Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering astrocytom Patogenese Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Astrocytomas er den vanligste primære hjernesvulst og glioblastom (GBM), en klasse IV astrocytom, er den vanligste og aggressiv subtype med en median overlevelse på 12-15 måneder 1,2. Invasjonen av diffuse astrocytomas, særlig GBM, utelukker komplett kirurgisk reseksjon, begrenser effekten av adjuvant behandling, og fører uunngåelig til etter behandling tilbakefall tre. Pasienter utgangspunktet stede enten med de novo (primær) GBM eller med lavere klasse astrocytomas som uunngåelig utvikler seg til (sekundær) GBM fire. GBM er genomisk heterogen og preget av gjensidig utelukkende og co-forekommende mutasjoner i gener som styrer tre sentrale signalveier: G 1 / S (RB) cellesyklus sjekkpunkt, reseptor tyrosin kinase (RTK), og TP53 trasé 5-7. GBM består av fire genomiske undergrupper med distinkt uttrykk profiler som ligner forskjellige hjernecelletyper, noe som tyder på at GBM subtype er influenced av sin celle opprinnelses 6,8,9. Bedre astrocytom modeller er påkrevet for å definere rollen til spesifikke kombinasjoner av mutasjoner i bestemte celletyper under astrocytom patogenesen. Utnytte disse modellene for mer effektiv preklinisk utvikling av legemidler til slutt vil bidra til å forbedre pasientens utfall. Gjeldende astrocytom modellene er etablert humane cellelinjer, pasient avledet xenografts (PDX), genmodifiserte normale menneskelige astrocytter og nevrale stamceller (NSC), og genmanipulerte mus (GEM) 10-14. Vi utviklet en alternativ, ikke-germline GEM (nGEM) modell 15 utnytte primære hjerneceller - kortikale astrocytter og NSC - høstet fra GEM husing ulike kombinasjoner av floxed onkogene alleler. Målet var å generere astrocytom modeller med genetisk definerte celler som kan være fenotypisk kjennetegnet både in vitro og in vivo, og eventuelt benyttes for preklinisk utvikling av legemidler i immune-kompetente mus.

Etablerte humane cellelinjer er den mest brukte modellen av astrocytom patogenesen og narkotika respons in vitro og in vivo. De er teknisk sett rett frem, allment tilgjengelig, og har definert kinetikk og tumorigenisitet ved orthotopic xenografting i immunodeficient mus 10,11,16-18 . Deres ulemper omfatte manglende evne til å generere etablerte cellelinjer fra lavgradige astrocytomas, begrense studien bare høygradig astrocytomas; Mangelen på en definert celle opprinnelse; tilstedeværelse av komplekse genomiske abnormiteter, ofte med genomisk profiler som avviker vesentlig fra den opprinnelige pasientprøve; og mottakelighet for fenotypisk og genotypisk drift under serie kultur i serum 11,17,19-22. De fenotypiske konsekvenser av enkelte onkogene mutasjoner i etablerte menneske GBM cellelinjer kan være maskert av de mange forandringer som faktisk er til stede, som ofte utelukker elucidation av direkte genotype-fenotype konsekvenser.

PDX er generert gjennom subkutan passasje av pasient isolert astrocytom celler i immundefekte mus eller gjennom deres kultur som ikke-adherente sfæroider i definert, serumfritt medium før det orthotopic injeksjon i hjernen hos mus immunodeficient 12,23. PDX mer nøyaktig opprettholde det genomiske landskap av humane astrocytomer, men ligner på etablerte humane cellelinjer, kan den fenotypiske effekten av individuelle onkogene mutasjoner bli maskert på grunn av deres genomiske kompleksitet 19,24. For å definere de fenotypiske konsekvenser av spesifikke onkogene mutasjoner, spesielt i respons mot nye behandlinger, blir paneler av etablerte humane cellelinjer eller PDX ofte benyttet for å etablere korrelasjoner genotype-fenotype, viser generalizability, og reduserer mulighetene for at cellelinjespesifikke effekter. Mens PDX nøyaktig rekapitulere de histopatologiske kjennetegnene ved menneskelig astrocytomas, incLuding invasjon, ortotopiske xenografts av etablerte humane cellelinjer generelt ikke 21,23,25. I tillegg normale menneskelige astrocytter og NSC har blitt genetisk konstruert med definerte onkogene mutasjoner å modellere astrocytom tumorigenesis in vitro og in vivo 13,14,26. Disse cellene mangler genomisk kompleksitet etablerte humane cellelinjer og PDX og nøyaktig rekapitulere menneskelig astrocytom histopatologi, men krever xenografting i immunsvikt gnagere in vivo. Fordi alle menneskelige cellemodeller krever immunsvikt gnager verter å hindre immunmediert xenograft avvisning, disse modellene ikke klarer å rekapitulere de innfødte tumor-Stroma interaksjoner av en syngene system og mangler et intakt immunforsvar, noe som begrenser preklinisk undersøkelse av stroma-målrettet og immun-moduler therapies 10,11.

GEM tillatelse undersøkelse av fenotypiske konsekvensene av forhåndsbestemte kombinasjoner av onkogene mutasjoner i vivo under in situ tumorigenesis. Mens ikke-betinget GEM har mutasjoner i alle vev i hele utvikling, har betinget GEM floxed onkogene alleler som muliggjør målretting av mutasjoner ved å begrense Cre-mediert rekombinasjon til bestemte celletyper ved bruk av celletypespesifikke arrangører 10,11,15,18. Betinget astrocytom GEM har blitt benyttet til å belyse de funksjonelle roller av onkogene mutasjoner i forskjellige celletyper innen et intakt hjernen 11. Den prekliniske nytten av in situ ved å bruke betinget gliomagenesis GEM er begrenset av en rekke faktorer, inkludert 1) mangel på en in vitro korrelerer, 2) vanskeligheter med å generere store kullene av mus med komplekse genotyper, 3) lang ventetid for in situ tumorutvikling , 4) og stokastisk tumorprogresjon. Fordi in situ tumorigenesis mangler en tilsvarende in vitro-modell, kan stoffet testing in vitro ikke utføres wed konvensjonelle betingede GEM modeller. I motsetning til andre kreftformer, er betinget GEM modeller av astrocytomer sjelden indusert av enkle onkogene mutasjoner 11. Således er komplekse avl ordninger som kreves for å generere betinget GEM med flere onkogene mutasjoner. Videre oppstår astrocytom initiering med variabel pene etter en lang latenstid i disse modellene, mens progresjon til høyverdige astrocytomer vanligvis forekommer i et ikke-uniformt, stokastisk måte og til slutt gir opphav til svulster med komplekse genomiske landskap og hurtige vekstkinetikk 27, 28. Den variable pene og stokastisk natur ondartet progresjon i betingede GEM-modeller krever at enkelt mus bli skjermet av radiografisk å påvise tilstedeværelse og plassering av høy klasse astrocytomas før deres innmelding i prekliniske legemiddelutprøvninger. Samlet utgjør disse begrensninger hindre generering og testing av de store årskull av betinget GEM kreves for preclinical narkotika testing.

Den RCAs-TVA GEM system, som benytter avian retrovirale (RCAs) vektorer å infisere GEM konstruert for å uttrykke viral reseptor (TVA) på bestemte nervecelletyper, har blitt grundig brukt til å modellere astrocytom tumorigenesis 11. I motsetning til betinget GEM, muliggjør dette modellsystem innføring av multiple onkogene mutasjoner i spesifikke typer celler uten behov for kompliserte avl ordninger. Det er imidlertid begrenset av variabel penetrans, kravet for aktivt delende celler for å oppnå viral integrering, og tilfeldig innsetting av transgener i vertsgenomet 29.

Non-germline GEM (nGEM) modeller, som utnytter celler høstet fra GEM, blir stadig viktigere fordi de overvinne mange av begrensningene i modell andre systemer 15. Rollen initiere celletype og co-forekommende mutasjoner i astrocytom patogenesen er vanskelig å avskrekkemin ved anvendelse av etablerte humane cellelinjer eller GBM PDX fordi de er utledet fra utgangen av scene tumorer som har akkumulert omfattende genetiske mutasjoner i udefinerte celletyper i løpet av malign progresjon. I kontrast, kan alle graderinger av astrocytomas modelleres ved hjelp nGEM ved å fremkalle definert genetiske mutasjoner innenfor bestemte rensede hjernecelletyper 11,30. Således kan påvirkningen av spesifikke genetiske mutasjoner og celletype på cellulære og molekylære fenotyper bestemmes in vitro og in vivo. I likhet med etablerte humane GBM cellelinjer, kan begynnende in vitro medikamenttesting ved hjelp nGEM brukes til å prioritere legemidler for in vivo tester som benytter de samme cellene. Tumorigenesis in vivo kan da bli bestemt av allografting nGEM celler orthotopically inn i hjernen til immunkompetente syngene kullsøsken 30. Disse ortotopiske allograft modeller tillater derfor in vivo testing, ikke bare av cytotoksisk en konvensjonellnd målrettet terapi, men immun-modulerende og Stroma målrettede behandlinger også. Endelig kan rollen til mikromiljøet på tumor initiering og progresjon bestemmes ved å sammenligne resultatene mellom nGEM og konvensjonelle GEM-modeller ved å bruke de samme mutasjoner i de samme celletyper.

Vi og andre har utviklet astrocytom nGEM bruker primærceller - astrocytter, NSC, eller oligodendrocyte forløper celler (OPC) - høstet fra GEM 30-34. Begrunnelsen bak utviklingen av et astrocytom nGEM var å lage en modell for å bestemme fenotypiske konsekvensene av onkogene mutasjoner i bestemte celletyper som potensielt kan brukes til preklinisk narkotika testing in vitro og in vivo i immun-kompetente dyr. Vi høstet fenotypisk WT kortikale astrocytter og NSC fra ikke-Cre uttrykker, betinget GEM opprettholdes på en> 94% C57 / BL6 bakgrunn med floxed RB sti - Rb1 loxP / loxP, eller TgGZT121 - og floxed RTK / RAS / PI3K pathway - NF1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP - gener i ulike kombinasjoner 35-39. Vi indusert genetisk rekombinasjon in vitro ved hjelp av adenovirale vektorer som koder for Cre rekombinase. Fordi kortikale astrocyte avlinger inneholder en blanding av celletyper, brukte vi Ad5GFAPCre vektorer eller dominerende onkogene transgener, slik som TgGZT 121 drevet fra den menneskelige GFAP promoter, for å berike for GFAP + kortikale astrocytter i disse kulturene. Vi definerte fenotypiske konsekvensene av G 1 / S (RB), MAPK, og PI3K pathway mutasjoner i kortikale astrocytter og NSC in vitro og in vivo. MAPK og PI3K sti-aktivert G1 / S-defekte astrocytter molekylært etterlignet menneske proneural GBM, og ved orthotopic injeksjon, dannet svulster i et forhåndsdefinert sted ensartede vekstkinetikk, korte ventetider, og histopatologiskeal kjennetegnene ved menneskelig GBM 30. Langsgående overvåking av tumorvekst in vivo hjelpemidler preklinisk narkotika testing gjennom normalisering av behandlings kohorter og kvantitativ analyse av tumorvekst i respons på behandlingen 40. Vi bestemt tumorvekst kinetikk ved langsgående bioluminesens avbildning av mus injisert med luciferase uttrykke kortikale astrocytter. Derfor kortikale astrocytter og NSC avledet fra betinget GEM gi en medgjørlig modellsystem for definisjon av funksjonelle konsekvenser av astrocytom mutasjoner og en potensiell modellsystem for preklinisk narkotika utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrestudier ble godkjent av University of North Carolina Institutional Animal Care og bruk komité.

1. dyrking kortikal astrocytter fra Neonatal Mus

  1. Forberedelse
    1. Krølle 2-3 delikat oppgave vev og plasseres i bunnen av en flaske inneholdende 70% etanol. Plasser disseksjonssaksen, buede pinsett og 2 par rette mikro tang inn i denne flasken. Vevene blir brukt for å unngå bøying mikro tang.
    2. Tilsett 1 ml HBSS til en 60 mm vevskultur-fatet. Forbered en egen rett for hvert dyr og vedlikeholde retter på is.
    3. Bedøve dyr per institusjonelle bestemmelser.
    4. Varm 7 ml DMEM med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin (komplett DMEM) for hvert dyr i en 37 ° C vannbad. MERK: For fem mus trinn 1.1.1-1.1.4 vil ta ~ 15 min.
  2. Tissue innhøstings
    1. Sacrifice neonatal mus (dag 1-3) per institutional bestemmelser.
    2. Fjern disseksjonssaksen fra etanol, la dem dryppe tørr, og gjøre en sagittal snitt i huden over kraniet fra ryggmargen til nesen.
    3. Gjør et kutt i kraniet langs sagittal sutur, fra ryggmargen og strekker seg forbi olfactory pærer. Vær nøye med å holde sakse tips nær den indre overflaten av kraniet å minimalisere hjernevevet skade.
    4. Ved hjelp buet tang, forsiktig skrelle hver halvkule av kraniet sidelengs vekk fra hjernen.
    5. Bruke rette mikro tang klemmer du forsiktig bort dorsal del av hver kortikale halvkule og plassere den inn i vevet kultur fatet inneholder HBSS. Pass på å unngå lillehjernen og luktelappen. Ikke ta noen vev under corpus callosum.
    6. Ved hjelp av en dissekere mikroskop og 2 par mikro tang, forsiktig fjerne hjernehinnene fra hver kortikale halvkule. Returnere vevskultur fatet til is inntil begynnelsen vev homogenization.
    7. Gjenta trinn 1.2.1 gjennom 1.2.6 for hver ekstra dyr. MERK: For fem mus trinn 1.2.1-1.2.7 vil ta ~ 30 min.
  3. Tissue Homogenisering
    1. Ved hjelp av en ren barberblad, fint terninger hjernebark halvkuler og flytt platen til en vev kultur hette.
    2. Overfør terninger vevet inn i et sterilt 15 ml konisk rør. Vask platen med 1 ml iskald HBSS og overføre til røret inneholdende vev.
    3. Vent til vev synker til bunnen av røret, deretter forsiktig fjerne overskudd av HBSS ved hjelp av en pipette.
    4. Tilsett 2 ml romtemperatur trypsin / EDTA. Pipetter ~ 10x med en 1 ml pipette for ytterligere å dissosiere celler.
    5. Inkuber cellesuspensjonen ved 37 ° C i 15 - 20 min. Nøye bland ved inversjon hvert 5 min.
    6. Tilsett 3 ml komplett DMEM å inhibere trypsin. Pipetter ~ 10x med en 1 ml pipette for å blande oppløsningen.
    7. Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    8. Fjernsupernatanten med en 1 ml-pipette. Ikke aspirer medium fordi pelleten kan være løs.
    9. Resuspender pellet i 4 ml av 37 ° C full DMEM. Overfør cellesuspensjonen til en 75 cm skrukork vevskultur kolbe. MERK: For fem mus trinn 1.3.1-1.3.9 vil ta ~ 50 min.
    10. Omtrent 16 timer etter astrocyte innhøsting, vaske kolben med 4 ml 37 ° C HBSS, deretter legge 4 ml 37 ° C full DMEM. Opprettholde hjernebark astrocytter ved 37 ° C i 5% CO 2. MERK: vasketrinn er viktig for fjerning av ikke-adherente celler og rusk fra dyrkningsskål.
    11. Når kulturen er ~ 95% konfluent, rist over natten ved 37 ° C i 5% CO 2, fjerne medier som inneholder frittliggende celler, vask deretter kolben med 4 ml 37 ° C HBSS. Tilsett 4 ml av 37 ° C full DMEM og opprettholde cellene ved 37 ° C i 5% CO2. MERK: Dette trinnet er viktig å berike kulturer for kortikale astrocytter, som forurenser mikroglia ogoligodendrocyte progenitorceller løsner med denne fremgangsmåten og blir fjernet fra kulturen 41.
    12. Gjenta trinn 1.3.1-1.3.11 for hvert dyr.
  4. Induksjon av Genetisk rekombinasjon
    1. 24 timer etter at du har fullført trinn 1.3.11, erstatte mediet med 2 ml 37 ° C full DMEM. Tilsett 1 ml 37 ° C SCM inneholder en ul> 10 10 PFU / ml Ad5CMVCre eller Ad5GFAPCre. Inkuber i 6 timer ved 32 ° C i 5% CO 2 .CAUTION: Forebyggende tiltak Bruk BSL2 ved håndtering av rekombinant adenovirus.
    2. Fjerne viruset inneholder media og legge til 37 ° C komplett DMEM uten virus til hjernebark astrocytter. FORSIKTIG: Forebyggende tiltak Bruk BSL2 ved håndtering av rekombinante adenovirus og kast viruset holdige medier per institusjonelle bestemmelser. MERK: For fem astrocyte kulturer trinn 1.4.1 - 1.4.3 vil ta ~ 15 min unntatt seks timers inkubasjon.
    3. Utvid kortikale astrocyte kulturer for ivitro og in vivo karakterisering. MERK: bestemme nærvær av mutasjoner følgende Cre-rekombinasjon ved PCR med primere som er spesifikke for det rekombinerte gen eller ved immunoblots for enten den spesifikke muterte proteinet eller dets signal konsekvenser. Den nødvendige tid for stabilisering av fenotypisk kortikale astrocyte kulturer etter at Cre-rekombinasjon vil være avhengig av de mutasjoner som brukes, og må bestemmes empirisk (figur 2).

2. dyrking nevrale stamceller fra Neonatal Mus

  1. Forberedelse
    1. Før du starter disseksjon, forberede 4 ml fordøyelsen løsning per hjernen ved å legge 3,1 mg papain og 1,3 mg cystein til 4 ml dissosiasjon medium - 98 mm Na 2 SO 4, 30 mM K 2 SO 4, 5,8 mM MgCl2, 0,25 mm CaCl 2 , 1 mm HEPES (fra 1 M HEPES pH 7,4 lager) 20 mM glukose, 0,001% Fenol rødt, og 0,125 mM NaOH. Tilsetning av papainog cystein til dissosiasjon medium vil slå løsningen gul.
    2. Inkuber i 37 ° C vannbad i 15 min. Bland med jevne mellomrom av inversjon.
    3. Legg 0,1 M NaOH dråpe klokka inntil fordøyelsen løsning returnerer til lys rød farge.
    4. I en vevskultur hette, sterilt filter fordøyelsen løsning ved hjelp av et sprøytefilter (0,22 um porestørrelse). Hold fordøyelsen løsning på is.
    5. Forbered 50 ml av Stem Cell Medium (SCM) ved å blande 44,5 ml NSC Basal Medium, 5 ml NSC supplement, 0,5 ml penicillin-streptomycin, 50 mL 0,2% heparin, 10 mikroliter 100 mikrogram / ml EGF, og 10 mikroliter 100 mikrogram / ml bFGF. SCM er stabil for en uke når de oppbevares ved 4 ° C.
    6. Forbered komplett HBSS (cHBSS) ved å blande 50 ml av 10x HBSS, 1,25 ml 1 M HEPES (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glukose, 5 ml 100 mM CaCl 2, 5 ml 100 mM MgSO 4, og 2 ml 1 M NaHCO3. Ta med det totale volumet til 500 ml med DDH 2 O.
    7. Filtrere sterilisere cHBSS viddha 0,2 mikrometer porestørrelse filter og oppbevar ved 4 ° C.
    8. Krølle 2-3 delikat oppgave vev og plasseres i bunnen av en flaske inneholdende 70% etanol. Plasser disseksjonssaksen, buede tang, og 2 par rette mikro tang inn i denne flasken. Vevene blir brukt for å unngå bøying mikro tang. MERK: For fem mus trinn 2.1.1-2.1.8 vil ta ~ 45 min.
  2. Tissue innhøstings
    1. Sacrifice neonatal (dag 1-3) mus per institusjonelle bestemmelser.
    2. Fjern disseksjonssaksen fra 70% etanol, la dem dryppe tørr, og gjøre en sagittal snitt i huden over kraniet fra ryggmargen til nesen.
    3. Gjør et kutt i kraniet langs sagittal sutur, fra ryggmargen og strekker seg forbi olfactory pærer. Vær nøye med å holde sakse tips nær den indre overflaten av kraniet å minimalisere hjernevevet skade.
    4. Ved hjelp buet tang, skrelle forsiktig hver halvkule av kraniet sidelengs bort frahjernen.
    5. Fjerne hele hjernen og plasser i iskald cHBSS forsiktig.
    6. Ved hjelp av en disseksjon mikroskop, forsiktig fjerne hjernehinnene fra hjernen med fine disseksjon verktøy.
    7. Sett hjernen på bunnflaten og fjern cerebellum / hindbrain og luktelappen / frontal cortex med vertikal (koronale) kutter med en størrelse 11 skalpell.
    8. Roter de rester hjernen ved 90 ° for å plassere den på halepartiet, og dermed generere en koronale visning av hjernen. Finn sideventriklene.
    9. Skjær ut en kubisk delen inneholder subventricular sone (SVZ).
    10. Overfør SVZ holdig vev til en 60 mm vev kultur tallerken med frisk iskald cHBSS og kjøttdeig vev med størrelse 11 skalpell.
    11. Overfør hakket vevet inn i et sterilt 15 ml rør. Plasser røret på is.
    12. Vask petriskål med 1-2 ml iskald cHBSS. Overfør vaskeløsningen til røret inneholdende vev.
    13. Gjenta trinn 2.2.1-2.2.12 med ekstra neonatal mus om nødvendig. Overfør alle 15 ml rør i et vevskultur hette for resten av protokollen. MERK: For fem mus trinn 2.2.1 - 2.2.13 vil ta ~ 45 min.
  3. Tissue Homogenisering
    1. Plasser fordøyelsen løsning (fremstilt i trinn 2.1.1) i et 37 ° C vannbad i 5 min. Også, varme 2 ml SCM pr hjerne i en 37 ° C vannbad.
    2. Fjern forsiktig supernatant av hakket vev med en 1 ml-pipette. Ikke aspirer.
    3. Tilsett 2 ml 37 ° C fordøyelsen løsning per 15 ml tube og bland forsiktig ved inversjon.
    4. Inkuber i 37 ° C vannbad i 15 min. Bland ved hver 5 min.
    5. Legge ytterligere 2 ml 37 ° C fordøyelsen løsning til hvert rør og gjenta trinn 2.3.4.
    6. Tillat cellene fikk sette seg på bunnen av røret ved hjelp av gravitasjon, og deretter fjerne supernatanten fra fordøyd vev ved hjelp av en 1 ml-pipette.
    7. Tilsett 2 ml 10 mM E-64 fortynnet i cHBSS og bland forsiktig ved inversjon.
    8. Tillat cellene fikk sette seg på bunnen av røret ved hjelp av gravitasjon, og deretter fjerne supernatanten fra fordøyd vev.
    9. Tilsett 1 ml 37 ° C cHBSS og homogenisere med en 1 ml pipette (~ 20 slag). Unngå å injisere luftbobler under vev homogenisering.
    10. Før vev homogenat gjennom et 40 mikrometer porestørrelse celle sil, skyll silen med 5 ml av 37 ° C cHBSS.
    11. Sentrifuger vev homogenat ved 125 xg i 5 min.
    12. Fjern 95% av supernatanten med en 1 ml pipette uten å forstyrre cellepelleten. Nøye resuspender cellen pellet i 200 mL 37 ° C SCM med en 200 mL pipette.
    13. Legg 1,8 ml 37 ° C SCM og overføre cellesuspensjonen til en brønn i en steril 6 brønners plate. MERK: For fem mus trinn 2.3.1-2.3.14 vil ta ~ 75 min.
  4. Neural Stem Cell Culture
    1. Etterfyll mediet etter 3 dager ved å legge ytterligere 2 ml 37 °C SCM.
    2. Etter 7 dager, overføre neurospheres til en 15 ml tube og la neurospheres bosette av tyngdekraften for> 5 min.
    3. Fjern supernatanten og tilsett 2 ml 37 ° C SCM.
    4. Overfør neurospheres til et nytt godt av en 6 brønn plate.
    5. Tilsett 2 ml 37 ° C SCM hver 3-4 dager, og endre medium helt hver 7. dag.
    6. Hvis neurospheres er> 100 mikrometer i diameter, omhyggelig dissosiere med stamcelle dissosiasjon løsning og replate NSC ved den ønskede celletetthet.
  5. Induksjon av Genetisk rekombinasjon
    1. Tilsett 1 ml av 37 ° C inneholdende SCM 1 pl av> 10 10 pfu / ml av Ad5CMVCre eller Ad5GFAPCre til 2 ml av SCM tiden på cellene. FORSIKTIG: Forebyggende tiltak Bruk BSL2 ved håndtering av rekombinant adenovirus.
    2. Inkuber i 6 timer ved 32 ° C i 5% CO 2.
    3. Overfør SCM med neurospheres inn i en 15 ml tube og la sfærer bosette av tyngdekraften for 5 min.
    4. Fjern supernatanten først med en 1 ml-pipette, og deretter med en 200 ul pipette. FORSIKTIG: Forebyggende tiltak Bruk BSL2 ved håndtering av rekombinante adenovirus og kast viruset holdige medier per institusjonelle bestemmelser.
    5. Tilsett 2 ml 37 ° C SCM uten virus til NSC, og deretter overføre til en 6 brønn plate. MERK: For fem NSC kulturer trinn 2.5.1-2.5.5 vil ta ~ 15 min unntatt seks timers inkubasjon.
    6. Neste dag, gjentar du trinn 2.5.1-2.5.5, etterfulgt av neurosphere aging når det er nødvendig. Kulene kan nå bli utvidet til 2-3 passeringer før in vitro karakterisering og orthotopic injeksjon i mus hjerner in vivo. MERK: bestemme nærvær av mutasjoner følgende Cre-rekombinasjon ved PCR med primere som er spesifikke for det rekombinerte gen eller ved immunoblots for enten den spesifikke muterte proteinet eller dets signal konsekvenser. Den nødvendige tid for stabilisering av fenotypisk NSC kulturer etter at Cre-rekombinasjon vil være avhengigpå mutasjoner benyttes og må bestemmes empirisk (figurene 2 og 3).

3. orthotopic Injeksjon av recombined celler i hjernen til mottaker Iimmunocompetent Mus

  1. Fremstilling av 5% metylcellulose
    1. Oppløs 5 g av 15 cPs metylcellulose i deionisert vann til et sluttvolum på 50 ml i en 100 ml skrulokk flaske. Tilsett pulver langsomt under omrøring ved 4 ° C for å forhindre klumpdannelse. Det kan ta opp til 24 timer av omrøring ved 4 ° C for hele metylcellulose å angi løsning.
    2. Vei flasken og noter vekten.
    3. Autoklaver i 5% metylcellulose-løsning. Når autoklavert, vil metylcellulose blitt en halvfast gel.
    4. Vei flasken og beregne vekten tapt under autoklavering.
    5. Aseptisk tilsett 1 ml sterilt vann for hvert gram vekt tapt.
    6. Plasser på is og tilsett 50 ml iskald 2x DMEM. </ Li>
    7. Bland over natten ved bruk av en magnetisk rører ved 4 ° C. Bruk steril teknikk for å dele 5% metylcellulose-løsning i 20 ml alikvoter. Oppbevar alikvoter ved 4 ° C i inntil seks måneder eller inntil 2x DMEM utløper. MERK: Fremstilling av 5% metylcellulose-løsning i trinn 3.1.1-3.1.7 vil ta ~ 2,5 dager.
  2. Utarbeidelse av kortikal astrocytter for Injection
    1. Slakte kortikale astrocytter når ~ 90% konfluente.
    2. For å høste, aspirat komplett DMEM og vaske platene med et likt volum av 37 ° C HBSS.
    3. Legg nok trypsin å dekke plate. Forsiktig vippe og trykk på plate før cellene begynner å løsne.
    4. Inaktivere trypsin med et likt volum av 37 ° C full DMEM.
    5. Overfør cellene til en 50 ml konisk rør og vaske platen med samme volum av 37 ° C i komplett DMEM brukt i 3.2.4.
    6. Overfør vaskemedium til røret inneholdende celler. Sentrifuger ved 200 x g i 3 min.
    7. Aspirer supernatant og resuspender celler i 1 ml 37 ° C full DMEM.
    8. Tell cellesuspensjonen ved hjelp av en eller annen hensiktsmessig hemocytometer celleteller for å bestemme antall celler / mL.
    9. Overfør det ønskede antall celler i et nytt 15 ml konisk rør. Sentrifuger ved 200 x g i 3 min.
    10. Suspender cellene i 800 mL av 37 ° C full DMEM. Bestemme volumet av cellepelleten (totalt volum av cellesuspensjon - 800 ul). MERK: Det er viktig å oppnå en nøyaktig cellekonsentrasjonen for injeksjon. Dermed må volumet av cellepelleten bestemmes i dette trinnet for å beregne volumet av 5% metylcellulose til å legge i trinn 3.2.12.
    11. Overfør cellene til et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 200 x g i 3 min.
    12. Aspirer supernatanten fra cellepelleten og resuspender kortikale astrocytter i det passende volum av iskald 5% metyl-cellulose (ønsket totalt volum - volumcellepelleten) for å oppnå det ønskede antall celler / mL.
    13. Plassere cellene på is inntil injeksjon.
    14. Plasser en 250 mL glass sprøyte inn en gjentakende Antigen Enser deretter plassere en sløv 18 G nål på sprøyten.
    15. Trekk stempelet sakte med nålen i kortikale astrocyte suspensjon; vil det være en luftboble over cellene som må fjernes, fordi luftbobler vil komprimere og minske volumet faktisk injiseres i hjernen.
    16. Hold tuppen av nålen like over kortikale astrocyte suspensjon og skyver stempelet raskt. Luftboblen vil bevege seg raskere enn cellesuspensjonen og vil for det meste bli utstøtt.
    17. Gjenta trinn 3.2.16 inntil alle luftbobler er fjernet fra nålen.
    18. Fyll sprøyten til ca ~ 200 mL, deretter holde nålen opp og dra stempelet tilbake til den stopper. Små luftbobler kan bli fjernet ved å holde nålespissen opp og raskt å skyve stempelet omtrent 50 mL deretter sakte å trekke til full kapasitet.
    19. Hold spissen oppreist og gjenta trinn 3.2.18 4-5 ganger.
    20. Kast 18 gauge nål og passer en 27 G nål på sprøyten.
    21. Trykk på knappen på antigen dispenser til væsken er utvist fra nålen. MERK: For en astrocyte cellelinje trinn 3.2.1-3.2.21 vil ta ~ 60 min.
  3. Utarbeidelse av NSC for Injection
    1. Når neurospheres er> 100 mikrometer i diameter, overføring til 15 ml rør og la neurospheres bosette av tyngdekraften for> 5 min.
    2. Fjern supernatanten og dissosierer de neurospheres med en mild dissosiasjon reagens, slik som stamcelle dissosiasjon løsning eller accutase i henhold til produsentens instruksjoner, eller med 0,05% trypsin-EDTA som beskrevet 42.
    3. Hemme dissosiasjon reagenser i henhold til produsentens instruksjoner, uten å skremme NSC til serum. Sentrifuger ved 100 xg i 5 min.
    4. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en annen passende celleteller å bestemme antall celler / mikroliter.
    5. Overfør det ønskede antall NSC i et nytt 15 ml konisk rør. Sentrifuger ved 100 xg i 5 min.
    6. Suspender cellene i 800 mL av 37 ° C HBSS. Bestemme volumet av cellepelleten (totalt volum av cellesuspensjon - 800 ul). MERK: Det er viktig å oppnå en nøyaktig cellekonsentrasjonen for injeksjon. Dermed må volumet av cellepelleten bestemmes i dette trinnet for å beregne volumet av 5% metylcellulose til å legge i trinn 3.3.9.
    7. Overfør cellene til et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 100 xg i 5 min.
    8. Aspirer supernatanten og avslutt forbereder cellene for orthotopic injeksjon som i 3.2.12-3.2.21. MERK: For en NSC cellelinje trinn 3.3.1-3.3.9 vil ta ~ 60 min.
  4. Utarbeidelse av mus for Injection
    1. Bedøve mottakeren dyret via et IP-injeksjon av 250 mg / kg Avertin (2,2,2 Tribromoethanol) eller 100 mg / kg ketamin pluss 10 mg / kg xylazin, per institusjonelle IACUC retningslinjer. MERK: utnyttes her er mus ved 3-6 måneders alder som leverallograft verter. Mus ved forskjellige aldre kan anvendes for å undersøke virkningen av microenvironmental utviklings hjerne alder på tumorigenesis.
    2. Barbere hodebunnen over snittet området med klippere eller saks.
    3. Sterilisere operasjonsstedet med tre vekslende vattpinner av 70% etanol og betadine.
    4. Påfør oftalmisk salve til øynene for å hindre skader på grunn av tap av blunkerefleksen.
    5. Vurdere anestesidybden ved pedal tilbaketrekking (tå klype) refleks. MERK: For fem mus trinn 3.4.1-3.4.5 vil ta ~ 15 min.
  5. Orthotopic Implantasjon
    1. Sikre dyret i stereotaksisk ramme.
    2. Make et snitt over sagittal sutur ca 0,5 cm lang mellom ørene og øynene.
    3. Finn skjæringspunktet mellom de koronale og sagittal suturer (bregma), samt krysset av bakhode og sagittal suturer (Lambda). Sørg for at Bregma og Lambda er i samme horisontalplanet.
    4. Fest sprøyten inneholdende cellesuspensjonen, og å gjenta antigen dispenser til stereotaksisk ramme over hodet. Bring spissen av nålen 27 G i kontakt med Bregma. Dette er opprinnelsen som skal brukes for manipulering av tredimensjonale koordinater.
    5. Hev nålen litt utenfor skallen overflaten og flytte 2 mm lateral og 1 mm rostral fra Bregma.
    6. Senk nålen nøye gjennom skallen til sin destinasjon 4 mm ventral fra Bregma. MERK: Vi utnyttet disse stereotaktisk koordinater for å målrette basalgangliene. Forskjellige stereotaktisk koordinater kan bli anvendt for å undersøke virkningen av forskjellige microenvironmentalområder av hjernen på tumorigenesis.
    7. Injiser 5 mL av cellesuspensjonen ved å aktivere den repeterende antigen dispenseren én gang. La nålen på plass i 2 min for å tillate intrakranialt trykk for å ekvilibrere.
    8. Trekk nålen langsomt over en periode på 30 sek. Bruk en bomullspinne for å legge trykk på noen blødning som kan oppstå.
    9. Tilnærmet sårkantene og lukke snitt bruker vev lim. Administrer 20fil Lidocaine subkutant ved innsnitt området. MERK: For fem mus trinn 3.5.1-3.5.9 vil ta ~ 50 min. The UNC IACUC godkjente postoperativ bruk av lokalbedøvelse bare. Samråd med lokale institusjonelle IACUC anbefales om krav til postoperativ smertestillende bruk etter denne prosedyren.
  6. Post-kirurgisk Care
    1. Plasser dyrene i et rent, varmt bur å gjenopprette. Dyr bør ikke plasseres direkte i sengetøy, som utilsiktet inhalering kan forekomme.
    2. Observerdyr for gjenopptakelse av normal atferd som for eksempel stell, spising, og avføring. MERK: Gjenopptagelse av normal atferd kan ta ~ 60 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi utviklet en nGEM modellsystem med kortikale astrocytter og NSC høstet fra neonatal GEM husing floxed betingede onkogene alleler som kan fenotypisk preget in vitro og in vivo (Figur 1). For å undersøke konsekvensene av onkogene mutasjoner spesielt i kortikale astrocytter in vitro, er det avgjørende å først berike for astrocytter. Kortikale astrocyte avlinger inneholder en blanding av mikroglia, astrocytter, oligodendrocytter, OPC, og nerveceller, men mekaniske og genetiske metoder kan hjelpe i astrocyte berikelse. Mens nevroner dø under normale kultur forhold, kan mikroglia og oligodendrocytter fjernes ved å riste over natten 41,43. I tillegg kan genetisk rekombinasjon av floxed, onkogene alleler målrettet mot GFAP + astrocytter ved hjelp av en Ad5GFAPCre berike for astrocytter. Vi brukte denne metoden for å infisere kortikale avlinger fra Rb1 loxP / loxP GEM unger med flofast NF1 loxP / loxP og / eller PTEN loxP / loxP alleler. Ad5GFAPCre infeksjon forårsaket en proliferativ fordel i rekombinert GFAP + astrocytter, som økte astrocyte renhet fra 59% til> 90% etter 5-9 passasjer i kultur (Figurene 2A og 2B). Alternativt kan vi anriket for astrocytter ved å uttrykke T 121 under kontroll av GFAP-promotoren til å indusere en proliferativ fordel i astrocytter høstet fra TgGZT 121 mus (figur 2C). Mens kortikale astrocytter vokse tilhenger til dyrkningsskål (figur 2C), NSC vokse som ikke-adherente neurospheres in vitro (figur 3A). Både WT NSC og NSC med saman, floxed onkogene alleler - TgGZT 121 (T), Kras G12D (R), og homozygot PTEN sletting (P - / -), referert til som TRP- / - - Uttrykke NSC markør Sox2, mens bare NSC høstet fra GEM inneholder TgGZT 121 uttrykke T 121 etter Cre-mediert rekombinasjon (Figur 3B).

Å bestemme hvordan G 1 / S (RB), MAPK og / eller PI3K pathway endringer påvirker veksten av GFAP + astrocytter in vitro, spredning ble undersøkt ved hjelp av to metoder. MTS og celletelling viste at ekspresjon av T 121 og Kras G12D økt spredning av kortikale astrocytter (figurene 4A og 4B). Tilsvarende homozygot Rb1 (RB) og NF1 (N), sletting kombinert med heterozygot PTEN (P +/-) sletting også økt kortikal astrocyte spredning (figur 4C). Transformerte celler har ubegrenset proliferativ kapasitet. De transformerende effekter av mutasjonene kan måles in vitro ved hjelp av colony formasjons analyser. Vi har derfor testet de transformere effekter av T 121 og Kras G12D uttrykk og homozygot PTEN sletting i TRP - / - kortikale astrocytter etter koloni dannelsen analysen som tidligere beskrevet 44. Mens WT astrocytter ikke danner kolonier, T astrocytter dannet kolonier på 1,03% effektivitet. Spesielt, TRP - / - astrocytter hadde den høyeste kolonidannelse effektivitet på 6,40% (tabell 1). For å være egnet for preklinisk medikament-testing, er det viktig at in vitro tumormodeller kan lett manipuleres genetisk. Andre genetiske forandringer kan stabilt innført i kortikale astrocytter etter plasmid eller virale vektorer. Som et eksempel, vi stabilt omformet luciferase genet inn TRP - / - astrocytter (TRP - / - luc) med en VSV-pseudotyped pMSCV retroviral vektor. Ekspresjon av luciferase øker luminescens ~ 1000 ganger sammenlignet med foreldreceller ( in vitro. Vi har tidligere vist at behandling med lavdose PI-103, en dobbelt mTOR / PI3K-inhibitor, inhiberte PI3K-signalering uten å påvirke cellelevedyktighet 30. Imidlertid ble cytostatika / cytotoksiske effektene av høyere PI-103 doser ikke bestemt. Dermed testet vi om PI-103 kan redusere TRP - / - astrocyte vekst in vitro. PI-103 forårsaket en maksimal 88% reduksjon i TRP - / - astrocyte vekst (figur 4E). Vi har tidligere benyttet ortotopiske allografts av TRP - / - astrocytter å teste andre klinisk relevante legemiddel in vivo (Schmid et al, manuskript innsendt.) 45,46. Disse dataene antyder at forvandlet kortikale astrocytter høstet fra betinget GEM kan gi et fleksibelt modellsystem der å utføre preklinisk narkotika testing i immun kompetent mice.

Xenografts av etablerte humane cellelinjer og PDX krever immunsvikt verter. I motsetning til PDX, mange etablerte menneske GBM cellelinjer ikke rekapitulere de histopatologiske trekk ved GBM. For eksempel U87MG ortotopiske xenografts dannet avgrensede svulster som ikke invadere normal hjerne (figur 5A). I kontrast, injeksjon av TRP - / - astrocytter mot hjernen på immun kompetente, syngene mus ga invasive svulster som rekapitulert de histologiske trekk ved sine menneskelige kolleger, spesielt invasjonen av normal hjerne (Figur 5B). Til lengde kvantifisere TRP - / - allograft vekst, ble musene ofret hver 5 dager etter celle injeksjon og tumorbyrde ble bestemt ved å kvantifisere tumorområdet på H & E-farget hjerne seksjoner. Tumorområdet økt eksponentielt over tid (figur 5C). Orthotopic injeksjon av 10 5 TRP - / - astrocytter i recipient hjerner førte til nevrologisk sykelighet, med en median overlevelse på 22 dager (Figur 5D). I tillegg til kortikale astrocytter, vi utførte ortotopiske injeksjoner ved hjelp av TRP - / - NSC. TRP - / - NSC-avledet svulster var T 121 positive, proliferativ, og opprettholdt uttrykk for NSC markør Sox2 (figur 6). Av notatet, injeksjon av kortikale astrocytter og NSC høstet fra WT C57BL / 6 mus samt fenotypisk WT kortikale astrocytter eller NSC med unrecombined, floxed onkogene alleler fra betinget GEM klarte å lokke fram tumorigenesis i denne tidsrammen (data ikke vist). Langsgående avbildning in vivo har blitt brukt for å overvåke tumorvekstkinetikk i respons til medikamentbehandlinger 40. Dermed TRP - / - LUC astrocytter ble injisert inn i hjernen til immun kompetente syngene kullsøsken og tumorvekst ble bestemt av serie bioluminesens imaging. Bioluminescence økt 15 ganger i løpet av 16 dager(7A og 7B). Vi har vist at kortikale astrocytter og NSC høstet fra betinget GEM kan bli genetisk modifisert, og fenotypisk karakterisert in vitro og in vivo for definisjon av genetikk og cellebiologi astrocytom patogenese og eventuelt brukes for preklinisk utvikling av legemidler.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av kortikal astrocyte og NSC høste fra nGEM. Fenotypisk WT kortikale astrocytter og NSC ble høstet fra GEM med betinget onkogene alleler. Genetisk rekombinasjon ble indusert in vitro med en AdCre vektor. Transformerte celler ble karakterisert fenotypisk in vitro ved forskjellige fremgangsmåter og in vivo ved orthotopic injeksjon i hjernen av immun-kompetente,syngene kullsøsken.

Figur 2
Figur 2. berikelse av GFAP + astrocytter på serieaging in vitro. Representative immunofluorescence bilder som viser GFAP + astrocytter høstet fra Rb1 loxP / loxP GEM unger med NF1 loxP / loxP og / eller PTEN loxP / loxP der genetisk rekombinasjon ble indusert med Ad5GFAPCre og cellene passaged X ganger (PX) (A). Kvantifisering av anrikning av GFAP + astrocytter i panelet A. Barer representerer standard feil 3-24 replikater (B). Representant immunfluorescens (øverst) og fasekontrast (nederst) bilder av heft kortikale astrocytter høstet fra TgGZT 121 GEM unger som uttrykker T 121 fra GFAP promoter på pass9 år etter rekombinasjon med Ad5CMVCre in vitro (C). Astrocytter ble kvantifisert som antall GFAP + (grønn) celler dividert med det totale antall DAPI-farget kjerner (blå) på annenhver passering. Bilder ble tatt ved 10X opprinnelig forstørrelse (A, C). Scale barer representerer 100 mikrometer (A, C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. WT og saman NSC høstet fra TRP - / - GEM. Representative bilder fase kontrast til fenotypisk WT (øverst) og TRP - / - (nederst) NSC vokst som neurospheres in vitro (A). Representant immunfluorescens farging for T 121 (grønn) og Sox2(Rød) uttrykk i WT (øverst) og TRP - / - (nederst) neurospheres (B). Scale barer representerer 100 mikrometer (A, B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Karakterisering av kortikale astrocytter in vitro. Vekst av WT og TR kortikale astrocytter ble bestemt ved telling av celler på dag 1-7 (A). Relativ optisk tetthet (OD) av WT og TR kortikale astrocytter ble bestemt av MTS (B). Relative veksten av WT og recombined Rb1 - / -; NF1 - / -; PTEN +/- (RbNP +/-) astrocytter ble bestemt av MTS (C). Luminescence av foreldre TRP - / - og Luciferase uttrykke TRP - / - astrocytter (TRP - / - luc) (D). Relativ OD av TRP - / - astrocytter behandlet med PI103 5 dager som bestemmes av MTS (E). Spredning og doserespons ble beregnet ved hjelp av den eksponentielle veksten ligningen i GraphPad Prism 5. Barer representerer standard feil fra seks replikater per tilstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. In vivo gliomagenesis. Representant H & E farget del av en U87MG xenograft viser diskrete tumoravgrensninger (A). Representant H & E farget del av en TRP - / - allograft viser diffuse invasjon av normal hjerne (B). Scale barer i venstre og høyre H & E bildene representerer 1 mm og 100 mikrometer, henholdsvis. Tumorområdet ble bestemt ved å analysere H & E farget deler av formalinfikserte, parafin innebygd hjerner fra immun-kompetente, syngene kullsøsken injisert med 10 5 TRP - / - astrocytter og ofret på 5 dagers mellomrom etter injeksjonen. (C). Kaplan-Meier overlevelsesanalyse av TRP - / - leverallograft mus alderen til sykelighet viser en median overlevelse på 22 dager (D).

Figur 6
Figur 6. Immunfluorescens av TRP +/- NSC allografts. Representative immunofluorescence bildene viser at TRP +/- NSC injisert i hjernen av immun-kompetente, syngene kullsøsken uttrykke T 121 (grønn) og Sox2 (hvit) og spre seg, som bestemmes av Edu (rød) innlemmelse. Mus ble perfundert med Edu og ofret 6 uker etter injeksjonen og deres hjerner perfundert med paraformaldehyde. Scale bar representerer 20 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Lengde avbildning av TRP - / - LUC allografts. Representative Bioluminescens bilder (A) og kvantifisering av luciferase flux over tid (B) viser en vekst på TRP - / - allografts i immun-kompetente, syngene mus injisert med 10 5 TRP - / - LUC kortikale astrocytter og avbildes på de angitte dager etter injeksjon.g "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Genotype Plating effektivitet (%) SEM
WT 0 0
T 1.03 0,15
TRP - / - 6,40 0.83

Tabell 1. Colony dannelsen av kortikale astrocytter. WT, T og TRP - / - kortikale astrocytter ble belagt i tre eksemplarer på 4000, 2000, og 250 celler / brønn hhv. Kolonier ble farget med krystallfiolett 14 dager etter plating, avbildes, og coskapsføres ved hjelp ImageJ. Plating effektiviteten ble beregnet som antall kolonier dividert med antall celler belagt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest kritiske trinn for å sikre riktig og høsting av kulturen kortikale astrocytter er 1) for å skjære barken uten å ta vev under corpus callosum, 2) for å fjerne hjernehinnene, 3) for å grundig dissosiere cellene, og 4) å anrike for GFAP + astrocytter. Selv om vi brukte mekanisk (risting) og genetisk (begrensning av genetisk rekombinasjon med en Ad5GFAPCre vektor eller utnyttelse av en dominerende transformerende transgenet (TgGZT 121) under GFAP promoter kontroll) metoder for å berike for GFAP + astrocytter, har andre teknikker blitt brukt til å rense kortikale astrocytter. For eksempel kan kontaminere mikroglia fjernes ved behandling av konfluente kulturer med en mitotisk inhibitor etterfulgt av l-leucin-metylester 47. Morfologien og ekspresjonsvektorer profiler av astrocytter mekanisk renset og dyrket i serum-inneholdende medier forskjellig fra akutt isolerte astrocytter, med den tidligere hypothesiZed å representere enten mer umodne astrocytic celler eller en reaktiv astrocyte fenotype 48,49. Mer nylig har en immunopanning metoden blitt utviklet for å prospektivt rense cortical gnager astrocytter og deres uttrykk profiler nærmere etterlignet akutt rensede astrocytter når dyrket i vekstfaktor-supplert, serumfrie medier 49. Virkningen av den konvensjonelle, mekaniske metode for kortikal astrocyte berikelse og kultur versus mer nylig utviklet immunopanning metoden på fenotyper undersøkt her fortsatt uklare. Uansett hvilken metode som benyttes, er det viktig å anrike for GFAP + kortikale astrocytter å bestemme fenotypiske konsekvenser av onkogene mutasjoner spesifikt innenfor denne celletype.

Kritiske fremgangsmåte for høsting NSC er 1) å nøyaktig lokalisere SVZ, 2) for å minimalisere skade på SVZ under disseksjon, og 3) for å filtrere cellene etter dissosiasjon før plettering. PreciSE NSC disseksjon teknikk er nødvendig for å finne og høste SVZ. Fordi NSC vokse i suspensjonskultur, er det nødvendig å filtrere cellesuspensjonen etter dissosiasjon til å redusere mengden av flytende avfall. Selv om vi utnyttet vekst i SCM å velge for NSC, kan NSC være prospektivt isolert av fluorescens-aktivert celle sortering av SVZ vev homogenate 50. Etter induksjon av genetisk rekombinasjon in vitro, er det viktig å overvåke de cellulære egenskapene av det kortikale astrocyte og NSC kulturer på tvers av passasjene. Fordi vi ikke prospektivt berike for astrocytter eller NSC under vev innhøsting, vi serielt overvåket berikelse og kvantifisert renhet av cellen type interesse ved immunfluorescens farging med kjent celle-type spesifikke markører (GFAP for astrocytter, Sox2 for NSC). I tillegg anbefaler vi systematisk overvåking av forventede signal konsekvensene av onkogene mutasjoner både før og ved hver passering etter Cre-Mediated rekombinasjon ved immuno og fenotypisk karakter celler tidligst passasje der renhet er maksimert og mutasjons indusert signal endringer stabilisere seg.

En viktig faktor i å utnytte primære cellekulturer er deres iboende replikative kapasitet og den fenotypiske effekten av de induserte mutasjoner. Fenotypisk WT murine astrocytter har begrenset replikative kapasitet og kan kun passaged 3 - 4 ganger i kulturen før de gjennomgår replikative senescens 31. Videre har mange kreft mutasjoner, spesielt i MAPK pathway gener, årsaken onkogen-indusert senescence in vitro 51. Således, hvis de induserte mutasjoner unnlater å udødeliggjøre celler og beskytte dem fra onkogen-indusert senescens, kan de ikke bli serielt passaged for fenotypisk karakteriser in vitro. Viral teinene som HPV E6 / E7 og SV40 store T antigen har blitt grundig utnyttet til å forevige mange menneskelige og muRine celletyper i kultur, inkludert astrocytter 13,26,30. Vi har tidligere vist at ablasjon av G1 / S cellesykluskontrollpunktet med T var tilstrekkelig til å udødeliggjøre kortikale astrocytter, men ikke tilstrekkelig til å forårsake letale astrocytomer in vivo. I kontrast, aktivering av MAPK og PI3K signalering i TRP - / - astrocytter førte til dannelsen av GBM i orthotopic allograft modellsystem 30. Således kan effekten av T, R, og P mutasjoner på murine astrocyte transformasjon in vitro som definert av koloni formasjons assays korrelerte med in vivo tumorigenesis i ortotopiske allografter.

Som alle modeller som krever kirurgisk implantasjon av tumorceller, orthotopic injeksjon av transform, nGEM celler i syngene mus hjerner vil lokke fram en akutt respons såret, kalt reaktiv gliosis. Under dette svaret, nevrale celler, inkludert astrocytter, oligodendrocyte stamfar (NG2 +) gliaceller, og microglia, proliferspiste og få en mer primitiv differensiering staten, i hovedsak som følge av utskilte proteiner som sonic hedgehog 52,53. Imidlertid er den proliferative fase av reaktiv gliosis i respons til stikk såret forholdsvis kort, vanligvis én uke 53. Vi har tidligere vist at injeksjon av TRP - / - astrocytter effektivt induserer tumorigenesis i denne tidsrammen, noe som gir lav grad astrocytomas som ofte utvikle seg til høyverdige astrocytomas, inkludert GBM. I kontrast, injeksjon av T eller TP - / - astrocytter sjelden utvikle seg til lavgradige astrocytomas på 1-3 uker etter injeksjon og disse svulstene ikke klarer å gå videre til høyverdig astrocytomas 30. Videre injeksjon av fenotypisk villtype kortikale astrocytter og NSC alene klarer å fremkalle tumorigenesis (data ikke vist). Vi fant at TRP - / - allograft vekst øker eksponentielt 2-3 ukers post-injeksjon, en tidsperiode som den proliferative fase reagererive gliosis har avsluttet (figur 5 og 7). Til å dekke eventuelle microenvironmental påvirkninger på tumorigenesis ved injeksjon av transform, nGEM celler i syngene muse hjernen, spesielt i proliferasjonsfasen av reaktiv gliosis, anbefaler vi å utføre kontroll injeksjoner av fenotypisk WT kortikale astrocytter eller NSC når undersøker nye kombinasjoner av unrecombined, floxed onkogene alleler. Vi anbefaler også overvåking av effektiviteten av tumorigenesis av både fenotypisk WT og transform (rekombinerte) celler med ukentlige intervaller i løpet av den første måneden etter injeksjonen, som vi tidligere har beskrevet 30.

Gjennom genetisk manipulering av enten de injiserte celler eller allograft verten seg selv, kan den nGEM astrocytom modellsystem bli brukt til å modellere mange aspekter av astrocytom patogenesen, inkludert tumor-Stroma interaksjoner. Som et eksempel, vi konstruert TRP - / - kortikale astrocytes til å uttrykke luciferase for å definere tumorvekstkinetikken in vivo (figur 7). Alternativt kan nGEM celler genetisk modifisert til å uttrykke et fluorescerende protein og orthotopically injisert i hjernene av GEM med fluorescensmerkede neuroner eller vaskulatur å definere interaksjoner mellom tumorceller og normale hjerneceller 54. Den microenvironmental påvirkning av hjernen regionen eller utviklingsalder på gliomagenesis kan bestemmes ved orthotopically injisere nGEM celler på forskjellige steder eller i ulike eldre mus. Selv korte tumor ventetider og overlevelse er gunstig for preklinisk narkotika testing, kan rask svulst utvikling ikke være ideelt å modellere noen aspekter av astrocytom patogenesen, inkludert ondartet progresjon, invasjon, og tumor-stomi interaksjoner. Overlevelse av nGEM allograft verter lett kan manipuleres ved å endre antallet celler injisert og systematisk å overvåke tumor pene og latens 30.

Menneske astrocytomas er genomisk kompleks og viser omfattende intra og inter-tumor heterogenitet 5-7,55,56. Potensielle kilder til denne heterogenitet inkluderer de somatiske mutasjoner som setter i gang tumorigenesis, mutasjonene ervervet i løpet av utviklingsprosessen av ondartet progresjon, og utviklingspotensialet av cellene oppstår disse mutasjonene. Storskala sekvense prosjekter har identifisert mange astrocytom mutasjoner og deres mønstre av co-forekomst 7. Disse studiene har stolt på bioinformatiske algoritmer for å identifisere hyppigst forekommende mutasjoner og å nominere mutasjoner som er sannsynlig onkogene, altså. "driver mutasjoner" som setter i gang tumorigenesis eller kjøre ondartet progresjon. Men den oncogene potensialet av mange av disse mutasjoner, og deres potensielle celletype spesifisitet, er ikke systematisk undersøkt i modellsystemer. Vi foreslår at nGEM modeller utilizing kortikale astrocytter og NSC som er beskrevet her, så vel som andre neurale celletyper som kan bli renset og dyrket i kultur, gir et allsidig system for å utføre slike undersøkelser. Tilstrekkeligheten og nødvendigheten for transformasjon av nye kandidat identifiserte mutasjoner gjennom storskala sekvense prosjekter kan da bli systematisk undersøkt ved hjelp av konvensjonelle genetisk gevinst-og taps-of-funksjon tilnærminger med spesifikke nGEM celletyper husing vanlige co-forekommende mutasjoner i kjerne GBM trasé som betinget GEM eksisterer fem. Vi foreslår videre at paneler av nGEM husing ulike kombinasjoner av mutasjoner i flere nevrale celletyper vil være nyttig i å modellere genomisk heterogenitet av menneskelige astrocytomas. I tillegg kan nGEM astrocytom modeller med kortikale astrocytter og NSC avledet fra betinget GEM gi en medgjørlig modell for preklinisk narkotika utvikling fordi innledende in vitro testing av både mono-og kombinasjonsbehandlinger kanutføres i disse cellene for å lede mer effektiv in vivo medikamenttesting i immun kompetente, syngene mus. Videre kan immunmodulerende og Stroma målrettede behandlingsmetoder testes i nGEM astrocytom modeller med immun kompetente, syngene leverallograft verter. Således nGEM astrocytom modeller med transform kortikale astrocytter og NSC er et verdifullt modellsystem for å bestemme de funksjonelle konsekvenser av kombinasjoner av onkogene mutasjoner i spesifikke celletyper, og kan være nyttig ved preklinisk medikament-testing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Tags

Nevrovitenskap astrocytom kortikale astrocytter genmanipulerte mus glioblastom nevrale stamceller orthotopic allograft
Modellering astrocytom Patogenese<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em&gt; Bruke kortikal astrocytter eller nevrale stamceller fra Betinget, Genetisk konstruert Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, … More

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter