Summary
Линии Репортер сотовые предлагают средства для визуализации, отслеживать и изолировать клетки интерес гетерогенных популяций. Тем не менее, ген-таргетинга с использованием обычного гомологичной рекомбинации в человеческих эмбриональных стволовых клеток крайне неэффективно. Здесь мы опишем ориентации ЦНС среднего мозга конкретного фактора транскрипции Pitx3 локуса EGFP помощью цинка пальца нуклеазы повышенную гомологичной рекомбинации.
Abstract
Одним из основных ограничений с нынешних человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) дифференцировки протоколов является генерация гетерогенных популяций клеток. Эти культуры содержат клетки интерес, но также загрязнены недифференцированных ЭСК, не-нейронных производных и других нервных подтипов. Это ограничивает их использование в в пробирке и в естественных приложений, таких как моделирование в пробирке для открытия новых лекарств или заместительной клеточной терапии. Чтобы помочь преодолеть это, клеточные линии репортер, которые предлагают средства для визуализации, дорожки и изолировать клетки интерес, могут быть спроектированы. Тем не менее, для достижения этой цели в человеческих эмбриональных стволовых клеток с помощью обычного гомологичной рекомбинации крайне неэффективно. Этот протокол описывает адресности гипофиза гомеобоксных 3 (Pitx3) локуса в человеческих эмбриональных стволовых клеток с помощью специально созданных нуклеазы цинка пальцев, которые вводят двунитевых разрывов ДНК, специфичные для конкретного, вместе сPitx3 - EGFP -специфический вектор донор ДНК. После генерации линии клеток Pitx3 репортера, он может быть дифференцированы с помощью опубликованные протоколы для использования в исследованиях, такие как в пробирке моделирования заболевание или клеточной заместительной терапии Паркинсона.
Introduction
Текущие эмбриональных стволовых клеток (ESC) дифференциации протоколы привести в гетерогенных клеточных популяций, особенно в отношении получения конкретных нейронных фенотипов. Таким образом, хотя культуры содержат желаемый клеточный фенотип, другой нейронов, не нейронов и не-дифференцированные типы клеток часто присутствуют 1. Эти характеристики ограничивают применение ESC получены клеточные источники для использования в клеточной заместительной терапии, и в моделировании пробирке заболевания.
Генетические линии репортер сотовые предлагают средства для визуализации, отслеживать и изолировать клетки интерес, при условии, что выражение репортера белка (РП) воспроизводит эндогенной экспрессии. Использование промоторов, которые непосредственно выше по потоку от области гена, кодирующего могут быть использованы для получения сырых генетические репортеров, но такие конструкции не имеют точные регуляторные элементы, которые контролируют экспрессию эндогенного гена. В отличие от этого, гомологичной рекомбинации предлагаетвозможность обеспечить высококачественный выражение РП. В прошлом ориентации векторов, предназначенных для гомологичной рекомбинации в конкретной локусов интерес были использованы для целевой RPS в мышиных ЭСК (mESCs) с помощью электропорации в качестве средства доставки ДНК 1,2. Однако генерация линий репортеров клеток через обычной гомологичной рекомбинации крайне неэффективно для эмбриональных клеток (ЭСК), и, таким образом, только были зарегистрированы в нескольких случаев (обзор 3). Используя инженерии химерный белок, содержащий слияние с Фок I нуклеазы с конкретным участкам мотивов цинка пальцев, известных под общим названием цинка пальцев нуклеазы (ZFNs), ДНК двухцепочечной перерывы могут быть введены в заранее определенном локусов генома. Когда ДНК-вектор с гомологии с обеих сторон двухцепочечной ДНК перерыва добавляется, геномную сайт может быть восстановлен с помощью гомологичной рекомбинации, что позволяет включение последовательности ДНК донора. Эта техника оказалась полезной Fили геномной редактирования в обоих человека первичных клеток 4,5 и ЭСК 6,7. Более поздние работы, используемые активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Talens), транскрипционные факторы, используемые патогенов растений 8, чтобы помочь в разработке нуклеаз сайт-специфических 9.
В следующем протоколе мы демонстрируем поколение линии чЭСК репортера клеток путем электропорации в EGFP содержащей гомологичной вектора направленного 6 вместе с ZFNs для человеческого гипофиза гомеобоксного 3 (Pitx3) локуса. После выбора антибиотика в течение 2-3 недель, ЭСК с правильно интегрированной ДНК можно вручную выбрал, расширен и скрининг первоначально методом ПЦР, а затем подтверждено Саузерн-блоттинга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры проводили в стерильном ламинарном боксе. Все среды и растворы уравновешивали до 37 ° С, если не указано иное.
1 Расширение человека ЭСК (ЭСК и hiPSCs, WA-09 используется в настоящем Протоколе) для трансфекции
Примечание: Это не необходимо расширить ЭСК на Матригель или Geltrex. ЭСК расширенные на мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) может быть использован для электропорации или nucleofection следующего за MEF стадии удаления (см раздел 2.8).
- Подготовка 1 х 100 мм чашку и 1 х 75cm2 колбу DR4 MEFs в 2,0 × 10 4 клеток на см 2 в MEF среды (таблица 1) на чашки, предварительно покрытые 0,1% вес / об желатин.
Примечание: CF1, BLK6 или MF1 MEFs могут быть использованы, однако, рекомендуется, что резистентные к антибиотикам MEF линии используются, например, DR410. - На следующий день, прохождение ЭСК на А 100 мм блюдо предварительно покрыты MEFs подготовленных в разделе 1.1. Для этого ASPIСкорость чЭСК СМИ от культур блюд, мыть ЭСК сбалансированным солевым раствором Ca2 + / Mg2 + -свободных Хэнкса (HBSS), добавить диспаза (см Таблицу 2 соответствующих объемов) и место в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C / 5% CO 2. После 3-5 мин инкубации, аспирата диспаза и аккуратно мыть 1 - 2 раза с ССРХ удалить MEFs. Добавить чЭСК СМИ (таблица 3) и с помощью мобильного скребок или 5 мл пипетки, аккуратно очистить колонии с поверхности чашки для культивирования.
- Соберите колонии фрагменты в суспензии от культуры блюдо в 15 мл центрифужную пробирку. Промыть культуры блюдо с чЭСК СМИ и передачи в 15 мл трубки. Будьте осторожны, чтобы не разбить комки на отдельные клетки или небольшие фрагменты.
- Центрифуга в течение 5 мин при 160 х г для осаждения колонии фрагменты.
- Аспирируйте супернатант. Нажмите нижнюю часть 15 мл трубки с пальцем, чтобы ослабить колонии фрагмент осадок. Аккуратно ресуспендирования фрагменты колонии в чЭСК СМИ по раздельным соотношении (Normallя разделить соотношение между 1: 4 и 1: 8 которая подходит). Будьте крайне осторожны, чтобы не оказывать глыбы на отдельные клетки или небольшие фрагменты, как это повлияет на replating эффективность.
- До replating чЭСК фрагменты на MEFs мыть 1x с ССРХ. Медленно добавить соответствующее количество (таблица 2) клеточной суспензии, содержащей чЭСК фрагменты в чЭСК СМИ чашки, предварительно металлизированные с MEFs.
- Поместите чашки для культивирования на полке в инкубаторе и медленно двигаться вперед и назад и из стороны в сторону для равномерного распределения колонии фрагменты.
- Ежедневно Заменить чЭСК СМИ.
- Для подготовки кондиционированной среды от MEFs (MEF-CM) вымыть 75 см 2 колбу предварительно покрыты MEFs 1 х с ССРХ. Добавить чЭСК СМИ. После 24 ч, собирают кондиционером материал и замените свежим чЭСК СМИ. Повторите в день в течение максимум 12 дней. Хранить MEF-CM при 4 ° С до использования.
2 Получение ЭСК человека для трансфекции
- Соблюдайте рост ЭСКпод микроскопом в день. Когда колонии становятся 40-50% сливной, пластина 3 х 100 мм блюда с 2,0 х 10 5 MEFs на см 2.
- При колонии стали 60 - 70% сливной они готовы для трансфекции. 'жениха колонии, удалив дифференцированные колонии или колонии ядер.
Примечание: Как мы считаем высокую трансфекции и целеуказания эффективности возникают, когда клетки находятся в фазе роста журнал, предполагается, что электропорации проводиться до ЭСК достичь ≥ 70% слияния. - Вымойте чЭСК колонии с ССРХ и добавить Accutase.
Примечание: Это не нужно предварительно обрабатывать ЭСК с ингибитором ROCK Y-27632 достаточным торможение будет происходить при инкубации с Y-27632 во время этапа 2.7 - Инкубировать в течение 10 - 20 мин при 37 ° С / 5% CO 2, пока колонии не предоставляются отдельные клетки, если смотреть под микроскопом. Растирают клетки с 1 мл пипетки.
- Добавить чЭСК СМИ и фильтр в 15 мл коническую трубку с использованием 40 мкм клеток straineг удалить скопления клеток.
- Центрифуга при 160 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируйте осадок клеток в свежих чЭСК СМИ и повторить, чтобы удалить остатки раствора Accutase.
- Ресуспендируют клеток в чЭСК среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 и передать общую клеточной суспензии на 100 мм чашку, предварительно покрытых желатином.
- Инкубировать при 37 ° C / 5% CO 2 в течение как минимум 30 мин.
- В течение этого времени MEFs будет придерживаться желатина покрытием блюдо. Сбор неадгезированных ЭСК с использованием 1 мл пипетки в свежем 15 мл центрифужную пробирку и определяют плотность клеток с помощью гемоцитометра.
3 Электропорация ЭСК
- Фильтры CM-MEF СМИ, использующие фильтр 0,22 мкм и добавить 10 нг фактором / мл рекомбинантного человеческого роста фибробластов 2 (rhFGF2).
- Трансфер 7,5 х 106 из ЭСК разделе 2.9 на новый 15 мл коническую трубку и центрифуги при 160 мкг в течение 5 мин.
- За это время создана электропоратора: Выбрать программу для экспоненциального элеctroporation и установите следующие параметры, Напряжение: 250 В, емкость: 500 мкФ, и сопротивление: ∞-.
- Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать осадок клеток в 0,8 мл охлажденного льдом 0,22 мкм фильтрованной HBSS. Перенесите раствор в стерильный 0,4 см кювету для электропорации.
- Добавить ТВ-hPITX3-вперед прицеливания конструкцию (30 мкг ДНК) и аккуратно перемешать с 200 мкл пипетки. Инкубируют на льду в течение 5 мин. В течение этого времени удалить одну аликвоту Pitx3 ZFN мРНК и размораживания на льду. При дефростации трансфер 7,5 мкл ZFN мРНК в ДНК / смеси клеток в кювету для электропорации. Осторожно перемешать с 200 мкл пипетки.
Примечание: локус мишенью является основным фактором, который способствует ориентации эффективности. Loci кодирования молчащие гены, гены не выраженные в ЭСК, такие как Pitx3 трудно целевой использованием обычного гомологичной рекомбинации 6. Таким образом, этот протокол утилизирует специально созданных ZFNs для человеческого Pitx3 локуса, чтобы вызвать ДНК двухцепочечной брубить. - Электропорации, следуя инструкциям на экране по электропоратора.
- Использование 200 мкл пипетки перенести содержимое из кювету для электропорации в 15 мл пробирку, содержащую 10 мл чЭСК СМИ. Вымойте кювету дважды 200 мкл чЭСК СМИ каждый раз и передачи в 15 мл трубки. Там будет "слизистой, как" мусора, состоящую из ДНК и белка из лизированных клеток, которые негативно влияют выживаемость клеток. Центрифуга при 160 х г в течение 5 мин, чтобы удалить этот мусор.
- Аспирируйте супернатант и слегка утрамбуйте осадок клеток, чтобы ослабить. Повторное приостановить в 30 мл дополненной MEF-CM, содержащих 10 мкм Y-27632 и replate на 3 х 100-мм чашек preplated с MEFs.
- Замените носитель ежедневно. На 2-й день, Y-27632 может быть отозвано и клетки, выращенные только в чЭСК СМИ.
- Через 2-3 дня ЭСК должна быть 50-70% сливной. В этот момент начинают выбор антибиотика (например, 0,5 мкг / мл пуромицина).
- Поддержание SELотражения, добавив свежий чЭСК / пуромицину СМИ ежедневно. После ~ 7 дней небольшие колонии должны быть видны. Если устойчивых к антибиотикам MEFs не используются, MEFs можно дополнить, добавив дополнительные 1,0 х 10 4 клеток на см 2.
4. Сбор Трансгенные чЭСК Клоны
- Около 14 - 21 дней после отбора (когда колонии достигли диаметр ~ 1 мм) подготовить пластины для расширения и скрининга. Начнем с размораживания аликвоту Матригель или Geltrex при 4 ° С в течение не менее 5 ч. Развести в соответствии с инструкциями производителя и добавить 75 мкл в каждую лунку 3 х 96-луночных планшетах. Подготовьте 3 х 48-луночных путем посева MEFs на 2,0 х 10 4 клеток на см 2. Выдержите обе пластины O / N при 37 ° С / 5% CO 2.
- На следующий день рассекают колонии в 16-25 штук с помощью 21 G иглу на конце 2-мл пипетки путем разрезания сетки.
- Аспирируйте Матригель от 96-луночных планшетах и заменить Доп.рук.поподарил CM-MEF СМИ. Вымойте MEFs в 48-луночных планшетах 1 х с ССРХ и добавить чЭСК СМИ.
- Использование 200 мкл пипетки осторожно передачи 1/3 из рассеченной колонии в 48-луночный планшет для расширения. Передача другой 2/3 из рассеченной колонии в соответствующий 96-луночного планшета, содержащего дополненные CM-MEF носитель.
- Поддержание обе пластины путем изменения носитель в день (дополнено CM-MEF носитель для 96-луночных планшетах Матригель покрытием и чЭСК средах в течение 48-луночные планшеты, содержащие MEFs; как с добавлением 0,5 мкг / мл пуромицин).
- Развернуть до 96-луночные планшеты не являются 100% сливной а затем первоначально экран с помощью ПЦР.
5 Отбор и расширение положительных клонов
- Для подготовки геномной ДНК (метод, основанный на 11) Извлеките носитель из пластин путем обращения, то промокните на бумажных полотенцах.
- Промыть каждую лунку дважды RT PBS (100 мкл / лунку каждой промывки), инвертный и блот, как и для этапа 5.1. Место пластины при температуре -80 ° C Fили 1 - 2 ч, чтобы помочь в лизиса клеток (пластины могут быть сохранены на неопределенный срок, как это).
- В то время как клетки при -80 ° С сделать саркозил буфера для лизиса (таблица 4) (50 мкл / лунку). Для лизиса клеток, теплые тарелки в течение 5 мин при комнатной температуре затем пипеткой буфера для лизиса в каждую лунку. Печать края каждой пластины с лентой, место в герметичный контейнер, содержащий влажные бумажные полотенца, чтобы создать влажность, и инкубировать O / N при 60 ° C.
- После инкубации добавляют 150 мкл 5 М NaCl в 10 мл -20 ° C абсолютного этанола, хорошо перемешать и добавить 100 мкл в каждую лунку (Примечание: этанол пойдет облачно, когда добавляется NaCl). Нажмите пластины аккуратно перемешать (не пипетку) и оставьте как минимум на 30 минут при комнатной температуре. В течение этого времени раствор пойдет ясно, и ДНК будет выпадать в осадок.
- Удалить решение, как на стадии 5.1 затем добавить 150 мкл 70% этанола в каждую лунку. Обратить планшет слегка и промокните, как и раньше. Повторите этот шаг еще 2x.
Примечание: Потому что осажденный ДНК естественно адгезивРЭС по культуре ткани пластика не стать выбили во время этих стадий промывки.) - После последней промывки кратко центрифуги плиты на максимальной скорости, чтобы сконцентрировать ДНК к нижней части каждого хорошо то воздушно-сухой при комнатной температуре (или 37 ° С) в течение не менее 30 мин.
- Добавить 40 - 50 мкл T0.1E (рН 8,0) (таблица 5) или Те (рН 8,0) в каждую лунку и место пластин при 65 ° С в течение 1 ч или при 4 ° СО / Н перед использованием ПЦР. Ресуспендируют ДНК, осторожно коснувшись сторон пластины. Используйте 1-2 мкл ресуспендировали ДНК / 10 мкл ПЦР-реакции.
- Использование Развернуть Long Template ПЦР-системы с hPITX3 L руки ген. F и hPITX3 L рука GFP R праймеры выполнить первоначальную проверку клонов при 58 ° C отжига, 45 расширения сек, 35 циклов.
- Electrophorese образцы с Hyperladder 1 КБ 1% агарозном геле, содержащем GelRed при 100 V в течение 45 мин и выявления положительных клонов через ультрафиолетовом освещении.
- Подтвердить ПЦР положительных клонов перевариванием геномной ДНК от EXPanded клоны (см ниже) с HindIII и гибридизации зондов 5 'и 3' вектора плечами гомологии к Саузерну (как описано ранее в 1). Зонды генерируются с использованием пары праймеров hPITX3 5 'зонда F и R, и hPITX3 3' зонда F и R, переваривают EcoRI и лигируют в общий вектор клонирования с помощью ПЦР.
- В зависимости от количества положительных клонов, подготовить 2 лунки 6-луночного планшета по предварительной металлизации с MEFs (2,0 х 10 4 клеток на см 2).
- На следующий день предварительно обработать положительных клонов в 48-луночный планшет с 10 мкМ Y-27632 в течение минимум 1 часа.
- Вымойте положительных клонов с ССРХ и добавить 300 мкл Accutase.
- Когда колонии оказываются отдельные клетки, добавить 1 мл чЭСК СМИ и собрать в 15 мл трубки.
- Замените носитель ежедневно. На 2-й день, Y-27632 может быть отозвано и клетки, выращенные в чЭСК СМИ.
- Когда колонии 70 - 80% сливной, субкультура и заморозить оставшуюся часть колоNY фрагменты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После совместного электропорации пользовательского предназначен Pitx3 цинка пальца пары вместе с Pitx3 - EGFP -специфический ДНК донора вектора, и последующего отбора пуромицином, положительные клоны чЭСК первоначально обнаружен с помощью геномной скрининга ПЦР (Рисунок 1). Саузерн-блот гибридизация этих ПЦР положительных клонов с 5 'и 3' специфических зондов подтвердили правильный таргетинг для экзона 1 в Pitx3 локуса (рисунок 2), с эффективностью 19%. Иммунофлуоресцентных изображения показаны на рисунке 3, показывают, EGFP выражение, приводимый в действие Pitx3 промоутер следующей дифференциацию используя опубликованные PA6 протокол стромальных клеток дифференциации 12,13. Co-локализация EGFP можно было наблюдать с маркерами среднего мозга дофаминергических нейронов, таких как Foxa2 (красный) (Рисунок 3А) и тирозингидроксилазы (TH, красный) (Рисунок 3B), в то время как главное не со-локализации с ульд наблюдаться с маркером ГАМКергической, гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК; красный) (Фиг.3С).
Рис.1 Предварительный геномной скрининг ПЦР. После колонии сбора и расширения, предварительная геномной скрининг ПЦР обнаружены многочисленные положительные клоны, как показано на ПЦР-продукта (группы на 984 б.п.). (Клоны скринировали с использованием праймеров hPITX3 L рука поколения. F, который лежит в непосредственной близости от левой таргетирования руку, и hPITX3 L рука GFP R, который расположен внутри гена EGFP.) Правая и левая боковые переулки 1 КБ лестница. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 Проверка EGFP ориентации на hPITX3 локуса с помощью пальцев цинка нуклеазы в ЭСК. (А) Схема блот стратегии Южной занятого для проверки ориентации. На верхней панели схематично иллюстрирует родной hPITX3 локус до ориентации. Нижняя панель схематически изображает hPITX3 локус следующую правильной вставки трансгена EGFP. Красные линии под каждой панели иллюстрируют сайтов, при котором 5 'и 3' Southern-блот зонды будут связываться, и соответствуют полос на фиг.2В. (B) представитель Саузерн-блот правильно нацеленных колоний, выбранных из ПЦР предварительного отбора. Сокращения: EGFP, усиленный зеленый флуоресцентный белок; ПГК, человек phosphoglycerol киназы промоутер; PURO, ген устойчивости пуромицину. Другие особенности: LoxP сайты, фиолетовый; последовательность полиаденилирования, блие, hPITX3 экзоны, оранжевый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 hPITX3-EGFP ЭСК дифференцируются в условиях ПА6 / LSB / SAG / Fgf8. Иммунофлуоресцентных образы EGFP меченные (A) Foxa2 (красный), (B) TH (красный) и (С) ГАМК (красный). Контрастно с DAPI (синий). Весы бары, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
После совместного электропорации пользовательского предназначен Pitx3 цинка пальца пары вместе с Pitx3 - EGFP -специфические ДНК донора вектор, и последующий выбор пуромицину, положительные клоны чЭСК первоначально обнаружен с помощью геномной скрининга ПЦР (Рисунок 1). Саузерн-блот гибридизация этих ПЦР положительных клонов с 5 'и 3' специфических зондов подтвердили правильный таргетинг для экзона 1 в Pitx3 локуса (рисунок 2), с эффективностью 19%. Иммунофлуоресцентных изображения показаны на рисунке 3, показывают, EGFP выражение, приводимый в действие Pitx3 промоутер следующей дифференциацию используя опубликованные PA6 протокол стромальных клеток дифференциации 12,13. Co-локализация EGFP можно было наблюдать с маркерами среднего мозга дофаминергических нейронов, таких как Foxa2 (красный) (Рисунок 3А) и тирозингидроксилазы (TH, красный) (Рисунок 3B), в то время как главное не совместная локализация не наблюдалось с маркером ГАМКергической , гамма-аминомасляная кислота (ГАМК; красный) (Фиг.3С).
ontent "FO: держите-together.within-страницу =" всегда ">Рис.1 Предварительный геномной скрининг ПЦР. После колонии сбора и расширения, предварительная геномной скрининг ПЦР обнаружены многочисленные положительные клоны, как показано на ПЦР-продукта (группы на 984 б.п.). (Клоны скринировали с использованием праймеров hPITX3 L рука поколения. F, который лежит в непосредственной близости от левой таргетирования руку, и hPITX3 L рука GFP R, который расположен внутри гена EGFP.) Правая и левая боковые переулки 1 КБ лестница. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 ВалидацияEGFP ориентации на hPITX3 локуса с помощью пальцев цинка нуклеазы в ЭСК. (А) Схема блот стратегии Южной занятого для проверки ориентации. На верхней панели схематично иллюстрирует родной hPITX3 локус до ориентации. Нижняя панель схематически изображает hPITX3 локус следующую правильной вставки трансгена EGFP. Красные линии под каждой панели иллюстрируют сайтов, при котором 5 'и 3' Southern-блот зонды будут связываться, и соответствуют полос на фиг.2В. (B) представитель Саузерн-блот правильно нацеленных колоний, выбранных из ПЦР предварительного отбора. Сокращения: EGFP, усиленный зеленый флуоресцентный белок; ПГК, человек phosphoglycerol киназы промоутер; PURO, ген устойчивости пуромицину. Другие особенности: LoxP сайты, фиолетовый; последовательность полиаденилирования, синий, hPITX3 экзоны, оранжевый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фифигура.
Рисунок 3 hPITX3-EGFP ЭСК дифференцируются в условиях ПА6 / LSB / SAG / Fgf8. Иммунофлуоресцентных образы EGFP меченные (A) Foxa2 (красный), (B) TH (красный) и (С) ГАМК (красный). Контрастно с DAPI (синий). Весы бары, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Вещество | мл / 100 мл | № по каталогу (Поставщик) |
| DMEM | 89 | 10566-016 (Life Technologies) |
| Эмбриональной телячьей сыворотки | 10 | 16140-071 (Life Technologies) |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) |
Таблица 1.
| Компонент | 100 мм блюдо | 60 мм блюдо | 6-а | 48-а | 96-а | 75см 2 колбу |
| ССРХ | 5 мл | 2 мл | 1 мл | 0,5 мл | 0,1 мл | 8 мл |
| Accutase | 5 мл | 2 мл | 1 мл | 0,5 мл | 0,1 мл | 8 мл |
| Диспаза | 5 мл | 2 мл | 1 мл | - | - | - |
| чЭСК СМИ | 10 мл | 6 мл | 3 мл | 0,5 мл | 0,2 мл | 15 мл |
| Матригель | - | - | - | - | 0,1 мл | - |
Таблица 2.
| Вещество | мл / 100 мл | № по каталогу (Поставщик) | |
| DMEM / F12 | 80 | 11320-033 (Life Technologies) | |
| KSR | 20 | 10828-028 (Life Technologies) | |
| NEAA | 1 | 11140-050 (Life Technologies) | |
| GlutaMAX | 1 | 35050-061 (Life Technologies) | |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) | |
| ß-меркаптоэтанола | 0.1 | 21985-023 (Sigma-Aldrich) | |
| rhFGF2 | 7 нг / мл [финал] | 233-FB-025 / CF (R & D Systems) |
| Вещество | Концентрация | № по каталогу (Поставщик) |
| N-лауроилсаркозин раствор натриевой соли (саркозил) | 0,5% (вес / объем) | 61747 (Sigma-Aldrich) |
| ЭДТА | 10,0 мМ | E9884 (Sigma-Aldrich) |
| NaCl | 10,0 мМ | S3014 (Sigma-Aldrich) |
| Трис-Cl (рН 7,5) | 10,0 мМ | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| Протеиназы К | 1,0 мг / мл | BIO-37084 (Bioline Австралия) |
Таблица 4.
| Вещество | Концентрация | № по каталогу (Поставщик) |
| Трис-Cl (рН 8,0) | 10,0 мМ | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| ЭДТА (рН 8,0) | 0,1 мм | E9884 (Sigma-Aldrich) |
Таблица 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поколение линий репортеров клеточных предлагает мощные средства для отслеживания, визуализации и выделения клеток, представляющих интерес с гетерогенной популяции, полученной из ЭСК. Тем не менее, целенаправленное изменение генов с помощью обычной гомологичной рекомбинации оказалась крайне неэффективной для эмбриональных клеток 3. В этом протоколе описываются относительно простую технику для введения RP в экзоне одной из Pitx3 локуса, в ЭСК с помощью широко доступных нацеливающего вектора вместе с ZFNs. В наших руках система таргетинга ген является эффективным, с 19% пуромицина устойчивых клонов, содержащих правильно целевой Pitx3 локус (аналогичной той, что ранее опубликована 6).
Ограничение с помощью ZFNs для облегчения таргетинг гена является трудность в проектировании ZFNs с нуля в доме. Таким образом, в данном протоколе мы использовали специально разработанные коммерчески доступные ZFNs, которые могут быть дорогими для приобретения. & #160; Совсем недавно, система Talen был использован для генного таргетинга с использованием гомологичной рекомбинации 9. Использование Talens значительно снижает стоимость редактирования генов и могут быть разработаны в доме, ускорения процесса. Хотя явно не показано в этом исследовании, этот протокол может быть легко изменен, чтобы включить использование Talens как методология то же самое, за исключением того, Talen плазмиды используются в шаге 3,5 вместо ZFN мРНК, как показано на 9.
При использовании этого метода крайне важно для того, чтобы hPSCs в лог-фазе роста, (например, культуры не 70% или более сливающийся). Мы считаем, что это имеет решающее значение, как получает доступ плазмиды к ядру следующей разбивкой ядерной оболочки во время деления клетки. Кроме того, вектор ДНК донора будет включать только в ДНК После синтеза ДНК, как этот процесс использует гомологии-направленный ремонт во время деления для включения донорской ДНК вгенома.
Еще одна потенциальная ограничение с подходом ZFN является введение ДНК распадается в другом месте в геноме. Хотя гибридизацию с внешним 5 'и 3' зондов обнаруживает правильное взаимодействие не обнаружит дополнительные мероприятия по интеграции или ошибкам ремонт в другом месте в геноме. Дополнительные мероприятия по интеграции могут быть рассмотрены Саузерн-гибридизации с использованием векторных конкретных зонды (например, EGFP), тогда как мимо цели расщепления пар ZFN могут быть обнаружены с помощью SELEX 3,6.
Хотя мы не наблюдали никаких явных последствий в развитии среднего мозга дофаминергических нейронов, которые могут быть непосредственно отнесены к инактивации одного гена Pitx3, исследователи должны иметь в виду, что любой ориентации мероприятие, на котором одна копия гена нарушается может иметь пагубные последствия для Развитие этой ячейки и должны принять это во внимание при анализе результатов. Если это так, будет в значительной степени зависетьна геном мишенью и может быть установлено только путем проведения эксперимента.
Используя основанную ПА6 протокол дифференциации 12,13 мы смогли подтвердить верность репортера системы иммунофлуоресценцией (Рисунок 3) и КПЦР анализ EGFP положительной против негативных населения следующие флуоресценции активированных сортировки клеток (данные не представлены). Как Pitx3 является фактором транскрипции специфичные для среднего мозга дофаминергических нейронов 14, инжиниринг человеческого линии Pitx3 репортера клеток будет способствовать использованию Pitx3 + среднего мозга дофаминергических нейронов, полученных из ЭСК в исследованиях либо в пробирке PD моделирования или заместительной клеточной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Работа описано в данном протоколе стало возможным благодаря финансированию викторианской правительства в рамках совместного альянса с калифорнийской Института регенеративной медицины (CIRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer - 40 μm | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
Tags
Молекулярная биология выпуск 90 Электропорация человеческих эмбриональных стволовых клеток редактирование генома линия репортер клеток среднего мозга нейроны допаминергические View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
