Summary
记者的细胞系提供了可视化，跟踪和隔离，从不同的人群感兴趣的细胞的方法。然而，基因靶向用常规的同源重组在人胚胎干细胞是非常低效的。在这里，我们将介绍使用锌指核酸酶增强同源重组靶向中枢神经系统中脑特异性转录因子PITX3基因与绿色荧光蛋白。
Abstract
与当前的人类胚胎干细胞（ESC）的分化方案的一个主要限制是异质的细胞群的产生。这些培养物含有感兴趣的细胞，而且还污染了未分化的胚胎干细胞，非神经衍生物和其他神经元亚型。这限制了它们的使用在体外和体内应用中，如在体外模型用于药物开发的或细胞替代疗法。为了帮助解决这个问题，记者的细胞系，它提供可视化，跟踪和隔离感兴趣的细胞的方法，可以设计。然而，要实现这个在人胚胎干细胞通过常规的同源重组是极其低效的。这个协议描述了一种具有靶向垂体同源使用定制设计的锌指核酸酶，其引入位点特异性双链DNA断裂3（PITX3）位点在人胚胎干细胞，一起PITX3 - 绿色荧光蛋白特异性的DNA供体载体。以下的PITX3报道细胞系的产生，其然后可以使用发表的方案为在研究中使用的分化，例如在体外帕金森氏病模型或细胞替代疗法。
Introduction
当前的胚胎干细胞（ESC）分化的协议导致异质细胞群，特别是相对于特定的神经元表型的推导。因此，虽然文化包含所需的细胞表型，其他的神经元，非神经和未分化的细胞类型是经常存在1。这些特点限制了ESC键的应用程序源细胞来源的细胞替代疗法的使用和体外疾病模型。
遗传报告基因的细胞系提供了可视化，跟踪和隔离所关注的细胞的装置，只要该报告蛋白（RP）中的表达再现的内源性表达。使用的启动子紧接基因编码区上游的可用于推导粗遗传记者但这样的构建缺乏控制内源基因表达的精确调控元件。与此相反，同源重组提供了机会，确保安置计划的高保真表达。在过去，针对设计用于同源重组在感兴趣的特定基因的载体已被用于使用电穿孔作为DNA递送1,2的手段对目标在小鼠胚胎干细胞（mESCs分化）的RP。但是通过传统的同源重组报告细胞系的生成是非常低效的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），因此只被记录在极少数情况下（在3审查）。通过使用含有融合的霍 1核酸酶与特定地点的锌指结构，统称为锌指核酸酶（ZFN）的工程嵌合蛋白，DNA双链断裂可以在预先确定的基因组位点引入。当用同源性的DNA载体的DNA双链断裂的两侧添加，基因组位点可通过同源重组得到修复，从而使该DNA供体序列的掺入。该技术已被证明非常有用˚F或在两个人原代细胞4,5和6,7人类胚胎干细胞的基因组编辑。更近期的工作已经利用转录激活因子样效应物核酸酶（TALENS），所使用的植物转录因子的病原体如图8所示 ，位点特异性核酸酶9来帮助设计。
在下面的协议我们展示了人类胚胎干细胞报道细胞系的产生，含有同源靶向载体6用的ZFN对人垂体同源3（PITX3）轨迹在一起的EGFP的电穿孔。下列抗生素选择为2-3周，胚胎干细胞具有正确整合的DNA可以手动拾取，膨胀并通过PCR筛选最初，并随后通过Southern杂交验证。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有过程都在无菌的层流罩中进行。所有介质和溶液平衡至37℃，除非另有规定。
1，扩展人类的产品分成合同（人类胚胎干细胞和iPS细胞，WA-09本议定书中所使用）的转
注意：这是没有必要扩大对基质胶或Geltrex人类胚胎干细胞。人类胚胎干细胞展开对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中），可用于电或核转遵循MEF去除步骤（见第2.8节）。
- 制备1×100毫米培养皿和DR4的MEF中的2.0×10 4个细胞每cm 2在MEF媒体1×75平方厘米烧瓶中（ 见表1）上的菜肴预先涂有0.1％w / v的明胶。
注意：CF1，可以使用BLK6或MF1的MEF，但是，它建议抗生素有抗药性的MEF线被使用， 例如，DR410。 - 第二天，通过胚胎干细胞到100毫米的菜预镀在1.1节准备的MEF。要做到这一点ASPI从培养的菜肴速率的hESC介质，洗的hESC与Ca2 + / Mg2 +的-free Hanks'平衡盐溶液（HBSS）中，于37℃/ 5％CO 2在潮湿的培养箱中添加分散酶（ 见表2为适当体积）和地点。继3-5分钟孵化，吸分散酶，轻轻地洗1 - 2次的HBSS删除的MEF。添加人类胚胎干细胞介质（ 见表3），用细胞刮刀，或5毫升吸管轻轻刮落掉的培养皿的表面。
- 收集悬浮在培养皿中的菌落片段入15ml离心管中。冲洗培养皿用人类胚胎干细胞的媒体和转移到15ml试管中。小心不要打破团块成单个细胞或小片段。
- 离心5分钟，在160 XG以沉淀细胞集落的碎片。
- 吸出上清液。挖掘15ml试管底部用手指拧松落碎片颗粒。根据分流比在人类胚胎干细胞介质轻轻悬浮细胞集落的碎片（normall4和1：8为宜）雅间1分流比。要格外小心，不要使团块成单个细胞或小片段，因为这会影响replating效率。
- 此前replating人类胚胎干细胞碎片上的MEF用HBSS洗1X。慢慢地将适量含于人类胚胎干细胞介质的hESC片段的细胞悬浮液（ 见表2）添加到菜预镀的MEF。
- 将培养皿架子上的孵化器，慢慢地前后移动和左右摇晃均匀分布的殖民地片段。
- 每天更换人类胚胎干细胞介质。
- 为了准备由MEF（MEF-CM）条件培养基洗75 平方厘米瓶预镀的MEF 1个用HBSS。人类胚胎干细胞中添加媒体。以下24个小时，收集条件培养基，换上新鲜的人类胚胎干细胞介质。每天最多12天重复。存储的MEF-CM在4℃下直到需要。
2，准备人类胚胎干细胞的转染
- 观察人类胚胎干细胞的生长每天在显微镜下。当菌落变成40-50％汇合时，板3×100毫米培养皿中，每平方厘米2.0×10 5的MEF。
- 当菌落变成60 - 70％汇合，他们准备被转染。 '新郎'殖民地去除分化的殖民地，殖民地的核心。
注意：由于我们相信更高的转染和当细胞处于对数期生长靶向效率发生，故建议电穿孔进行之前的hESC达到≥70％汇合。 - 用HBSS洗涤人类胚胎干细胞克隆，并添加的Accutase。
注意：这是没有必要预先治疗人类胚胎干细胞与ROCK抑制剂Y-27632时，在步骤2.7以Y-27632孵育会发生如足以抑制 - 孵育10 - 20分钟，在37℃/ 5％CO 2，直至菌落呈现单个细胞在显微镜下的观察。磨碎细胞以1毫升吸管。
- 添加人类胚胎干细胞介质和过滤到15毫升锥形管使用40微米的细胞straineR以除去细胞团块。
- 离心机在160×g离心5分钟。重悬细胞沉淀在新鲜胚胎干细胞介质，并重复以除去任何残留的Accutase溶液。
- 重悬的细胞在胚胎干细胞介质含有10μM的Y-27632，总细胞悬浮液转移到100mm培养皿预先涂有明胶。
- 在37°C / 5％CO 2的至少30分钟。
- 在此期间的MEF将坚持以明胶涂层菜。收集使用1毫升吸管非粘附的hESC成新鲜15ml离心管中，并确定使用血球细胞密度。
3，电穿孔胚胎干细胞
- 使用0.22微米过滤器，并加入10纳克/ ml重组人成纤维细胞生长因子2（rhFGF2）过滤器CM-MEF媒体。
- 传输距离2.9节7.5×106个胚胎干细胞到一个新的15毫升锥形管和离心160×g离心5分钟。
- 在此期间，成立了电穿孔：选择程序的指数ELEctroporation并设置以下参数，电压：250伏，容量：500μF，和阻力：∞-。
- 吸出上清液，并于0.8ml冰冷却的0.22微米过滤的HBSS中重悬细胞沉淀。将溶液转移到无菌的0.4cm电比色皿。
- 添加电视hPITX3进靶向构建（30微克DNA），并用200微升移液器轻轻混匀。在冰上孵育5分钟。在这段时间删除PITX3 ZFN表达的一个分装解冻冰。当电比色皿解冻转移7.5微升ZFN基因与DNA /细胞混合物。用200微升移液器轻轻混匀。
注意：作为目标的轨迹是有助于靶向效率的主要因素。基因座编码沉默基因，不表达于胚胎干细胞的基因，如PITX3是难以用常规的同源重组6进行定位。因此，该协议利用定制的ZFN为人类PITX3基因诱导的DNA双链break。 - 通过电穿孔以下的电穿孔仪屏幕上的说明进行操作。
- 用200微升吸管从电比色皿的内容传送到一个15毫升的试管含有10ml人类胚胎干细胞介质。与每个时间，并转移到15ml试管中加入200μl人类胚胎干细胞介质的两次冲洗比色皿。会出现“粘液状”碎片组成的DNA和蛋白从裂解的细胞将细胞存活产生不利影响的。离心机在160×g离心5分钟以除去这些碎屑。
- 吸出上清液，并轻轻拍打细胞沉淀松动。重悬在30毫升补充的MEF-CM含有10微米Y-27632和replate上预镀用的MEF 3×100毫米的菜肴。
- 每天更换介质。在第2天，Y-27632可抽出并生长的细胞中只有人类胚胎干细胞的介质。
- 后2-3天的人类胚胎干细胞应该是50-70％汇合。在这一点上开始抗生素选择（ 例如，0.5微克/毫升嘌呤霉素）。
- 保持SEL挠度通过每天增加新鲜胚胎干细胞/嘌呤霉素媒体。后〜7天小菌落应该是可见的。如果不使用抗生素有抗药性的MEF，MEF中通过每平方厘米增加一个额外的1.0×10 4个细胞的补充。
4，采摘转基因人类胚胎干细胞克隆
- 大约14 - 22天内选择（当殖民地已经达到约1毫米直径）准备板的扩展和筛选。通过解冻基底膜或Geltrex的等分在4℃下至少5小时的开始。稀释按制造商的指示，并添加75微升至3.0×96孔板各孔中。通过在2.0×10 4个细胞每cm 2电镀的MEF制备3×48孔板中。孵育两个板在o / n 37℃/ 5％的CO 2。
- 用在2毫升吸管的端部的21G针头切网格次日解剖菌落成16-25件。
- 吸出基质胶从96孔板中，并替换为supplemented CM-MEF媒体。洗的MEF在48孔板1个用HBSS，并添加人类胚胎干细胞的介质。
- 用200微升吸管轻轻转移解剖殖民地的三分之一到48孔板进行扩展。传送解剖菌落的其他三分之二到含有补充CM-MEF媒体对应的96孔板中。
- 通过每日更换介质保持两板（补充CM-MEF培养基的96孔基质胶包被的平板和人类胚胎干细胞培养基包含的MEF 48孔板;都补充有0.5微克/毫升嘌呤霉素）。
- 扩大直到96孔板100％汇合，然后开始通过PCR筛选。
5，筛选和扩展阳性克隆
- 要准备的基因组DNA（基于11法）由反相删除板所有媒体，然后涂抹到纸巾。
- 冲洗各孔两次，用RT PBS（100μl/孔，每次洗涤），转化和印迹，作为步骤5.1。地方板在-80°C 2 F或1 - 2小时，细胞裂解援助（板可以无限期地保存这样的）。
- 而细胞在-80℃下使烷基肌氨酸钠裂解缓冲液（ 见表4）（50μl/孔）。裂解细胞，暖板5分钟，在RT再吸移管的裂解缓冲液到每个孔中。封含有湿润纸巾湿度创建一个可密封的容器中的每个盘磁带，地方的边缘，并培育在o / n 60℃。
- 孵育后加入150μl5M氯化钠10毫升-20℃的无水乙醇，混合均匀，并加入100微升，每孔（注：酒精会去阴天时NaCl的加入）。轻轻拍打板混合（不要吸管），并留下了至少30分钟，在室温。在此期间，溶液会清楚的DNA会沉淀。
- 除去溶液如在步骤5.1，然后加入150微升70％乙醇中的每个孔中。轻轻翻转板和以前一样吸干。重复此步骤，进一步的2倍。
注：由于沉淀的DNA自然阿德水库于组织培养塑料它不会成为在这些洗涤步骤被撞出。） - 最后一次洗涤后，短暂离心平板以最高速度来浓缩DNA到各孔然后空气干燥的在室温下（即37℃）下至少30分钟。
- 添加40 - 50微升T0.1E液（pH8.0）（ 见表5）或TE（pH为8.0），向每个孔中并置于平板在65℃下进行1小时或在4℃CO / N使用用于PCR之前。通过轻轻敲击板的侧面重悬DNA。使用1-2微升的再悬浮的DNA / 10微升的PCR反应。
- 使用Expand长模板PCR系统与hPITX3Ł臂根。 F和hPITX3Ļ臂GFPŕ引物进行克隆的初步筛选，在58℃退火，45秒延伸，35个循环。
- 与Hyperladder 1KB在1％琼脂糖凝胶Electrophorese样本含有GelRed在100伏45分钟，并通过紫外线照射检测阳性克隆。
- 验证PCR阳性克隆，通过消化，从EXPA基因组DNAnded克隆（见下）用HindIII和杂交探针的5'和3'的载体同源臂，以Southern印迹（如先前所述 ）。通过PCR使用引物对hPITX3 5'探针F和R，并hPITX3 3'探针F和R，用EcoRI消化，并连接到一个通用的克隆载体中产生的探针。
- 根据阳性克隆的数目，通过预镀用的MEF（2.0×10 4个细胞每cm 2）的制备2孔6孔板。
- 第二天预处理阳性克隆在48孔板为10μm的Y-27632最少1小时的。
- 用HBSS洗阳性克隆，并加入300μl的Accutase的。
- 当菌落呈现单细胞，加入1 ml人类胚胎干细胞介质和收集到15毫升管。
- 每天更换介质。在第2天，Y-27632可抽出并生长的细胞在人类胚胎干细胞的介质。
- 当殖民地的70 - 80％融合，传代培养和冷冻的结肠其余纽约片段。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以下共电穿孔的定制设计PITX3锌指一对连同PITX3 - EGFP特异性DNA供体载体中，并随后嘌呤选择，阳性胚胎干细胞克隆，通过基因组PCR筛选（ 图1），首先检测到的。这些PCR阳性克隆与5'和3'特异性探针的Southern印迹杂交确认正确的定位外显子1的PITX3轨迹（ 图2），具有19％的效率。在图3所示的免疫荧光图像表明EGFP表达由PITX3子使用刊登PA6基质细胞分化方案12,13以下分化驱动。共定位的EGFP的可能与中脑多巴胺能神经元的标记物如FOXA2（红色）（ 图3A）和酪氨酸羟化酶（TH;红色）被观察（ 图3B），而重要的是没有共定位Ç乌尔德与GABA能标记物，γ-氨基丁酸（;红色GABA）可以观察到 （ 图3C）。
图1中的初步的基因组PCR筛选。以下菌落采摘和扩张，初步的基因组PCR筛选检测出大量的阳性克隆所示的PCR产物（带在984碱基对）。 （克隆，使用引物hPITX3Ł臂根，男，说谎只是左胳膊目标外，并hPITX3Ł手臂的GFP R，它位于EGFP基因中筛选。）右侧和左侧车道有1千阶梯。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2：验证EGFP的靶向hPITX3座使用锌指核酸酶在人类胚胎干细胞。用来验证针对Southern印迹策略（一）示意图。前面板示意图说明针对之前的原生hPITX3轨迹。底部面板示意图描绘了hPITX3座位下面的绿色荧光蛋白转基因的正确插入。每个面板下方的红色线条示出了在其5'和3'Southern杂交的探针将结合的位点，并对应于在图2B中（B）的从PCR预筛分选正确定位的菌落代表Southern印迹的条带。简称：绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白; PGK，人类磷酸甘油激酶启动子; PURO，嘌呤霉素抗性基因。其他功能：loxP位点，紫色;多聚腺苷酸化序列，BLUE，hPITX3个外显子，橙色。 请点击这里查看该图的放大版本。
PA6 / LSB / SAG / FGF8条件下，图3 hPITX3-EGFP的人类胚胎干细胞分化。绿色荧光蛋白的免疫荧光图像标记（A）FOXA2（红色），（B）个 （红色）和（C）GABA（红色）。 Counterstained用DAPI（蓝色）。秤酒吧，50微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
以下共电穿孔的定制设计PITX3锌指一对连同PITX3 - EGFP特异性 DNA供体载体中，并随后嘌呤选择，阳性胚胎干细胞克隆，通过基因组PCR筛选（ 图1），首先检测到的。这些PCR阳性克隆与5'和3'特异性探针的Southern印迹杂交确认正确的定位外显子1的PITX3轨迹（ 图2），具有19％的效率。在图3所示的免疫荧光图像表明EGFP表达由PITX3子使用刊登PA6基质细胞分化方案12,13以下分化驱动。共定位的EGFP的可能与中脑多巴胺能神经元的标记物如FOXA2（红色）（ 图3A）和酪氨酸羟化酶（TH;红色）被观察（ 图3B），而重要的是没有共定位可以与GABA能标记被观察，γ-氨基丁酸（GABA;红色） （ 图3C）。
ontent“FO：保together.within页=”总是“>图1中的初步的基因组PCR筛选。以下菌落采摘和扩张，初步的基因组PCR筛选检测出大量的阳性克隆所示的PCR产物（带在984碱基对）。 （克隆，使用引物hPITX3Ł臂根，男，说谎只是左胳膊目标外，并hPITX3Ł手臂的GFP R，它位于EGFP基因中筛选。）右侧和左侧车道有1千阶梯。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2的验证绿色荧光蛋白靶向hPITX3场所使用锌指核酸酶在人类胚胎干细胞。用来验证针对Southern印迹策略（一）示意图。前面板示意图说明针对之前的原生hPITX3轨迹。底部面板示意图描绘了hPITX3座位下面的绿色荧光蛋白转基因的正确插入。每个面板下方的红色线条示出了在其5'和3'Southern杂交的探针将结合的位点，并对应于在图2B中（B）的从PCR预筛分选正确定位的菌落代表Southern印迹的条带。简称：绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白; PGK，人类磷酸甘油激酶启动子; PURO，嘌呤霉素抗性基因。其他功能：loxP位点，紫色;多聚腺苷酸化序列，蓝色，hPITX3个外显子，橙色。 请点击这里查看该网络的放大版本。gure。
PA6 / LSB / SAG / FGF8条件下，图3 hPITX3-EGFP的人类胚胎干细胞分化。绿色荧光蛋白的免疫荧光图像标记（A）FOXA2（红色），（B）个 （红色）和（C）GABA（红色）。 Counterstained用DAPI（蓝色）。秤酒吧，50微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
| 物质 | 毫升/百毫升 | 目录编号（供应商） |
| DMEM | 89 | 10566-016（生命科技） |
| 胎牛血清 | 10 | 16140-071（生命科技） |
| 笔/链球菌 | 1 | 15070-063（生命科技） |
表1。
| 组件 | 100mm培养皿 | 60mm培养皿 | 6孔 | 48孔 | 96孔 | 75厘米2瓶 |
| HBSS | 5毫升 | 2毫升 | 1毫升 | 0.5毫升 | 0.1毫升 | 8毫升 |
| 的Accutase | 5毫升 | 2毫升 | 1毫升 | 0.5毫升 | 0.1毫升 | 8毫升 |
| 中性蛋白酶 | 5毫升 | 2毫升 | 1毫升 | - | - | - |
| 人类胚胎干细胞介质 | 10毫升 | 6毫升 | 3毫升 | 0.5毫升 | 0.2毫升 | 15毫升 |
| 基底膜 | - | - | - | - | 0.1毫升 | - |
表2。
| 物质 | 毫升/百毫升 | 目录编号（供应商） | |
| DMEM / F12 | 80 | 11320-033（生命科技） | |
| KSR | 20 | 10828-028（生命科技） | |
| NEAA | 1 | 11140-050（生命科技） | |
| 的GlutaMAX | 1 | 35050-061（生命科技） | |
| 笔/链球菌 | 1 | 15070-063（生命科技） | |
| β-巯基乙醇 | 0.1 | 21985-023（Sigma-Aldrich公司） | |
| rhFGF2 | 7毫微克/毫升[决赛] | 233-FB-025 / CF（R＆D系统） |
| 物质 | 浓度 | 目录编号（供应商） |
| Ñ-十二烷基肌氨酸钠盐溶液（十二烷基肌氨酸钠） | 0.5％（重量/体积） | 61747（Sigma-Aldrich公司） |
| EDTA | 10.0毫米 | E9884（Sigma-Aldrich公司） |
| 氯化钠 | 10.0毫米 | S3014（Sigma-Aldrich公司） |
| 三，氯液（pH7.5） | 10.0毫米 | T3253（Sigma-Aldrich公司） |
| 蛋白酶K | 1.0毫克/毫升 | BIO-37084（澳大利亚生物在线） |
表4。
| 物质 | 浓度 | 目录编号（供应商） |
| 三，氯液（pH8.0） | 10.0毫米 | T3253（Sigma-Aldrich公司） |
| EDTA液（pH8.0） | 0.1毫米 | E9884（Sigma-Aldrich公司） |
表5。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
对记者的细胞系的产生提供了强有力的手段来跟踪，可视化和从人类胚胎干细胞来源的异质群体隔离感兴趣的细胞。然而，基因通过常规的同源重组靶向已被证明是非常低效的人类胚胎干细胞3。在这个协议中，我们描述了一个相对简单的技术采用广泛使用的目标向量的ZFN一起引入到RP的外显子的PITX3基因之一，在人类胚胎干细胞。我们手中的基因靶向系统是高效的，用含有正确的目标PITX3轨迹（类似于此前公布的6）嘌呤霉素抗性无性系19％。
使用的ZFN以促进基因打靶的限制是从无到有的房子设计的ZFN的难度。因此，在该协议中，我们使用的自定义设计的市售的ZFN，这可能是昂贵的获取。＆＃160;最近，TALEN系统已经用于基因通过同源重组9定位。使用TALENS的大大降低基因编辑的成本和可设计的内部，加速过程。虽然没有在本研究明确证实，该协议可以很容易地修改，以结合使用TALENS作为方法是相同的，除了TALEN质粒在步骤3.5，而不是ZFN的mRNA使用，如图9。
当使用此技术就必须确保hPSCs是在对数期生长，（ 例如，培养物是不为70％以上汇合）。我们认为，这是由于下列细胞分裂过程中核被膜破裂质粒获得访问细胞核的关键。此外，DNA的供体载体将只纳入以下的DNA合成的DNA作为这一过程划分中利用同源定向修复纳入了供体DNA进基因组。
与ZFN方法的另一个潜在的限制是DNA引入其他地区爆发的基因组中。虽然与外部5'和3'探针的Southern杂交检测正确整合它不会检测到额外的积分事件或易错修复基因组中的其他地方。额外的积分事件可以通过使用载体特异性的探针进行Southern杂交（ 例如，绿色荧光蛋白），而脱靶切割可以使用SELEX 3,6来检测的ZFN对的进行检查。
虽然我们并没有观察到中脑多巴胺能神经元的发育，可以直接归因于一个PITX3基因的失活没有明显的效果，研究人员应该牢记，任何针对事件，其中一个基因的一个拷贝被破坏可能是有害的该小区与发展分析时，结果应该考虑到这一点。是否是这种情况将在很大程度上取决于在基因上被定位的，并且可以仅通过进行实验来确定。
使用PA6基于分化方案12,13，我们能够确认该报告系统的通过免疫荧光的保真度（ 图3）和EGFP阳性与阴性群的下列荧光激活细胞分选的qPCR分析（数据未示出）。如PITX3是一种转录因子特异性到中脑多巴胺能神经元14，人PITX3报道细胞系的工程将有利于使用在任体外 PD建模或细胞替代疗法的研究来源于人类胚胎干细胞PITX3 +中脑多巴胺能神经元。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
在本协议中所述的工作成为可能，通过与美国加州再生医学研究所（CIRM）的协作联盟的一部分，由维多利亚州政府资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer - 40 μm | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
Tags
分子生物学，第90，电穿孔，人类胚胎干细胞，基因组编辑，报道细胞系，中脑多巴胺能神经元 View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
