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Neuroscience

모델링 성상 세포종 병인 Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

성상 세포종은 가장 흔한 일차 뇌종양 및 아교 모세포종 (GBM), 등급 IV의 성상 세포종 아르, 12-15개월 1,2의 평균 생존과 가장 일반적이고 공격적인 서브 타입이다. 미만성 성상 세포종, 특히 GBM의 침공, 완전한 수술 적 절제를 배제 보조 요법의 효과를 제한하고, 필연적으로 치료 후 재발 세 리드. 드 노보 (주) GBM 또는 필연적으로 (보조) GBM 사에 진행 낮은 뇌 성상 세포종 중 처음 본 환자. GBM은 유 전적으로 이기종 세 가지 핵심 신호 전달 경로 제어하는 유전자에 상호 배타적와 공동으로 발생하는 돌연변이에 의해 특징입니다 : G 1 / S (굽은) 세포주기 체크 포인트, 수용체 티로신 키나제 (RTK)를, 그리고 TP53 5-7 경로. GBM은 GBM의 하위 유형 influ 것을 제안, 서로 다른 뇌 세포 유형과 유사한 별개의 발현 양상과 네 게놈 하위 유형으로 구성원점 6,8,9의 그것의 세포에 의해 추측되는. 성상 세포종 나은 모델은 성상 세포종 병인 중에 특정 세포 유형의 돌연변이의 특정 조합의 역할을 정의해야한다. 보다 효율적인 임상 약물 개발을위한 이러한 모델을 활용하여 궁극적으로 환자 결과를 개선하는 데 도움이됩니다. 성상 세포종 전류 모델은 인간 세포주, 환자 유래의 이종 이식 (PDX), 유전자 변형 정상적인 인간 성상 세포와 신경줄 기세포 (NSC), 유전자 조작 및 마우스 (GEM) 10-14 확립 포함한다. 대뇌 피질의 성상 및 NSC - - floxed 종양 대립 유전자의 다양한 조합을 품고 GEM에서 수확 우리는 차 뇌 세포를 활용 대안, 비 생식 GEM (nGEM) 모델 15을 개발했다. 목적 표현형 I에서 전임상 약물 개발을위한 시험 관내 및 생체 내 모두에서 특징 및 잠재적으로 이용 될 수있는 유 전적으로 정의 성상 세포종 세포 모델을 생성 할 수 있었다mmune 능력있는 마우스.

설립 인간의 세포 라인 그들은 곧장 앞으로, 기술적으로 널리 사용할 수 있습니다. 성상 세포종의 발병 기전 및 생체 외 및 생체 내에서 약물 반응의 가장 일반적으로 사용되는 모델이며, 면역 결핍 쥐 10,11,16-18에서 소성을 xenografting에 따라 반응 속도와 발암을 정의한 . 이들 단점은 높은 성상 세포종에 연구를 제한 뇌 성상 세포종에서 확립 세포주를 생성하는 무능력을 포함한다; 기원의 정의 셀의 부족; 종종 원래의 환자 샘플에서 현저하게 차이가 게놈 프로파일 복잡한 게놈 이상의 존재; 그리고 감수성 혈청 11,17,19-22 직렬 문화 중 표현형 및 유전자형 드리프트. 설립 인간의 GBM 세포 라인의 개별 종양 돌연​​변이의 표현형의 결과는 종종 eluc을 배제 실제로 존재하는 이상,의 무리에 의해 마스크 될 수있다직접 유전자형 - 표현형 결과의 idation.

PDX는 면역 결핍 마우스 또는 면역 결핍 생쥐 12,23의 뇌에 소성을 주입 이전에 정의 된 무 혈청 배지에서 비 부착 회전 타원체로 그들의 문화를 통해 환자 격리 성상 세포종 세포의 피하 통로를 통해 생성됩니다. PDX보다 정확하게 인간 성상 세포종의 게놈 프리를 유지하지만, 인간의 확립 세포주 유사한 개별 발암 돌연변이 표현형 효과는 그들의 게놈 19,24 복잡성으로 인해 마스크 할 수있다. 특히 신규 한 치료법에 대한 응답으로, 특정 종양 돌연​​변이 표현형 결과를 정의하는 확립 인간 세포주 또는 PDX의 패널은 자주, 유전자형 표현형의 상관 관계를 확립 일반화를 보여주고, 세포주 특정 효과의 가능성을 최소화하기 위해 이용된다. PDX 정확하게 인간의 별아교 세포종, INC의 조직 병리학 적 특징을 요점을 되풀이하는 동안내습 luding 확립 인간 세포주의 동 소성은 일반적으로 이종 이식편을 수행하지 21,23,25. 또한, 정상적인 인간의 성상 및 NSC는 시험관 및 생체 내 13,14,26에서 성상 세포종의 종양을 모델로 정의 된 발암 돌연변이 유전자 설계되었다. 이러한 세포는 인간의 확립 세포주 및 PDX 게놈의 복잡성이 부족하고 정확하게 인간 성상 세포종의 조직 병리학 요점을 되풀이하지만, 생체 내에서 면역 결핍 설치류 xenografting을 필요로한다. 인간의 모든 세포 모델은 면역 매개 이종 이식 거부 반응을 방지하기 위해 면역 결핍 쥐 호스트를 요구하기 때문에,이 모델은 기질 타겟팅 및 면역 조절 성 전임상 연구를 제한 동계 체제의 기본 종양 기질 상호 작용을 요점을 되풀이하는 데 실패하고 그대로 면역 체계 부족 10, 11를 치료.

종양 무타 소정 조합의 표현형 결과의 GEM 허가 심사현장 종양에있는 동안 생체 내에서 tions. 비 조건부 GEM 개발을 통해 모든 조직 내에서 돌연변이를 가지고있는 반면, 조건부 GEM은 세포 유형 - 특이 적 프로모터 10,11,15,18의 사용을 통해 특정 세포 유형에 Cre 호텔 매개 재결합을 제한하여 돌연변이의 대상으로 사용 발암 대립 유전자를 floxed있다. 조건부 성상 세포종의 GEM은 그대로 뇌 (11) 내에서 서로 다른 종류의 세포에 발암 성 변이의 기능적 역할을 규명하기 위해 이용되고있다. 조건부 GEM을 사용 시츄 gliomagenesis에서의 전임상 유틸리티 1) 생체 외 상관 관계의 부족, 복합 유전형과 시츄 종양 발생에서의, 3) 긴 레이턴시를 마우스의 큰 코호트를 생성하는 2)의 어려움을 포함하여 많은 요인에 의해 제한된다 4) 확률 적 종양 진행. 반응계에서 종양이 대응 관내 모델이 부족하기 때문에, 시험 관내 시험은 약물 w 수행 할 수없는기존의 i 번째 조건 GEM 모델. 다른 암과는 대조적으로, 성상 세포종의 조건부 GEM 모델은 거의 하나의 종양 유전자 돌연변이 (11)에 의해 유도되지 않는다. 따라서, 복잡한 사육 방식은 여러 종양 돌연​​변이 조건부 GEM을 생성해야합니다. 높은 성상 세포종으로의 진행은 일반적으로 불균일, 확률 적으로 발생하고 궁극적 복잡한 게놈 경관과 빠른 성장 동역학 (27)과 종양 상승을 제공하면서 또한, 성상 세포종 개시는이 모델에서 오랜 지연 기간 후에 가변 투과도 발생, 28. 조건부 GEM 모델에서 변수 투과도 및 악성 진행의 확률 적 특성은 개별 쥐가 임상 약물 시험에서 자신의 등록 전에 높은 성상 세포종의 존재 및 위치를 검출하기 위해 방사선 촬영으로 검사를해야합니다. 함께 찍은, 이러한 제한은 홍보에 필요한 생성 및 조건 GEM의 대규모 코호트 시험을 방해e 임상 약물 검사.

특정 신경 세포 유형의 바이러스 성 수용체 (TVA)를 표현하기 위해 설계 GEM 감염 조류 레트로 바이러스 (RCA 단자) 벡터를 이용하여 RCA 단자-TVA의 GEM 시스템은 광범위하게 성상 세포종의 종양 (11)를 모델로 활용되고 있습니다. 조건부 GEM과 대조적으로,이 모델 시스템은 복잡한 육종 계획에 대한 요구없이 특정 세포 유형에서의 다중 발암 돌연변이의 도입을 가능하게한다. 그러나, 가변 투과도 적극적 바이러스 통합을 달성하기 위해 세포를 분할하기위한 요구, 및 숙주 게놈 (29)에 도입 유전자의 임의의 삽입에 의해 제한된다.

그들은 다른 모델 시스템 (15)의 많은 한계를 극복하기 때문에 GEM에서 수확 세포를 활용하는 비 생식 GEM (nGEM) 모델은 점점 더 중요 해지고있다. 성상 세포종의 병인 세포 유형과 공동 발생 돌연변이를 개시 역할 억제하기 어렵다이들은 악성 진행 중에 미정 세포 유형에서의 광범위한 유전 적 돌연변이를 축적 말기 종양으로부터 유도되기 때문에 내 인간 GBM 세포주 또는 PDX 설립 사용. 대조적으로, 성상 세포종 모든 등급은 특정 정제 뇌 세포 유형 11,30 내에 유전 변이를 유도함으로써 nGEM 정의를 사용하여 모델링 될 수있다. 따라서, 특정 유전자 돌연변이 세포 및 분자 표현형에 세포 유형의 영향을 시험 관내 및 생체 내에서 결정될 수있다. 설립 된 인간 GBM 세포주와 유사 nGEM를 사용 초기 시험 관내 약물 테스트는 동일한 셀을 이용한 생체 내 테스트에 대한 약물의 우선 순위를 사용할 수있다. 생체 내에서 종양 형성 후 orthotopically 면역 능력 한배 새끼 동계 (30)의 뇌에 nGEM 세포 동종 이식에 의해 결정될 수있다. 이러한 동 소성 이식 모델은 따라서뿐만 아니라 종래의 세포 상해의 생체 내 시험에서 허용차 치료를 대상으로하지만, 면역 조절 성 간질 - 표적으로 한 치료뿐만 아니라. 마지막으로, 종양의 개시 및 진행에 미세 환경의 역할은 동일 세포 유형에서 동일한 변이를 사용 nGEM 종래 GEM 모델 사이의 결과를 비교함으로써 결정될 수있다.

우리와 다른 일차 전지를 사용하여 성상 세포종 nGEM을 개발했다 - 성상, NSC, 또는 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (OPC) - GEM 30-34에서 수확을. 성상 세포종 nGEM 개발 배후의 이론적 근거는 잠재적 면역 유능한 동물에서 시험 관내 약물 전임상 시험 및 생체 내에서 사용될 수있는 특정 유형의 세포에서 발암 돌연변이 표현형 결과를 결정하는 모델을 생성 하였다. 사포닌에 loxP /에 loxP 또는 TgGZT - 우리는 표현 표현형 WT 대뇌 피질의 성상 세포 및 비 Cre 호텔에서 NSC, floxed RB 경로와> 94 % C57 / BL6 배경에 유지 조건 GEM 수확121 - 다양한 조합 35-39에서 유전자 - NF1에 loxP /에 loxP, Kras은 G12D, PTEN을에 loxP /에 loxP - 및 RTK / RAS / PI3K 통로를 floxed. 우리는 Cre 호텔 재조합 효소를 암호화하는 아데노 바이러스 벡터를 사용하여 시험 관내에서 유전자 재조합을 유도. 대뇌 피질의 성상 세포 수확은 세포 유형의 혼합물을 포함하기 때문에, 우리는이 문화 GFAP + 대뇌 피질의 성상 세포에 풍부하게, 같은 TgGZT 인간 GFAP 프로모터에서 쫓겨 121 Ad5GFAPCre 벡터 지배적 발암 유전자를 사용했다. 우리는 생체 외 및 생체 내에서 대뇌 피질의 성상 및 NSC의 표현형 G 1 / S의 결과 (굽은), MAPK와 PI3K 통로 돌연변이를 정의했다. MAPK 및 PI3K 경로 활성 G1 / S 불량 아스트로 분자 모방 proneural 인간의 GBM과, 소성을 주입하면, 균일 한 성장 동역학, 짧은 대기 시간을 가진 사전 정의 된 위치에 형성된 종양 및 조직 병리학인간의 GBM (30)의 알 특징. 생체 내에서 종양 성장의 종 모니터링 치료 40 님의 질문에 답변 처리 동료와 종양 성장의 정량 분석의 정상화를 통해 전임상 약물 검사를 도움이됩니다. 우리는 루시퍼 라제는 대뇌 피질의 성상을 표현 주입 한 쥐의 종 생물 발광 영상으로 종양의 성장 속도론을 결정했다. 따라서 조건부 GEM에서 파생 된 대뇌 피질의 성상 및 NSC는 성상 세포종 관련 돌연변이의 기능적인 결과와 임상 약물 개발을위한 잠재적 인 모델 시스템의 정의에 대한 다루기 쉬운 모델 시스템을 제공한다.

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Protocol

모든 동물 연구는 노스 캐롤라이나 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.

신생아 쥐에서 1 배양 대뇌 피질의 성상

  1. 준비
    1. 2-3 섬세한 작업 조직을 구겨 및 70 % 에탄올을 함유하는 플라스크의 바닥에 놓는다. 해부 가위, 곡선 포셉이 플라스크에 넣고 바로 마이크로 포셉의 이쌍를 놓습니다. 조직은 마이크로 집게를 구부러지지 않도록하는 데 사용됩니다.
    2. 60mm 조직 배양 접시에 HBSS 1 ML을 추가합니다. 각 동물에 대해 별도의 접시를 준비하고 얼음에 요리를 유지한다.
    3. 기관의 규정에 따라 동물을 마취.
    4. 따뜻한 10 % 소 태아 혈청 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (완료 DMEM) 37 ° C의 물을 욕조에 각 동물에 대한과 DMEM 7 ML. 참고 : 5 쥐를 들어, 1.1.1-1.1.4은 ~ 15 분 소요됩니다 단계를 반복합니다.
  2. 조직 수확
    1. instituti 당 신생아 마우스 (일 1-3) 희생ONAL 규정.
    2. , 에탄올 해부 가위를 제거 그들을 건조 똑 수 있도록하고, 코 척수의 두개골을 통해 피부에서 시상을 잘라주십시오.
    3. 척수에서 시작하여 후각 전구를지나 연장, 시상 봉합 따라 두개골에 상처를 확인합니다. 뇌 조직의 손상을 최소화하기 위해 두개의 내측 표면 근처 가위 끝을 유지하는데주의를 기울여야.
    4. 곡선 집게를 사용하여 부드럽게 옆으로 떨어져 뇌에서 두개골의 각 반구 껍질.
    5. 바로 마이크로 집게를 사용하여 부드럽게 각 대뇌 피질 반구의 등 부분을 멀리 집어 HBSS를 포함하는 조직 배양 접시에 놓습니다. 소뇌와 후각 망울 않도록주의하십시오. 뇌량 아래의 모든 조직을 복용하지 마십시오.
    6. 해부 현미경 및 마이크로 포셉의 이쌍을 사용하여, 부드럽게 각 대뇌 피질 반구에서 수막을 제거합니다. 조직 homogenizatio을 시작하기까지 얼음에 조직 배양 접시를 돌려명.
    7. 추가 할 때마다 동물에 대한 1.2.6을 통해 1.2.1 단계를 반복합니다. 참고 : 5 쥐를 들어, 1.2.1-1.2.7은 ~ 30 분 소요됩니다 단계를 반복합니다.
  3. 조직의 균질화
    1. 깨끗한 면도날을 사용하여 미세 대뇌 피질 반구 주사위와 조직 문화 후드에 접시를 이동합니다.
    2. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 다이 싱 조직을 전송합니다. 얼음 차가운 HBSS의 1 ㎖로 접시를 씻고 조직을 포함하는 튜브에 전송할 수 있습니다.
    3. 조직 튜브의 바닥에 놓일 때까지, 조심스럽게 피펫을 사용하여 초과 HBSS 제거 기다립니다.
    4. 실내 온도 트립신 / EDTA 2 ㎖를 추가합니다. 1 ML의 피펫 피펫 ~ 10 배 더 세포를 떼어 놓다.
    5. 20 분 - 15 37 ° C에서 세포 현탁액을 품어. 조심스럽게 반전에 의해 5 분마다 섞는다.
    6. 트립신을 억제하는 완전한 DMEM 3 ㎖를 추가합니다. 1 ML의 피펫 피펫 ~ 10 배 솔루션을 혼합합니다.
    7. 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리기.
    8. 제거1 ML 피펫으로 상층 액. 펠릿이 느슨하기 때문에 매체를 대기음하지 마십시오.
    9. DMEM을 완료 C 37 °의 4 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 75cm에 세포 현탁액을 이동시켜 상부 조직 배양 플라스크를 조입니다. 참고 : 5 쥐를 들어, 1.3.1-1.3.9은 ~ 50 분 소요됩니다 단계를 반복합니다.
    10. 약 성상 세포의 수확 후 16 시간 후 DMEM을 완료 C 4​​ ml의 37 °를 추가, 37 ° C HBSS의 4 mL로 플라스크를 씻어. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 대뇌 피질의 성상을 유지한다. 참고 : 세척 단계는 배양 접시에서 비 부착 세포의 제거 및 이물질이 중요합니다.
    11. 문화가되면 ~ 95 %의 합류는 5 %에서 37 ° C에서 하룻밤 흔들 CO 2, 분리 된 세포를 포함하는 미디어 다음, 37 ° C HBSS의 4 mL로 플라스크를 씻어 제거합니다. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 세포를 DMEM을 완료하고 유지 C 37 °의 4 ML을 추가합니다. 참고 :이 단계는 대뇌 피질의 성상 세포에 대한 문화를 풍부하게하는 것이 중요하다, 미세 아교 세포를 오염으로하고희소 돌기 아교 세포의 전구 세포는이 절차를 분리하고 문화 41에서 제거됩니다.
    12. 반복 각 동물에 대한 1.3.1-1.3.11 단계를 반복합니다.
  4. 유전자 재조합 유도
    1. 24 시간 1.3.11 단계를 완료 한 후, DMEM을 완료 C 37 °의 2 ㎖로 매체를 교체합니다. Ad5CMVCre 또는 Ad5GFAPCre의> 10 10 PFU / ㎖의 1 μl를 포함하는 37 ° C SCM의 1 ML을 추가합니다. 사용 BSL2 안전주의 사항 처리 재조합 아데노 바이러스 : 5 % CO 2 .CAUTION에서 32 ° C에서 6 시간 동안 품어.
    2. 바이러스가 포함 된 용지를 제거하고 대뇌 피질의 성상 세포에 바이러스없이 37 ° C 완전한 DMEM을 추가합니다. 주의 : BSL2 안전주의 사항 재조합 아데노 바이러스를 처리하는 제도적 규제 당 바이러스 함유 미디어를 폐기 할 때. 참고 : - ~ 6 시​​간 배양을 제외한 15 분 소요됩니다 1.4.3 5 성상 세포 배양의 경우, 1.4.1 단계를 반복합니다.
    3. 에 대한 대뇌 피질의 성상 세포 배양 확대체외 및 생체 특성에. 참고 : 재조합 유전자 또는 특정 돌연변이 단백질이나 신호 결과 중 하나에 대한 immunoblots에 의해 특정 프라이머와 PCR에 의한 Cre 호텔 - 재조합 다음 돌연변이의 존재를 확인합니다. Cre 호텔 - 재결합 후 대뇌 피질의 성상 세포 배양의 표현형 안정화에 필요한 시간은 사용되는 돌연변이에 의존하고 경험적으로 (그림 2)를 결정해야합니다.

신생아 쥐에서 2 배양 신경 줄기 세포

  1. 준비
    1. 98 mM의 나 2 SO 4, 30 mM의 K 2 SO 4, 5.8 mM의 MgCl2를, 0.25 mM의 염화칼슘 2 - 절개를 시작하기 전에, 3.1 mg의 파파인 및 4 ml의 해리 배지에 1.3 mg의 시스테인을 첨가함으로써 뇌 당 4 ㎖의 소화 용액을 조제 , 1 mM의 HEPES 20 mM의 포도당, 0.001 % 페놀 레드, 0.125 mM의 수산화 나트륨 (1 M HEPES pH를 7.4 재고). 파파인의 추가그리고 해리 매체에 시스테인은 솔루션 노란색으로 변합니다.
    2. 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 반전에 의해 주기적으로 섞는다.
    3. 소화 용액이 붉은 색 빛을 반환 할 때까지 0.1 M NaOH를 드롭 현명 추가합니다.
    4. 조직 배양 후드에서, 살균 필터 주사기 필터 (0.22 μm의 기공 크기)를 사용하여 분해 용액. 얼음에 소화 솔루션을 유지합니다.
    5. 44.5 ㎖의 NSC 기초 중간 5 ML NSC 보충, 0.5 ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 50 ㎕의 0.2 % 헤파린, 10 μL 100 μg / ml의 EGF, 10 ㎕를 100 ㎍ / ㎖의 혼합에 의해 줄기 세포 중간 (SCM) 50 ㎖를 준비 bFGF를. 4 ° C에서 저장 될 때 SCM은 일주에 대한 안정적이다.
    6. 완전한 HBSS (cHBSS) 배 HBSS 50 ㎖, 1.25 ㎖의 1 M HEPES (pH를 7.4), 혼합하여 제조 15 ml의 1 M D-글루코스, 5 ㎖의 100 mM의 염화칼슘, 5 ㎖의 100 mM의 황산, 및 2 ㎖의 1 M 탄산 수소 나트륨. DDH 2 O.과 500 mL의 전체 볼륨을 가져와
    7. cHBSS 재치를 살균 필터4 ° C에서 헥타르 0.2 μm의 기공 크기의 필터 및 저장.
    8. 2-3 섬세한 작업 조직을 구겨 및 70 % 에탄올을 함유하는 플라스크의 바닥에 놓는다. 해부 가위, 곡선 포셉,이 플라스크에 넣고 바로 마이크로 포셉의 이쌍를 놓습니다. 조직은 마이크로 집게를 구부러지지 않도록하는 데 사용됩니다. 참고 : 5 쥐를 들어, 2.1.1-2.1.8은 ~ 45 분 소요됩니다 단계를 반복합니다.
  2. 조직 수확
    1. 제도적 규제 당 신생아 (일 1 ~ 3) 마우스를 희생.
    2. , 70 % 에탄올에서 해부 가위를 제거 그들을 건조한 똑똑 떨어지는 것을 허용하고, 코 척수의 두개골을 통해 피부에서 시상을 잘라주십시오.
    3. 척수에서 시작하여 후각 전구를지나 연장, 시상 봉합 따라 두개골에 상처를 확인합니다. 뇌 조직의 손상을 최소화하기 위해 두개의 내측 표면 근처 가위 끝을 유지하는데주의를 기울여야.
    4. 곡선 집게를 사용하여 부드럽게 옆으로 멀리에서 두개골의 각 반구를 벗겨뇌.
    5. 조심스럽게 차가운 얼음 cHBSS에 전체 뇌와 장소를 제거합니다.
    6. 해부 현미경을 사용하여, 신중하게 미세 해부 도구를 사용하여 뇌에서 수막을 제거합니다.
    7. 그 바닥면에 뇌를 놓고 크기 11 메스로 잘라 세로 (관상)와 소뇌 / 후뇌 및 후각 망울 / 전두엽 피질을 제거합니다.
    8. 따라서 뇌의 관상보기를 생성, 꼬리 부분에 배치하기 위해 90 °로 남아있는 두뇌를 회전합니다. 측면 심실을 찾습니다.
    9. 뇌실 영역 (SVZ)를 포함하는 입방체 섹션을 잘라.
    10. 크기 11 메스와 신선한 얼음 냉 cHBSS을 말하다 조직과 60mm 조직 배양 접시에 조직을 SVZ이 함유 전송합니다.
    11. 멸균 15 ML 튜브에 다진 조직을 전송합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다.
    12. 1 ~ 2 ㎖의 얼음 차가운 cHBSS와 페트리 접시를 씻으십시오. 조직을 함유하는 튜브에 세척액을 전송.
    13. 반복하여 neonata와 2.2.1-2.2.12 단계L 생쥐 필요한 경우. 프로토콜의 나머지 조직 문화 후드에 모두 15 ml의 튜브를 전송합니다. 참고 : - ~ 45 분 소요됩니다 2.2.13 5 쥐를 들어, 2.2.1 단계를 반복합니다.
  3. 조직의 균질화
    1. 5 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에서 소화 용액 (2.1.1 단계에서 제조)를 놓습니다. 또한, 37 ° C의 물을 욕조에 머리 당 따뜻한 두 ML의 SCM.
    2. 조심스럽게 한 ML의 피펫 다진 조직의 상층 액을 제거합니다. 대기음하지 마십시오.
    3. 15 ML 튜브 당 2 ㎖의 37 ° C 소화 솔루션을 추가하고 반전 조심스럽게 섞는다.
    4. 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 반전에 의해 5 분마다 섞는다.
    5. 각 튜브 단계를 반복 2.3.4 37 ° C 소화 솔루션의 또 다른 2 ML을 추가합니다.
    6. 세포가 중력에 의해 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 허용 한 후 1 ㎖의 피펫을 사용하여 소화 조직에서 뜨는을 제거합니다.
    7. cHBSS에 희석 10 μM E-64 2 ㎖를 추가하고 반전 조심스럽게 섞는다.
    8. 세포가 중력에 의해 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 허용하고 소화 조직에서 뜨는을 제거합니다.
    9. 37 ° C cHBSS 1 ㎖를 추가하고 1 ML의 피펫 팁 (~ 20 타)로 균질화. 조직 균질화하는 동안 공기 방울을 주입하지 마십시오.
    10. 다음 37 ° C cHBSS 5 ㎖을 사용하여 여과기를 씻어, 40 μm의 기공 크기의 셀 스트레이너를 통해 조직 균질을 전달합니다.
    11. 5 분 동안 125 XG에 조직 파쇄 액을 원심 분리기.
    12. 세포 펠렛을 방해하지 않고 1 ml의 피펫으로 상층 액의 95 %를 제거합니다. 200 μL 피펫 팁 200 ㎕를 37 ° C SCM에서 조심스럽게 재현 탁 세포 펠렛.
    13. 1.8 ml의 37 ° C에서의 SCM을 추가하고 무균 6 웰 플레이트의 웰에 세포 현탁액을 전송합니다. 참고 : 5 쥐를 들어, 2.3.1-2.3.14은 ~ 75 분 소요됩니다 단계를 반복합니다.
  4. 신경 줄기 세포 배양
    1. 또 다른 2 ㎖의 37 °를 추가하여 삼일 후 매체를 보충C SCM.
    2. 칠일 후, 15 ML 튜브에 neurosphere를 전송하고 neurosphere를가> 5 분 동안 중력에 의해 해결하자.
    3. 상층 액을 제거하고 2 ㎖의 37 ° C SCM을 추가합니다.
    4. 6 웰 플레이트의 웰에 새로운 neurosphere를 옮긴다.
    5. 모든 3~4일 37 ° C SCM의 2 ML을 추가, 모든 칠일 매체 완전히 변경합니다.
    6. neurosphere를 직경> 100 μm의 경우, 신중 줄기 세포 해리 용액으로 해리 및 원하는 세포 밀도에 NSC를 replate.
  5. 유전자 재조합 유도
    1. 현재 셀에 SCM의 2 ml의 Ad5CMVCre 또는 Ad5GFAPCre의> 10 10 PFU / ㎖의 1 μl를 포함하는 37 ° C SCM의 1 ML을 추가합니다. 주의 : BSL2 안전주의 사항 재조합 아데노 바이러스를 처리.
    2. 5 % CO 2에서 32 ° C에서 6 시간 동안 품어.
    3. 15 ML 튜브에 neurosphere를 함께 SCM을 전송하고 구체가 5 분 동안 중력에 의해 정착하자.
    4. 다음 200 μL 피펫, 1 ML의 피펫 첫번째 뜨는을 제거합니다. 주의 : BSL2 안전주의 사항 재조합 아데노 바이러스를 처리하는 제도적 규제 당 바이러스 함유 미디어를 폐기 할 때.
    5. 6 웰 플레이트에 전송 한 후, NSC에 바이러스없이 37 ° C SCM 2 ㎖를 추가합니다. 참고 : 5 NSC 문화를 들어, 2.5.1-2.5.5가 ~ 6 시​​간 배양을 제외한 15 분 소요됩니다 단계를 반복합니다.
    6. 다음 날, 반복 필요에 neurosphere의 계대 다음, 2.5.1-2.5.5 단계를 반복합니다. 구체 해주기 관내 특성화 및 생체 내 마우스 뇌 정위 주사 전에 2-3 통로 위해 확장 될 수있다. 참고 : 재조합 유전자 또는 특정 돌연변이 단백질이나 신호 결과 중 하나에 대한 immunoblots에 의해 특정 프라이머와 PCR에 의한 Cre 호텔 - 재조합 다음 돌연변이의 존재를 확인합니다. Cre 호텔 - 재결합 후 NSC 문화의 표현형 안정화에 필요한 시간은 달려있다(그림 2, 3) 사용 된 돌연변이들에 대한 경험적으로 결정해야합니다.

받는 사람 Iimmunocompetent 쥐의 뇌에 재조합 세포의 3 동 소성 사출

  1. 5 % 메틸 셀룰로오스의 제조
    1. 100 ㎖에서 50 ㎖의 최종 부피의 탈 이온수에 15 CPS 메틸 셀룰로오스 5g을 용해는 캡 스크류 병. 응집을 방지하기 위해 4 ° C에서 교반하면서 천천히 분말을 추가합니다. 이 솔루션을 입력 할 수있는 모든 메틸 셀룰로오스 4 °​​ C에서 교반의 24 시간까지 걸릴 수 있습니다.
    2. 병의 무게를 측정하고 무게를 기록한다.
    3. 5 % 메틸 셀룰로오스 용액을 압력솥. 멸균 후에, 메틸 셀룰로스는 반고체 겔해질 것이다.
    4. 병의 무게를 측정하고 고압 증기 멸균하는 동안 손실 무게를 계산합니다.
    5. 무균 손실 무게의 모든 g에 멸균 수 1 ㎖를 추가합니다.
    6. 얼음에 넣고 50 ㎖의 얼음의 차가운 배 DMEM을 추가합니다. </ 리>
    7. 4 ° C에서 하룻밤 자기 교반기를 사용하여 섞는다. 20 ㎖의 분취 량에 5 % 메틸 셀룰로오스 솔루션을 분할하는 멸균 기술을 사용합니다. 최대 6 개월 또는 2 배 DMEM이 만료 될 때까지 4 ° C에서 보관 분취. NOTE : 단계 5 % 메틸 셀룰로오스 용액의 조제 3.1.1-3.1.7 ~ 2.5 일이 걸릴 것이다.
  2. 사출을위한 두피 성상의 준비
    1. 피질 별아교 세포 수확시 ~ 90 % 합류.
    2. , 수확 흡인 완료 DMEM, 37 ° C HBSS의 동일한 볼륨 플레이트를 세척합니다.
    3. 플레이트를 커버하기에 충분한 트립신을 추가합니다. 조심스럽게 기울 세포가 분리 시작할 때까지 판을 누릅니다.
    4. DMEM을 완료 C 37 °의 동량 트립신을 비활성화합니다.
    5. 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 3.2.4에 사용되는 37 ° C 완전한 DMEM의 동일한 볼륨으로 접시를 씻으십시오.
    6. 세포를 포함하는 튜브에 세척 미디어를 전송합니다. 3 분 동안 200 XG에 원심 분리기.
    7. 기음의1 ML 37 °에서 upernatant 및 재현 탁 세포는 DMEM을 완료 C.
    8. 세포 / μL의 수를 결정하는 혈구 또는 다른 적합한 세포 계수기를 사용하여 세포 현탁액 횟수​​.
    9. 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 세포의 수를 전송합니다. 3 분 동안 200 XG에 원심 분리기.
    10. 37 °의 800 μL에 재현 탁 세포는 DMEM을 완료 C. 세포 펠렛의 체적 (- 800 ㎕의 세포 현탁액의 총량)을 결정한다. 참고 :이 주사에 대한 정확한 세포 농도를 달성하기 위해 필수적이다. 이와 같이, 세포 펠릿의 부피는 단계 3.2.12에서 추가 5 % 메틸 셀룰로오스의 양을 계산하기 위해이 단계에서 결정되어야한다.
    11. 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포를 전송 한 후 3 분 동안 200 XG에 원심 분리기.
    12. 대기음 세포 펠렛으로부터 상층 액을 얼음처럼 차가운 5 % 메틸 셀룰로오스의 적절한 부피 피질 성상 세포를 재현 탁은 (총 부피를 원하는 - 볼륨세포 펠렛) 세포 / μL의 수를 얻었다.
    13. 사출까지 얼음 세포를 놓습니다.
    14. 다음 주사기에 뭉툭한 18 G 바늘을 배치 반복 항원 디스펜서에 250 μL 유리 주사기를 놓습니다.
    15. 대뇌 피질의 성상 세포 현탁액 바늘로 천천히 플런저를 철회; 기포가 압축 실제로 뇌에 주입 부피를 줄이기 때문에, 제거해야 세포 상기 기포가있을 것이다.
    16. 바로 대뇌 피질의 성상 세포 현탁액 위 바늘의 끝 부분을 잡고 빠르게에서 플런저를 밀어 넣습니다. 기포 빠르게 세포 현탁액보다 이동 주로 배출된다.
    17. 모든 공기 방울까지 단계를 반복 3.2.16 바늘에서 제거됩니다.
    18. 약 ~ 200 μL에 주사기를 입력 한 다음 바늘을 잡고 멈출 때까지 다시 플런저를 잡아 당깁니다. 작은 기포는 바늘 끝을 잡고 빠르게 약 5 플런저를 밀고에 의해 제거 될 수있다0 μL는 천천히 전체 용량 철회.
    19. 똑바로 팁을 유지하고 단계 3.2.18 4-5x를 반복합니다.
    20. 18 게이지 바늘을 취소하고 주사기에 27 G 바늘을 장착한다.
    21. 유체가 바늘에서 추방 될 때까지 항원 디스펜서에있는 버튼을 누릅니다. 주 : 1 성상 세포 세포주를 들어, 3.2.1-3.2.21은 ~ 60 분 소요됩니다 단계를 반복합니다.
  3. 사출에 대한 NSC의 준비
    1. neurosphere를 직경으로> 100 μm의 경우, 15 ml의 튜브에 전송하고 neurosphere를가> 5 분 동안 중력에 의해 해결하자.
    2. 상층 액을 제거하고 줄기 세포 분리 용액 또는 42에 설명 된대로, 제조업체의 지침에 또는 0.05 % 트립신-EDTA에 따라 accutase 같은 부드러운 해리 시약 neurosphere를을, 해리.
    3. 혈청에 NSC를 노출하지 않고 제조업체의 지시에 따라 해리 시약을 억제한다. 5 분 동안 100 XG에 원심 분리기.
    4. 세포 / μL의 수를 결정하기 위해 다른 적절한 또는 혈구 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트.
    5. 새로운 15 ML 원뿔 관에 NSC의 수를 전송합니다. 5 분 동안 100 XG에 원심 분리기.
    6. 37 ° C HBSS의 800 ㎕의 세포를 재현 탁. 세포 펠렛의 체적 (- 800 ㎕의 세포 현탁액의 총량)을 결정한다. 참고 :이 주사에 대한 정확한 세포 농도를 달성하기 위해 필수적이다. 따라서, 세포 펠렛 부피의 단계 3.3.9에서 추가 5 % 메틸 셀룰로오스의 양을 계산하기 위해이 단계에서 결정되어야한다.
    7. 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 세포를 전송 한 후 5 분 동안 100 XG에 원심 분리기.
    8. 뜨는을 대기음 3.2.12-3.2.21 같이 소성을 주입 세포를 준비 완료. 주 : 1 NSC 세포주를 들어, 3.3.1-3.3 단계를 반복합니다.9 ~ 60 분 소요됩니다.
  4. 사출에 대한 마우스의 준비
    1. 기관 IACUC 가이드 라인 당 250 ㎎ / ㎏ AVERTIN (2,2,2 Tribromoethanol) 또는 100 ㎎ / ㎏의 케타민 (ketamine) 플러스 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 (xylazine)의 IP 주사를 통해받는 동물을 마취. 참고 : 활용은 여기에 동종 이식 호스트로 연령 3-6 개월에 마우스입니다. 다양한 연령의 마우스는 종양의 발달 뇌 나이의 미세 환경의 영향을 조사하기 위해 이용 될 수있다.
    2. 가위 또는 가위로 절개 사이트를 통해 두피를 면도.
    3. 70 % 에탄올 및 betadine 3 교대 면봉으로 수술 부위를 소독.
    4. 깜빡임의 손실로 인한 손상을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용합니다.
    5. 페달 철수 (발가락 핀치) 반사에 의한 마취의 깊이를 평가합니다. 참고 : 5 쥐를 들어, 3.4.1-3.4.5은 ~ 15 분 소요됩니다 단계를 반복합니다.
  5. 동 소성 이식
    1. 고정대에 동물을 고정합니다.
    2. 막눈과 귀 사이에 약 0.5 cm 긴 시상 봉합을 통해 절개를 전자.
    3. 관상 및 시상 봉합 (브레 그마)의 교차점뿐만 아니라 lambdoid 및 시상 봉합 (람다)의 교차점을 찾습니다. 브레 그마 및 람다 같은 수평면에 있는지 확인하십시오.
    4. 주사기 세포 현탁액을 포함하고 머리 고정대에 항원 디스펜서 반복을 연결합니다. 브레 그마와 접촉 27 G 바늘의 끝을 가져와. 이 삼차원 좌표의 조작에 사용되는 원점이다.
    5. 두개골 표면에서 약간 바늘을 올리고 2mm 측면과 브레 그마에서 1mm의 주동이를 이동합니다.
    6. 브레 그마에서 대상 4mm의 복부에 두개골을 통해 조심스럽게 바늘을 낮 춥니 다. 참고 : 우리는 기저핵을 대상으로하도록 정위 좌표를 이용했다. 다른 정위 좌표 상이한 미세 환경의 영향을 조사하기 위해 이용 될 수있다종양의 뇌 영역.
    7. 반복 항원 디스펜서를 한 번 활성화하여 세포 현탁액의 5 μL를 주입한다. 이 분은 두개 내 압력이 평형을 할 수 있도록 장소에서 바늘을 둡니다.
    8. 서서히 30 초 동안 바늘을 철수. 발생할 수있는 출혈에 압력을 적용하기 위해 면봉을 사용합니다.
    9. 상처 가장자리 대략적인 조직 접착제를 사용하여 절개를 닫습니다. 절개 사이트에서 리도카인의 피하의 20 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. 참고 : 5 쥐를 들어, 3.5.1-3.5.9은 ~ 50 분 소요됩니다 단계를 반복합니다. UNC IACUC는 국소 마취의 수술 후 사용을 승인했다. 지역 기관 IACUC와 상담이 수술 후 수술 후 진통제 사용을위한 요구 사항에 좋습니다.
  6. 수술 후 케어
    1. 복구 할 수있는 깨끗하고 따뜻한 케이지에 동물을 배치합니다. 실수로 흡인이 발생할 수 있으므로 동물은 직접 침구에 배치 할 수 없습니다.
    2. 관찰이러한 정리, 식사, 배변 등의 정상적인 동작의 재개를위한 동물. 주 : 정상적인 동작의 재개가 ~ 60 분 걸릴 수 있습니다.

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Representative Results

우리는 표현형 생체 외 및 생체 특징으로 할 수있다 조건부 종양 대립 유전자 (그림 1) floxed 신생아 GEM의 숨겨에서 수확 대뇌 피질의 성상 및 NSC와 nGEM 모델 시스템을 개발했다. 구체적으로는 시험 관내에서 피질 별아교 세포의 발암 돌연변이의 영향을 조사하기 위하여, 성상 세포에 대한 제 풍부하는 것이 중요하다. 두피 성상 세포는 미세 아교 세포 수확, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트, OPC 및 뉴런의 혼합물을 포함하지만, 기계적 및 유전 적 방법은 성상 세포 농축에 도움을 줄 수있다. 뉴런 정상 배양 조건 하에서 다이 반면, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포는 41,43 밤새 진탕 제거 될 수있다. 또한, Ad5GFAPCre을 사용 GFAP + 성상 세포를 대상으로 floxed, 종양 대립 유전자의 유전자 재조합은 성상 세포에 풍부하게 할 수 있습니다. 우리는 플로와 사포닌에 loxP /에 loxP GEM 새끼에서 대뇌 피질의 수확을 감염시키기 위해이 방법을 사용고정 된 NF1에 loxP /에 loxP 및 / 또는 PTEN을에 loxP /에 loxP 대립 유전자. Ad5GFAPCre 감염 후 5 59 %> 90 %에서 성상 세포의 순도를 증가 재결합 GFAP + 성상 세포에서 증식 장점을 야기 - 배양 9 통로 (도 2a 및도 2b). 또한, 우리는 TgGZT 121 마우스 (그림 2C)에서 수확 성상 세포에서 증식 장점을 유도하기 위해 GFAP 프로모터의 제어하에 T (121)를 표현함으로써 성상 세포에 농축. 대뇌 피질의 성상 세포는 배양 접시 (그림 2C)에 부착 성장하는 동안, NSC는 체외 (그림 3A)의 비 접착 neurosphere를 성장. TRP라고도 TgGZT 121 (T), Kras은 G12D (R), 동형 접합체 PTEN을 삭제 (P - - - /) 재결합에 WT NSC와 NSC 모두 발암 대립 유전자를 floxed- / - 만 - NSC가 TgGZT (121)를 포함하는 GEM에서 수확 Cre 호텔 매개 재조합 (그림 3B) 후 T (121)을 표현하면서, NSC 마커 SOX2를 표현한다.

G 1 / S (굽은)이, MAPK 및 / 또는 PI3K 경로 변경이 GFAP의 성장에 미치는 영향을 확인하려면 + 성상 세포의 체외 증식이 두 가지 방법을 사용하여 조사 하였다. MTS 세포 카운팅 T 121 Kras은 G12D의 발현 피질 별아교 세포 (도 4A 및 4B)의 증식을 증가 하였음을 보여 주었다. 마찬가지로, 동형 접합 사포닌 (RB)에서 NF1 (N), 이형 PTEN을 (P +) 삭제도 증가 대뇌 피질의 성상 세포의 증식 (그림 4C)와 함께 삭제. 형질 전환 된 세포가 무제한 증식 능력을 가지고있다. 돌연변이 바뀌는 효과를 이용 COL 시험 관내에서 측정 할 수있다ONY 형성 분석. 이전 44 설명한대로 콜로니 형성 분석에 의해 대뇌 피질의 성상 교세포 - / - 따라서 우리는 TRP에서 T (121) 및 Kras은 G12D 표현과 동형 접합 PTEN을 삭제의 변화 효과를 시험했다. WT 성상 교세포가 식민지를 형성하지 않은 반면, T 성상 교세포는 1.03 %의 효율에서 식민지를 형성했다. 특히, TRP - / - 성상 세포는 6.40 % (표 1)에서 가장 높은 콜로니 형성 효율이었다. 전임상 약물 테스트에 적합하기 위해서는, 시험 관내 종양 모델에서 유전자 조작을 쉽게하는 것이 중요하다. 추가의 유전 적 변형이 안정적으로 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 의한 피질 별아교 세포 내로 도입 될 수있다. VSV-pseudotyped pMSCV의 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 - / - 성상 교세포 (배낭 - - / TRP) 예로서, 우리는 안정적으로 TRP 루시퍼 라제 유전자를 형질 도입. 루시 페라 제의 발현은 부모의 세포에 비해 발광 ~ 1000 배 증가 ( 시험관 내에서 표적 억제제의 효능을 결정하기 위해 사용될 수있다. 우리는 저용량 PI-103, mTOR의 이중 / PI3K 억제제로 처리가 세포 생존 능력에 영향을주지 않고 30 PI3K 신호를 억제하는 것이 앞에서 보여 주었다. 그러나, 높은 PI-103 용량의 세포 증식 억제 / 세포 독성 효과는 결정되지 않았다. 체외에서 성상 세포 성장 - / - 따라서, 우리는 PI-103는 TRP을 줄일 수 있는지 여부를 테스트했다. - / - 성상 세포의 성장 (그림 4E) PI-103는 TRP에서 최대 88 %의 감소를 일으키는 원인이되었다. 성상 세포는 생체 내에서 다른 임상 적 치료법을 테스트하기 위해 (슈미트는 등, 원고를 제출했다.) 45, 46 - / - 우리는 이전에 TRP의 동 소성 이식을 이용했다. 이러한 데이터는 조건부 GEM에서 수확 형질 피질 별아교 세포는 면역 능력이 마이크에서 전임상 약물 검사를 수행 할 수있는 유연한 모델 시스템을 제공 할 수 있음을 시사전자.

설립 인간의 세포 라인과 PDX의 이종 이식은 면역 결핍 호스트를 필요로한다. PDX 대조적으로, 많은 구축 인간 GBM 세포주 GBM의 조직 병리학 적 특징 요점을 되풀이하지 않는다. 예를 들어, 동 소성 U87MG 이종 이식 정상적인 뇌 (도 5a)을 침범하지 않은 외접 종양을 형성했다. 반면, TRP의 주입은 - / - 면역 능력, 동계 쥐의 뇌에 성상 세포는 인간의 대응, 정상 뇌 (그림 5B)의 특히 침략의 조직 학적 특징을 효과적으로 요약 침습적 종양을 얻었다. - / - 종 TRP 정량화 동종 성장을 생쥐마다 오일 세포 주입 후 희생시키고 종양 부담은 H & E 염색 섹션이 뇌에서 종양의 면적을 정량화하여 측정 하였다. 종양 영역 시간 (그림 5C)을 통해 기하 급수적으로 증가했다. 열 다섯 TRP의 소성을 주입 - / - R에 성상 교세포ecipient 뇌는 이십이일 (그림 5D)의 평균 생존 기간과, 신경 병적되었다. - / - NSC 피질 별아교 세포 외에, 우리는 TRP를 이용하여 소성을 주사를 시행 하였다. TRP - / - NSC 유래 종양 증식 긍정적 T (121)이었고, (그림 6) NSC 마커 SOX2의 발현을 유지했다. 조건부 GEM이 기간 동안 종양 형성을 유도하는 데 실패에서 참고, unrecombined와 WT C57BL / 6 마​​우스뿐만 아니라 표현형 WT 대뇌 피질의 성상 또는 NSC에서 수확 대뇌 피질의 성상 및 NSC의 주입, (데이터가 표시되지 않음) 발암 대립 유전자를 floxed. 생체 내 이미징 길이는 약물 치료 (40)에 응답하여 종양 성장 동력학을 모니터하는 데 사용되어왔다. 따라서, TRP는 - / - 루크 성상 직렬 생물 발광 이미징에 의해 결정 하였다 면역 능력 동계 한배 새끼 및 종양 성장의 뇌에 주사 하였다. 생물 발광 16 일 동안 15 배 증가(도 7a 및도 7b). 조건부 GEM에서 수확 대뇌 피질의 성상 및 NSC가 유전자 변형 및 표현형 시험 관내 및 유전학과 성상 세포종의 발병 기전의 세포 생물학의 정의에 대한 생체에있어서 잠재적으로 임상 약물 개발에 사용 될 수 있다는 것을 우리는 증명하고있다.

그림 1
nGEM에서 대뇌 피질의 성상 세포와 NSC 수확의 그림 도식. 표현형 WT 대뇌 피질의 성상 및 NSC 조건부 종양 대립 유전자와 GEM에서 수확했다. 유전자 재조합 AdCre 벡터를 체외에서 유도 하였다. 형질 전환 된 세포 표현형, 면역 능력의 뇌에 다양한 방법에 의해 소성을 주입함으로써 생체 내에서 생체 특징했다동계 한배 새끼.

그림이
체외에서 시리얼 계대시 GFAP + 성상 세포의 그림 2 농축. 사포닌에 loxP에서 수확 GFAP + 성상 세포를 보여주는 대표적인 면역 형광 이미지 / NF1에 loxP /에 loxP 및 / 또는 PTEN을에 loxP /에 loxP와에 loxP GEM 새끼가있는 유전자 재조합은 Ad5GFAPCre으로 유도 된 X 시간 (PX) 계대 배양 세포 (A). 패널 A. 바에서 GFAP + 성상 세포의 농축 정량 3-24 회 반복 (B)에서 표준 오류를 나타냅니다. 대표적인 면역 (위)와 위상차 (아래) 패스에서 GFAP 프로모터에서 T 121 표현 TgGZT 121 GEM 새끼에서 수확 부착 대뇌 피질의 성상 교세포의 이미지9 세 Ad5CMVCre 시험 관내 (C)와 재결합 후. 성상 세포는 다른 모든 통로에서 DAPI 염색 핵 (청색)의 총 개수로 나눈 GFAP + (녹색) 세포 수로 정량 하였다. 이미지는 10 배 원래의 배율 (A, C)에서 촬영되었다. 스케일 바는 100 μm의 (A, C)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
- / - GEM 그림 3 WT와 재결합 NSC는 TRP에서 수확. - / - 표현형 WT (위)와 TRP의 대표적인 위상 콘트라스트 이미지 (아래) NSC는 neurosphere를 시험관 (A) 성장 중. T 121 (녹색) 및 SOX2 대표적인 면역 형광 염색- / - (아래) neurosphere를 (B) WT (위)와 TRP에서 (적색) 식입니다. 스케일 바 대표 100 μm의 (A, B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
체외에서 대뇌 피질의 성상 교세포의 4 특성을 그림. WT 및 TR 피질 별아교 세포의 성장은 1-7 일 (A)에 세포를 계수함으로써 측정 하였다. WT 및 TR 피질 별아교 세포의 상대 광 밀도 (OD)는 MTS (B)에 의해 결정 하였다. WT의 상대적인 증가와 재조합 사포닌 - / -] NF1 - / -] PTEN을 +/- (RbNP +/-) MTS (C)에 의해 결정 하였다 아스트로. - / - 루시퍼 부모 TRP의 발광ASE 표현 TRP - / - 성상 교세포 (TRP - / - 루크) (D). - / - TRP 상대 OD MTS (E)에 의해 결정된 바와 같이 5 일간 PI103 처리 아스트로. 대량 살상 무기 확산 및 용량 응답이 5 바는 조건 당 6 회 반복에서 표준 오차를 나타내는 그래프 패드 프리즘의 기하 급수적 인 성장의 방정식을 사용하여 계산 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
생체 gliomagenesis에서 그림 5. U87MG 이종 이식의 대표 H & E 염색 부분은 분리 된 종양 마진 (A)를 보여줍니다. - / - TRP의 대표 H & E 염색 부분 이식은 정상적인 뇌의 확산 침략을 (보여줍니다B). 왼쪽과 오른쪽 H & E 이미지의 스케일 바는 각각 1mm와 100 μm의를 나타냅니다. - / - 종양 영역은 열 다섯 TRP 주사 면역 능력, 동계 한배 새끼에서 포르말린 고정 파라핀 뇌의 H & E 염색 섹션을 분석하여 결정 하였다 성상 세포와 오일 간격으로 주입 후 희생. (C). - / - TRP의 Kaplan-Meier 생존 분석 이환율에 세 이식 생쥐 이십이일 (D)의 평균 생존 기간을 보여줍니다.

그림 6
그림 TRP + NSC 동종 이식의 면역 형광 6. 대표적인 면역 형광 이미지는 T 121 (녹색) 및 SOX2 (흰색)을 표현 TRP + NSC는 면역 능력, 동계 한배 새끼의 뇌에 주입 보여 EDU (적색) 혼입에 의해 결정하고, 증식. 마우스는 EDU 관류 및 육주에게 파라 포름 알데히드 관류 주입 후 자신의 머리를 희생되었다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
TRP의 그림 7 종 영상 - / - 루크 동종 이식. 시간 (B) 이상 루시 페라 제 플럭스의 대표 생물 발광의 이미지 (A) 및 정량화 TRP의 성장을 보여줍니다 - / - 표시 일 포스트에서 루크 대뇌 피질의 성상 및 이미징 - / - 면역 능력, 동계 쥐에서 동종 이식은 열 다섯 TRP 주입 사출.g "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자형 도금 효율 (%) SEM
WT 0 0
T 1.03 0.15
TRP - / - 6.40 0.83

대뇌 피질의 성상 교세포의 표 1 콜로니 형성. WT, T와 TRP는 - / - 대뇌 피질의 성상은 / 잘 각각 4000, 2000, 250 세포에서 세중 도금 하였다. 식민지는 십사일 도금 후 크리스탈 바이올렛으로 염색 군데, 공동했다ImageJ에를 사용 unted. 도금 효율이 도금 셀의 개수로 나눈 콜로니의 개수로 계산 하였다.

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Discussion

가장 중요한 단계, 2), 3) 철저히 세포를 떼어 놓다, 수막을 제거하는 뇌량 아래 조직을 고려하지 않고 피질을 절제하는 적절한 수확 및 대뇌 피질의 성상 세포의 배양 아르 일)을 보장하기 위해, 4) GFAP에 대한 풍부 + 성상 교세포. 우리는 GFAP + 성상 세포에 대한 풍부 방법 (GFAP 프로모터의 제어하에 (지배적 인 변형 유전자의 Ad5GFAPCre 벡터 또는 활용과 TgGZT 121)를 유전자 재조합의 제한) 기계 (흔들림) 유전자를 사용하지만, 다른 기술은 대뇌 피질을 정화하기 위해 이용되어왔다 성상 교세포. 예를 들어, 오염 된 미세 아교 세포는 L-류신 메틸 에스터 (47)이어서 유사 분열 억제제 합류 배양을 처리함으로써 제거 될 수있다. 혈청 함유 미디어에서 기계적으로 정제 배양 성상 세포의 형태와 발현 프로파일은 이전 hypothesi으로, 급성 격리 성상과 다를데이빗은 더 미성숙 성상 세포 또는 반응성 성상 세포의 표현형 48, 49를 나타냅니다. 최근 immunopanning 방법 전향 피질 짐승 성상 세포 및 그 발현 양상보다 밀접 심하게 정제 된 성상 세포를 모방 정화하기 위해 개발 한 배양시 성장 인자 보충, 혈청이없는 배지에서 49. 조사 표현형에 더 최근에 개발 된 immunopanning 방법에 비해 대뇌 피질의 성상 세포 농축과 문화의 기존의 기계적 방법의 영향은 여기 불분명 남아있다. 에 관계없이 사용 방법, 그것은 구체적으로이 셀 유형 내 종양 돌연변이의 표현형의 결과를 결정하는 GFAP + 대뇌 피질의 성상 세포에 풍부하게하는 것이 필수적입니다.

NSC 수확하기위한 중요한 단계는 1) 정확하게 SVZ를 찾기 위해 2) 박리시 SVZ 손상을 최소화하기 위해, 3) 도금 전에 해리는 다음의 세포를 필터링한다. Preci자체 NSC 해부 기술은 찾아 SVZ을 수확 할 필요가있다. NSC가 현탁 배양에서 성장하기 때문에, 부유물의 양을 감소시키기 위해 분리 후 세포 현탁액을 필터링하는 것이 필수적이다. 우리는 NSC에 대한 선택 SCM의 성장을 사용하지만, NSC 전향 SVZ 조직 균질 50의 형광 활성화 세포 분류에 의해 분리 될 수있다. 시험관 내 유전자 재조합 유도 한 결과, 통로를 통해 셀룰러 피질 별아교 세포의 특성 및 NSC 배양을 모니터하는 것이 중요하다. 우리가 전향 적으로 조직 수확하는 동안 성상 세포 또는 NSC에 대한 풍부하지 않았기 때문에, 우리는 직렬 (성상 세포에 대한 GFAP, NSC에 대한 SOX2) 면역 알려진 세포 유형 특정 마커 염색으로 관심의 세포 유형의 농축 및 정량 순도를 모니터링. 또한, 우리는 체계적 전에 먹어​​ 치운다 - 중간체의 후 각 구절에서 모두 종양 돌연​​변이의 예상 신호 결과를 모니터링하는 것이 좋습니다발현 수준 및 표현형 순도가 최대화 및 돌연변이 유발 시그널링 변화가 안정화되는 초기 통로에서 세포를 특성화함으로써 재조합 D.

일차 세포 배양을 활용에 중요한 고려 사항은 자신 고유의 증식 및 용량과 유도 돌연변이 표현형 효과이다. 표현형 WT 쥐의 성상 세포는 증식 및 용량 제한 만 3 계대 수 있습니다 - 그들은 증식 및 노화 (31)를 받아야하기 전에 문화에 4 번. 더욱이, 많은 암은 종양 유전자의 시험 관내 51-유도 노화 원인, 특히 MAPK 경로 유전자에서 돌연변이를 연관. 돌연변이가 유도 된 세포를 불멸 종양 유전자 및 노화 - 유도으로부터 보호하는 데 실패하는 경우 즉, 그들은 순차적으로 시험 관내 형질 특성화 계대 될 수 없다. 이러한 HPV E6 / E7 및 SV40 큰 T 항원과 같은 바이러스 성 oncoproteins 광범위하게 많은 사람과 무 불멸 이용되어왔다성상 세포 13,26,30 포함한 문화 에피네프린의 세포 유형. T는 대뇌 피질의 성상 세포를 불멸하게하기에 충분하지만, 생체 내에서 치명적인 성상 세포종의 원인이 충분하지 않았다으로 우리는 이전에 G1 / S 세포주기 체크 포인트의 절제를 보여 주었다. 대조적으로, MAPK 및 PI3K는 TRP 시그널링의 활성화 - / - 성상은 동 소성 이식 모델 시스템 (30) GBM 형성되었다. 따라서, 시험 관내 뮤린 성상 세포 변형에 T, R, 및 P 돌연변이의 효과는 동 소성 이식의 생체 내 종양 형성과 관련 콜로니 형성 어 세이에 의해 정의.

종양 세포, 동계 마우스의 뇌에 변형, nGEM 세포의 소성을 주입 수술 주입을 필요로하는 모든 모델은 급성 상처의 응답을 이끌어내는 것처럼 반응 gliosis이라고. 이 응답하는 동안, 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (NG2의 +) 아교 세포 및 미세 아교 세포, prolifer을 포함하여 신경 세포,먹고 예컨대 소닉 헤지 호그 (52, 53)로 주로 분비 단백질에 대한 응답으로, 더 원시적 분화 상태를 획득. 그러나, 찔린 상처 님의 반응 gliosis의 증식 단계는 일반적으로 일주 53 상대적으로 짧다. - / - 우리는 이전에 TRP의 주입을 보여 주었다 성상 세포를 효율적으로 자주 GBM을 포함한 고급 성상 세포종으로 진행 뇌 성상 세포종를 산출,이 기간 동안 종양 형성을 유도한다. 반면, T 또는 TP의 주입 - / - 성상 교세포가 자주 1-3 주입 후 주 및이 종양에서 뇌 성상 세포종으로 발전 높은 성상 세포종 (30)에 진행하지 못한다. 또한, 단독으로 표현형 야생형 피질 별아교 세포의 주입 및 NSC는 (데이터 미도시) 종양 형성을 유도하지 못한다. - / - 동종 성장 지수 2~3주 포스트 분사의 증식기 동안 반응 시간 프레임을 증가 우리는 TRP 발견필자 gliosis이 종료 (그림 5, 7). 동계 마우스의 뇌에 변형, nGEM 세포의 주입시 종양 발생에 대한 잠재적 인 미세 환경의 영향을 설명하기 위해, 특히 반응성 gliosis의 증식 단계에서, 우리는 표현형 WT 대뇌 피질의 성상이나 NSC unrecombined의 새로운 조합을 조사의 제어 주사를 수행하는 것이 좋습니다 발암 floxed 대립 유전자. 우리는 이전에 (30)를 설명 것처럼 우리는 또한 첫 번째 달 후 분사 동안 매주 간격으로 모두 표현형 (WT) 및 변형 (재조합) 세포의 종양 형성의 효율성을 모니터링하는 것이 좋습니다.

주입 된 세포 동종 이식 또는 호스트 자체가 하나의 유전자 조작을 통해, 성상 세포종 nGEM 모델 시스템은 종양 - 기질 상호 작용을 포함 성상 세포종 병인의 많은 측면을 모델링하는데 사용될 수있다. - / - 예를 들어, 우리는 TRP 설계 대뇌 피질의 astrocy을TES는 생체 내 (그림 7)에서 종양의 성장 속도론을 정의하는 루시 페라 제를 표현합니다. 대안 적으로, nGEM 세포 유전자 형광 단백질을 발현하도록 변형 될 수 있고 orthotopically 종양 세포와 정상 뇌 세포 (54) 사이의 상호 작용을 정의하기 위해 형광 표지 혹은 신경 맥관계와 GEM의 뇌에 주입. gliomagenesis에 뇌 영역 또는 발달 연령의 미세 환경의 영향 orthotopically 상이한 위치에서 또는 상이한 세 nGEM 생쥐 세포를 주입함으로써 결정될 수있다. 짧은 종양 대기 시간과 생존 전임상 약물 검사에 유용하지만, 급속한 종양 발생은 악성 진행, 침략, 그리고 종양 장루의 상호 작용과 같은 성상 세포종의 발병 기전의 일부 측면을 모델링하기에 적합하지 않을 수 있습니다. nGEM 동종 호스트 생존 용이하게 주입 된 세포의 수를 변경하고 체계적 종양 투과도 및 지연 3 모니터링에 의해 조작 될 수있다0.

유 전적으로 인간 성상 세포종은 복잡하고 광범위한 인트라 간 종양 5-7,55,56 이질성을 나타낸다. 이 이질성의 잠재적 인 소스는 종양을 시작 체세포 돌연변이, 악성 진행의 진화 과정에서 획득 한 돌연변이, 이러한 돌연변이가 발생하는 세포의 발달 가능성을 포함한다. 대규모 시퀀싱 프로젝트는 많은 성상 세포종 관련 돌연변이와 동시 발생 칠 자신의 패턴을 확인했다. 이러한 연구 즉, 자주 발생하는 돌연변이를 확인하고 가능성이 종양 아르 돌연변이를 지명 생물 정보학 알고리즘에 의존했다. 종양을 시작하거나 악성 진행을 드라이브 "드라이버 돌연변이". 그러나, 이들 돌연변이 중 많은 그리고 잠재적 세포 유형 특이성의 발암 잠재력 체계적 모델 시스템에서 조사되지 않았다. 우리는 제안이 nGEM 모델 U피질 별아교 세포 및 NSC 여기에서 설명한 바와 같이,뿐만 아니라 정제 한 배양에서 성장 될 수있는 다른 신경 세포 형태를 tilizing, 이러한 조사를 수행하는 다기능 시스템을 제공한다. 대규모 시퀀싱 프로젝트를 통해 확인 된 신규 한 후보 돌연변이의 변환에 대한 충분하고 필요성이어서 체계적 종래 유전 이득 - 및 -의 기능 상실은 특정 nGEM 세포 유형 코어 GBM 경로에서 일반적인 공동 발생 돌연변이를 은닉과 방법을 사용하여 조사 할 수있는 대 조건부 GEM은 5 존재한다. 우리는 더 nGEM의 패널은 인간의 성상 세포종의 게놈 이질성을 모델링에 도움이 될 것입니다 여러 신경 세포 유형의 돌연변이의 다양한 조합을 품고 있음을 제안한다. 또한, 조건부 GEM에서 파생 된 대뇌 피질의 성상 및 NSC와 nGEM의 성상 세포종 모델은 전임상 약물 개발을위한 다루기 쉬운 모델을 제공 할 수 있기 때문에 모두 모노 및 조합 치료의 초기 시험 관내 시험 할 수면역 능력, 동계 생쥐의 생체 내 약물 검사에 더 효율적 직접 이들 세포에서 수행 될 수있다. 또한, 면역 변조 및 기질 - 표적으로 한 치료는 면역 능력, 동계 이식 호스트와 nGEM의 성상 세포종 모델에서 테스트 할 수 있습니다. 따라서, 변환 및 NSC 피질 별아교 세포와 성상 세포종 nGEM의 모델은 특정 세포 유형에서 발암 돌연변이의 조합의 기능적 결과를 결정하기 위해 유용한 모델 시스템이며, 전임상 시험 약물에 유용 할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

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McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

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