरपी में टी 121 और क्रास G12D अभिव्यक्ति और समयुग्मक PTEN विलोपन के बदलने प्रभाव का परीक्षण किया. गुम्मट astrocytes कालोनियों फार्म नहीं था, जबकि टी astrocytes 1.03% दक्षता पर कालोनियों का गठन. विशेष रूप से, टीआरपी - / - astrocytes 6.40% (1 टेबल) पर उच्चतम कॉलोनी गठन दक्षता था. पूर्व नैदानिक ​​दवा परीक्षण के लिए उपयुक्त होने के लिए आदेश में, यह इन विट्रो ट्यूमर मॉडल में आसानी से आनुवंशिक रूप से चालाकी से किया जा है कि महत्वपूर्ण है. अतिरिक्त आनुवंशिक परिवर्तन stably प्लाज्मिड या वायरल वैक्टर द्वारा कॉर्टिकल astrocytes में पेश किया जा सकता है. एक VSV-pseudotyped pMSCV रेट्रोवायरल वेक्टर का उपयोग / - - astrocytes (ल्यूक - - / टीआरपी) एक उदाहरण के रूप में, हम stably टीआरपी में luciferase जीन transduced. Luciferase की अभिव्यक्ति पैतृक कोशिकाओं की तुलना में luminescence ~ 1000 गुना वृद्धि हुई है ( विट्रो में लक्षित अवरोधकों की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम कम खुराक गड़बड़ी-103, एक दोहरी mTOR / PI3K अवरोध, साथ उपचार सेल व्यवहार्यता 30 को प्रभावित किए बिना PI3K संकेत हिचकते कि पहले से पता चला है. हालांकि, उच्च गड़बड़ी-103 खुराक की cytostatic / साइटोटॉक्सिक प्रभाव निर्धारित नहीं किया गया. इन विट्रो में astrocyte विकास - / - इस प्रकार, हम गड़बड़ी-103 टीआरपी कम कर सकते हैं कि क्या जांच की. - / - Astrocyte विकास (चित्रा 4E) पीआई-103 टीआरपी में एक अधिक से अधिक 88% की कमी के कारण होता है. Astrocytes विवो में अन्य चिकित्सकीय प्रासंगिक चिकित्सा परीक्षण करने के लिए (Schmid एट अल, पांडुलिपि प्रस्तुत की.) 45,46 - / - हम पहले से टीआरपी की Orthotopic allografts का उपयोग किया है. इन आंकड़ों सशर्त मणि से काटा तब्दील कॉर्टिकल astrocytes प्रतिरक्षा सक्षम mic में पूर्व नैदानिक ​​दवा परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए, जिसमें एक लचीला मॉडल प्रणाली प्रदान कर सकते हैं सुझाव है किई.

स्थापित मानव कोशिका लाइनों और PDX की xenografts immunodeficient मेजबान की आवश्यकता होती है. PDX के विपरीत, कई स्थापित मानव जीबीएम सेल लाइनों जीबीएम की histopathological सुविधाओं पुनरावृत्ति नहीं है. उदाहरण के लिए, U87MG Orthotopic xenografts सामान्य मस्तिष्क (चित्रा 5A) पर आक्रमण नहीं किया था कि घिरा ट्यूमर का गठन. इसके विपरीत, टीआरपी के इंजेक्शन - / - प्रतिरक्षा सक्षम, syngeneic चूहों के दिमाग में astrocytes उनके मानव समकक्षों, सामान्य मस्तिष्क (चित्रा 5 ब) की विशेष रूप से आक्रमण की ऊतकीय सुविधाओं recapitulated कि आक्रामक ट्यूमर झुकेंगे. - / - Longitudinally टीआरपी यों allograft विकास, चूहे हर 5 दिनों सेल इंजेक्शन के बाद बलिदान किया गया और ट्यूमर बोझ एच एंड ई दाग मस्तिष्क वर्गों पर ट्यूमर क्षेत्र बढ़ाता द्वारा निर्धारित किया गया था. ट्यूमर क्षेत्र समय (चित्रा 5C) से अधिक तेजी से वृद्धि हुई है. 10 5 टीआरपी के Orthotopic इंजेक्शन - / - आर में astrocytesecipient दिमाग 22 दिनों (चित्रा 5D) के एक औसत अस्तित्व के साथ, स्नायविक रुग्णता का नेतृत्व किया. - / - एनएससी कॉर्टिकल astrocytes के अलावा, हम टीआरपी का उपयोग Orthotopic इंजेक्शन प्रदर्शन किया. टीआरपी - / - एनएससी व्युत्पन्न ट्यूमर proliferative सकारात्मक टी 121, थे, और (चित्रा 6) एनएससी मार्कर Sox2 की अभिव्यक्ति बनाए रखा. सशर्त मणि इस समय सीमा के दौरान tumorigenesis प्रकाश में लाना करने में विफल रहा से ध्यान दें, unrecombined साथ WT C57BL / 6 चूहों के साथ ही phenotypically गुम्मट कॉर्टिकल astrocytes या एनएससी से काटा कॉर्टिकल astrocytes और एनएससी के इंजेक्शन की, (नहीं दिखाया डेटा) oncogenic alleles floxed. विवो में अनुदैर्ध्य इमेजिंग दवा उपचार 40 के जवाब में ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रकार, टीआरपी - / - ल्यूक astrocytes धारावाहिक bioluminescence इमेजिंग द्वारा निर्धारित किया गया था प्रतिरक्षा सक्षम syngeneic littermates और ट्यूमर के विकास के दिमाग में इंजेक्शन थे. Bioluminescence 16 दिनों में 15 गुना वृद्धि हुई(आंकड़े 7A और 7 बी). सशर्त मणि से काटा कॉर्टिकल astrocytes और एनएससी आनुवंशिक रूप से संशोधित और phenotypically विट्रो में और आनुवंशिकी और तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन की कोशिका जीव विज्ञान की परिभाषा के लिए vivo में विशेषता और संभावित preclinical दवा के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि हम प्रदर्शन किया है.

चित्रा 1
NGEM से कॉर्टिकल astrocyte और एनएससी फसल की चित्रा 1 योजनाबद्ध. Phenotypically गुम्मट कॉर्टिकल astrocytes और एनएससी सशर्त oncogenic alleles के साथ मणि से काटा गया. आनुवंशिक पुनर्संयोजन एक AdCre वेक्टर के साथ इन विट्रो में प्रेरित किया गया था. बदल कोशिकाओं phenotypically, प्रतिरक्षा सक्षम के दिमाग में विभिन्न तरीकों से और Orthotopic इंजेक्शन द्वारा vivo में इन विट्रो में विशेषता थेsyngeneic littermates.

चित्रा 2
इन विट्रो में धारावाहिक passaging पर GFAP + astrocytes की चित्रा 2 संवर्धन. Rb1 loxP से काटा GFAP + astrocytes दिखा प्रतिनिधि immunofluorescence छवियों / NF1 loxP / loxP और / या PTEN loxP / loxP साथ loxP मणि पिल्ले जिसमें आनुवंशिक पुनर्संयोजन Ad5GFAPCre के साथ प्रेरित किया गया था और एक्स टाइम्स (px) passaged कोशिकाओं (ए). पैनल ए बार्स में GFAP + astrocytes के संवर्धन की मात्रा 3-24 प्रतिकृति (बी) से मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रतिनिधि immunofluorescence (ऊपर) और चरण विपरीत (नीचे) दर्रे पर GFAP प्रमोटर से टी 121 व्यक्त कि TgGZT 121 मणि पिल्ले से काटा पक्षपाती कॉर्टिकल astrocytes के चित्र9 साल की उम्र Ad5CMVCre में इन विट्रो (सी) के साथ पुनर्संयोजन के बाद. Astrocytes हर दूसरे बीतने पर DAPI दाग नाभिक (नीला) की कुल संख्या से विभाजित GFAP + (हरा) कोशिकाओं की संख्या के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था. छवियाँ 10X मूल बढ़ाई (ए, सी) पर ले जाया गया. स्केल सलाखों 100 माइक्रोन (ए, सी) का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
- / - मणि चित्रा 3 WT और recombined एनएससी टीआरपी से काटा. - / - Phenotypically डब्ल्यूटी (ऊपर) और टीआरपी के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों (नीचे) एनएससी neurospheres में इन विट्रो (ए) के रूप में हो. टी 121 (हरा) और Sox2 के लिए प्रतिनिधि immunofluorescence धुंधला- / - (नीचे) neurospheres (बी) डब्ल्यूटी (ऊपर) और टीआरपी में (लाल) अभिव्यक्ति. स्केल सलाखों प्रतिनिधित्व 100 माइक्रोन (ए, बी). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
इन विट्रो में कॉर्टिकल astrocytes के 4 विशेषता चित्रा. WT और टी.आर. कॉर्टिकल astrocytes की ग्रोथ दिन 1-7 (ए) पर कोशिकाओं की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया था. WT और टी.आर. कॉर्टिकल astrocytes के सापेक्ष ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) एमटीएस (बी) के द्वारा निर्धारित किया गया था. गुम्मट के सापेक्ष विकास और recombined Rb1 - / -, NF1 - / -, PTEN +/- (RbNP +/-) एमटीएस (सी) द्वारा निर्धारित किया गया था astrocytes. / - है - और लूसिफ़ेर पैतृक टीआरपी की luminescenceएएसई व्यक्त टीआरपी - / - astrocytes (टीआरपी - / - ल्यूक) (डी). - / - टीआरपी के सापेक्ष आयुध डिपो एमटीएस (ई) द्वारा निर्धारित 5 दिनों के लिए PI103 साथ इलाज astrocytes. प्रसार और खुराक प्रतिक्रिया 5 बार्स हालत प्रति 6 replicates से मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व GraphPad चश्मे में बहुत तेजी से विकास समीकरण का उपयोग कर की गणना की गई. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
विवो gliomagenesis में चित्रा 5. एक U87MG xenograft के प्रतिनिधि एच एंड ई दाग खंड असतत ट्यूमर मार्जिन (ए) से पता चलता है. / - - एक टीआरपी के प्रतिनिधि एच एंड ई दाग खंड allograft सामान्य मस्तिष्क के फैलाना आक्रमण (पता चलता हैबी). बाएँ और दाएँ एच ई छवियों में स्केल सलाखों क्रमशः 1 मिमी और 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. - / - ट्यूमर क्षेत्र 10 5 टीआरपी इंजेक्शन के साथ प्रतिरक्षा सक्षम, syngeneic littermates से formalin तय, आयल एम्बेडेड दिमाग के एच ई दाग वर्गों का विश्लेषण करके निर्धारित किया गया था astrocytes और 5 दिन के अंतराल के बाद इंजेक्शन पर बलिदान कर दिया. (सी). - / - टीआरपी के कापलान-Meier अस्तित्व विश्लेषण रुग्णता आयु वर्ग allograft चूहों 22 दिन (डी) के एक औसत अस्तित्व से पता चलता है.

चित्रा 6
चित्रा टीआरपी +/- एनएससी allografts के 6 इम्यूनोफ्लोरेसेंस. प्रतिनिधि immunofluorescence छवियों टी 121 (हरा) और Sox2 (सफेद) व्यक्त टीआरपी +/- एनएससी प्रतिरक्षा सक्षम, syngeneic littermates के दिमाग में इंजेक्शन बताते हैं कि edu (लाल) निगमन द्वारा निर्धारित और, पैदा करना. चूहे edu साथ perfused और 6 सप्ताह paraformaldehyde के साथ perfused बाद इंजेक्शन और उनके दिमाग बलिदान थे. स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
टीआरपी के 7 चित्रा अनुदैर्ध्य इमेजिंग - / - ल्यूक allografts. समय (बी) पर luciferase प्रवाह के प्रतिनिधि bioluminescence छवियों (ए) और मात्रा का ठहराव टीआरपी की वृद्धि से पता चलता है - / - संकेत दिनों के बाद में ल्यूक कॉर्टिकल astrocytes और imaged - / - प्रतिरक्षा सक्षम, syngeneic चूहों में allografts 10 5 टीआरपी के साथ इंजेक्शन इंजेक्शन.जी "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

जीनोटाइप चढ़ाना दक्षता (%) SEM
गुम्मट 0 0
टी 1.03 0.15
टीआरपी - / - 6.40 0.83

कॉर्टिकल astrocytes की तालिका 1 कालोनी गठन. गुम्मट, टी और टीआरपी - / - कॉर्टिकल astrocytes / अच्छी तरह से क्रमश: 4,000, 2,000, और 250 कोशिकाओं में तीन प्रतियों में चढ़ाया गया. कालोनियों 14 दिनों चढ़ाना के बाद क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग imaged, और सह गयाImageJ का उपयोग Unted. चढ़ाना दक्षता चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या से विभाजित कालोनियों की संख्या के रूप में गणना की गई.

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Discussion

सबसे महत्वपूर्ण कदम, 2), 3) अच्छी तरह से कोशिकाओं को अलग कर देना, तानिका दूर करने के लिए महासंयोजिका नीचे ऊतक लेने के बिना प्रांतस्था आबकारी करने के लिए उचित फसल और cortical astrocytes की संस्कृति हैं 1) सुनिश्चित करने के लिए और 4) GFAP के लिए समृद्ध करने के लिए + astrocytes. हम GFAP + astrocytes के लिए समृद्ध करने के तरीकों (GFAP प्रमोटर नियंत्रण में (एक प्रमुख बदलने transgene की एक Ad5GFAPCre वेक्टर या उपयोग के साथ TgGZT 121) आनुवंशिक पुनर्संयोजन के प्रतिबंध) मैकेनिकल (मिलाते हुए) और आनुवंशिक प्रयोग किया जाता है, अन्य तकनीकों कॉर्टिकल शुद्ध करने के लिए उपयोग किया गया है astrocytes. उदाहरण के लिए, दूषित microglia एल leucine मिथाइल एस्टर 47 के बाद mitotic अवरोध के साथ मिला हुआ संस्कृतियों के इलाज से हटाया जा सकता है. सीरम युक्त मीडिया में यंत्रवत् शुद्ध और सुसंस्कृत astrocytes की आकृति विज्ञान और अभिव्यक्ति प्रोफाइल पूर्व hypothesi साथ, तीव्रता से अलग astrocytes से अलगजेड अधिक अपरिपक्व astrocytic कोशिकाओं या एक प्रतिक्रियाशील astrocyte फेनोटाइप 48,49 या तो प्रतिनिधित्व करने के लिए. अभी हाल ही में एक immunopanning विधि भावी कॉर्टिकल कृंतक astrocytes और उनकी अभिव्यक्ति प्रोफाइल और अधिक बारीकी से तीव्रता से शुद्ध astrocytes मजाक उड़ाया को शुद्ध करने के लिए विकसित किया गया है जब सुसंस्कृत वृद्धि कारक पूरक, सीरम मुक्त मीडिया 49 में. जांच phenotypes पर अधिक हाल ही में विकसित immunopanning विधि बनाम कॉर्टिकल astrocyte संवर्धन और संस्कृति की पारंपरिक, यांत्रिक विधि का प्रभाव इस के साथ साथ अस्पष्ट रहते हैं. बावजूद उपयोग विधि की, यह विशेष रूप से इस सेल प्रकार के भीतर oncogenic परिवर्तन के प्ररूपी परिणाम निर्धारित करने के लिए GFAP + कॉर्टिकल astrocytes के लिए समृद्ध करने के लिए आवश्यक है.

एनएससी फसल कटाई के लिए महत्वपूर्ण कदम 1) सही, SVZ लगाने के लिए 2) विच्छेदन के दौरान SVZ को नुकसान कम करने के लिए, और 3) चढ़ाना पहले हदबंदी निम्नलिखित कोशिकाओं को फिल्टर करने के लिए कर रहे हैं. Preciएसई एनएससी विच्छेदन तकनीक लगाने और SVZ फसल के लिए आवश्यक है. एनएससी निलंबन संस्कृति में हो जाना है, यह अस्थायी मलबे की मात्रा को कम करने के लिए हदबंदी के बाद सेल निलंबन फिल्टर करने के लिए आवश्यक है. हम एनएससी के लिए चयन करने के लिए एससीएम में वृद्धि का उपयोग किया है, एनएससी भावी SVZ ऊतक homogenate 50 के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा अलग किया जा सकता है. इन विट्रो में आनुवंशिक पुनर्संयोजन के शामिल होने के बाद, यह अंश भर में सेलुलर कॉर्टिकल astrocyte की विशेषताओं और एनएससी संस्कृतियों पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है. हम भावी ऊतक फसल के दौरान astrocytes या एनएससी के लिए समृद्ध नहीं था, इसलिए हम क्रमानुसार (astrocytes के लिए GFAP, एनएससी के लिए Sox2) immunofluorescence ज्ञात सेल प्रकार विशिष्ट मार्कर के साथ धुंधला द्वारा ब्याज की सेल प्रकार के संवर्धन और मात्रा निर्धारित शुद्धता पर नजर रखी. साथ ही, हम व्यवस्थित से पहले और रचनात्मक-मध्यस्थता के बाद प्रत्येक पारित होने पर दोनों oncogenic म्यूटेशन की उम्मीद है और संकेतन परिणामों की निगरानी की सिफारिशImmunoblotting और phenotypically पवित्रता अधिकतम और उत्परिवर्तन प्रेरित संकेत परिवर्तन को स्थिर है, जिस पर जल्द से जल्द पारित होने पर कोशिकाओं निस्र्पक द्वारा डी पुनर्संयोजन.

प्राथमिक सेल संस्कृतियों के उपयोग में एक महत्वपूर्ण विचार अपने निहित replicative क्षमता और प्रेरित परिवर्तन के प्ररूपी प्रभाव है. Phenotypically गुम्मट murine astrocytes replicative क्षमता सीमित है और केवल 3 passaged किया जा सकता है - वे replicative वार्धक्य 31 गुजरना से पहले संस्कृति में 4 बार. इसके अलावा, कई कैंसर विट्रो 51 में ओंकोजीन प्रेरित वार्धक्य कारण, विशेष रूप से MAPK मार्ग जीन में, म्यूटेशन जुड़े. प्रेरित उत्परिवर्तन कोशिकाओं अमर और ओंकोजीन प्रेरित वार्धक्य से उन्हें बचाने के लिए असफल इस प्रकार, यदि वे क्रमानुसार इन विट्रो में प्ररूपी लक्षण वर्णन के लिए passaged नहीं किया जा सकता. ऐसे एचपीवी E6 / E7 और SV40 बड़ी टी प्रतिजन के रूप में वायरल oncoproteins बड़े पैमाने पर कई मानव और म्यू अमर करने के लिए उपयोग किया गया हैastrocytes 13,26,30 सहित संस्कृति में rine प्रकार की कोशिकाओं,. टी कॉर्टिकल astrocytes अमर करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन विवो में घातक astrocytomas पैदा करने के लिए पर्याप्त नहीं था के साथ हम पहले G1 / एस सेल चक्र चौकी की कि पृथक से पता चला है. इसके विपरीत, MAPK और PI3K टीआरपी में संकेत के सक्रियण - / - astrocytes Orthotopic allograft मॉडल प्रणाली 30 में जीबीएम के गठन के लिए नेतृत्व किया. इस प्रकार, इन विट्रो में murine astrocyte परिवर्तन पर टी, आर, पी और परिवर्तन के प्रभाव Orthotopic allografts में इन विवो tumorigenesis साथ सहसंबद्ध कॉलोनी गठन assays के द्वारा परिभाषित के रूप में.

ट्यूमर कोशिकाओं, syngeneic माउस दिमाग में तब्दील, nGEM कोशिकाओं के Orthotopic इंजेक्शन की शल्य आरोपण की आवश्यकता है कि सभी मॉडलों के एक तीव्र घाव प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना होगा की तरह, प्रतिक्रियाशील gliosis करार दिया. इस प्रतिक्रिया के दौरान, astrocytes, oligodendrocyte पूर्वज (NG2 +) glia, और microglia, prolifer सहित तंत्रिका कोशिकाओं,खाया और ऐसी ध्वनि हाथी 52,53 के रूप में बड़े पैमाने पर स्रावित प्रोटीन के जवाब में, एक अधिक आदिम भेदभाव राज्य के अधिग्रहण. हालांकि, चाकू लोग घायल हो गए के जवाब में प्रतिक्रियाशील gliosis के प्रफलन अवस्था, आम तौर पर एक सप्ताह में 53 अपेक्षाकृत कम है. / - है - हम पहले से टीआरपी की है कि इंजेक्शन से पता चला है astrocytes कुशलतापूर्वक अक्सर जीबीएम सहित उच्च ग्रेड astrocytomas, पर प्रगति कि कम ग्रेड astrocytomas उपज, इस समय सीमा के दौरान tumorigenesis लाती है. इसके विपरीत, टी या टी.पी. इंजेक्शन - / - astrocytes बार बार 1-3 के बाद इंजेक्शन सप्ताह और इन ट्यूमर में कम ग्रेड astrocytomas में विकसित उच्च ग्रेड astrocytomas 30 पर प्रगति के लिए असफल. इसके अलावा, अकेले phenotypically जंगली प्रकार कॉर्टिकल astrocytes और एनएससी के इंजेक्शन (नहीं दिखाया डेटा) tumorigenesis प्रकाश में लाना करने में विफल रहता. - / - Allograft विकास तेजी से 2-3 सप्ताह के बाद इंजेक्शन के प्रफलन अवस्था प्रतिक्रिया के दौरान जो एक समय सीमा बढ़ जाती है हम जानते हैं कि टीआरपी पायाIve gliosis समाप्त हो गया है (आंकड़े 5 और 7). Syngeneic माउस दिमाग में तब्दील, nGEM कोशिकाओं के इंजेक्शन पर tumorigenesis पर संभावित microenvironmental प्रभावों के लिए खाते में करने के लिए, विशेष रूप से प्रतिक्रियाशील gliosis के proliferative चरण के दौरान, हम phenotypically गुम्मट कॉर्टिकल astrocytes या एनएससी unrecombined का उपन्यास संयोजन जब जांच के नियंत्रण इंजेक्शन प्रदर्शन की सलाह देते हैं, oncogenic floxed alleles. हम पहले 30 में वर्णित है के रूप में हम भी, पहले महीने के बाद इंजेक्शन के दौरान साप्ताहिक अंतराल पर दोनों phenotypically WT और तब्दील (recombined) कोशिकाओं की tumorigenesis की दक्षता निगरानी सलाह देते हैं.

इंजेक्शन कोशिकाओं या allograft मेजबान खुद या तो की आनुवंशिक हेरफेर के माध्यम से, nGEM तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल प्रणाली ट्यूमर स्ट्रोमा बातचीत सहित तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन के कई पहलुओं, मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. / - - एक उदाहरण के रूप में, हम टीआरपी इंजीनियर कॉर्टिकल astrocytes विवो (चित्रा 7) में ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स परिभाषित करने के लिए luciferase व्यक्त करने के लिए. वैकल्पिक रूप से, nGEM कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और orthotopically ट्यूमर कोशिकाओं और सामान्य मस्तिष्क कोशिकाओं 54 के बीच बातचीत को परिभाषित करने के लिए fluorescently लेबल न्यूरॉन्स या vasculature के साथ मणि के दिमाग में इंजेक्शन. gliomagenesis पर मस्तिष्क क्षेत्र या विकासात्मक उम्र के microenvironmental प्रभाव orthotopically विभिन्न स्थानों में या विभिन्न आयु वर्ग के चूहों में nGEM कोशिकाओं को इंजेक्शन के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. कम ट्यूमर सुप्तावस्था और अस्तित्व preclinical दवा परीक्षण के लिए फायदेमंद है, तेजी से ट्यूमर के विकास घातक प्रगति, आक्रमण, और ट्यूमर रंध्र बातचीत सहित तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन के कुछ पहलुओं, मॉडल के लिए आदर्श नहीं हो सकता. NGEM allograft सेनाओं के जीवन रक्षा आसानी से इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या में फेरबदल और व्यवस्थित ट्यूमर अंतर्वेधन और विलंबता 3 की निगरानी के द्वारा चालाकी से किया जा सकता है0.

मानव astrocytomas genomically जटिल हैं और व्यापक अंतर और अंतर ट्यूमर विविधता 5-7,55,56 दिखा रहे हैं. इस विविधता के संभावित स्रोतों tumorigenesis आरंभ कि दैहिक म्यूटेशनों, घातक प्रगति की विकासवादी प्रक्रिया के दौरान अर्जित म्यूटेशन, और इन म्यूटेशन होते हैं जिसमें कोशिकाओं के विकास क्षमता शामिल हैं. बड़े पैमाने पर अनुक्रमण परियोजनाओं कई तारिकाकोशिकार्बुद जुड़े म्यूटेशन और सह घटना 7 के अपने पैटर्न की पहचान की है. इन अध्ययनों यानी, अक्सर होने वाली म्यूटेशन की पहचान करने के लिए और अधिक संभावना oncogenic हैं कि म्यूटेशन को मनोनीत करने के लिए पहले से पंजीकृत एल्गोरिदम पर भरोसा किया है. Tumorigenesis आरंभ या घातक प्रगति ड्राइव कि "ड्राइवर म्यूटेशन". हालांकि, इन म्यूटेशन के कई, और उनके संभावित सेल प्रकार विशिष्टता के oncogenic क्षमता, व्यवस्थित मॉडल प्रणाली में जांच नहीं की गई. हम प्रस्ताव है कि nGEM मॉडल यूकॉर्टिकल astrocytes और एनएससी यहाँ के रूप में वर्णित है, साथ ही शुद्ध और संस्कृति में उगाया जा सकता है कि अन्य तंत्रिका कोशिका प्रकार tilizing, इस तरह की जाँच करने के लिए एक बहुमुखी प्रणाली प्रदान करते हैं. बड़े पैमाने पर अनुक्रमण परियोजनाओं के माध्यम से पहचान उपन्यास उम्मीदवार म्यूटेशन के परिवर्तन के लिए पर्याप्तता और आवश्यकता तो व्यवस्थित पारंपरिक आनुवंशिक gain- और के समारोह नुकसान विशिष्ट nGEM सेल प्रकार कोर जीबीएम रास्ते में आम सह होने वाली म्यूटेशन को शरण देने के साथ दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच की जा सकती है जिसके लिए सशर्त मणि 5 अस्तित्व. हम आगे nGEM के पैनल मानव astrocytomas के जीनोमिक विविधता मॉडलिंग में उपयोगी होगा कई तंत्रिका प्रकार की कोशिकाओं में उत्परिवर्तन के विभिन्न संयोजनों को शरण देने का प्रस्ताव है कि. साथ ही, सशर्त रत्न से व्युत्पन्न cortical astrocytes और एनएससी के साथ nGEM तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल preclinical दवा के विकास के लिए एक विनयशील मॉडल उपलब्ध करा सकता है क्योंकि दोनों मोनो और संयोजन चिकित्सा के प्रारंभिक इन विट्रो में परीक्षण कर सकते हैंप्रतिरक्षा सक्षम, syngeneic चूहों में विवो औषधि परीक्षण में अधिक कुशल निर्देशित करने के लिए इन कोशिकाओं में प्रदर्शन किया. इसके अलावा, प्रतिरक्षा modulating और स्ट्रोमा-लक्षित चिकित्सा प्रतिरक्षा सक्षम, syngeneic allograft मेजबानों के साथ nGEM तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल में परीक्षण किया जा सकता है. इस प्रकार, तब्दील कॉर्टिकल astrocytes और एनएससी के साथ nGEM तारिकाकोशिकार्बुद मॉडल विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में oncogenic परिवर्तन के संयोजन के कार्यात्मक परिणाम निर्धारित करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली रहे हैं और पूर्व नैदानिक ​​दवा परीक्षण में उपयोगी हो सकता है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 90 तारिकाकोशिकार्बुद कॉर्टिकल astrocytes अनुवांशिक इंजीनियर चूहों glioblastoma तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं Orthotopic allograft
मॉडलिंग तारिकाकोशिकार्बुद रोगजनन<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; इन विवो</em&gt; Cortical Astrocytes या सशर्त, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उपयोग
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