Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modelleme Astrositom Patogenez Published: August 12, 2014 doi: 10.3791/51763
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 3, 5, 6, 2,3,7
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Introduction

Astrositomlar en sık görülen primer beyin tümörü glioblastoma (GBM), bir sınıf IV astrositom vardır, 12-15 ay 1,2 medyan sağkalım en yaygın ve agresif bir alt tiptir. Yaygın astrositomlar, özellikle GBM, istilası, tam cerrahi rezeksiyon engellemektedir adjuvan tedavilerin etkinliğini sınırlayan ve kaçınılmaz tedavi sonrası nüks 3 yol açar. De novo (birincil) GBM ile ya da kaçınılmaz (ikincil) GBM 4 ilerledikçe daha düşük grade astrositom ile ya başlangıçta başvururlar. GBM genomik heterojen ve üç damarlı sinyal yolları yönlendiren genler birbirini dışlayan ve co-ortaya çıkan mutasyonlar ile karakterizedir: G 1 / S (Rb) hücre döngüsü kontrol noktası, reseptör tirozin kinaz (RTK) ve TP53 5-7 yolaklarıyla. GBM GBM alt tipi Grip Grip Ağrilari olduğunu düşündürmektedir, beyin hücre tiplerinin farklı benzer sentezleme profillerine sahip dört alt tipinin genomik oluşmaktadırköken 6,8,9 kendi hücre tarafından etkilemiştir. Iyi astrositom modelleri astrositomdur patogenezi sırasında belirli hücre tiplerine mutasyonların belirli kombinasyonları rolünü tanımlamak için gereklidir. Daha verimli preklinik ilaç geliştirme için bu modelleri yararlanan hasta sonuçlarını geliştirmemize yardımcı olacaktır. Mevcut astrositom modeller, insan hücre hatları, hasta türetilmiş ksenograftları (PDX) genetik olarak tadil edilmiş normal insan astrositlerin nöral kök hücreleri (MGK) ve genetik olarak fareler (GEM) 10-14 kurulmuş bulunmaktadır. Kortikal astrositleri ve NSC - - floxed onkojenik alleles çeşitli kombinasyonlarını barındıran GEM hasat Biz primer beyin hücrelerini kullanan bir alternatif olmayan germ GEM (nGEM) modeli 15 geliştirmiştir. Amaç, fenotipik i preklinik ilaç gelişimi için in vitro ve in vivo olarak karakterize edilmiş ve potansiyel olarak yararlanılabilir genetik olarak tanımlanmış hücrelerin astrositom modellerini üretmek için olanmmune-kompetan farelerde azaltılmıştır.

Kurulan insan hücre çizgileri Bunlar düz ön teknik yaygın olarak mevcuttur. Astrositoma patogenezinde ve in vitro ve in vivo ilaç yanıtı en yaygın olarak kullanılan model, ve immün yetersiz farelerde 10,11,16-18, ortotopik Xenografting üzerine kinetik ve tümör oluşum nedenlerinin tanımlanmış . Onların dezavantajları sadece yüksek dereceli astrositom çalışma sınırlayıcı, düşük-dereceli astrositomlardan kurulan hücre hatları oluşturmak için yetersizlik içermektedir; Kalkış tanımlanmış bir hücre eksikliği; genellikle orijinal hasta numunesinden gelen belirgin bir şekilde farklıdır genomik profiller ile kompleks genomik anormalliklerin mevcudiyeti; ve duyarlılık serumdaki 11,17,19-22, seri kültürü sırasında fenotipik ve genotipik sürüklenme için. Kurulan insan GBM hücre hatlarında bireysel onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçları genellikle eluc engeller aslında mevcut anomalilerin sayıda kamufle edilebilirDoğrudan genotip-fenotip sonuçları idation.

PDX immün yetersiz farelerde veya bağışıklık yetersizliği olan farelerde 12,23 beyinlerine ortotopik enjeksiyondan önce tanımlandığı gibidir, serumsuz ortam içinde yapışkan olmayan küremsi olarak kültür yoluyla hastaya izole astrositom hücrelerinin deri altına geçişi elde edilmektedir. PDX daha doğru bir insan astrositomas genomik manzara eder, fakat bilinen insan hücre çizgilerine benzer, tek tek onkojenik mutasyonların fenotipik etkisinin genomik karmaşıklığı nedeniyle 19,24 maskelenebilir. Özellikle yeni tedavilere karşılık olarak, belirli onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçlarını tanımlamak için, bilinen insan hücre çizgileri veya PDX panelleri genellikle, genotip-fenotip bağlantıları ortaya genelleştirilebilirliğini gösterir ve hücre çizgisi özel etkilerin ihtimalini en aza indirmek için kullanılmaktadır. PDX doğru insan astrositomaların, inc histopatolojik izlerini recapitulate ikeninvazyon luding, bilinen insan hücre çizgilerinin ortotopik ksenogrefleri genelde 21,23,25 yok. Buna ek olarak, normal insan astrositler ve NSC in vitro ve in vivo olarak 13,14,26 astrositom tümörogenez modellemek için tanımlandığı onkojenik mutasyonu olan genetik olarak tasarlanmış edilmiştir. Bu hücreler, bilinen insan hücre çizgileri ve PDX genomik karmaşıklığı eksikliği ve doğru bir şekilde insan astrositoma histopatoloji özetlemek, fakat in vivo olarak bağışıklık eksikliği, kemirgenlerde yabancı-doku naklinde gerektirir. Tüm insan hücre modelleri immün-aracılı ksenogreft reddini önlemek için bağışıklık yetersizliği olan kemirgen ana gerektirdiğinden, bu modeller stroma hedefli ve immün-modülatör preklinik soruşturma sınırlayıcı, bir singenik sisteminin yerel tümör-stroma etkileşimleri özetlemek başarısız ve sağlam bir bağışıklık sistemi eksikliği 10,11 terapiler.

Onkojenik Muta önceden belirlenmiş kombinasyonları fenotipik sonuçları GEM izni incelenmesiin situ tümörigenezinde sırasında in vivo leri. -Çıkışlı şartsız GEM gelişimi boyunca bütün dokular içinde mutasyonlara sahip ise, koşullu GEM hücre tipine özgü promoterler 10,11,15,18 kullanımı yoluyla, özel hücre tipleri Cre-aracılı rekombinasyon sınırlayan mutasyonların hedefleme olanak onkojenik allelleri floxed var. Koşullu astrositom GEM sağlam bir beyin içinde 11 farklı hücre tiplerinde onkojenik mutasyonların işlevsel roller ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Koşullu GEM kullanılarak in situ gliom klinik öncesi programı 1) bir in vitro bir korelasyon eksikliği, kompleks genotipler ile, in situ tümör gelişiminde, 3) uzun gecikme farelerin büyük gruplarının bir üreten 2) zorluk içeren bir dizi faktöre ile sınırlıdır , 4) ve stokastik tümör ilerlemesi. In situ uygun bir tümör oluşumu in vitro bir model eksik olduğundan, in vitro ilaç testi ağırlık gerçekleştirilemezi'inci geleneksel koşullu GEM modelleri. Diğer kanserlerin tersine, astrositom şartlı gem modelleri nadiren tek onkogenik mutasyon 11 ile uyarılmaktadır. Böylece, karmaşık ıslah programları çoklu onkojenik mutasyonlar ile koşullu GEM oluşturmak için gereklidir. Yüksek dereceli astrositom ilerleme genellikle tekdüze olmayan, stokastik bir şekilde ortaya çıkar ve sonuçta karmaşık genomik manzaralar ve hızlı büyüme kinetiği 27 ile tümörlere yol açar Dahası, astrositom başlatma, bu modellerde uzun bir kuluçka döneminden sonra penetransı değişken oluşur, 28. Koşullu GEM modellerinde değişken Penetrans ve malign ilerlemesi stokastik doğası bireysel farenin preklinik ilaç araştırmaları yaptığını kayıt önce yüksek dereceli astrositomaların varlığını ve yerini belirlemek için radyografik görüntüleme ile taranmalıdır gerektirir. Birlikte ele alındığında, bu sınırlamalar pr için gerekli üretim ve koşullu GEM büyük kohortlarda test engeleclinical uyuşturucu testi.

Belirli bir nöral hücre tipleri üzerinde bulunan viral reseptörü (tva) ifade etmek üzere geliştirilen GEM enfekte etmek için kuş retroviral (RCAS) vektör kullanır RCAS-tva GEM sistemi,, geniş bir astrositoma tümörogenez 11 modellemek için kullanılmıştır. Koşullu GEM aksine, bu model sistem karmaşık yetiştirme programları için gerek olmaksızın, belirli hücre tiplerinde çoklu onkojenik mutasyonun ortaya çıkmasına olanak tanır. Bununla birlikte, değişken penetrans aktif viral entegrasyonu sağlamak için bölünen hücreler için ihtiyaç ve bunlar, konakçı genomu 29 içine transgenlerin rastgele yerleştirilmesi ile sınırlıdır.

Diğer model sistemler 15 sınırlamaları birçok üstesinden çünkü GEM hasat hücreleri kullanması Sigara germ GEM (nGEM) modelleri, giderek daha önemli hale gelmektedir. Astrositoma patogenezinde hücre tipinin ve birlikte görülen mutasyon başlatma rolü engellemek için zordurbu habis ilerleyişi sırasında belirsiz hücre tipinde yaygın genetik mutasyonlar birikmiş son aşama tümörlerinden türetilmiştir, çünkü maden insan GBM hücresi türleri veya PDX tesis kullanılarak. Buna karşılık, astrositomaların tüm sınıflarda spesifik saflaştırılmış beyin hücre tipleri 11,30 içindeki genetik mutasyonlar tanımlanmış indükleyerek nGEM kullanılarak modellenebilir. Bu nedenle, belirli genetik mutasyon ve hücresel ve moleküler fenotipe hücre tipinin etkisi in vitro ve in vivo olarak belirlenebilir. Kurulan insan GBM hücre çizgilerine benzer bir şekilde, başlangıç ​​nGEM kullanılarak in vitro ilaç testleri aynı hücreleri kullanılarak, in vivo testler için ilaç öncelik için kullanılabilir. In vivo olarak tümör oluşumu daha sonra ortotopikal bağışıklık-kompetan singeneik litermatlarından 30 beyinlerine nGEM hücreleri allogeneik belirlenebilir. Bu ortotopik alograft modelleridir nedenle, sadece sitotoksik a in vivo testler izinnd terapileri hedefli, ancak immün-modülatör ve stroma hedefli tedaviler de. Son olarak, tümör başlaması ve ilerlemesi üzerinde mikro-rolü, aynı hücre tipinde aynı mutasyonları kullanılarak, nGEM konvansiyonel GEM modelleri arasında sonuçları karşılaştırarak belirlenebilir.

Biz ve diğerleri birincil hücreler kullanılarak astrositomdur nGEM geliştirdik - astrositleri, MGK, ya olgodendrosit öncü hücrelerini (OPC) - GEM 30-34 hasat. Astrositom nGEM geliştirilmesi arkasındaki mantık, potansiyel olarak, bağışıklık-kompetan hayvanlarda klinik öncesi in vitro ilaç testleri için ve in vivo kullanılabilecek belirli hücre tiplerinde onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçlarını belirlemek için bir model oluşturmak için olmuştur. Rb1 loxp / loxp veya TgGZT - Biz ifade fenotipik WT kortikal astrositleri ve non-Cre gelen MGK, floxed RB yolun bir>% 94 C57 / BL6 arka plan üzerinde muhafaza koşullu GEM hasat121 - çeşitli kombinasyonlarda 35-39 genleri - Nf1 LoxP / LoxP, Kras G12D, PTEN LoxP / loxp - ve RTK / RAS / PI3K- yolu floxed. Bu Cre rekombinazı kodlayan adenoviral vektörler kullanılarak in vitro genetik yeniden neden oldu. Kortikal astrosit hasat hücre tiplerinin bir karışımını içerdiği için, bu kültürlerde GFAP + kortikal astrositler zenginleştirmek için, bu tür TgGZT insan GFAP promotöründen 121 olarak Ad5GFAPCre vektörler veya baskın onkojenik transgenleri, ikinci. Bu in vitro ve in vivo olarak kortikal astrositler ve NSC fenotipik G1 / S sonuçlarını (Rb) için, MAPK ve PI3K yolu tanımlanmış mutasyonlar. MAPK ve PI3K yolu ile aktive olan G1 / S hatalı olarak taklit insan astrosit moleküler proneural GBM ve ortotopik enjeksiyonu üzerine, düzgün büyüme kinetikleri, kısa süreye göre önceden belirlenmiş bir konumda oluşan tümörler, ve histopatolojikinsan GBM 30 al işaretlerinden. In vivo tümör büyümesinin tedavisine boyuna izlenmesi 40 cevaben tedavi gruplarına ya da tümör büyümesinin kantitatif analiz normalizasyonu ile klinik öncesi bir ilaç test yardımcı olur. Biz, lusiferaz sentezleyen kortikal astrositler enjekte edilmiş farelerin uzunlamasına biyolüminesans görüntüleme ile tümör büyüme kinetiklerini belirlenmiştir. Bu nedenle, elde edilen koşullu GEM kortikal astrositler ve NSC astrositom ve ilişkili mutasyonların işlevsel sonuçları ve klinik öncesi bir ilaç gelişimi için olası bir model sisteminin tanımı için izlenebilir model sistem sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları Kuzey Carolina Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Yenidoğan Farelerde 1. ekimi Kortikal Astrositler

  1. Hazırlık
    1. 2-3 hassas bir görev doku buruşturma ve% 70 etanol ihtiva eden bir kabın dibine içine koyun. Kesme makasları, kavisli bir forseps ve bu balona düz mikro forseps 2 çift yerleştirin. Dokular, mikro forseps eğilmesini önlemek için kullanılır.
    2. Bir 60 mm doku kültürü çanağı, HBSS içinde 1 ml ilave edilir. Her bir hayvan için ayrı bir çanak hazırlayın ve buz üzerinde yemekleri korumak.
    3. Kurumsal düzenlemeler başına hayvanların anestezisi.
    4. Sıcak% 10 fetal sığır serumu ve 1% penisilin-streptomisin (tam bir DMEM), 37 ° C su banyosu içinde, her hayvan için DMEM 7 ml. NOT: 5 fareler için, 1.1.1-1.1.4 ~ 15 dakika sürer adımları.
  2. Doku Hasat
    1. Instituti başına yenidoğan fare (günde 1-3) KurbanÖnal düzenlemeler.
    2. , Etanol kesme makasları kaldır onları kuru damla izin ve burun omurilikten kafatası üzerinde deri bir sagital kesim yapmak.
    3. Omurilik başlayan ve bulbuslarında geçmiş uzanan, sagital sütür boyunca kafatası bir kesim olun. Beyin doku hasarı en aza indirmek için kafatasının iç yüzeyine yakın makas ipuçları tutmaya özen gösterin.
    4. Kavisli bir forseps kullanarak, yavaşça yanal beyin uzak kraniyumun her yarımkürede soyun.
    5. Düz mikro forseps kullanarak, yavaşça her kortikal yarımkürenin dorsal kısmını uzak çimdik ve HBSS içeren doku kültürü çanak içine yerleştirin. Beyincik ve koku ampul önlemek için özen gösterin. Korpus kallosum altındaki herhangi bir doku almayın.
    6. Diseksiyon mikroskobu ve mikro forseps 2 çift kullanarak, yavaşça her kortikal yarımkürede meninksler kaldırmak. Doku homogenizatio başlayana kadar buz doku kültürü çanak dönn.
    7. Her ek hayvan için 1.2.6 ile 1.2.1 adımları. NOT: 5 fareler için, 1.2.1-1.2.7 ~ 30 dakika sürer adımları.
  3. Doku Homojenizasyon
    1. Temiz bir jilet kullanarak, ince kortikal hemisferlerin zar ve doku kültürü kaputu plaka taşıyın.
    2. Bir steril 15 ml konik bir tüp içine küp şeklindeki doku aktarın. Buz gibi soğuk HBSS 1 ml, plakayı yıkayın ve doku ihtiva eden tüpe aktarın.
    3. Doku tüpünün tabanına yerleşir kadar, daha sonra dikkatli bir şekilde bir pipet kullanarak fazla HBSS kaldırmak bekleyin.
    4. Oda sıcaklığı tripsin / EDTA, 2 ml ilave edilir. 1 ml pipet pipet ~ 10x daha fazla hücreleri ayırmak.
    5. 20 dakika - 15 boyunca 37 ° C'de hücre süspansiyonu inkübe edin. Dikkatle ters çevirme ile her bir 5 dakika karıştırın.
    6. Tripsin inhibe etmek için tam DMEM 3 ml ilave edilir. 1 ml'lik bir pipet pipet ~ 10x çözeltinin karıştırın.
    7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
    8. Kaldır1 ml'lik bir pipet ile yüzer. Pelet gevşek olabilir çünkü orta aspire etmeyin.
    9. DMEM ile tamamlanmış, 37 ° C, 4 ml pelletini. 75 cm hücre süspansiyonu aktarın üst doku kültürü şişesi vidalı. NOT: 5 fareler için, 1.3.1-1.3.9 ~ 50 dakika sürer adımları.
    10. Yaklaşık astrosit hasattan sonra 16 saat, daha sonra DMEM ile tamamlanmış C 4 mi 37 ° ekleyin 37 ° C'de 4 ml HBSS ile balonun yıkayın. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de kortikal astrositler koruyun. NOT: yıkama adımı kültürü çanak yapışmayan hücrelerin uzaklaştırılması ve kalıntının için önemlidir.
    11. Kültür olduğunda ~% 95 birleştiğinde,% 5 37 ° C'de gece boyunca çalkalanır CO2, müstakil hücreleri ihtiva eden ortam daha sonra 37 ° C'de 4 ml HBSS ile balonun yıkayınız. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de hücreler DMEM doldurun ve muhafaza 37 ° C 4 ml ilave edilir. NOT: Bu adım kortikal astrositlerde için kültürlerini zenginleştirmek için önemlidir, mikroglianın kirlenmesine olarak veolgodendrosit progenitör hücreler bu prosedür ile ayırmak ve kültürden 41 kaldırılır.
    12. Tekrar her bir hayvan için 1.3.1-1.3.11 adımları.
  4. Genetik Rekombinasyon indüksiyon
    1. 24 saat 1.3.11 adımı tamamlandıktan sonra DMEM ile tamamlanmış, 37 ° C, 2 ml orta yerine. Ad5CMVCre veya Ad5GFAPCre> 10 10 pfu / ml 1 ul içeren 37 ° C SCM 1 ml ekleyin. Kullanım BSL2 güvenlik önlemleri taşıma rekombinant adenovirüsün:% 5 CO2 .CAUTION 32 ° C'de 6 saat süreyle inkübe edin.
    2. Virüs içeren ortamları çıkarın ve kortikal astrositlere virüs olmadan 37 ° C tam DMEM ekleyin. DİKKAT: BSL2 güvenlik önlemleri rekombinant Adenovirusların taşıma ve kurumsal düzenlemelere göre virüs içeren medya atarken. NOT: - ~ 6 saat inkübasyon hariç 15 dakika sürer 1.4.3 5 Astrosit kültürler için, 1.4.1 adımları.
    3. En çok kortikal Astrosit kültürleri genişletvitro ve in vivo karakterizasyonu. Not: yeniden birleştirilmiş gen için ya da belirli bir mutasyona uğramış proteinin ya da onun sinyal sonuçlarından biri için immünoblotlar ile spesifik primerler kullanılarak PCR ile takip rekombinasyon Cre mutasyonların varlığını belirlemek. Cre rekombinasyon sonra kortikal astrosit kültürlerinin fenotipik stabilizasyonu için gerekli süre kullanılan mutasyon bağlı olacaktır ve deneysel olarak (Şekil 2) tespit edilmelidir.

Yenidoğan Farelerde 2. ekimi Nöral Kök Hücreler

  1. Hazırlık
    1. 98 mM Na-2 SO4, 30 mM K 2 SO4, 5.8 mM MgCl2, 0.25 mM CaCl2 - diseksiyon başlamadan önce, 3.1 mg papain ve 4 ml ayrışma ortamı 1,3 mg sistein eklenerek beyin başına 4 mi sindirim çözelti hazırlamak , 1 mM HEPES, 20 mM glükoz,% 0.001 kırmızı Fenol ve 0.125 mM NaOH (1 M HEPES pH 7.4 stoktan). Papain ilavesive ayrışma ortamı sistein çözelti sarıya döner.
    2. 15 dakika için 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. Tersine çevirerek periyodik karıştırın.
    3. Sindirim çözüm kırmızı renk ışık dönene kadar 0,1 M NaOH damla damla ekleyin.
    4. Bir doku kültürü kaput, steril bir filtre, bir şırınga filtresi (0.22 um gözenek boyutu) kullanılarak sindirim çözeltisi. Buz üzerinde sindirim çözeltisi tutun.
    5. 44.5 mi MGK bazal ortam, 5 mi MGK ek, 0.5 ml penisilin-streptomisin, 50 ul% 0.2 heparin, 10 ul 100 ug / ml EGF ve 10 ul 100 ug / ml karıştırılarak Kök Hücre Orta (SCM) 50 ml hazırlamak bFGF'dir. 4 ° C'de saklandığında, SCM 1 hafta süreyle stabildir.
    6. Tam HBSS (cHBSS) HBSS 10x 50 mi, 1.25 mi, 1 M HEPES (pH 7.4) karıştırılarak hazırlanması 15 ml 1 M D-glikoz, 5 ml 100 mM CaCl2, 5 ml 100 mM MgSO 4 ve 2 mi 1 M NaHCO3. GKD 2 O ile 500 ml toplam hacmi getirmek
    7. CHBSS zekâ sterilize Filtre4 ° C 'de 0.2 hektar um gözenek boyutlu filtre saklayın.
    8. 2-3 hassas bir görev doku buruşturma ve% 70 etanol ihtiva eden bir kabın dibine içine koyun. Kesme makasları, kavisli bir forseps, ve bu balona düz mikro forseps 2 çift yerleştirin. Dokular, mikro forseps eğilmesini önlemek için kullanılır. NOT: 5 fareler için, 2.1.1-2.1.8 ~ 45 dakika sürer adımları.
  2. Doku Hasat
    1. Kurumsal düzenlemeler başına neonatal (gün 1-3) fareler kurban.
    2. ,% 70 etanol kesme makasları kaldır onları kuru damla izin ve burun omurilikten kafatası üzerinde deri bir sagital kesim yapmak.
    3. Omurilik başlayan ve bulbuslarında geçmiş uzanan, sagital sütür boyunca kafatası bir kesim olun. Beyin doku hasarı en aza indirmek için kafatasının iç yüzeyine yakın makas ipuçları tutmaya özen gösterin.
    4. Kavisli bir forseps kullanarak, yavaşça yanal uzak gelen kraniyumun her yarımkürede soymabeyin.
    5. Yavaşça buz cHBSS yılında tüm beyin ve yer çıkarın.
    6. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, dikkatle ince diseksiyon araçları ile beyin meninks çıkarın.
    7. Alt yüzeyinde beyin yerleştirin ve bir boyutu 11 neşter ile keser dikey (koronal) ile beyincik / arka beyin ve koku alma ampul / frontal korteks kaldırmak.
    8. Böylece beynin koronal görünümünü üreten, kuyruk kısmına yerleştirmek için 90 ° kalan beyin Döndür. Lateral ventriküllerin bulun.
    9. Subventriküler bölgesini (SVZ'una) içeren bir kübik bir bölümünü kesmek.
    10. Boyutu 11 neşter ile taze buz soğuk cHBSS ve kıyma dokusu olan bir 60 mm doku kültürü çanağı için doku SVZ'una içeren aktarın.
    11. , Steril bir 15 ml tüp içine kıyılmış doku aktarın. Buz üzerinde tüp yerleştirin.
    12. 1-2 ml buz soğukluğunda cHBSS ile petri yıkayın. Doku içeren tüp yıkama çözeltisini.
    13. Tekrar ek neonata ile 2.2.1-2.2.12 adımlarıL. farenin gerekirse. Protokol kalanı için bir doku kültürü kaputu 15 ml tüpler aktarın. NOT: - ~ 45 dakika sürer 2.2.13 5 fareler için, 2.2.1 adımları.
  3. Doku Homojenizasyon
    1. 5 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde sindirim çözeltisi (aşama 2.1.1 'de hazırlanmış) yerleştirin. Ayrıca, bir 37 ° C su banyosu içinde beyin başına sıcak 2 mi SCM.
    2. Dikkatle 1 ml pipet ile kıyılmış doku süpernatant kaldırmak. Aspire etmeyin.
    3. 15 ml tüp başına 2 ml 37 ° C sindirim çözüm ekleyin ve tersine çevirerek iyice karıştırın.
    4. 15 dakika için 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. Ters çevirme ile her bir 5 dakika karıştırın.
    5. Her tüp ve tekrar adım 2.3.4 37 ° C sindirim solüsyonunun başka bir 2 ml ekleyin.
    6. Hücreler, yerçekimi ile tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin, daha sonra 1 mL pipet kullanılarak sindirilmiş dokusundan süpernatantı kaldırmak.
    7. CHBSS seyreltilmiş 10 mcM E-64 2 ml ekleyin ve tersine çevirerek iyice karıştırın.
    8. Hücreler, yerçekimi ile tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin sonra sindirilmiş dokudan süpernatantı kaldırmak.
    9. 37 ° C cHBSS 1 ml ilave edilir ve 1 ml pipet ucu (~ 20 vuruş) ile homojenize edilmiştir. Doku homojenizasyon sırasında hava kabarcığı enjekte kaçının.
    10. Daha sonra 37 ° C'de, 5 ml cHBSS ile süzgeç yıkayın, 40 mikron gözenek büyüklüğü hücre süzgecinden dokusu Homojenat geçirin.
    11. 5 dakika boyunca 125 x g'de doku Homojenat santrifüj.
    12. Hücre topaklarını bozmadan 1 ml'lik bir pipet ile% 95 arasında yüzer çıkarın. 200 ul pipet ile 200 ul 37 ° C SCM dikkatlice tekrar süspansiyon hücre pelet.
    13. 1.8 ml 37 ° C SCM ekleyin ve steril 6 delikli bir plakanın bir oyuğuna hücre süspansiyonu aktarın. NOT: 5 fareler için, 2.3.1-2.3.14 ~ 75 dakika sürer adımları.
  4. Nöral Kök Hücre Kültürü
    1. Başka bir 2 mi 37 ° eklenerek 3 gün sonra, ortam doldurmakC SCM.
    2. 7 gün sonra, 15 ml'lik bir tüpe aktarın ve neurospheres Neurospheres> 5 dakika boyunca yerçekimi ile razı.
    3. Süpernatantı ve 2 ml 37 ° C SCM ekleyin.
    4. 6 delikli bir plakanın yeni bir oyuğuna transfer neurospheres.
    5. Her 3-4 gün 37 ° C SCM 2 ml ekleyin ve her 7 gün orta tamamen değiştirebilir.
    6. Neurospheres çapı> 100 mm ise, dikkatli bir şekilde kök hücre ayrışma çözeltisi ile ayırmak ve istenen hücre yoğunluğu MGK Replate.
  5. Genetik Rekombinasyon indüksiyon
    1. Şu anda hücreleri üzerinde SCM 2 ml Ad5CMVCre veya Ad5GFAPCre> 10 10 pfu / ml 'lik 1 ul ihtiva eden 37 ° C SCM 1 ml ilave edilir. DİKKAT: BSL2 güvenlik önlemleri rekombinant adenovirüs taşıma.
    2. % 5 CO2 içinde 32 ° C'de 6 saat süreyle inkübe edin.
    3. 15 ml'lik bir tüp içine neurospheres ile SCM aktarın ve küreler 5 dakika boyunca yerçekimi ile razı.
    4. Daha sonra 200 ul pipet ile, 1 ml'lik bir pipet ile ilk süpernatantı. DİKKAT: BSL2 güvenlik önlemleri rekombinant Adenovirusların taşıma ve kurumsal düzenlemelere göre virüs içeren medya atarken.
    5. 6 plaka transfer sonra MGK virüs olmadan 37 ° C SCM 2 ml ilave edilir. NOT: 5 MGK kültürler için, 2.5.1-2.5.5 ~ 6 saat inkübasyon hariç 15 dakika sürer adımları.
    6. Ertesi gün, tekrar gerekli olduğu durumlarda neurosphere geçirme ile, ardından adım 2.5.1-2.5.5. Küreler şimdi in vitro karakterizasyonu ve in vivo Fare beyinleri ortotopik enjekte edilmeden önce, 2-3 geçişleri için genişletilebilir. Not: yeniden birleştirilmiş gen için ya da belirli bir mutasyona uğramış proteinin ya da onun sinyal sonuçlarından biri için immünoblotlar ile spesifik primerler kullanılarak PCR ile takip rekombinasyon Cre mutasyonların varlığını belirlemek. Cre yeniden birleşme sonrası kültürleri MGK fenotipik stabilizasyonu için gerekli olan zamana bağlı olacaktır(Şekil 2 ve 3) kullanılan mutasyon ve deneysel olarak tespit edilmelidir.

Alıcı Iimmunocompetent Fareler Beyin içine Rekombine Hücreleri 3. Ortotopik Enjeksiyon

  1. % 5 Metil selüloz hazırlanması
    1. 100 ml 50 ml'lik bir son hacme kadar iyonu giderilmiş su içinde 15 cps metil selüloz, 5 g çözülür vida kapaklı şişeye. Kümeleşmesini önlemek için 4 ° C sıcaklıkta yavaş yavaş karıştırılarak toz ekleyin. Bu çözüm girmek için tüm metil selüloz, 4 ° C de karıştırılarak 24 saat kadar sürebilir.
    2. Şişeyi tartın ve ağırlığı kaydedin.
    3. % 5 metil selüloz çözeltisi otoklava. Otoklavlanmış sonra, metil selüloz, bir yarı katı jel haline gelecektir.
    4. Şişe tartılır ve otoklav sırasında kaybedilen ağırlığın hesaplanması.
    5. Aseptik kayıp ağırlığının her gramı için steril su içinde 1 ml.
    6. Buz üzerine yerleştirin ve 50 ml buz soğukluğunda 2x DMEM ekleyin. </ Li>
    7. Gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 20 ml'lik miktarlar halinde,% 5 metil selüloz çözeltisi bölmek için steril tekniği kullanın. Altı aya kadar veya 2x DMEM sona erinceye kadar 4 ° C'de saklayın tümbölenleri. NOT: adımlarla% 5 metil selüloz çözeltisi hazırlanması 3.1.1-3.1.7 2,5 gün ~ alacaktır.
  2. Enjeksiyon için Kortikal Astrositler hazırlanması
    1. Hasat kortikal astrositler zaman ~% 90 konfluent.
    2. Toplama, aspirat bitmiş DMEM ve 37 ° C HBSS eşit hacimde plakaları yıkayın.
    3. Plaka karşılamak için yeterli tripsin ekleyin. Yavaşça tilt ve hücreleri ayırmak başlayana kadar plaka dokunun.
    4. DMEM ile tamamlanmış C 37 ° 'lik bir eşit hacmi ile tripsin etkisiz hale getirirler.
    5. 50 ml'lik konik bir tüp hücreleri aktarın ve 3.2.4 kullanılan 37 ° C'de tam DMEM aynı hacme sahip olan, plakayı yıkayın.
    6. Hücreleri içeren tüp yıkama medya aktarın. 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
    7. Aspire s1 ml 37 ° içinde upernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri DMEM tamamlamak C.
    8. Hücre / ul sayısını belirlemek için bir hemasitometre ya da başka bir uygun hücre sayacı kullanılarak hücre süspansiyonu sayın.
    9. Yeni bir 15 ml konik tüp hücreleri istenilen sayıda aktarın. 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
    10. 37 ° 800 ul süspanse hücreler DMEM tamamlamak C. Hücre topağı hacmini (- 800 ul hücre süspansiyonu, toplam hacim) belirler. NOT: Bu enjeksiyon için doğru bir hücre konsantrasyonu elde etmek esastır. Bu durumda, hücre topağın hacminin aşamasında 3.2.12 eklemek% 5 metil selüloz hacmi hesaplamak için bu aşamada tespit edilmelidir.
    11. Steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücreleri aktarın ve daha sonra 3 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
    12. Aspire hücre topağından süpernatan ve buz-soğuğu% 5 metil selüloz uygun hacimde kortikal astrositler tekrar süspansiyon (toplam hacmi istenen - hacimhücre topağı) hücre / ul istenen sayıda elde etmek için.
    13. Enjeksiyona kadar buz üzerinde hücreleri yerleştirin.
    14. Daha sonra şırınga üzerine künt bir 18 G iğne yerleştirmek bir tekrarlanması Antijen sebili içine 250 ul cam şırınga yerleştirin.
    15. Kortikal astrocyte süspansiyon iğne ile pistonu yavaşça geri çekin; hava kabarcıkları sıkıştırmak ve aslında beyin içine enjekte edilen hacim azalacak, çünkü çıkarılmalıdır hücreleri üzerinde bir hava kabarcığı olacaktır.
    16. Sadece kortikal astrosit süspansiyonun üstünden iğne ucu tutun ve hızlı bir şekilde pistonu itin. Hava kabarcığı hızlı hücre süspansiyonu daha hareket edecek ve çoğunlukla ihraç edilecektir.
    17. Tüm hava kabarcıkları olana kadar, tekrarlayın Adım 3.2.16 iğne kaldırılır.
    18. Yaklaşık ~ 200 ul şırınga doldurun, sonra iğne yukarı tutun ve duruncaya kadar geri pistonu çekin. Küçük hava kabarcıkları iğne ucu tuttuğunu ve hızlı bir şekilde yaklaşık 5 pistonu iterek çıkarılabilir0 ul sonra yavaş yavaş tam kapasite çekilmesi.
    19. Dik ucu tutun ve adımı 3.2.18 4-5x tekrarlayın.
    20. 18 iğne atın ve şırınga üzerine 27 G iğne sığacak.
    21. Sıvı iğne çıkana kadar antijen dağıtıcı üzerindeki düğmesine basın. NOT: 1 Astrosit hücre hattı için, 3.2.1-3.2.21 ~ 60 dakika sürer adımları.
  3. Enjeksiyon için MGK hazırlanması
    1. Neurospheres çapı> 100 mikron olduğunda, 15 ml tüplere aktarmak ve Neurospheres> 5 dakika boyunca yerçekimi tarafından razı olsun.
    2. Süpernatantı, örneğin kök hücre ayrışma çözeltisi ya da 42 tarif edildiği gibi, üreticinin talimatlarına göre veya% 0.05 tripsin-EDTA ile uygun Accutase gibi hafif bir ayrışma reaktif ile neurospheres, ayrışır.
    3. Serum MGK maruz kalmadan, üreticinin talimatlarına uygun olarak ayırma reaktifleri inhibe eder. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
    4. Hücre / ul sayısını belirlemek için bir hemasitometre ya da başka bir uygun hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın.
    5. Yeni bir 15 ml konik tüp MGK istenilen sayıda aktarın. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin.
    6. 37 ° C'de 800 ul HBSS içinde süspansiyon hücreleri. Hücre topağı hacmini (- 800 ul hücre süspansiyonu, toplam hacim) belirler. NOT: Bu enjeksiyon için doğru bir hücre konsantrasyonu elde etmek esastır. Bu durumda, hücre topağın hacminin aşamasında 3.3.9 eklemek% 5 metil selüloz hacmi hesaplamak için bu aşamada tespit edilmelidir.
    7. Steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne hücreleri transferi ve daha sonra 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj.
    8. Süpernatantı aspire ve 3.2.12-3.2.21 gibi ortotopik enjeksiyon için hücrelerin hazırlanması bitirmek. NOT: 1 MGK hücre hattı için, 3.3.1-3.3 adımları.9 ~ 60 dakika sürer.
  4. Enjeksiyon için Fare hazırlanması
    1. Kurumsal IACUC kurallarına göre 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribromoetanol) ya da 100 mg / kg ketamin artı 10 mg / kg ksilazin bir İP enjeksiyonu vasıtasıyla, alıcı hayvan anestezisi. NOT: Kullanılan burada allogreft olarak ana yaşı 3-6 ay farenin vardır. Farklı yaşlarda farenin ur gelişimi üzerindeki gelişimsel beyin yaşın microenvironmental etkisini araştırmak için kullanılabilir.
    2. Clippers ya da makasla kesi sitesi üzerinden kafa derisi tıraş.
    3. % 70 etanol ve betadin 3 alternatif çubukla cerrahi siteyi sterilize.
    4. Göz kırpma refleksi kaybı nedeniyle herhangi bir zarar görmesini önlemek için gözleri oftalmik merhem sürün.
    5. Pedalı geri çekme (ayak tutam) refleks ile anestezi derinliği değerlendirin. NOT: 5 fareler için, 3.4.1-3.4.5 ~ 15 dakika sürer adımları.
  5. Orthotopik İmplantasyon
    1. Stereotaksik çerçeveye hayvan edin.
    2. Makgözleri ve kulakları arasındaki yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda sagital sütür üzerinde bir kesi e.
    3. Koronal ve sagital sütür (Bregma) kesişimi yanı sıra lambdoid ve sagital sütür (Lambda) kesişimini bulun. Bregma ve Lambda aynı yatay düzlemde olduğundan emin olun.
    4. Şırınga hücre süspansiyonu içeren ve başının üzerinde stereotaksik çerçeve antijen dağıtıcı yinelenen takın. Bregma ile temas, 27 G iğne ucu getirin. Bu, üç boyutlu koordinatlar manipülasyonu için kullanılacak kökenlidir.
    5. Kafatası yüzeyinden hafifçe iğne kaldırın ve 2 mm lateral ve bregmadan 1 mm rostral taşıyın.
    6. Bregmadan, hedef 4 mm ventral kafatası dikkatle iğne indirin. NOT: bazal ganglionlar hedeflemek için bu stereotaktik koordinatları kullanılmıştır. Farklı Stereotaktik koordinatları farklı microenvironmental etkisini araştırmak için kullanılabilirur gelişimi üzerindeki etkileri beyin bölgelerinde.
    7. Yinelenen antijen Dispenseri bir kez aktive ederek hücre süspansiyonu 5 ul enjekte edilir. 2 dakika kafa içi basıncı dengelenmeye gelmeye bırakın için iğneyi yerinde bırakın.
    8. Yavaş yavaş 30 saniyelik bir süre boyunca iğnenin geri çekilmesi. Oluşabilecek herhangi bir kanama basınç uygulamak için bir pamuklu çubuk kullanın.
    9. Yara kenarları yaklaştığı ve doku yapıştırıcı kullanılarak kesi kapatın. Kesi yerinde Lidokain subkutan 20 ul uygulayın. NOT: 5 fareler için, 3.5.1-3.5.9 ~ 50 dakika sürer adımları. UNC IACUC sadece lokal anestezi postoperatif kullanımını onayladı. Yerel kurumsal IACUC ile istişare Bu işlemden sonra postoperatif analjezik kullanım şartlarına ilişkin tavsiye edilir.
  6. Post-Cerrahi Bakım
    1. Kurtarmak için temiz, sıcak bir kafeste hayvanları yerleştirin. Kazara oluşabilir aspirasyon gibi hayvanlar, doğrudan yatak içine yerleştirilmiştir olmamalıdır.
    2. GözlemleyinBu tımar, yeme ve dışkılama gibi normal davranışı sürdürme hayvanlar. NOT: Normal davranış Sürmesine ~ 60 dakika sürebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu, fenotipik olarak in vitro ve in vivo olarak karakterize edilebilir koşullu onkojenik alelleri (Şekil 1) floxed yenidoğan GEM barınağı hasat kortikal astrositler ve MGK bir nGEM model sistemi geliştirmiştir. Özellikle in vitro kortikal astrositler onkojenik mutasyonların sonuçlarını incelemek için, ilk olarak astrositleri zenginleştirmek için kritik öneme sahiptir. Kortikal astrosit hasat mikroglia, astrositler, oligodendrositler, OPC ve nöronların bir karışımını içeren, mekanik ve genetik yöntemler astrosit zenginleşmesine yardımcı olabilir. Nöronlar normal kültür koşulları altında kalıp ise, mikroglia ve oligodendrosit gece boyunca çalkalanarak 41,43 çıkarılabilir. Ayrıca, bir Ad5GFAPCre kullanarak GAFP + astrositlere hedefleyen floxed, onkojenik allel genetik rekombinasyon astrositlerde için zenginleştirebilirsiniz. Biz flo ile Rb1 loxp / loxp GEM yavrular kortikal hasat bulaştırmak için bu yöntem kullanılırxed Nf1 loxp / loxp ve / veya PTEN loxp / loxp alelleridir. Ad5GFAPCre enfeksiyon,% 59 5 sonra>% 90 saflık için ideal astrosit artan yeniden birleştirilen GFAP + astrositler, proliferatif bir avantaj neden - Kültürde 9 geçişleri (Şekil 2A ve 2B). Alternatif olarak, 121 TgGZT farelerde (Şekil 2C) hasat astrositlerde proliferatif avantaj indüklemek için GFAP promoterinin kontrolü altında tanımlanması suretiyle T 121 astrositlerin zenginleştirilmiş. Kortikal astrositler kültür çanağı (Şekil 2C) için yapışkan büyürken NSC nitro (Şekil 3A) olarak yapışkan olmayan neurospheres olarak büyür. TRP olarak adlandırılan TgGZT 121 (T), Kras G12D (R) ve homozigot PTEN delesyonu (- P - - /) yeniden birleştirilmiş olan WT MGK ve NSC ikisi de onkojenik allel floxed- / - - Sadece MGK TgGZT 121 içeren GEM hasat Cre-aracılı rekombinasyon (Şekil 3B) sonra T 121 ifade ederken, MGK işaretleyici Sox2 ifade eder.

G 1 / S (Rb), MAPK ve / veya PI3K yolu değişiklikler GFAP'nin büyümesini nasıl etkilediğini belirlemek için + Astrositler in vitro, proliferasyon iki yöntem kullanılarak incelenmiştir. MTS ve T hücre sayımı ve 121 Kras G12D ifade kortikal astrositler (Şekil 4A ve 4B) çoğalmasını arttığını göstermiştir. Benzer şekilde, homozigot RB1 (Rb) ve Nf1 (K), heterozigot PTEN (p +/-) delesyon aynı zamanda artan kortikal astrosit proliferasyon (Şekil 4C) ile birleştirildi silme. Dönüştürülmüş hücreler sınırsız çoğalma kapasitesine sahiptir. Mutasyonların dönüştürme etkisi col kullanılarak in vitro ölçülebilirony oluşum analizleri. Daha önce tarif edildiği gibi 44 koloni oluşturma deneyi ile kortikal astrositler - / - Bu nedenle TRP T 121 ve Kras G12D ifade ve homozigoz PTEN delesyonu dönüşürken etkilerini test ettik. WT Astrositler koloniler teşkil etmedi Oysa, T astrocytes 1.03 verimliliği% koloniler kurdu. Özellikle, TRP - / -% 6.40 astrositler (Tablo 1) en yüksek koloni oluşumu etkinliği vardı. Klinik öncesi bir ilaç testleri için uygun olması amacıyla, in vitro tümör modellerinde kolayca Genetik olarak manipüle edilmesi önemlidir. İlave genetik değişiklikler stabil olarak plazmid ya da viral vektörler tarafından kortikal astrositler içine sokulabilir. Bir VSV-psödotipli pMSCV retroviral vektör kullanılarak - / - astrositler (luc - / - TRP), bir örnek olarak, kararlı bir şekilde TRP içine lusiferaz geni transduse. Lusiferaz ekspresyonu, ebeveyn hücreleri ile karşılaştırıldığında ışık yayılması ~ 1000 kat arttı ( astrositler, in vitro olarak hedef inhibitörlerinin etkinliğini belirlemek için kullanılabilir. Düşük doz PG-103, ikili bir mTOR / PI3K inhibitörü ile tedavi hücre canlılığı 30 etkilemeden PI3K sinyallemesini inhibe ettiği daha önce gösterilmiştir. Ancak, daha yüksek PI-103 doz sitostatik / sitotoksik etki tespit edilmedi. In vitro astrocyte büyüme - / - Böylece biz PI-103 TRP azaltabilir olup olmadığını test ettik. - / - Astrosit büyüme (Şekil 4E) PI-103 TRP maksimal% 88 azalmaya neden oldu. Astrositler in vivo diğer klinik ilgili terapötiklerinin test etmek için (Schmid ve ark, el yazması teslim.) 45,46 - / - Biz daha önce TRP ortotopik alograftlarını kullanmıştır. Bu veriler, koşullu GEM hasat dönüştürülmüş kortikal astrositler Bağışıklık olarak güçlü mikrofon ön-klinik ilaç testi gerçekleştirmek için olan esnek bir model sistemi temin edebileceğini öne sürmektedirör.

Oluşturulmuş insan hücre çizgileri ve PDX Ksenograftlar bağışıklık yetersizliği olan ana gerektirir. PDX aksine, bir çok insan GBM kurulmuş hücre çizgileri GBM histopatolojik özellikleri özetlemek yoktur. Örneğin, U87MG orthotopik ksenogratflardır, normal beyin (Şekil 5A) istila etmedi sınırlı tümörler kurdu. Bunun aksine, TRP enjeksiyonu - / - Bağışıklık olarak güçlü, sinjeneik farelerden beyinlerine astrositler insan muadilleriyle normal beyinden (Şekil 5B), özellikle istilasının histolojik özelliklerini değinmeyecek invaziv tümörleri verdi. - / - Uzunlamasına TRP ölçmek için alograft büyüme fareler, 5 günde bir hücre enjeksiyonundan sonra kurban edildi ve tümör yükü H & E ile boyanmış beyin kesitleri üzerinde tümör alanı ölçülerek belirlenmiştir. Tümör alanı zaman (Şekil 5C) katlanarak arttı. 10 5 TRP ortotopik enjeksiyon - / - r içine astrositleriecipient beyinleri 22 gün (Şekil 5D) medyan sağkalım, nörolojik morbidite yol açtı. - / - NSC kortikal astrositleri ek olarak, TRP kullanılarak ortotopik enjeksiyonları uygulandı. TRP - / - NSC-türevli tümörler proliferatif pozitif T 121 idi, ve (Şekil 6) MGK işaretleyici Sox2 ifadesini sürdürdü. Koşullu GEM bu zaman dilimi boyunca tümörogenez ortaya çıkarmada başarısız ikinci not, unrecombined wt C57BL / 6 fareler gibi fenotipik WT kortikal astrosit veya NSC hasat kortikal astrositler ve MGK enjeksiyon, (veriler gösterilmemiştir) onkojenik aleller floxed. In vivo görüntüleme Boyuna ilaç tedavileri 40 tepki olarak tümör büyüme kinetiklerini izlemek için kullanılmıştır. Bu nedenle TRP - / - Luc astrositler seri biyolüminesans görüntüleme ile tespit edilmiştir, bağışıklık yetkin sinjeneik litermatı ve tümör büyümesinin beyinlerine enjekte edildi. Biyoparlaklık 16 gün zarfında 15 kat arttı(Şekil 7A ve 7B). Koşullu GEM hasat kortikal astrositler ve MGK genetiği değiştirilmiş ve fenotipik in vitro ve genetik ve astrositom patogenezinde hücre biyolojisi tanımı için in vivo özelliği ve potansiyel klinik öncesi ilaç geliştirme için kullanılabilir olduğunu ortaya koyduk.

Şekil 1
NGEM kortikal astrosit ve MGK hasat Şekil 1. Şematik. Fenotipik WT kortikal astrositler ve MGK koşullu onkojenik allelli GEM hasat edildi. Genetik rekombinasyon bir AdCre vektör ile in vitro olarak uyarıldı. Dönüştürülmüş hücreler fenotipik olarak, bağışıklık-kompetan beyinlerine çeşitli yöntemlerle ve ortotopik enjeksiyonu ile in vivo, in vitro olarak karakterize edilmiştirSingeneik litermatlarının.

Şekil 2
In vitro seri pasaj üzerine GAFP + astrositlerde Şekil 2. Zenginleştirme. RB1 loxP hasat GFAP + astrositler gösterilen Örnek imüno görsel / Nf1 loxp / loxP ve / veya PTEN, loxP / loxP ile loxp gem yavrular olan genetik rekombinasyon Ad5GFAPCre ile görülmüş ve X, kat (PX) pasajlama hücreler (A). Paneli A. Barlar GAFP + astrositlerde zenginleşme Kantitasyonu 3-24 çoğaltır (B) standart hata temsil eder. Temsilci immünfloresans (üst) ve faz kontrast (alt) geçişte de GAFP promoterinden T 121 ekspres TgGZT 121 GEM yavrular hasat yapışık kortikal astrositlerde görüntüleriYaş 9 Ad5CMVCre in vitro olarak (C), sonra yeniden bağlanma. Astrositler her geçiş DAPI ile boyanmış çekirdekleri (mavi) toplam sayısına bölünerek GFAP + (yeşil), hücrelerin sayısı olarak ölçüldü. Görüntüler 10X orijinal büyütme (A, C) alınmıştır. Ölçek çubukları 100 mikron (A, C) temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
- / - GEM Şekil 3. WT ve recombined MGK TRP hasat. - / -, Fenotipik olarak WT ile (üst) ve TRP temsili Faz kontrast görüntüleri (alt) NSC Neurospheres in vitro olarak (A) gibi büyütülür. T 121 (yeşil) ve Sox2 Temsilcisi immünoflüeresans boyama- / - (Alt) Neurospheres (B), WT ile (üst) ve TRP (kırmızı) ekspresyonu. Ölçek çubukları temsil 100 mikron (A, B). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4
In vitro kortikal astrositlerde 4. Karakterizasyonu Şekil. WT ve TR kortikal astrositler büyümesi 1-7 günlük (A) hücre sayımı yolu ile belirlendi. WT ve TR kortikal astrositler nispi optik yoğunluk (OD) MTS (B) ile belirlenmiştir. WT nispi büyüme ve yeniden bir araya RB1 - / -; Nf1 - / -, PTEN +/- (RbNP +/-) MTS (C) ile belirlenmiştir astrositlerden salınmaktadır. - / - Ve lucifer ebeveyn TRP arasında Lüminesansase ifade TRP - / - astrositler (TRP - / - luc), (D). - / - TRP göreli OD MTS (E) ile belirlenen, 5 gün boyunca PI103 ile muamele astrositlerden salınmaktadır. Çoğalma ve doz-yanıt 5. Barlar durum başına 6 çoğaltır standart hatasını temsil GraphPadPrizmasındaki üstel büyüme denklemi kullanılarak hesaplandı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Vivo gliom Şekil 5.. Bir U87MG xenograftlarının Temsilcisi H & E boyalı bölüm ayrık tümör kenar (A) gösterir. - / - Bir TRP Temsilcisi H & E boyalı bölüm allogreft normal beyindeki yaygın işgali (gösterirB). Sağ ve sol H & E görüntülerde Ölçek barlar sırasıyla, 1 mm ve 100 mikron temsil eder. - / - Tümör alanı 10 5 TRP enjekte-immün yetkili, singenik litermatlarından gelen formalin fikse parafin gömülü beyinleri H & E boyalı kesitler analiz ile belirlendi astrositlerde ve 5 günlük aralıklarla enjeksiyon sonrası kurban. (° C). - / - TRP Kaplan-Meier sağkalım analizi morbidite yaş arası allogreft farelerde 22 gün (D) ortalama sağkalım gösterir.

Şekil 6,
Şekil TRP +/- MGK allograftlann 6. İmmünofloresan. Temsilci immünfloresans görüntüleri T 121 (yeşil) ve Sox2 (beyaz) ifade TRP +/- NSC-immün yetkili, singenik littermates beyinlerine enjekte olduğunu göstermektedir edu (kırmızı) birleştirilmesi ile tanımlanan ve çoğalır. Fareler edu ile perfüze ve 6 haftaları paraformaldehid post-enjeksiyon ve beyinlerini kurban edildi. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7
TRP Şekil 7. Boyuna görüntüleme - / - luc allogreftler. Zaman (B) üzerinde lusiferaz akı Temsilcisi biyoışıldama görüntüleri (A) ve miktar TRP büyüme gösteriyor - / - belirtilen günlerde sonrası en luc kortikal astrositlerde ve görüntülü - / --immün yetkili, sinjenik farelerde allogreftler 10 5 TRP ile enjekte enjeksiyon.g "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Genotip Kaplama verimliliği (%) SEM
WT 0 0
T 1.03 0.15
TRP - / - 6.40 0.83

Kortikal astrositlerde Tablo 1. Koloni oluşumu. AWT T ve TRP - / - kortikal astrositler / oyuk, sırasıyla 4000, 2000 ve 250 hücreler üç kopya halinde plakalanmıştır. Koloniler, 14 gün sonra kaplama kristal viyole ile boyanmış görüntülü ve işbirliği edildiImageJ kullanarak unted. Kaplama verim kaplama hücrelerinin sayısı bölü kolonilerin sayısı olarak hesaplanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En kritik adımlar, 2), 3) iyice hücreleri ayırmak, meninks kaldırmak için korpus kallosum altında doku almadan korteksi çıkarılması için uygun hasat ve kortikal astrositlerde kültürünü 1) sağlamak ve 4) GFAP zenginleştirmek için + astrositlerden salınmaktadır. Biz GAFP + astrositlere zenginleştirmek için yöntemler (GFAP promotör kontrolü altında (bir baskın dönüşen transgen bir Ad5GFAPCre vektörü veya kullanımı ile TgGZT 121) genetik rekombinasyon kısıtlama) mekanik (titreme) ve genetik kullanılmasına rağmen, diğer teknikler kortikal arındırmak için kullanılmıştır astrositlerden salınmaktadır. Örneğin, kontamine mikroglia L-lösin metil ester 47 tarafından izlenen bir mitotik inhibitör ile kültürlerini muamele etmek suretiyle uzaklaştırılabilir. Serum ihtiva eden ortamda mekanik olarak arıtılmış ve kültüre astrositlerin morfolojisi ve ekspresyon profilleri eski hypothesi ile akut bir şekilde izole edilen astrositlerden farklıdırzed daha olgunlaşmamış Astrositik hücreleri veya reaktif bir Astrosit fenotip 48,49 ya da temsil etmek. Daha yakın zamanda, bir immunopanning yöntem ileriye kortikal kemirgen astrositler ve ekspresyon profilleri daha yakından taklit eden akut bir şekilde saflaştırılmış astrosit saflaştırmak için geliştirilmiştir kültürlendiğinde büyüme faktörü-desteklenmiş serumsuz ortam 49'da. Incelenen fenotipe yeni geliştirilmiş bir yöntem immunopanning karşı kortikal astrosit zenginleştirme ve kültür geleneksel mekanik yönteminin etkisi, bu tarifnamede tam olarak bilinmemektedir. Ne olursa olsun, kullanılan yöntemin, özellikle söz konusu bir hücre tipi içinde onkojenik mutasyonların fenotipik sonuçlarını belirlemek için GFAP + kortikal astrositler zenginleştirmek için gereklidir.

MGK hasat için kritik adımlar 1) doğru, svz bulmak için 2) Diseksiyon sırasında SVZ'unda hasarı en aza indirmek için, ve 3) kaplama önce ayrışmayı aşağıdaki hücrelerini filtre vardır. Precise MGK diseksiyon tekniği bulmak ve svz hasat için gereklidir. MGK süspansiyon kültürü içinde büyümek için, yüzen enkaz miktarını azaltmak için ayrıldıktan sonra hücre süspansiyonu filtre esastır. Biz NSC seçmek SCM büyüme kullanılmasına rağmen NSC ileriye SVZ'una doku homojenatının 50 floresan-aktive edilmiş hücre sıralama ile izole edilebilir. In vitro genetik rekombinasyon indüksiyonundan sonra, bu geçitlerin arasında hücresel kortikal astrosit özelliklerini ve NSC kültürleri izlenmesi önemlidir. Prospektif doku hasat sırasında astrositlerde veya MGK zenginleştirmek yoktu çünkü, biz seri (astrositlerde için GFAP, MGK için Sox2) immünofluoresans bilinen hücre tipi özel işaretleri ile boyama ile ilgi hücre tipi zenginleştirme ve sayısal saflık izlenir. Ayrıca, sistematik öncesi ve kre-aracılık sonra her pasajda hem de onkojenik mutasyonlar beklenen sinyal etkilerini izleme tavsiyeİmünolekelemeden ve fenotipik saflık maksimize ve mutasyon kaynaklı sinyal değişiklikleri stabilize edildiği erken geçit hücreleri karakterize ederek d rekombinasyon.

Primer hücre kültürleri kullanılarak edilmesinde önemli bir husus, kendilerine has replikatif kapasitesi ve bağlı mutasyonların fenotipik etkisidir. Fenotipik WT kemirgen astrocytes Replikatif kapasitesi sınırlı olan ve sadece 3 geçişli - onlar replikatif yaşlılıkla 31 tabi önce kültüründe 4 kez. Ayrıca, birçok kanser in vitro 51 onkogen kaynaklı senesensi nedeni, özellikle MAPK yolu genlerindeki mutasyon ilişkili. Mutasyonlar hücrelerini ölümsüzleştirmek ve onkogen yaşlanmasının neden olduğu karşı korumak için başarısız Böylece, eğer, bu seri olarak in vitro fenotipik nitelendirilmesi için geçişli değildir. Örneğin, HPV E6 / E7 ve SV40 büyük T antijeni gibi viral oncoproteins çok değişik insan ve mu ölümsüzleştirme kullanılmıştır13,26,30 astrositler içeren kültürde hücre tipleri Rine. T astrositlerin kortikal ölümsüzleştirmek için yeterli, ama in vivo olarak ölümcül astrositomlardır neden olmak için yeterli değildir ile Daha önce G1 / S hücre siklüs kontrol noktasının ablasyonunun göstermiştir. Bunun aksine, MAPK ve PI3K TRP sinyalleşme aktivasyonu - / - astrositler ortotopik allogreft model sistemde 30 GBM oluşumuna yol açtı. Bu nedenle, in vitro olarak sıçangil astrosit dönüşüm T, R ve p mutasyonların etkisi ortotopik allogreft in vivo tümör oluşumu ile ilişkili koloni oluşumu deney tanımlandığı gibidir.

Tümör hücreleri, ikiz fare beyinleri dönüştü, nGEM hücrelerin ortotopik enjeksiyon implantasyonu gerektiren tüm modeller bir akut yara tepkisi olacak gibi, reaktif gliozis olarak nitelendirdi. Bu tepki sırasında, astrositlerde, olgodendrosit atası (NG2 +) glia ve mikroglialar, çoğaldığı içeren sinir hücreleri,yedi ve bu Sonic dikenli 52,53 büyük oranda salgılanmış proteinlere karşılık, daha ilkel bir farklılaşma durumunu kazanır. Bununla birlikte, bıçak yaralanma karşısında reaktif gliozdan çoğalma fazı, tipik olarak bir hafta 53 görece kısadır. - / - Daha önce TRP enjeksiyonunun göstermiştir astrositler verimli bir şekilde sık sık GBM gibi yüksek kaliteli astrositom, ilerleme düşük dereceli astrositomlardır sonuçta, bu zaman dilimi boyunca tümörogenez neden olur. Buna karşılık, T veya TP enjeksiyon - / - astrocytes seyrek 1-3 enjeksiyon sonrası haftalarda ve bu tümörlerin düşük dereceli astrositomlarla haline yüksek dereceli astrositomlarla 30 ilerleme başarısız. Ayrıca, tek başına fenotipik olarak vahşi tip kortikal astrositler ve MGK enjeksiyonu (veriler gösterilmemiştir) tümörogenez açığa çıkarmada başarılı değildir. - / - Allogreft büyüme katlanarak 2-3 hafta sonrası enjeksiyon, çoğalma fazı tepki sırasında bir zaman çerçevesi artar Biz TRP bulunduive gliozis sona eren (Şekil 5 ve 7). Singeneik fare beyinleri dönüştürüldü, nGEM hücrelerin enjeksiyonu üzerine ur gelişimi üzerindeki olası mikro-çevresel etkileri hesaba katılması için, özellikle de reaktif gliozdan çoğalma fazı sırasında, fenotipik WT kortikal astrosit veya MGK unrecombined yeni kombinasyonlarım, araştıran kontrol enjeksiyonları tavsiye, onkojenik floxed allelleri. Daha önce 30 tarif var gibi biz de, ilk bir ay sonrası enjeksiyon sırasında haftalık aralıklarla hem fenotipik WT ve transforme (recombined) hücrelerin Tümörgenez verimliliği izlemek öneririz.

Enjekte edilen hücreler ya da allogreft Ana bilgisayarın ya da genetik manipülasyon sayesinde, nGEM astrositom model sistem tümör stromanın etkileşimler dahil olmak üzere astrositom patojenez pek çok açıdan, modellemek için de kullanılabilir. - / - Bir örnek olarak, TRP tasarlanmıştır kortikal astrocyTES, in vivo (Şekil 7), tümör büyüme kinetiklerini belirlemek için lusiferazı ifade etmek. Seçenek olarak ise, hücreler genetik nGEM bir flüoresan proteini ifade etmek üzere modifiye edilebilir ve ortotopikal tümör hücrelerinde hem de normal beyin hücreleri 54 arasındaki etkileşimleri tanımlamak için, floresanla işaretlenmiş nöronlar ya da damar sistemi ile GEM beyinlerine enjekte edildi. Gliom beyin bölgesinde veya gelişimsel yaş mikro-çevresel etkisi ortotopikal farklı yerlerde ya da farklı yaşlı farelerde nGEM hücreleri enjekte edilmesi ile tespit edilebilir. Kısa tümör latans ve sağkalım klinik öncesi uyuşturucu testi için yararlı olmakla birlikte, hızlı tümör gelişimi malign ilerlemesi, işgal ve tümör-stoma etkileşimler de dahil olmak üzere astrositomdur patogenezi bazı yönlerini modellemek için ideal olmayabilir. NGEM allogreft ana Survival kolayca enjekte edilen hücrelerin sayısını değiştirerek ve sistematik tümör penetrasyonun ve gecikme 3 izleyerek manipüle edilebilir0.

İnsan astrositomlar genomik karmaşık ve kapsamlı içi ve inter-tümör heterojenliğini 5-7,55,56 sergilerler. Bu heterojenite potansiyel kaynakları tümörogenez başlatmak somatik mutasyonları, malign ilerleme evrim sürecinde edinilen mutasyonlar ve bu mutasyonların ortaya çıktığı hücrelerin gelişim potansiyeli bulunmaktadır. Büyük ölçekli dizileme projeleri birçok astrositomdur ilişkili mutasyonları ve ko-oluşumu 7 onların kalıplarını tespit ettik. Bu çalışmalar, yani sık sık meydana gelen mutasyonları tespit etmek ve olası onkojenik mutasyonları aday biyoinformatik algoritmaları dayandırılmıştır. Tümörogenez başlatmak veya malign ilerlemesini sürücü "sürücü mutasyonlar". Bununla birlikte, bu mutasyonlarının çoğu, ve potansiyel hücre tipi özgüllük onkojenik potansiyeli, sistematik bir model sistemlerinde araştırılmamıştır. Biz önermesi nGEM modelleri ukortikal astrositler ve NSC burada tarif edildiği gibi, hem de arıtıldı ve kültürde büyütülebilen edilebilecek diğer nöronal hücre tipleri tilizing, bu inceleme yapmak için çok yönlü bir sistem sağlar. Büyük ölçekli dizileme projeleri ile tanımlanan yeni aday mutasyonlar dönüşümü için yeterliliği ve gerekliliği daha sonra sistematik konvansiyonel genetik gain- ve fonksiyon-kaybı özgü nGEM hücre tipleri çekirdek GBM yollarında sık birlikte görülen mutasyonları barındıran yaklaşımları kullanılarak incelenmiştir edilebileceği için koşullu GEM 5 var. Daha ileri nGEM paneller insan astrositomas genomik heterojenliğini modellenmesinde yararlı olacaktır birden fazla nöral hücre tiplerinde çeşitli kombinasyonları mutasyon taşıyan öneriyoruz. Ayrıca, koşullu GEM türetilen kortikal astrositlerde ve MGK nGEM astrositomdur modeller preklinik ilaç geliştirme için izlenebilir model sağlayabilir, çünkü hem mono ve kombinasyon tedavilerinin ilk in vitro testi yapabilirsinizBağışıklık olarak güçlü, sinjeneik farelerde in vivo ilaç test daha verimli doğrudan bu hücrelerde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, bağışıklık modüle ve stroma hedefli tedaviler bağışıklık yetkili, singenik allogreft bilgisayarlar ile nGEM astrositomdur modellerde test edilebilir. Bu nedenle, dönüştürülmüş kortikal astrositler ve MGK nGEM astrositom modeller, özel hücre tipleri onkogenik mutasyon kombinasyonları fonksiyonel sonuçlarını belirlemek için değerli bir model sistem ve klinik öncesi bir ilaç test yararlı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum, Regular Cellgro 35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-395
Cartilage Thumb Forceps, Curved Fisher Scientific 1631
Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 Miltex 17-301
Ethanol (200 proof) Decon Labs 2710
Razor Blades VWR 55411-050
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid Invitrogen 14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol Red Invitrogen 12605-010 Other trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture
Culture Dish, 60 x 15 mm Thomas Scientific 9380H77
15 ml Tubes BD Biosciences 352096
50 ml Tubes BD Biosciences 352070
Adenovirus stock Gene Transfer Vector Core, U. Iowa Ad5CMVCre Store in 5 µl aliquots at -80 °C. Hazardous. Use Bsl2 safety precautions
Sodium sulfate (Na2SO4)  Sigma-Aldrich 238597
Potassium sulfate (K2SO4) Sigma-Aldrich 221325
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich 746495
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
D-(+)- Glucose Sigma-Aldrich G8270 
Phenol Red Sigma-Aldrich P3532
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881
Papain Worthington LS003127
L-Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C1276
Syringe filter (0.22 µm pore size) Millipore SLGP033NS
Neurocult proliferation kit, mouse Stemcell Technologies 5702 This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture
0.2% Heparin solution Stemcell Technologies 7980
EGF  Invitrogen PMG8041
bFGF  Invitrogen PHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x) Invitrogen 14185-052
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761
E-64 Sigma-Aldrich E3132 Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C
6-well Plates Fisher Scientific 07-200-83
Cell strainer (40 µm pore size) Corning 352340
Stem cell dissociation solution Stemcell Technologies 5707 Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase
Methyl cellulose 15 cP Sigma-Aldrich M7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2x Millipore SLM-202-B For making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning 3620
Hamilton syringe, 250 µl LT no needle Fisher Scientific 14-815-92
PB600-1 Antigen Dispenser Hamilton  83700
Disposable 18 G needles Fisher Scientific NC9015638
27 ga 1/2" luer tip needle Fisher Scientific 14-826-48
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Betadine Fisher Scientific NC9386574
Puralube Opthalmic Ointment Fisher Scientific NC9689910
Model 900 Stereotaxic frame Kopf Instruments
VETBOND Fisher Scientific NC9259532  Tissue adhesive 
Lidocaine  ShopMedVet RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3580
Anti-Sox2 Millipore AB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako Z0334 
IVIS Kinetic PerkinElmer For in vivo imaging
D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate PerkinElmer 122796 For in vivo bioluminescence imaging
EdU Imaging Kit Invitrogen C10340
MSCV Luciferase PGK-hygro Addgene 18782

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

Tags

Nörobilim Sayı 90 astrositom kortikal astrositler genetiği farenin glioblastoma nöral kök hücreler orthotopik allogreft
Modelleme Astrositom Patogenez<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, … More

McNeill, R. S., Schmid, R. S., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K., Werneke, A. M., Constance, B. H., Huff, B., Miller, C. R. Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice. J. Vis. Exp. (90), e51763, doi:10.3791/51763 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter