Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Published: August 23, 2014 doi: 10.3791/51764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Drug Discovery Biology, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

Summary

خطوط الخلايا مراسل توفر وسيلة لتصور، وتتبع وعزل الخلايا من الاهتمام من السكان غير متجانسة. ومع ذلك، باستخدام إعادة التركيب مثلي التقليدية في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية استهداف الجين غير فعال للغاية. هنا، نحن تصف استهداف CNS محدد المخ الأوسط عامل النسخ PITX3 موضع مع EGFP باستخدام إصبع الزنك نوكلياز تعزيز إعادة التركيب مثلي.

Abstract

واحد القيود الرئيسية مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC) بروتوكولات التمايز الحالية هو الجيل من السكان الخلية غير المتجانسة. هذه الثقافات تحتوي على خلايا الفائدة، ولكن الملوثة أيضا مع المجالس الاقتصادية والاجتماعية غير متمايزة، والمشتقات غير العصبية والخلايا العصبية فرعية أخرى. هذا يحد من استخدامها في في المختبر وفي الجسم الحي التطبيقات، مثل النمذجة في المختبر لاكتشاف الأدوية أو العلاج ببدائل الخلية. للمساعدة في التغلب على هذا، خطوط الخلايا مراسل، والتي تقدم وسيلة لتصور وتتبع وعزل الخلايا من الفائدة، يمكن هندستها. ومع ذلك، من أجل تحقيق هذا في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عبر إعادة التركيب مثلي التقليدية غير فعالة للغاية. هذا البروتوكول يصف استهداف homeobox النخامية 3 (PITX3) موضع في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية باستخدام مصمم خصيصا nucleases إصبع الزنك، الذي يعرض فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا في مواقع محددة، جنبا إلى جنب معPITX3 - EGFP -specific ناقلات المانحة DNA. بعد جيل من خط الخلية مراسل PITX3، فإنه يمكن عندئذ أن تكون متباينة باستخدام بروتوكولات نشرت للاستخدام في الدراسات مثل النمذجة المرض في المختبر أو استبدال خلية العلاج باركنسون.

Introduction

الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) بروتوكولات التمايز الحالية تؤدي إلى السكان الخلية غير متجانسة، ولا سيما فيما يتعلق اشتقاق الظواهر العصبية محددة. وهكذا، على الرغم من الثقافات تحتوي على النمط الظاهري الخلوية المطلوب، العصبية الأخرى، وأنواع الخلايا غير العصبية وغير متمايزة، غالبا ما تكون موجودة 1. هذه الخصائص تحد من تطبيق ESC مصادر اشتقاق الخلايا لاستخدامها في العلاج ببدائل الخلية والنمذجة المرض في المختبر.

خطوط الخلايا مراسل الوراثية توفر وسيلة لتصور، وتتبع وعزل الخلايا من الفائدة، شريطة أن يكون التعبير عن بروتين مراسل (RP) يستنسخ التعبير الذاتية. استخدام المروجين المنبع مباشرة من منطقة الجين الترميز يمكن استخدامها لاستخلاص صحفيين الجيني الخام ولكن مثل هذه البنى التنظيمية تفتقر إلى العناصر الدقيقة التي تتحكم في التعبير الجيني الذاتية. في المقابل، إعادة التركيب مثلي يقدمفرصة لضمان عالية الدقة تعبير عن RP. في الماضي، واستهداف ناقلات مصممة لإعادة التركيب مثلي في مواضع محددة من الفائدة التي استخدمت لاستهداف RPS في الماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية (mESCs) باستخدام Electroporation للكوسيلة لتسليم DNA 1،2. ومع ذلك الجيل من خطوط الخلايا مراسل عبر إعادة التركيب مثلي التقليدية غير فعالة للغاية بالنسبة المجالس الاقتصادية والاجتماعية البشرية (hESCs)، وبالتالي قد تم توثيقه فقط في عدد قليل من الحالات (التي تم استعراضها في 3). باستخدام بروتين خيالية المهندسة تحتوي على الانصهار من فوك أنا نوكلياز بزخارف الزنك الاصبع في مواقع محددة، والمعروفة ب الزنك إصبع nucleases (ZFNs)، DNA فواصل المزدوج حبلا يمكن إدخالها في مواضع محدد مسبقا الجيني. عند إضافة ناقلات DNA مع التماثل لكلا الجانبين من الحمض النووي حبلا كسر مزدوج، يمكن اصلاحها الموقع الجيني عن طريق إعادة التركيب مثلي، والسماح للإدراج تسلسل الحمض النووي المانحة. وقد أثبتت هذه التقنية و مفيدةأو تحرير الجيني في كل من الخلايا الأولية الإنسان وhESCs 4،5 6،7. أكثر الأعمال الأخيرة وقد استخدمت النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs)، عوامل النسخ التي تستخدمها مسببات الأمراض النباتية 8، للمساعدة في تصميم nucleases موقع معين 9.

في البروتوكول التالية نظهر الجيل خط خلية مراسل HESC بواسطة Electroporation للمن EGFP تحتوي على استهداف ناقلات مثلي 6 مع ZFNs لhomeobox النخامية البشري 3 (PITX3) موضع. بعد اختيار المضادات الحيوية لمدة 2-3 أسابيع، hESCs مع الحمض النووي متكاملة بشكل صحيح يمكن التقاطها يدويا، وتوسعت في البداية عن طريق فحص PCR، والتحقق من صحتها فيما بعد النشاف الجنوبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تتم جميع الإجراءات في معقم غطاء تدفق الصفحي. ومعايرتها جميع وسائل الإعلام والحلول إلى 37 درجة مئوية ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. توسيع الأمنية الخاصة البشرية (hESCs وhiPSCs، WA-09 المستخدمة في هذا البروتوكول) لترنسفكأيشن

ملاحظة: ليس من الضروري توسيع hESCs على Matrigel أو Geltrex. hESCs موسعة على الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) يمكن استخدامها ل electroporation أو nucleofection التالية خطوة إزالة MEF (انظر القسم 2.8).

  1. إعداد 1 × 100 مم طبق و1 × 75cm2 قارورة من DR4 ​​MEFs في 2.0 × 10 4 خلايا لكل سم 2 في وسائل الإعلام MEF (انظر الجدول 1) على الأطباق المغلفة مسبقا مع 0.1٪ ث / ت الجيلاتين.
    ملاحظة: CF1، BLK6 أو MF1 MEFs يمكن استخدامها، ومع ذلك، فمن المستحسن أن يتم استخدام خطوط MEF المقاومة للمضادات الحيوية، على سبيل المثال، DR410.
  2. في اليوم التالي، hESCs مرور على طبق 100 ملم قبل مطلي مع MEFs أعدت في القسم 1.1. للقيام بذلك ASPIمعدل HESC سائل الإعلام من ثقافات الأطباق، وغسل hESCs مع CA2 + / MG2 + خالية هانكس "محلول ملحي متوازن (HBSS)، إضافة Dispase (انظر الجدول 2 للكميات المناسبة) ووضعت في حاضنة ترطيب عند 37 ° C / 5٪ CO 2. بعد 3-5 دقائق الحضانة، ونضح Dispase وغسل بلطف 1-2 مرات مع HBSS لإزالة MEFs. إضافة وسائط HESC (انظر الجدول 3) واستخدام مكشطة خلية، أو 5 مل ماصة، كشط بلطف المستعمرات قبالة سطح الطبق الثقافة.
  3. جمع شظايا مستعمرة في تعليق من الطبق الثقافة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. صحن الثقافة شطف مع وسائل الاعلام HESC ونقل إلى أنبوب 15 مل. نكون حذرين في عدم تفتيت كتل داخل خلايا مفردة أو شظايا صغيرة.
  4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 160 x ج لتكوير شظايا مستعمرة.
  5. نضح طاف. الاستفادة أسفل أنبوب 15 مل مع إصبع لتخفيف مستعمرة جزء بيليه. شظايا مستعمرة في resuspend بلطف في وسائل الاعلام HESC وفقا لنسبة تقسيم (بشكل طبيعييا تقسيم النسبة بين 1: 4 و 1: 8 غير مناسب). نكون حذرين للغاية ليس لجعل كتل داخل خلايا مفردة أو شظايا صغيرة لأن هذا سوف يؤثر replating الكفاءة.
  6. قبل replating شظايا HESC على MEFs غسل 1X مع HBSS. إضافة ببطء مبلغ مناسب (انظر الجدول 2) من تعليق خلية تحتوي على شظايا في وسائل الإعلام HESC HESC إلى الأطباق قبل مطلي مع MEFs.
  7. وضع الأطباق الثقافة على الرف في الحاضنة والتحرك ببطء ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي شظايا مستعمرة.
  8. استبدال وسائل الإعلام HESC يوميا.
  9. لإعداد وسائل الاعلام مكيفة من MEFs (MEF-CM) غسل 75 سم 2 قارورة قبل مطلي مع MEFs 1 × مع HBSS. إضافة وسائط HESC. بعد 24 ساعة، وجمع مكيفة وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الاعلام HESC الطازجة. يكرر يوميا لمدة أقصاها 12 يوما. تخزين MEF-CM في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.

2. إعداد المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان لترنسفكأيشن

  1. مراقبة نمو hESCsتحت المجهر يوميا. عندما تصبح المستعمرات 40-50٪ متموجة، لوحة 3 × 100 ملم الأطباق مع 2.0 × 10 5 MEFs لكل سم 2.
  2. عندما تصبح المستعمرات 60-70٪ متموجة انهم مستعدون ليتم transfected. "العريس" عن طريق إزالة المستعمرات مستعمرات متباينة أو النوى مستعمرة.
    ملاحظة: كما نعتقد أعلى ترنسفكأيشن الكفاءة وتحدث عندما تستهدف الخلايا في مرحلة النمو السجل، يقترح أن تجرى قبل أن تصل Electroporation للhESCs ≥ 70٪ confluency.
  3. غسل المستعمرات HESC مع HBSS وإضافة Accutase.
    ملاحظة: ليس من الضروري hESCs إلى ما قبل معاملتهم مع ROCK المانع Y-27632 سوف يحدث تثبيط كافية كما هو الحال عندما حضنت مع Y-27632 خلال خطوة 2.7
  4. احتضان لمدة 10 - 20 دقيقة في 37 ° C / 5٪ CO 2 حتى يتم تقديم مستعمرات الخلايا واحد كما يرى تحت المجهر. الخلايا يسحن مع ماصة 1 مل.
  5. إضافة وسائط HESC ومرشح في أنبوب 15 مل مخروطي باستخدام straine 40 ميكرون خليةص لإزالة كتل الخلية.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 160 x ج لمدة 5 دقائق. بيليه الخلية resuspend في وسائل الاعلام HESC جديدة وتكرار لإزالة أي حل Accutase المتبقية.
  7. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام HESC تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 ونقل تعليق خلية الإجمالي إلى صحن 100 ملم مسبقا المغلفة مع الجيلاتين.
  8. احتضان عند 37 ° C / 5٪ CO 2 لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
  9. خلال هذا الوقت MEFs ستلتزم طبق الجيلاتين المغلفة. جمع hESCs غير ملتصقة باستخدام ماصة 1 مل إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة وتحديد كثافة الخلية باستخدام عدادة الكريات.

3. Electroporation للمن hESCs

  1. مرشح وسائل الإعلام MEF-CM باستخدام 0.22 ميكرون تصفية وإضافة 10 نانوغرام / مل المؤتلف عامل نمو الخلايا الليفية الإنسان 2 (rhFGF2).
  2. نقل 7.5 × 106 hESCs من القسم 2.9 إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد والطرد المركزي في 160 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. خلال هذا الوقت إعداد electroporator: حدد برنامج ايلى الأسيctroporation وتعيين المعلمات التالية، الجهد: 250 V، السعة: 500 μF، والمقاومة: ∞-.
  4. نضح طاف وإعادة تعليق بيليه خلية في 0.8 مل من الجليد الباردة 0.22 ميكرومتر HBSS تصفيتها. نقل الحل إلى معقمة 0.4 سم كفيت electroporation.
  5. إضافة TV-hPITX3 إلى الأمام استهداف بناء (30 ميكروغرام DNA) وتخلط بلطف مع ماصة 200 ميكرولتر. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. خلال هذا الوقت إزالة قسامة واحدة من PITX3 ZFN مرنا وتذويب على الجليد. عندما ديفروستيد نقل 7.5 ميكرولتر من ZFN مرنا إلى الحمض النووي / خليط خلية في كفيت electroporation. المزيج بلطف مع ماصة 200 ميكرولتر.
    ملاحظة: موضع استهدافهم هو العامل الرئيسي الذي يساهم في استهداف الكفاءة. ترميز مواضع الجينات الصامتة، لا جينات المعبر عنها في المجالس الاقتصادية والاجتماعية، مثل PITX3 يصعب الهدف باستخدام إعادة التركيب مثلي التقليدية 6. وهكذا، وهذا البروتوكول يستخدم مخصصة ZFNs مصممة للموضع PITX3 البشري للحث على الحمض النووي المزدوج حبلا بREAK.
  6. Electroporate باتباع التعليمات التي تظهر على الشاشة على electroporator.
  7. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر من نقل محتويات كفيت Electroporation لللأنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل سائل الاعلام HESC. غسل كفيت مرتين مع 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام HESC كل مرة ونقل إلى أنبوب 15 مل. سيكون هناك "تشبه المخاط" الحطام تتكون من DNA والبروتين من الخلايا هي lysed والتي سوف تؤثر سلبا على بقاء الخلية. أجهزة الطرد المركزي في 160 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة هذا الحطام.
  8. نضح طاف والاستفادة بلطف بيليه الخلية لتخفيف. إعادة تعليق في 30 مل تستكمل MEF-CM تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 وreplate على 3 × 100 ملم أطباق preplated مع MEFs.
  9. تغيير وسائل الإعلام يوميا. في يوم 2، Y-27632 يمكن سحب والخلايا نمت في وسائل الاعلام HESC فقط.
  10. بعد 2-3 أيام من hESCs يجب أن يكون 50-70٪ متموجة. عند هذه النقطة تبدأ اختيار المضادات الحيوية (مثل 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين).
  11. الحفاظ SELection بإضافة جديدة وسائل الاعلام HESC / بوروميسين يوميا. بعد ~ 7 أيام مستعمرات صغيرة يجب أن يكون مرئيا. إذا لم يتم استخدام المضادات الحيوية مقاومة MEFs، MEFs يمكن استكمال بإضافة 1.0 × 10 4 خلايا إضافية لكل سم 2.

4. اختيار النسخ المعدلة وراثيا HESC

  1. حوالي 14 - 21 يوما بعد اختيار (عندما وصلت مستعمرات ~ 1 مم) إعداد لوحات للتوسع والفرز. تبدأ من خلال إزالة الجليد قسامة من Matrigel أو Geltrex في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 5 ساعة. تمييع وفقا لتعليمات الصانعين وإضافة 75 ميكرولتر إلى كل بئر من لوحات 3 × 96 جيدا. إعداد لوحات 3 × 48 جيدا من قبل تصفيح MEFs في 2.0 × 10 4 خلايا لكل سم 2. احتضان كل من لوحات O / N في 37 ° C / 5٪ CO 2.
  2. في اليوم التالي تشريح المستعمرات في 16-25 قطع باستخدام إبرة 21 G على نهاية ماصة 2 مل بقطع الشبكة.
  3. نضح Matrigel من 96 لوحات جيدا واستبدال supplemوسائل الإعلام ented CM-MEF. غسل MEFs في لوحات 48 جيدا 1 × مع HBSS وإضافة وسائل الاعلام HESC.
  4. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر نقل بلطف 1/3 للمستعمرة تشريح في لوحة 48 جيدا للتوسع. نقل 2/3 البعض من مستعمرة تشريح في المقابلة 96 لوحة جيدا تحتوي تستكمل وسائل الاعلام CM-MEF.
  5. الحفاظ على حد سواء عن طريق تغيير لوحات وسائل الإعلام يوميا (تستكمل وسائل الاعلام CM-MEF لوحات matrigel 96 المغلفة جيدا وسائل الاعلام HESC لوحات 48 كذلك يحتوي MEFs، وكلاهما تستكمل مع 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين).
  6. توسيع حتى 96 لوحات جيدا هي 100٪ متموجة ثم شاشة البداية عن طريق PCR.

5. الفحص والتوسع في النسخ إيجابي

  1. لإعداد الحمض النووي الجيني (الطريقة على أساس 11) إزالة جميع وسائل الإعلام من لوحات من قلب، ثم صمة عار على مناشف ورقية.
  2. شطف جيدا مع كل مرتين RT برنامج تلفزيوني (100 ميكرولتر / جيد كل غسل)، قلب وصمة عار بالنسبة للخطوة 5.1. مكان وحات في -80 درجة مئوية وأو 1 - 2 ساعة لتساعد في تحلل الخلايا (لوحات يمكن تخزينها لأجل غير مسمى مثل هذا).
  3. في حين أن الخلايا هي في -80 درجة مئوية جعل Sarcosyl الاحتياطي تحلل (انظر الجدول 4) (50 ميكرولتر / جيد). لليز الخلايا، لوحات دافئة لمدة 5 دقائق على RT ثم عازلة ماصة تحلل في كل بئر. ختم حواف كل لوحة مع الشريط، ومكان في وعاء قابل للغلق تحتوي على مناشف ورقية رطبة لخلق الرطوبة، واحتضان O / N عند 60 درجة مئوية.
  4. بعد الاحتضان إضافة 150 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 5M إلى 10 مل من -20 درجة مئوية الإيثانول المطلق، وتخلط جيدا، وإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر (ملاحظة: سوف تذهب الإيثانول غائم عند إضافة كلوريد الصوديوم). لوحات الصنبور بلطف إلى مزيج (لا ماصة) ويترك لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في RT. خلال هذا الوقت الحل لن يذهب اضح وسوف يعجل الحمض النووي.
  5. إزالة الحل كما في الخطوة 5.1 ثم إضافة 150 ميكرولتر من الايثانول 70٪ إلى كل بئر. عكس لوحة بلطف وصمة عار كما كان من قبل. كرر هذه الخطوة لمزيد من 2X.
    ملاحظة: نظرا لأن الحمض النووي عجلت adhe طبيعيالدقة إلى البلاستيك زراعة الأنسجة فإنه لا يصبح تخلع خلال هذه الخطوات الغسيل.)
  6. بعد غسل النهائي لوحات أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في سرعة قصوى للتركيز الحمض النووي إلى الجزء السفلي من كل جانب ثم الهواء الجاف في RT (أو 37 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  7. إضافة 40 - 50 ميكرولتر T0.1E (pH8.0) (انظر الجدول 5) أو TE (pH8.0) إلى كل بئر ومكان لوحات عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجة CO / N قبل استخدام لPCR. و resuspend الحمض النووي عن طريق التنصت بلطف على جانبي اللوحة. استخدام 1-2 ميكرولتر من إعادة علقت DNA / 10 ميكرولتر PCR رد فعل.
  8. باستخدام قالب طويل توسيع نظام PCR مع hPITX3 L ذراع جنرال. F وhPITX3 L الاشعال الذراع GFP R أداء الفحص الأولي من الحيوانات المستنسخة في 58 ° C الصلب، تمديد 45 ثانية، 35 دورات.
  9. عينات Electrophorese مع 1KB Hyperladder في agarose هلام 1٪ GelRed تحتوي على 100 فولت لمدة 45 دقيقة واكتشاف الحيوانات المستنسخة إيجابية عبر الإضاءة فوق البنفسجية.
  10. صحة الحيوانات المستنسخة PCR إيجابية من قبل هضم الحمض النووي الجيني من تنمية الصادراتاستنساخ nded (انظر أدناه) مع HindIII والتهجين تحقيقات 5 'و 3' من الأسلحة ناقلات التماثل إلى وصمة عار الجنوبية (كما هو موضح سابقا في 1). يتم إنشاء تحقيقات بواسطة PCR باستخدام أزواج التمهيدي hPITX3 5 "التحقيق وF R، وhPITX3 3" F التحقيق والبحث، ويتفاعل مع EcoRI و ligated إلى استنساخ ناقلات العام.
  11. اعتمادا على عدد من الحيوانات المستنسخة إيجابية، وإعداد 2 آبار لوحة 6 جيدا من قبل الطلاء مع MEFs (2.0 × 10 4 خلايا لكل سم 2).
  12. في اليوم التالي يمهد للمعالجة الحيوانات المستنسخة إيجابية في 48 لوحة جيدا مع 10 ميكرومتر Y-27632 مدة لا تقل عن 1 ساعة.
  13. غسل الحيوانات المستنسخة إيجابية مع HBSS وإضافة 300 ميكرولتر من Accutase.
  14. عندما يتم تقديم مستعمرات الخلايا واحدة، إضافة 1 مل من وسائل الاعلام HESC وجمع في أنبوب 15 مل.
  15. تغيير وسائل الإعلام يوميا. في يوم 2، Y-27632 يمكن سحب والخلايا نمت في وسائل الاعلام HESC.
  16. عندما المستعمرات هي 70-80٪ متموجة، ثقافة فرعية وتجميد ما تبقى من كولوشظايا نيويورك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

شارك التالية Electroporation للللمصممة خصيصا PITX3 زوج الزنك الاصبع مع ​​PITX3 - EGFP DNA -specific ناقلات المانحة، واختيار بوروميسين اللاحقة، تم الكشف عن استنساخ HESC إيجابية في البداية عبر الجيني فحص PCR (الشكل 1). التهجين لطخة الجنوبي من هذه الحيوانات المستنسخة PCR إيجابية مع 5 'و 3' تحقيقات محددة وأكد استهداف الصحيح لاكسون 1 من موضع PITX3 (الشكل 2)، مع كفاءة 19٪. الصور مناعي هو مبين في الشكل 3 تظهر التعبير EGFP مدفوعا المروج PITX3 التالية التمايز باستخدام الخلايا اللحمية PA6 نشرت التمايز بروتوكول 12،13. ويمكن ملاحظة المشارك توطين EGFP مع علامات من الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​مثل FOXA2 (أحمر) (الشكل 3A) وهيدروكسيلاز التيروزين (TH، أحمر) (الشكل 3B)، في حين لم الأهم شارك في توطين ج ولد ملاحظتها مع علامة GABAergic، حمض الغاما غاما (GABA، أحمر)   (الشكل 3C).

الشكل 1
الرقم 1. الأولي الجيني فحص PCR. بعد قطف مستعمرة والتوسع، الكشف الأولي الجيني فحص PCR العديد من الحيوانات المستنسخة الإيجابية كما هو موضح من قبل المنتج PCR (في الفرقة 984 سنة مضت). (تم فحص النسخ باستخدام بادئات hPITX3 L ذراع جنرال. F، التي تقع خارج الذراع تستهدف اليسار، وhPITX3 L الذراع GFP R الذي يقع داخل الجين EGFP.) اليد اليمنى والممرات الجانب الأيسر اليد هي 1 كيلوبايت سلم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

lways "> الشكل 2
الشكل 2. التحقق من EGFP استهداف موضع hPITX3 باستخدام nucleases إصبع الزنك في hESCs. (A) تخطيطي لاستراتيجية لطخة الجنوبية المستخدمة للتحقق من الاستهداف. يوضح كبار التخطيطي لوحة hPITX3 موضع الأصلي قبل الاستهداف. التخطيطي لوحة أسفل يصور موضع hPITX3 التالية الإدراج الصحيح من التحوير EGFP. خطوط حمراء تحت كل لوحة توضح المواقع التي 5 'و 3' تحقيقات وصمة عار الجنوبية وربط، وتتوافق مع العصابات في الشكل 2B. (B) لطخة الجنوبية التمثيلية للالمستعمرات المستهدفة بشكل صحيح مختارة من PCR قبل الفرز. الاختصارات: EGFP، وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر. PGK، phosphoglycerol البشرية كيناز المروج. بورو، ومقاومة بوروميسين الجينات. ميزات أخرى: مواقع loxP والأرجواني. تسلسل تذييل بعديد الأدينيلات، BLرق، الإكسونات hPITX3 والبرتقالي. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. hPITX3-EGFP hESCs متباينة في ظل ظروف PA6 / LSB / SAG / المهمتين Fgf8. الصور مناعي من EGFP المسمى مع (A) FOXA2 (الحمراء)، (B) TH (أحمر) و (C) GABA (الحمراء). Counterstained مع دابي (الأزرق). موازين الحانات، 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد Electroporation للزملاء من مصممة خصيصا PITX3 زوج الزنك الاصبع مع ​​PITX3 - EGFP -specific ناقلات DNA المانحة، واختيار بوروميسين اللاحقة، استنساخ HESC إيجابية تم الكشف في البداية عن طريق الفحص الجيني PCR (الشكل 1). التهجين لطخة الجنوبي من هذه الحيوانات المستنسخة PCR إيجابية مع 5 'و 3' تحقيقات محددة وأكد استهداف الصحيح لاكسون 1 من موضع PITX3 (الشكل 2)، مع كفاءة 19٪. الصور مناعي هو مبين في الشكل 3 تظهر التعبير EGFP مدفوعا المروج PITX3 التالية التمايز باستخدام الخلايا اللحمية PA6 نشرت التمايز بروتوكول 12،13. ويمكن ملاحظة المشارك توطين EGFP مع علامات من الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​مثل FOXA2 (أحمر) (الشكل 3A) وهيدروكسيلاز التيروزين (TH، أحمر) (الشكل 3B)، في حين يمكن ملاحظة أهمية أي المشارك التعريب مع علامة GABAergic ، حمض الغاما غاما (GABA، أحمر) (الشكل 3C).

ontent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما "> الشكل 1
الرقم 1. الأولي الجيني فحص PCR. بعد قطف مستعمرة والتوسع، الكشف الأولي الجيني فحص PCR العديد من الحيوانات المستنسخة الإيجابية كما هو موضح من قبل المنتج PCR (في الفرقة 984 سنة مضت). (تم فحص النسخ باستخدام بادئات hPITX3 L ذراع جنرال. F، التي تقع خارج الذراع تستهدف اليسار، وhPITX3 L الذراع GFP R الذي يقع داخل الجين EGFP.) اليد اليمنى والممرات الجانب الأيسر اليد هي 1 كيلوبايت سلم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. التحقق من صحةEGFP استهداف موضع hPITX3 باستخدام nucleases إصبع الزنك في hESCs. (A) تخطيطي لاستراتيجية لطخة الجنوبية المستخدمة للتحقق من الاستهداف. يوضح كبار التخطيطي لوحة hPITX3 موضع الأصلي قبل الاستهداف. التخطيطي لوحة أسفل يصور موضع hPITX3 التالية الإدراج الصحيح من التحوير EGFP. خطوط حمراء تحت كل لوحة توضح المواقع التي 5 'و 3' تحقيقات وصمة عار الجنوبية وربط، وتتوافق مع العصابات في الشكل 2B. (B) لطخة الجنوبية التمثيلية للالمستعمرات المستهدفة بشكل صحيح مختارة من PCR قبل الفرز. الاختصارات: EGFP، وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر. PGK، phosphoglycerol البشرية كيناز المروج. بورو، ومقاومة بوروميسين الجينات. ميزات أخرى: مواقع loxP والأرجواني. تسلسل تذييل بعديد الأدينيلات والأزرق والإكسونات hPITX3 والبرتقالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا فايجوري.

الرقم 3
الرقم 3. hPITX3-EGFP hESCs متباينة في ظل ظروف PA6 / LSB / SAG / المهمتين Fgf8. الصور مناعي من EGFP المسمى مع (A) FOXA2 (الحمراء)، (B) TH (أحمر) و (C) GABA (الحمراء). Counterstained مع دابي (الأزرق). موازين الحانات، 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

مادة مل / 100 مل كتالوج رقم (المورد)
DMEM 89 10566-016 (الحياة تكنولوجيز)
مصل بقري جنيني 10 16140-071 (الحياة تكنولوجيز)
القلم / بكتيريا 1 15070-063 (الحياة تكنولوجيز)

الجدول 1.

عنصر 100 ملم طبق 60 ملم طبق 6 جيدا 48 جيدا 96 جيدا 75CM 2 قارورة
HBSS 5 مل 2 مل 1 مل 0.5 مل 0.1 مل 8 مل
Accutase 5 مل 2 مل 1 مل 0.5 مل 0.1 مل 8 مل
Dispase 5 مل 2 مل 1 مل - - -
وسائل الاعلام HESC 10 مل 6 مل 3 مل 0.5 مل 0.2 مل 15 مل
Matrigel - - - - 0.1ml -

الجدول 2.

</ الجدول>

الجدول 3.

مادة مل / 100 مل كتالوج رقم (المورد)
DMEM / F12 80 11320-033 (الحياة تكنولوجيز)
KSR 20 10828-028 (الحياة تكنولوجيز)
NEAA 1 11140-050 (الحياة تكنولوجيز)
GlutaMAX 1 35050-061 (الحياة تكنولوجيز)
القلم / بكتيريا 1 15070-063 (الحياة تكنولوجيز)
ß-المركابتويثانول 0.1 21985-023 (سيغما الدريخ)
rhFGF2 7 نانوغرام / مل [النهائي] 233-FB-025 / CF (R & D الأنظمة)
مادة تركيز كتالوج رقم (المورد)
N-Lauroylsarcosine حل ملح الصوديوم (Sarcosyl) 0.5٪ (ث / ت) 61747 (سيغما الدريخ)
EDTA 10.0 ملم E9884 (سيغما الدريخ)
كلوريد الصوديوم 10.0 ملم S3014 (سيغما الدريخ)
تريس، الكلور (pH7.5) 10.0 ملم T3253 (سيغما الدريخ)
بروتين K 1.0 ملغ / مل BIO-37084 (بايو لاين أستراليا)

الجدول 4.

مادة تركيز كتالوج رقم (المورد)
تريس، الكلور (pH8.0) 10.0 ملم T3253 (سيغما الدريخ)
EDTA (pH8.0) 0.1 ملي E9884 (سيغما الدريخ)

الجدول 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

جيل من خطوط الخلايا مراسل يوفر وسيلة قوية لتتبع وتصور وعزل خلايا الفائدة من السكان غير متجانسة المستمدة من hESCs. ومع ذلك، فقد أثبتت استهداف الجينات عبر إعادة التركيب مثلي التقليدية لتكون فعالة للغاية بالنسبة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان 3. في هذا البروتوكول وصفنا تقنية بسيطة نسبيا لإدخال RP اكسون في واحدة من موضع PITX3، في hESCs باستخدام ناقلات يستهدف على نطاق واسع جنبا إلى جنب مع ZFNs. في أيدينا نظام استهداف الجين هو كفاءة، مع 19٪ من الحيوانات المستنسخة مقاومة للبوروميسين تحتوي على موضع PITX3 المستهدفة بشكل صحيح (مماثلة لتلك التي نشرت سابقا 6).

وجود قيود مع استخدام ZFNs لتسهيل استهداف الجين هو صعوبة في تصميم ZFNs من الصفر في المنزل. وهكذا، في هذا البروتوكول استخدمنا مصممة خصيصا ZFNs المتاحة تجاريا، والتي يمكن أن تكون مكلفة للحصول على. & #160؛ وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام نظام TALEN لاستهداف الجينات باستخدام إعادة التركيب مثلي 9. استخدام TALENs يقلل كثيرا من تكلفة تحرير الجينات ويمكن تصميم في المنزل، تسريع هذه العملية. وإن لم يكن صراحة أثبت في هذه الدراسة، وهذا البروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لدمج استخدام TALENs ومنهجية هي نفسها، باستثناء تستخدم البلازميدات TALEN في الخطوة 3.5 بدلا من ZFN مرنا، كما هو مبين في 9.

عند استخدام هذه التقنية لا بد من ضمان hPSCs هي في مرحلة النمو السجل، (على سبيل المثال، والثقافات ليست 70٪ أو أكثر متموجة). نحن نعتقد أن هذا أمر بالغ الأهمية كما المكاسب بلازميد الوصول إلى نواة التالية انهيار الغلاف النووي أثناء انقسام الخلية. وعلاوة على ذلك، فإن ناقلات المانحة DNA تتضمن فقط في الحمض النووي DNA كما يلي التوليف تستغل هذه عملية الإصلاح الموجه التماثل خلال تقسيم لدمج DNA المانحة فيالجينوم.

آخر الحد المحتمل مع اقتراب ZFN هو إدخال DNA يكسر في أماكن أخرى من الجينوم. على الرغم من التهجين الخارجي الجنوبي مع 5 'و 3' بالكشف عن تحقيقات التكامل الصحيح فإنه لن كشف الأحداث التكامل إضافية أو إصلاح عرضة للخطأ في أماكن أخرى من الجينوم. يمكن فحص الأحداث التكامل اضافية من قبل التهجين الجنوبي باستخدام ناقلات تحقيقات محددة (على سبيل المثال، EGFP) في حين خارج الهدف من أزواج الانقسام ZFN يمكن الكشف عنها باستخدام سيليكس 3،6.

على الرغم من أننا لم نلاحظ أي تأثيرات واضحة في تطوير الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​يمكن أن تعزى مباشرة إلى تثبيط الجين PITX3 واحد، يجب أن يتحمل الباحثون في الاعتبار أن أي استهداف الحدث حيث تعطلت نسخة واحدة من الجين قد يكون ضارا تطوير تلك الخلية ويجب أن يأخذ ذلك في الحسبان عند تحليل النتائج. إذا كان هذا هو الحال سيعتمد إلى حد كبيرعلى الجينات استهدافهم ويمكن التأكد فقط من خلال إجراء التجربة.

باستخدام بروتوكول PA6 التمايز القائم 12،13 تمكنا من تأكيد الإخلاص للنظام المناعي بواسطة مراسل (الشكل 3)، وتحليل QPCR من EGFP إيجابي مقابل السكان سلبي التالية مضان تنشيط الخلايا الفرز (لا تظهر البيانات). كما PITX3 هو عامل النسخ محددة إلى الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​14، وهندسة خط الخلية مراسل PITX3 البشري تسهيل استخدام PITX3 + الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​المستمدة من hESCs في دراسات سواء في المختبر أو النمذجة PD العلاج ببدائل الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقدم العمل المبين في هذا البروتوكول بفضل تمويل من حكومة فيكتوريا كجزء من تحالف التعاوني مع معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) GlobalStem GSC-6004G
Gelatin Sigma G1393-100ML
HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) Life Technologies 14175-095
Dispase StemCell Technologies 7923
Cell Scraper Corning 3008
Accutase Life Technologies A11105-01
Y27632 Axon Medchem Axon 1683
Cell Strainer - 40 μm BD Biosciences 352340
33 mm - 0.22 μm filter Millipore SLGP033RS
rhFGF2 R&D Systems 233-FB-025/CF
Electroporator BioRad 165-2661
0.4 cm electroporation cuvette BioRad 165-2088
Human TV-hPITX3-forward targeting construct Addgene 31942
ZFN Kit; Human PITX3 Sigma-Aldrich CKOZFN1050-1KT
Puromycin InvivoGen ant-pr-1
Matrigel BD Biosciences 354277
Geltrex Life Technologies A1569601
NaCl Sigma-Aldrich S3014
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 10566-016
Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) Life Technologies 16140-071
Pen/Strep Life Technologies 15070-063
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Life Technologies 11320-033
KnockOut Serum Replacement (KSR) Life Technologies 10828-028
MEM Non-Essential Amino Acids  (NEAA) Life Technologies 11140-050
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
ß-mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) Sigma-Aldrich 61747
EDTA Sigma-Aldrich E9884
Trizma Hydrochloride Sigma-Aldrich T3253
Proteinase K solution (20 mg/ml) Bioline Australia BIO-37084
Expand Long Template PCR System Roche Australia 11681834001
hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ GeneWorks, Australia
hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ GeneWorks, Australia
HyperLadder 1 kb  Bioline Australia BIO-33025
GelRed Jomar Bioscience, Australia 41003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
  2. Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
  3. Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
  4. Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
  5. Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
  6. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  7. Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
  8. Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
  9. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  10. Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
  11. Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
  12. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
  13. Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
  14. Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 90، Electroporation لل، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، والتحرير الجينوم، خط خلية المراسل، الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط
الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hartley, B. J., Fabb, S. A., Finnin, … More

Hartley, B. J., Fabb, S. A., Finnin, B. A. L., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (90), e51764, doi:10.3791/51764 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter