Summary
Linee cellulari Reporter offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse da popolazioni eterogenee. Tuttavia,-gene targeting utilizzando convenzionale ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali umane è estremamente inefficiente. Qui, descriviamo il targeting CNS mesencefalo specifico PITX3 locus fattore di trascrizione con EGFP utilizzando zinc-finger nucleasi avanzata ricombinazione omologa.
Abstract
Una limitazione importante con cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione attuali è la generazione di popolazioni cellulari eterogenee. Queste culture contengono le cellule di interesse, ma sono anche contaminati con i CES indifferenziate, derivati non-neurali e altri sottotipi neuronali. Questo limita il loro uso in vitro ed in vivo applicazioni, come la modellazione in vitro per la scoperta di farmaci o terapia di sostituzione cellulare. Per aiutare a superare questo, linee cellulari giornalista, che offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse, possono essere progettati. Tuttavia, per raggiungere questo obiettivo in cellule staminali embrionali umane via convenzionale ricombinazione omologa è estremamente inefficiente. Questo protocollo descrive il targeting della homeobox pituitaria 3 (PITX3) locus in cellule staminali embrionali umane utilizzando progettati su misura nucleasi zinc-finger, che introducono site-specific doppio filamento rotture del DNA, insieme ad unPITX3 - EGFP -specifica vettore donatore del DNA. Dopo la generazione della linea cellulare PITX3 giornalista, può quindi essere differenziato utilizzando protocolli pubblicati da utilizzare in studi in vitro come modelli di malattia o terapia di sostituzione cellulare di Parkinson.
Introduction
Cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione correnti provocano popolazioni cellulari eterogenee, soprattutto per quanto riguarda la derivazione di specifici fenotipi neuronali. Così, anche se le culture contengono il fenotipo cellulare desiderato, altro neuronale, tipi di cellule non-neuronali e non-differenziati sono spesso presenti 1. Queste caratteristiche limitano l'applicazione del CES derivato fonti di cellule per l'uso in terapia di sostituzione cellulare e nella modellazione delle malattie vitro.
Linee cellulari giornalista genetici offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse, a condizione che l'espressione della proteina reporter (RP) riproduce l'espressione endogena. L'uso di promotori immediatamente a monte di una regione del gene codificante può essere usata per derivare reporter genetici grezzi ma tali costrutti mancano i precisi elementi regolatori che controllano l'espressione del gene endogeno. Al contrario, la ricombinazione omologa offre laopportunità di garantire l'espressione ad alta fedeltà del RP. In passato, il targeting vettori progettati per ricombinazione omologa a specifici loci di interesse sono stati utilizzati per RP di topo (CES mESCs) bersaglio utilizzando elettroporazione come mezzo di consegna DNA 1,2. Tuttavia la generazione di linee cellulari giornalista via convenzionale ricombinazione omologa è estremamente inefficiente per CES umane (hESC), e, quindi, è stata documentata solo in una manciata di casi (recensito in 3). Utilizzando una proteina chimerica ingegneria contenente una fusione di una nucleasi Fok I con motivi zinc-finger site-specific, conosciuti collettivamente come zinc-finger nucleasi (ZFNs), DNA rotture del doppio filamento possono essere introdotti a livello pre-determinati loci genomici. Quando si aggiunge un vettore di DNA con omologia a entrambi i lati del DNA rottura a doppio filamento, il sito genomico può essere riparato tramite ricombinazione omologa, consentendo l'inserimento della sequenza di DNA donatore. Questa tecnica si è dimostrata utile fo editing genomico in cellule primarie umane 4,5 e 6,7 hESC. Più recente lavoro ha utilizzato trascrizione attivatore-come effettrici nucleasi (Talens), fattori di trascrizione utilizzati da impianti patogeni 8, per aiutare nella progettazione di site-specific nucleasi 9.
Nel seguente protocollo dimostriamo la generazione di una linea cellulare hESC giornalista da elettroporazione di un EGFP contenente omologa vettore targeting 6 insieme ZFNs per l'homeobox pituitaria umana 3 (PITX3) locus. Dopo la selezione antibiotica per 2-3 settimane, hESC con il DNA integrato correttamente possono essere raccolti manualmente, ampliati e proiettati inizialmente tramite PCR, e successivamente convalidati da Southern blotting.
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Protocol
Tutte le procedure sono eseguite in una cappa a flusso laminare sterile. Tutti i mezzi e le soluzioni sono equilibrati a 37 ° C se non diversamente specificato.
1 Espansione di PSC umani (hESC e hiPSCs, WA-09 utilizzato in questo protocollo) per la trasfezione
Nota: Non è necessario espandere hESC su Matrigel o Geltrex. hESC espanse su fibroblasti embrionali di topo (MEF) possono essere utilizzati per elettroporazione o nucleofection a seguito di una fase di rimozione MEF (vedi sezione 2.8).
- Preparare 1 x 100 mm piatto e 1 x boccetta 75cm2 di DR4 MEF a 2,0 x 10 4 cellule per cm 2 in mezzi MEF (vedi Tabella 1) su piatti pre-rivestite con 0.1% w / v di gelatina.
Nota: CF1, BLK6 o MF1 MEF può essere utilizzato, tuttavia, si consiglia di utilizzare le linee MEF resistenti agli antibiotici, per esempio, DR410. - Il giorno successivo, hESC passaggio su un piatto da 100 millimetri pre-placcato con MEF preparati in sezione 1.1. Per fare questo ASPItasso hESC supporti da culture piatti, lavare hESC con soluzione salina bilanciata Ca2 + / Mg2 + Hanks -free '(HBSS), aggiungere dispasi (vedi Tabella 2 per volumi adeguati) e posto in un incubatore umidificato a 37 ° C / 5% di CO 2. Dopo 3-5 minuti di incubazione, aspirare dispasi e delicatamente lavare 1 - 2 volte con HBSS per rimuovere MEF. Aggiungere i media hESC (vedi tabella 3) e utilizzando un raschietto cellulare, o 5 ml pipetta, raschiare delicatamente le colonie sulla superficie del piatto cultura.
- Raccogliere i frammenti di colonie in sospensione dal piatto di coltura in una provetta da centrifuga 15 ml. Piatto cultura Sciacquare con i media hESC e trasferimento al tubo da 15 ml. Fare attenzione a non rompere grumi in cellule singole o in piccoli frammenti.
- Centrifugare per 5 minuti a 160 xg per far sedimentare frammenti di colonia.
- Aspirare il surnatante. Toccare fondo della provetta 15 ml con il dito per allentare colonia frammento pellet. Frammenti di colonia delicatamente risospendere in hESC supporti in base al rapporto di divisione (normallya divisi rapporto tra 1: 4 e 1: 8 è appropriato). Fare molta attenzione a non rendere grumi nelle singole cellule o piccoli frammenti come questo influenzerà replating efficienza.
- Prima di replating frammenti hESC sul MEF di lavaggio 1X con HBSS. Lentamente aggiungere una quantità appropriata (vedi Tabella 2) di sospensione cellulare contenente frammenti hESC nei media hESC ai piatti pre-placcati con MEF.
- Posizionare piatti della cultura sulla mensola in incubatrice e muoversi lentamente avanti e indietro e un lato all'altro per distribuire uniformemente frammenti di colonia.
- Sostituire i media hESC quotidiana.
- Per preparare mezzi condizionati dal MEF (MEF-CM) lavare 75 cm 2 fiasco pre-plated con MEF 1 x con HBSS. Aggiungi i media hESC. Dopo 24 ore, raccogliere condizionata media e sostituire con i media hESC fresca. Ripetere ogni giorno per un massimo di 12 giorni. Conservare MEF-CM a 4 ° C fino al momento dell'uso.
2 Preparazione dei CES umane per la trasfezione
- Osservare la crescita di hESCsotto un microscopio giornaliero. Quando le colonie diventano 40-50% confluenti, la piastra 3 x 100 mm con piatti 2,0 x 10 5 MEF per cm 2.
- Quando le colonie diventano 60 - 70% confluenti sono pronti per essere transfettate. "Sposo" colonie rimuovendo colonie differenziate o per anime colonia.
Nota: Come crediamo maggiore trasfezione e l'efficienza di targeting si verificano quando le cellule sono in fase di crescita di registro, si suggerisce di elettroporazione essere effettuati prima di hESC raggiungano ≥ 70% di confluenza. - Lavare colonie hESC con HBSS e aggiungere Accutase.
Nota: Non è necessario hESCs pretrattare con inibitore ROCK Y-27632 inibizione sufficiente si verifica quando incubati con Y-27632 durante la fase 2.7 - Incubare per 10 - 20 min a 37 ° C / 5% di CO 2 fino colonie sono resi singole cellule come visto sotto un microscopio. Cellule Triturare con una pipetta 1 ml.
- Aggiungi i media hESC e filtro in un tubo da 15 ml con un straine 40 micron cellar per rimuovere grumi di cellule.
- Centrifugare a 160 xg per 5 min. Risospendere il pellet di cellule nei media hESC freschi e ripetere per rimuovere ogni residuo di soluzione Accutase.
- Risospendere le cellule in mezzi hESC contenente 10 mM Y-27632 e trasferire la sospensione cellulare totale per un piatto 100 millimetri pre-rivestito con gelatina.
- Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per almeno 30 min.
- Durante questo periodo MEF aderirà al piatto di gelatina rivestito. Raccogliere hESC non aderenti con una pipetta 1 ml in una nuova provetta da centrifuga 15 ml e determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro.
3. Elettroporazione di hESC
- Supporti CM-MEF filtro con un filtro da 0,22 micron e aggiungere 10 ng / fattore di crescita dei fibroblasti ml ricombinante umano 2 (rhFGF2).
- Trasferire 7,5 x 106 hESC da sezione 2.9 a un nuovo tubo da 15 ml e centrifugare a 160 xg per 5 min.
- Durante questo tempo impostato il elettroporatore: Scegliere il programma per ele esponenzialectroporation e impostare i seguenti parametri, Tensione: 250 V, Capacità: 500 uF, e Resistance: ∞-.
- Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,8 ml di ghiacciata 0,22 micron filtrato HBSS. Trasferire la soluzione in una sterile 0,4 centimetri elettroporazione cuvetta.
- Aggiungere TV-hPITX3-forward il targeting costrutto (30 mg DNA) e mescolare delicatamente con una pipetta 200 microlitri. Incubare in ghiaccio per 5 min. Durante questo tempo togliere un'aliquota di PITX3 ZFN mRNA e sbrinamento sul ghiaccio. Quando scongelato trasferimento di 7,5 ml di ZFN mRNA a DNA miscela / cellula elettroporazione cuvetta. Mescolare delicatamente con una pipetta 200 microlitri.
Nota: Il locus nel mirino è il fattore principale che contribuisce alla efficienza di targeting. Codifica Loci geni silenti, i geni non espressi in CES, come PITX3 sono difficili da indirizzare utilizzando convenzionale ricombinazione omologa 6. Così, questo protocollo utilizza progettato su misura ZFNs per il locus PITX3 umano per indurre un DNA a doppio filamento break. - Elettroporazione seguendo le istruzioni sullo schermo sul elettroporatore.
- Usando una pipetta 200 ml trasferire il contenuto della cuvetta elettroporazione ad una provetta da 15 ml contenente 10 ml supporti hESC. Lavare la cuvetta due volte con 200 ml di media hESC ogni volta e trasferire in una provetta da 15 ml. Ci saranno "muco-come" detriti costituito da DNA e proteine dalle cellule lisate che avrà un impatto negativo la sopravvivenza delle cellule. Centrifugare a 160 xg per 5 minuti per rimuovere questi detriti.
- Aspirare il surnatante e picchiettare delicatamente pellet di cellule per allentare. Risospendere in 30 ml completati MEF-CM contenenti 10 mM Y-27632 e replate composta da 3 x 100 mm preplated piatti con MEF.
- Modificare i media giornaliera. Il giorno 2, Y-27632 può essere ritirata e cellule cresciute in soli mezzi hESC.
- Dopo 2-3 giorni le hESC devono essere 50-70% confluenti. A questo punto iniziare selezione antibiotica (ad esempio, 0,5 mg / ml puromicina).
- Mantenere selezione aggiungendo fresco dei media hESC / puromicina quotidiana. Dopo ~ 7 giorni piccole colonie dovrebbero essere visibili. Se non si utilizzano MEF resistenti agli antibiotici, MEF può essere completata con l'aggiunta di un ulteriore 1,0 x 10 4 cellule per cm 2.
4. Picking cloni transgenici hESC
- Circa 14-21 giorni dopo la selezione (quando le colonie hanno raggiunto il diametro di circa 1 mm) preparano piatti per l'espansione e lo screening. Inizia sbrinamento un'aliquota di Matrigel o Geltrex a 4 ° C per un minimo di 5 ore. Diluire come da istruzioni del fabbricante e aggiungere 75 microlitri di ciascun pozzetto di piastre 3 x 96 pozzetti. Preparare piatti 3 x 48 pozzetti da placcatura MEF a 2,0 x 10 4 cellule per cm 2. Incubare entrambe le piastre O / N a 37 ° C / 5% di CO 2.
- Il giorno seguente sezionare colonie in 16-25 parti usando un ago G 21 sulla estremità di una pipetta 2 ml tagliando una griglia.
- Aspirare Matrigel da piastre da 96 pozzetti e sostituirlo con supplemsupporti ENTED CM-MEF. Lavare MEF in piastre 48 pozzetti 1 x con HBSS e aggiungere i media hESC.
- Usando una pipetta 200 microlitri delicatamente trasferire un terzo della colonia sezionato in una piastra a 48 pozzetti per l'espansione. Trasferire l'altra 2/3 della colonia sezionato in una piastra a 96 pozzetti contenenti corrispondente completati supporti CM-MEF.
- Mantenere entrambe le piastre cambiando media giornaliera (integrato multimediale CM-MEF per Matrigel piastre rivestite da 96 pozzetti e hESC supporti per le piastre 48 pozzetti contenenti MEF, entrambi integrati con 0,5 mg / ml puromicina).
- Espandere fino piastre a 96 pozzetti sono al 100% confluenti e quindi inizialmente schermo tramite PCR.
5. Screening ed espansione di cloni positivi
- Per preparare il DNA genomico (metodo basato su 11) Rimuovere qualsiasi supporto dalle lastre invertendo, quindi asciugare su carta assorbente.
- Lavare ogni pozzetto due volte con PBS RT (100 l / pozzetto ogni lavaggio), invertito e macchia come per il passo 5.1. Posizionare le piastre a -80 ° C fo 1 - 2 ore per aiutare a lisi cellulare (piastre possono essere conservate a tempo indeterminato come questo).
- Mentre le cellule sono a -80 ° C fare sarcosyl Lysis Buffer (vedi tabella 4) (50 ml / pozzetto). Per lisare cellule, piatti caldi per 5 minuti a temperatura ambiente poi tampone di lisi pipetta in ciascun pozzetto. Sigillare i bordi di ogni piatto con del nastro, posto in un contenitore sigillabile contenente tovaglioli di carta umidi per creare l'umidità, e incubare O / N a 60 ° C.
- Dopo l'incubazione aggiungere 150 ml di NaCl 5M a 10 ml di -20 ° C etanolo assoluto, mescolare bene e aggiungere 100 ml a ciascun pozzetto (Nota: etanolo andrà nuvoloso quando viene aggiunto NaCl). Piastre Toccare delicatamente per mescolare (non pipetta) e lasciare per un minimo di 30 minuti a temperatura ambiente. Durante questo tempo la soluzione andrà chiaro e il DNA viene precipitato.
- Rimuovere la soluzione come al punto 5.1 quindi aggiungere 150 ml di etanolo al 70% in ogni pozzetto. Capovolgere piastra delicatamente e asciugare come prima. Ripetere questa operazione un ulteriore 2x.
Nota: Poiché il DNA precipitato naturalmente aderes per la plastica coltura di tessuti non diventa sloggiato durante queste fasi di lavaggio.) - Dopo l'ultimo lavaggio piatti brevemente centrifugare alla massima velocità per concentrare il DNA al fondo di ciascun pozzetto poi asciugare a temperatura ambiente (o 37 ° C) per almeno 30 min.
- Aggiungere 40 - 50 ml T0.1E (pH8.0) (vedi tabella 5) o TE (pH8.0) ad ogni pozzetto e posizionare le piastre a 65 ° C per 1 ora o al 4 ° CO / N prima di utilizzare per la PCR. Risospendere il DNA toccando delicatamente i lati della piastra. Utilizzare 1-2 ml di ri-sospensione DNA / 10 microlitri reazione PCR.
- Utilizzando il Expand lunga Template PCR con hPITX3 L braccio gen. F e hPITX3 L primer braccio GFP R eseguono lo screening iniziale di cloni a 58 ° C ricottura, 45 sec estensione, 35 cicli.
- Campioni elettroforesi con 1kb Hyperladder in un gel di agarosio 1% contenente GelRed a 100 V per 45 minuti e rilevare cloni positivi mediante illuminazione UV.
- Convalidare PCR cloni positivi per digestione del DNA genomico da Expacloni nded (vedi sotto) con HindIII e ibridazione sonde 5 'e 3' dei bracci vettore omologia con un Southern blot (come descritto in precedenza al punto 1). Le sonde sono generati mediante PCR utilizzando coppie di primer hPITX3 5 'della sonda F e R, e hPITX3 3' della sonda F e R, digerito con EcoRI e ligato in un vettore generale clonazione.
- A seconda del numero di cloni positivi, preparare due pozzetti di una piastra da 6 pozzetti pre-placcatura con MEF (2,0 x 10 4 cellule per cm 2).
- Il giorno successivo pretrattare cloni positivi nella piastra a 48 pozzetti con 10 mM Y-27632 per un minimo di 1 ora.
- Lavare cloni positivi con HBSS e aggiungere 300 ml di Accutase.
- Quando le colonie sono resi singole cellule, aggiungere 1 ml di media hESC e raccogliere in una provetta da 15 ml.
- Modificare i media giornaliera. Il giorno 2, Y-27632 può essere ritirato e le cellule coltivate in hESC media.
- Quando le colonie sono il 70 - 80% confluenti, sottocultura e congelare il resto della coloframmenti di NY.
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Representative Results
A seguito di co-elettroporazione della PITX3 coppia zinc-finger personalizzato progettato insieme al PITX3 - EGFP DNA -specifica donatore vettore, e la successiva selezione puromicina, hESC cloni positivi sono stati inizialmente rilevati tramite lo screening genomico PCR (Figura 1). Southern blot ibridazione di questi cloni positivi PCR con 5 'e 3' sonde specifiche confermato corretto il targeting to esone 1 del locus PITX3 (Figura 2), con un rendimento del 19%. Immagini di immunofluorescenza mostrate in figura 3 mostrano espressione EGFP guidato dal promotore PITX3 seguente differenziazione con un PA6 pubblicato cellule stromali protocollo di differenziazione 12,13. Co-localizzazione di EGFP potrebbe essere osservato con marcatori di neuroni dopaminergici del mesencefalo quali Foxa2 (rosso) (Figura 3A) e tirosina idrossilasi (TH; rosso) (Figura 3B), mentre importante è non co-localizzazione c ould essere osservato con il marcatore GABAergici, acido gamma-aminobutirrico (GABA; rosso) (Figura 3C).
Figura 1 lo screening preliminare genomico PCR. Seguito colonia raccolta e di espansione, screening preliminare genomica PCR rilevato numerosi cloni positivi, come mostrato dal prodotto di PCR (banda a 984 bp). (Cloni sono stati proiettati utilizzando primer hPITX3 L braccio gen. F, che si trova appena fuori il braccio sinistro di targeting, e hPITX3 L braccio GFP R che si trova all'interno del gene EGFP.) Destra e sinistra corsie laterali sono 1 kb scaletta. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Validazione di EGFP mira al locus hPITX3 utilizzando nucleasi dito di zinco in hESC. (A) Schema della strategia Southern blot impiegato per convalidare il targeting. Lo schema illustra il pannello superiore hPITX3 luogo nativo prima di targeting. Lo schema pannello inferiore raffigura il locus hPITX3 seguente corretto inserimento del transgene EGFP. Le linee rosse sotto ogni pannello illustrano i luoghi in cui il 5 'e 3' sonde Southern blot vincolerà, e corrispondono alle bande in figura 2B. (B) Rappresentante Southern blot di colonie mirate correttamente selezionati da PCR pre-screening. Abbreviazioni: EGFP, proteina fluorescente verde migliorata; PGK, phosphoglycerol umano promotore chinasi; PURO, puromicina gene della resistenza. Altre caratteristiche: siti loxP, viola; sequenza di poliadenilazione, blue, esoni hPITX3, arancione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 hPITX3-EGFP hESC differenziato in condizioni di PA6 / LSB / SAG / FGF8. Immagini di immunofluorescenza EGFP marcati con (A) Foxa2 (rosso), (B) TH (rosso) e (C) GABA (rosso). Di contrasto con DAPI (blu). Bilance bar, 50 micron. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
A seguito di co-elettroporazione della PITX3 coppia zinc-finger personalizzato progettato insieme al PITX3 - EGFP -specifica Vettore DNA donatore, e successiva selezione puromicina, cloni positivi sono stati hESC inizialmente rilevate tramite lo screening genomico PCR (Figura 1). Southern blot ibridazione di questi cloni positivi PCR con 5 'e 3' sonde specifiche confermato corretto il targeting to esone 1 del locus PITX3 (Figura 2), con un rendimento del 19%. Immagini di immunofluorescenza mostrate in figura 3 mostrano espressione EGFP guidato dal promotore PITX3 seguente differenziazione con un PA6 pubblicato cellule stromali protocollo di differenziazione 12,13. Co-localizzazione di EGFP potrebbe essere osservato con marcatori di neuroni dopaminergici del mesencefalo quali Foxa2 (rosso) (Figura 3A) e tirosina idrossilasi (TH; rosso) (Figura 3B), mentre importante è non co-localizzazione può essere osservata con il marcatore GABAergico , gamma-aminobutirrico (GABA; rosso) (Figura 3C).
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Figura 2 Validazione diEGFP mira al locus hPITX3 utilizzando nucleasi dito di zinco in hESC. (A) Schema della strategia Southern blot impiegato per convalidare il targeting. Lo schema illustra il pannello superiore hPITX3 luogo nativo prima di targeting. Lo schema pannello inferiore raffigura il locus hPITX3 seguente corretto inserimento del transgene EGFP. Le linee rosse sotto ogni pannello illustrano i luoghi in cui il 5 'e 3' sonde Southern blot vincolerà, e corrispondono alle bande in figura 2B. (B) Rappresentante Southern blot di colonie mirate correttamente selezionati da PCR pre-screening. Abbreviazioni: EGFP, proteina fluorescente verde migliorata; PGK, phosphoglycerol umano promotore chinasi; PURO, puromicina gene della resistenza. Altre caratteristiche: siti loxP, viola; sequenza di poliadenilazione, blu, esoni hPITX3, arancione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura.
Figura 3 hPITX3-EGFP hESC differenziato in condizioni di PA6 / LSB / SAG / FGF8. Immagini di immunofluorescenza EGFP marcati con (A) Foxa2 (rosso), (B) TH (rosso) e (C) GABA (rosso). Di contrasto con DAPI (blu). Bilance bar, 50 micron. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Sostanza | ml / 100 ml | N. di catalogo (Fornitore) |
| DMEM | 89 | 10566-016 (Life Technologies) |
| Siero fetale bovino | 10 | 16140-071 (Life Technologies) |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) |
Tabella 1.
| Componente | 100 millimetri piatto | 60 millimetri piatto | 6-ben | 48 pozzetti | 96-ben | 75 centimetri 2 fiasco |
| HBSS | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Accutase | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Dispasi | 5 ml | 2 ml | 1 ml | - | - | - |
| i media hESC | 10 ml | 6 ml | 3 ml | 0,5 ml | 0,2 ml | 15 ml |
| Matrigel | - | - | - | - | 0,1 ml | - |
Tabella 2.
| Sostanza | ml / 100 ml | N. di catalogo (Fornitore) | |
| DMEM / F12 | 80 | 11320-033 (Life Technologies) | |
| KSR | 20 | 10828-028 (Life Technologies) | |
| NEAA | 1 | 11140-050 (Life Technologies) | |
| Glutamax | 1 | 35050-061 (Life Technologies) | |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) | |
| ß-mercaptoetanolo | 0.1 | 21985-023 (Sigma-Aldrich) | |
| rhFGF2 | 7 ng / ml [def] | 233-FB-025 / CF (R & D Systems) |
| Sostanza | Concentrazione | N. di catalogo (Fornitore) |
| Soluzione di sale di sodio N-Lauroylsarcosine (sarcosyl) | 0,5% (w / v) | 61747 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA | 10,0 mm | E9884 (Sigma-Aldrich) |
| NaCl | 10,0 mm | S3014 (Sigma-Aldrich) |
| Tris-Cl (pH7.5) | 10,0 mm | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| Proteinasi K | 1,0 mg / ml | BIO-37084 (Bioline Australia) |
Tabella 4.
| Sostanza | Concentrazione | N. di catalogo (Fornitore) |
| Tris-Cl (pH8.0) | 10,0 mm | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA (pH8.0) | 0,1 mm | E9884 (Sigma-Aldrich) |
Tabella 5.
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Discussion
La generazione di linee cellulari giornalista offre un potente mezzo per monitorare, visualizzare e isolare le cellule di interesse da una popolazione eterogenea derivato da hESC. Tuttavia, gene targeting via convenzionale ricombinazione omologa ha dimostrato di essere estremamente inefficiente per CES umani 3. In questo protocollo si descrive una tecnica relativamente semplice per l'introduzione di una RP in esone uno dei locus PITX3, in hESC utilizzando un vettore targeting ampiamente disponibili insieme a ZFNs. Nelle nostre mani il sistema di targeting gene è efficiente, con il 19% di cloni puromicina-resistenti contenenti un locus PITX3 mirato correttamente (simile a quello già pubblicato 6).
Una limitazione con l'utilizzo di ZFNs per facilitare gene targeting è la difficoltà nel progettare ZFNs da zero in casa. Così, in questo protocollo abbiamo usato personalizzato progettato ZFNs disponibili in commercio, che possono essere costosi da acquisire. & #160; Più di recente, il sistema TALEN è stato utilizzato per gene targeting utilizzando la ricombinazione omologa 9. L'uso di Talens riduce notevolmente i costi di editing gene e può essere progettato in-house, accelerare il processo. Anche se non esplicitamente dimostrato in questo studio, questo protocollo può essere facilmente modificato per incorporare l'uso di Talens come la metodologia è la stessa, tranne plasmidi ta vengono utilizzati nella Fase 3.5 anziché ZFN mRNA, come mostrato in 9.
Quando si utilizza questa tecnica è indispensabile per garantire che hPSCs sono in fase di crescita di registro, (ad esempio, le culture non sono il 70% o più confluenti). Noi crediamo che questo è critica come il plasmide guadagna l'accesso al nucleo seguente ripartizione membrana nucleare durante la divisione cellulare. Inoltre, il vettore donatore DNA incorporerà solo in DNA dopo la sintesi del DNA in quanto tale processo sfrutta riparazione omologia-diretto durante la divisione per incorporare il DNA del donatore nelgenoma.
Un'altra limitazione potenziale con l'approccio ZFN è l'introduzione di DNA rompe altrove nel genoma. Anche se l'ibridazione del sud con esterno 5 'e 3' sonde rileva corretta integrazione non rileverà eventi di integrazione aggiuntivi o riparazione soggetto a errori in altre parti del genoma. Eventi di integrazione extra possono essere esaminati da ibridazione Southern utilizzando sonde specifiche del vettore (ad esempio, EGFP), mentre fuori bersaglio scissione delle coppie ZFN possono essere rilevati tramite SELEX 3,6.
Anche se non abbiamo osservato alcun effetto evidente nello sviluppo dei neuroni dopaminergici del mesencefalo che potrebbero essere direttamente attribuita alla inattivazione di un gene PITX3, i ricercatori dovrebbero tenere a mente che ogni evento di targeting in cui si interrompe una copia di un gene può essere dannoso per la sviluppo di quella cella e deve tenerne conto quando si analizzano i risultati. Se questo è il caso, dipenderà in gran partesul gene essendo mirata e può essere accertata soltanto effettuando l'esperimento.
Utilizzando un protocollo di differenziazione basata PA6 12,13 siamo stati in grado di confermare la fedeltà del sistema giornalista per immunofluorescenza (Figura 3) e l'analisi qPCR di EGFP positive contro le popolazioni negative seguente cella fluorescenza-attivato l'ordinamento (dati non riportati). Come PITX3 è un fattore di trascrizione specifico per i neuroni dopaminergici del mesencefalo 14, la progettazione di una linea di cellule PITX3 giornalista umano facilitare l'uso di PITX3 + neuroni dopaminergici del mesencefalo derivate da hESC in studi sia in vitro modellazione PD o terapia di sostituzione cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro descritto in questo protocollo è stato reso possibile da un finanziamento da parte del governo vittoriana come parte di un'alleanza di collaborazione con l'Istituto californiano per la medicina rigenerativa (CIRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer - 40 μm | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
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